WO2022172807A1 - 口腔ケア用組成物 - Google Patents

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WO2022172807A1 PCT/JP2022/003836 JP2022003836W WO2022172807A1 WO 2022172807 A1 WO2022172807 A1 WO 2022172807A1 JP 2022003836 W JP2022003836 W JP 2022003836W WO 2022172807 A1 WO2022172807 A1 WO 2022172807A1
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antibacterial
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良太 竹内
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一丸ファルコス株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to an oral care composition containing, as an active ingredient, a protein fraction having a specific molecular weight obtained from an algae extract of the Myrraceae family.
  • Periodontal disease is an inflammatory disease that begins when periodontal disease-causing bacteria, a type of pathogenic bacteria in the oral cavity, settle in the oral cavity. If oral cleaning is insufficient, dental plaque (oral bacteria and its metabolites) adheres to the boundary between the gums and teeth, then settles and proliferates. In response to this foreign substance, neutrophils and macrophages infiltrate, causing inflammation. If the oral cavity can be cleaned by brushing or the like at an early stage, this inflammation can be improved. However, if the plaque is left unattended, the inflammation will spread, and if a periodontal pocket is formed, the plaque accumulated there will be difficult to remove by brushing or the like. Therefore, it is said that suppression of dental plaque, that is, sterilization and bacteriostasis of pathogenic bacteria in the oral cavity is useful as an effective means for preventing and improving periodontal disease.
  • dental plaque has been regarded as a biofilm
  • bacteria in oral biofilm differ greatly in bacterial protein expression patterns and drug resistance compared to planktonic bacteria. has been shown to be ineffective against biofilm-forming bacteria.
  • antibacterial agents such as cationic antibacterial agents such as cetylpyridinium chloride, benzethonium chloride, and chlorhexidine, and nonionic antibacterial agents such as triclosan, have been found to be effective when incorporated into oral compositions as a means of sterilization.
  • these antibacterial agents alone cannot provide a sufficient biofilm inhibitory effect due to the drug resistance mechanism of biofilm bacteria.
  • improvement techniques have been proposed by using them in combination with other ingredients, but none of them have achieved remarkable effects due to low drug penetration into biofilms.
  • Patent Document 1 mushroom-derived lectins such as ABA, which recognize sugar chains having terminal structures of Gal ⁇ 1-3GalNAc and GlcNAc, are used to attach and proliferate oral bacteria to plaque or biofilm in the oral cavity. It is disclosed that there is an effect of suppressing.
  • lectins that are contained in alga body extracts of Myrraceae algae and bind to sugar chains that compete with GalNAc are found to be able to inhibit the adhesion and growth of oral bacteria, particularly Streptococcus mutans, and prevent tooth decay. have been reported (see, for example, Patent Document 2).
  • oral care products such as mouthwash contain antibacterial ingredients
  • side effects such as diarrhea may occur, and these side effects usually disappear when the antibiotic is stopped. It is.
  • antimicrobial components may reduce the naturally occurring non-pathogenic bacteria that colonize the body, providing an opