JPS63316733A - 抗ウイルス剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、海草類特に緑藻植物より採取した多糖体又は
蛋白多糖体、および該多糖体又は蛋白多糖体を有効活性
成分とする抗ウィルス剤、特に抗レトロウィルス剤、就
中抗エイズウィルス剤に開会症候群が患各を死に至らし
める川篤な病気として注目され、それに対する有効な治
療薬が渇望されている。現在、唯一のＡ　Ｉ　Ｉ）　Ｓ
治療薬としては因はレトロウィルスであるＨ　Ｉ　Ｖ　
（ｔｌｕｉａｎ　Ｉｍｍｕｎ。

ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　Ｖｉｒｕｓ）、がヒトのＴ４リ
ンパ系細胞に付着することによって感染が始まり、他の
リンパ系細胞に次々に感染して免疫系を破壊することに
よって起こることが既に研究されている。本発明者らは
、すでに免疫系に対しでＢＲＨ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｒｅｓｐｏｎｓｅ　Ｍｏｄｉｆｉｅｒ）の働きをする多
くの蛋白多糖体を見出している。このＢ　ＲＭの働きを
する多糖体又は蛋白多糖体が免疫系に及ぼす影響が大き
いことに注目して鋭意検討を重ねた結果、海草類の中で
緑藻類に分類されている植物から抽出される物質にＨＩ
Ｖのヒト由来リンパ系細胞への付着阻害活性、及びＨＩ
Ｖの増殖過程の必須の酵素であるＲＴａｓｅ　　（逆転
写Ｎ索）阻害活性があることを見出して本発明を完成さ
せた。以下に訂し〈実施例をあげて説明をする。

本発明にかかわっている海草は、緑藻類に分類されるも
ので、山田常雄他編集［″ｆＪ波生物学辞典第３版Ｊ　
１９８３年３月１０日岩波書店発行の付録第１４ベージ
以下の［植物および菌類分類表１によると、特に緑藻植
物の中で、オオヒゲマワリ目、コツメモ目、クロレラ［
Ｊ１ヒビミドロ目、アオサ目、カフノリ目、ヨ」ワミド
ロロ、シオグサロ、ミドリゲ目、すＡ７ミドロ目、カリ
ノリ口、ミル目から選択された海部がかかわっている。

本発明は、驚くべきことにこれら海藻からの抽出物がＨ
ＩＶの付着阻害活性、ＲＴａｓｅ阻害活性を有すること
を見出して本発明を完成さゼた。つまり緑藻植物の中の
海草から抽出される多糖体又は蛋白多糖体を有効成分と
する抗ウィルス剤に関するものである。

本発明物質は、緑藻植物のオオヒゲマワリロ、コツメモ
目、クロレラ目、ヒビミドロ目、ア第１す目、カワノリ
目、ヨー１ワミドロ目、シオグυ目、ミドリグ目、サヤ
ミド口［１、カサノリ目、ミル目から選択される海草を
冷水、熱水、アルカリ又は熱アルカリ水溶液等の水系溶
媒で抽出することにより得られる。

抽出に際して用いる水系溶媒とは水又は水に可ば１０％
程度以下含有する水溶液から選択される１種又は２種以
上の組合ゼよりなるものである。有機溶媒としてはメタ
ノール、エタノール、イソプロピルアルコールなどが主
として用いられる。酸としては、塩酸、硫酸、酢酸など
である。塩幕としてはアンモニヤ、苛性ソーダ、苛性カ
リ、炭酸ソーダなどである。

抽出は原料（乾燥基準）に対して５倍乃至２００倍給０
抽出液を使用し、通常は４℃乃至１２０℃で２０分乃至
２０時間処理するものである。

精製処理［程とは、塩析、透析、限外濾過、逆滲透処理
、ゲル濾過、４Ｉ１１溶媒による沈澱処理などの１１４
又は２種以上の方法の適用により低分子物を除去するこ
とを意味するものである。工学的には加圧による膜分離
法である限外濾過法、逆滲透処理法の単独又は組合せが
特に好ましい。又場合により塩析工程後これらの処理を
↑１つでもよい。

塩析工程に用いる塩析剤は硫安、食塩、塩化カリ、炭酸
バリウム等であるが、硫安の使用が最も好ましい。又塩
析工程の少処理としで透析、限外濾過、ゲル濾過、逆滲
透処理等のいずれか１つ又はこれらの２以上の工程の組
合せが必要である。

透析は通常セロファン膜、コロジオン膜などの半透膜を
用いて実施されるものである。ゲル濾過はデキストラン
又はポリアクリルアミドゲルなどの吸着剤を充填したカ
ラムを用いて実施する。ピフ７デックス、バイオゲルの
名称で販売せられている充填剤が通常用いられる。

限外濾過、逆ｗｊ透圧法はいずれも加圧下で膜を用いて
分画する方法である。面前は０．５〜５に９／ｄ、１１
者は２０〜３５に’ｊ／Ｃｄで行うのが通常である。

有機溶媒による沈澱法はメタノール、エタノール、イソ
プロパツール、アセトンなどを用いるのが一般的である
。又、上記操作に加えて必要に応じイオン交換処理を行
っても良い。

上記開裂操作が終った後は噴霧乾燥、凍結乾燥などぐ水
分を除去した後製品化するものである。

尚本物質をアルカリ性水溶液で処理すると、驚くべきこ
とには抗ウイルス効果が増強されるので更に好ましい。

本物質を５倍乃至２００倍量の０．０１Ｎ乃至５Ｎ好ま
しくは０．１乃至２Ｎのアルカリ性水溶液で、４０℃乃
至２５０℃、好ましくは６０℃乃至２００℃、最も好ま
しくは１００℃乃至１５０℃で、５分乃至。

２時間好ましくは１０分乃至１時間処理する。次に該処
理液を中和し、精製処理工程を行なう。精製処理工程は
前記の塩析、透析、限外濾過、逆滲透処理、ゲル濾過、
有機溶媒による沈澱処理などの１種又は２種以上の方法
の適用により行なうことが出来る。条件は前記と同じで
ある。この精製操作が終った後は、噴霧乾燥、凍結乾燥
などで水分を除去した後製品化する。

また、本物質をジエチルアミノニブル（ＤＥＡＥ　）−
セルロース等のイオン交換セルロースゲル等を用いたク
ロマトグラフィーで更に精製を行うと、ましい。

本物質はα−ナフトール硫酸反応、インドール硫酸反応
、アンスロン硫酸反応、ノエノール硫酸反応及び又はロ
ーリイーフォーリン法、塩酸加水分解後のニンヒドリン
反応で陽性を示す。元素分析の結果、炭素２０〜５５％
、水素３〜９％、窒素０〜１６．０％を主成分として含
有する。

本物質の糖成分は少なくともグルコース、マンノース、
キシロースを含み、蛋白成分としては少なくともアスパ
ラギン酸、グルタミン酸、ロイシンを含有する。

赤外スペクトルを測定すると、３６００〜３２００α−
１付近に水酸基の吸収１葎糞Ａ、１７００〜１６００．
−１付近にはアミド基に由来する吸収を認めることが出
来た。

本物質は水系溶媒に可溶で、有機溶媒に不溶である。水
系溶媒は水又は水を主体として水に可溶のアルコール、
酸、塩基等を含むものであり、有機溶媒はクロロホルム
、ベンゼン、エーテル等をクロマトグラフィーにより１
０３−１０６である。

ラット（容重系ン４〜５３１令、体重１００〜１５０び
のものを用い、本物質を１０００ｑ／Ｋｇ経口投与し、
７日間観察を行ったが全匹生存していた。

本物質はその毒性が極めて低く且つ副作用も殆んど生起
しないなど安全な物質である。

一般にウィルスは、標的細胞に付着し、ウィルスの核酸
が細胞内に注入され、さらに細胞のゲノムにインチグレ
ートされる過程を経てウィルスが１ＦＩｊされることが
知られている。また、特にレトロウィルスについては、
細胞のゲノムにインチグレートされる前に、ウィルス由
来の核酸であるＲＮＡから、逆転写酵素の作用によって
ＤＮＡに転写される過程が必要である。本発明者等は、
本発明の緑藻植物の抽出物がＨＩ　Ｖ　（Ｈｔｌｌａｎ
　ＩＩＩｕｎＯｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　Ｖｉｒｕｓ）の
ヒト由来リンパ系細胞への付着および、それに引き続く
感染を阻害すること、および、逆転写酵素活性を阻害す
ることを見出した。フなわら、ＨＩ　Ｖを５０〜１００
０Ｍ　／　ｄの濃度の海草抽出物で０℃にて２時間処理
した後ＨＩＶを洗浄し、ＭＴ−４１胞に加えて感染させ
、３日問培養後のＨＩＶ抗原陽性細胞を測定する方法に
て、緑藻植物に含まれる海単抽出物の効果を検討したと
ころ、緑藻植物に含まれる海草抽出物による前処理によ
り、ＨＩＶ抗原陽性細胞がほとんど消失し、ＨＩ　Ｖの
ヒト由来リンパ系細胞に対する強い付着阻害効果が認め
られた。一方、本物質の逆転写Ｐｆ！素活性に及ぼす影
響をラット肝臓全メツセンジャーＲＮΔを鋳型として測
定したところ、本物質５０へ、　１０００埒／ｒｄの添
加により強い逆転写酵素活性の阻害がみられた。

これらのことは、緑藻植物由来の海草抽出物がウィルス
の感染を阻害する作用をもつこと、特に逆転写酵素をも
つレトロウィルスの感染を閉古づること、就中、ＨＩＶ
感染によって引き起こされるＡＩＤＳ　　　　’　　　
　　　　　”　　　　　　　　　、に有効であることを
示すものである。

抗ウィルス剤としてすでに使用されているＡＺ王の場合
、正常細胞に対しても分裂阻害作用を示す副作用がみら
れるが、本発明の多糖体あるいは呻Ｖ 蛋白多糖体は急性毒性も極めて低く、安全な士士メであ
り、ウィルス感染、特にレトロウィルス感染を阻害する
作用を示１ことより抗ウィルス（へ染症剤として有用で
ある。即ちウィルス感染症、特にレトロウィルス感染症
、就中ＡＩＤＳに有効ぐある。

本発明の多糖体あるいは蛋白多糖体は、抗ウイルス感染
症剤として用いる場合、任意の剤型にすることができる
。又、投与も各経路で行なわれる。

更に本発明の薬剤は、ウィルス感染症治療剤として用い
られている前記の　　・−−一　　　　→＝＊＃Ａ　Ｚ
　Ｔ　７などとの併用においてｂ効力を減ｆることがな
く、これら他の薬剤との併用は有効な手段として使用し
得る。

経口投与の場合には、それに適用される錠剤、顆粒剤、
散剤、カプセル剤などは、それらの組成、物中に製剤上
一般に使用される結合剤、包含剤、試形剤、潤滑剤、崩
壊剤、湿潤剤のような添加物を含有していてもよく、又
経日用液体製剤として用いる場合は、内用水剤、＠盪合
剤、懸濁液剤、乳剤、シロップ剤の形態であってもよく
、又使用する前に再溶解さＩる乾燥生成物の形態であっ
てもよい。さらに、このような液体製剤は４通用いられ
る添加剤、保存剤のいずれを含有してもよい。

注射用の場合には、その組成物は安定剤、緩衝剤、保存
剤、等張化剤などの添加剤を含んでいてもよく、単位投
与らｌアンプル、又は多投ｔＥ＋ｕ容墓中で提供される
。なお、上記組成物は水溶液、懸濁液、溶液、油性また
は水性ビヒクル中の乳液のような形態であってもよく、
一方活性成分は使用する前に適当なビヒクルたとえば発
熱物質不含の滅菌した水で再溶解させる粉末であっても
よい。

本発明の抗ウイルス感染症剤は人間及び動物に経口的ま
たは非経口的に投与される。経口的投与は舌下投与を包
含する。非経口的投与は注射例えば皮下、筋肉、静脈注
射、点滴などを含む。本発明の抗ウイルス感染症剤の役
！Ｅｊｍは動物か人間ににより、また年齢、個人差、病
状などに影響されるので、場合によっては下記範囲外の
但を投与する場合も生ずるが、一般に人間を対象とする
場合、本発明活性物質の経口投与量は体ｔ１＊ｇ、１日
当り０．１〜．１０００■、好ましくは１へ・ｉｏｏ璧
を１回から３回に分けて投与する。

以下、実施例を示づ。

実施例　１ 緑藻植物の中のクロレラ目り【］レラ科内のり［Ｉレラ
粉末１００９を容ｒ＋ｉ３ｊ！のステンレス製タンクに
入れ、２０００−の水を加えて撹拌しつつ）３度を９０
へ・９５℃に保った。約３時間抽出したのら、室温まで
冷却した。

抽出スラリーを遠心分Ｍ機により抽出液と残渣とに分離
する。更に残渣に０．４Ｎ−ＮａＯｔｌ　２０００媚を
加えて９０〜９５℃にて３時間抽出したのち、室温まで
冷却し、２Ｎ−１１ｃＡＩでｐＨを７．０に調整後遠心
分離し、抽出液と残渣に分離する。

抽出液は合し、減圧濃縮装置により４００ａｔｅまで濃
縮し、限外濾過にて脱塩の後凍結乾燥により乾燥し、１
３ｇの乾燥物（Ａ−１＞を得る。

実施例　２ クロレラ粉末１００ｇをよく細片化した後容ｆｆ１３１
のステンレス製タンクに入れ、０．４８　Ｈａ叶氷水溶
液加えて撹拌しつつ温度を９０〜９５℃に保った。

約３時間抽出したのら室温まＣ冷却した。冷却模２Ｎ−
１１ｃｆＩでｐＨ７，０に調整後遠心分離し、抽出液と
残漬を分離した。抽出液を減圧濃縮装置により４００　
ｄにまで濃縮し、その溶液を限外濾過装置を用いて脱塩
した。脱塩の後凍結乾燥により乾燥を行ない、約１２９
の乾燥物（Ａ−２）を得た。

実施例　３ クロレラ粉末１００ｇを容ｆｆｉ　３１のステンレス製
タンクに入れ、２０００ｍの水を加えて撹拌しつつ温度
を９０〜９５℃に保った。約３時間抽出したのち、室温
まで冷却した。

抽出スラリーを遠心分離機により抽出液と残渣とに分離
した。

抽出液は合し、減圧濃縮装置により４００ｄまで濃縮し
、限外濾過にて脱塩の後凍結乾燥により乾燥し、１Ｇ９
の乾燥物（Ａ−３）を得た。

実施例　４ 緑ｉ植物の中のアオサ目アオサ科内のアオナ粉末１００
９を容量３！のステンレス製タンクに入れ、１０００ｍ
の水を加えて撹拌しつつ温度を９０〜９５℃に保った。

約３時間抽出したのら、室温まで冷却した。

抽出スラリーを遠心分離機により抽出液と残漬とに分離
した。更に残漬に０．４８−ＮａＯＨ１０００ｍを加え
て９０〜９５℃にて３時間抽出したのら、室温まで冷却
し、２Ｎ−）１ｃ１でｐｎを７．０１．：！ＩＩ整後遠
心分離し、抽出液と残漬に分離した。

抽出液は合し、減圧濃縮装置により４００ｄまで濃縮し
、限外濾過にて脱塩の後凍結乾燥により乾燥し、１８ｇ
の乾燥物（Ｂ）を得る。

実施例　５ 緑藻植物の中のホシミドロ口内アオミドロ粉末１００ｇ
を容量３１のステンレス製タンクに入れ、１０００ｍの
水を加えて撹拌しつつ温度を９０〜９５℃に保った。約
３時間抽出したのら、室温まで冷却した。

抽出スラリーを遠心分離機により抽出液と残渣とに分離
する。更に残漬に０．４Ｎ−ＮａＱＨ１０００ａｅを加
えて９０〜９５℃にて３時間抽出した後室温まで冷却し
、２Ｎ−１１ＣｊでｐＨを７．０に調整後遠心分離し、
抽出液とＩＡ渣に分離する。

抽出液は合し、減圧濃縮装置により４００ｊｔｅまで濃
縮し、限外濾過にて脱塩の後凍結乾燥により乾燥し、１
５９の乾燥物（Ｃ）を得る。

１のステンレス製タンクに入れ、２０００ｔｍの水を加
えて撹拌しつつ温度を９０〜９５℃に保った。約３時間
抽出したのら、室温まで冷却した。

抽出スラリーを遠心分離機により抽出液と残渣とに分離
した。更に残漬に０．４Ｎ−ＮａＯＨ２０００−を加え
て９０〜９５℃にて３時間抽出したのち、室温まで冷却
し、２Ｎ　−１１ｃｊでｐＨを７．０に調整後遠心分離
し、抽出液と残渣に分離した。

抽出液は合し、減圧濃縮装置により４００ｄまで濃縮し
、限外濾過にて脱塩の後凍結乾燥により乾燥し、１７９
の乾燥物（Ｄ）を得る。

実施例　７ カサノリ粉末１００ｇを容ｆＢ　３１のステンレス製タ
ンクに入れ、２００Ｍの水を加えて撹拌しつつ温度を９
０〜９５℃に保った。約３時間ｈＪ出したのち、室温ま
で冷却した。

抽出スラリーを遠心分Ｍｍにより抽出液と残渣とに分離
した。更に残渣に０．４Ｎ−ＮａＯｌｌ　２０００ｍを
加えて９０〜９５℃にて３時間抽出したのら、室温まで
冷却し、２Ｎ　−ＨＣｊ　ｒ　ｐｕを７．０に調整後遠
心分離し、抽出液と残渣に分離した。

抽出液は合し、減圧濃縮装置により４００ｄまで濃縮し
、限外濾過による脱塩の後凍結乾燥により乾燥し、１９
ｇの乾燥物（Ｅ）を得る。

各種緑藻より新しく抽出された物質の物理化学的性質を
示しているのが下表の一覧である。木表において、フェ
ノール硫酸早色反応は糖類の存在を表わし、０−リイー
フオーリン法はペプチド結合の存在を示している。分子
量についてはゲル濾過法によって平均的に多く存在する
両分を記載した。

実施例　８ 実施例１〜７で得られた物質について、レトロウィルス
が特異的に保持する逆転写酵素の阻害度を以下の方法に
より測定した。

被験物質はすべて凍結乾燥品１０■を滅菌蒸留水１０ｄ
に溶解した（１１度：ｌｌｌ１ｇ／ｄ）。

１成の２０１１ＨＤ、Ｔ、丁、（ジチオスレイトール：
シグマ社製）、５屑の５倍濃度酵素反応液（２５０ｍＨ
Ｔｒｉｓ−１１ｃ＋ｆ！　（ＯＨ８，３）−２５（１ｍ
ＨＫＣ６−４０１８ＭＯＣＩ！　２）、１ｐの３ｄ　Ｎ
ＴＰ溶液（ＩＩＩＨｄ＾ＴＰ−１ｍＨＧＴＰ−１ｍＨｄ
ＴＴＰ　：シグマ社製）、２ｐｉの１００ｐ！ｇ／ａｔ
ｅオリゴ（ｄＴ）１２〜１８（ＰＬ−ｂｉｏｃｈｅｔｍ
ｉｃａｌｓ社）、１成のメツセンジャーＲＮＡ（正常ラ
ット肝臓由来：１巧／成）、ｏ、５１１１のＲＮａｓｅ
　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　（１６ｕｎｉｔ／［：宝酒造社
製）と１ｇの［α−３２Ｐ　］　ｄＣＴＰ　（〜８００
Ｃｉ／ｎｎｏｌ　、　１０μＣｉ／成：アマジャムジャ
パン社製）を１．５ＩｔＲ容けのエツベンドルフプー１
−ブに加え、３７℃つＡ−ターバス中におく。

５分後、先に調製した１＃／ｌＫ１１１度の被験物質１
２、５４を反応チューブに添加し、更に　１屑の逆転写
酵素（７ユニツト／成：宝酒造社製、Ｒｏｕｓａｓｓｏ
ｃｉａｔｃｄｖ　１ｒｕｓ由来）を加え、最終反応液１
４　ヲ２５μとして、３７℃で反応さゼた。

１時間後５１１！の反応液を２０×２１のＤＥＡＥ紙（
東洋口紙社製）にしみこませ、風乾後、【］Ｍ１１枚あ
たり１０ｍの０．５ｏ−Ｎａ　　ＨＰＯ４水溶液に浸し
、振盪しながら口紙上のＤＮＡ合成に使用されなかった
［α−３２Ｐ　］　ｄ　ＣＴＰを洗浄した（この操作を
５分間おきに５回実施する）。

その後１０−の液体シンチレーシコンカクテル（アマジ
ャムジャパン社製）の入っているガラスバイヤル瓶に上
記ＤＥＡＥ紙を入れ、シンチレーションカウンター（ア
ロカ社製）にて１分間放射活性（Ｃ，ｌ）、　ｍ、　）
をカウントした。

阻害率（％）は以下の式により求めた。

Ｃ８：被験物質添加の放射活性 各被験物質の逆転写酵素（ＲＴａｓｃ）活性阻害率を表
１に示す。

表１：各被験物質のＲＴａＳｅ括性阻害÷÷＋　７０〜
１００％ ÷÷　　３０〜６９％ ＋　　０〜２９％ 実施例　９ 被験物質によるＨＩＶ（ＡＩＤＳウィルス）のヒトリン
パ球への吸着阻害は以下の方法により実施した（尚、す
べての操作は無菌条ｆｉ下で１）なった）。

ＨＩ　Ｖ　（ｌｌｕｍａｎ　Ｉ＋ｕａｕｎｏｄｅ４ｉｃ
ｉｅｎｃｙ　Ｖｉｒｕｓ）浮遊液１１Ｒ１と被験物質溶
液（８ｏＯ＊／ａ＋ｅ）　　１−を試験管に入れ、水中
に静置した。２時間後試験管から１ｄのウィルス浮遊液
をとり、ヒトリンパ球由来細脂株ＭＴ　−４［Ｊｐｎ、
　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　（Ｇａｎｎ）、　２
８゜２１９−２２９　（１９８２）］に多重感染度（Ｈ
，０，１，）　＃２　ｒウィルスを吸着させた。遠心（
毎分２，０００回転。

１０分間）後、上清をすて沈澱したＭＴ−４１１１胞を
２０％ＦＣ８を含むＲＰ　Ｍ　１１６４０　（Ｇｉｂｃ
ｏ　Ｌａｂｏｒａｔ。

ｒｉｅｓ、ＮＹ）中に、細胞濃度２×１０５／Ｉｎｌ１
になるように浮遊させた。

９６穴プレートに上記ＭＴ−４細胞浮遊液を１００ρづ
つ分注して、５％ＣＯ２，３７℃の条件下で培養した。

培養３日目に間接蛍光抗体法によりＨＩＶ感染細胞と非
感染細胞を算出した。

表−２各被験物質のＨＩＶ感染阻害効果十＋÷　　１０
〜１００　　％ 十◆　　　３０〜６９　％ →・　　　　０へ・　２９　％ 実施例　１０ 圧力式自動充填機を用い、ｏ１３硬カプセルに本物質を
３３０句充填しカプセルを作製した。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）海草類より生産した多糖体又は蛋白多糖体を有効
   成分とする抗ウィルス剤。
2. （２）海草類は、緑藻植物より選ばれる特許請求の範囲
   第１項の抗ウィルス剤。
3. （３）緑藻植物は、オオヒゲマワリ目、ヨツメモ目、ク
   ロレラ目、ヒピミドロ目、アオサ目、カワノリ目、ヨコ
   ワミドロ目、シオグサ目、ミドリゲ目、サヤミドロ目、
   カサノリ目、ミル目から選ばれる特許請求の範囲第２項
   の抗ウィルス剤。
4. （４）特許請求の範囲第１項の多糖体又は蛋白多糖体を
   有効成分とする抗レトロウィルス剤。
5. （５）特許請求の範囲第１項の多糖体又は蛋白多糖体を
   有効成分とする抗エイズウィルス剤。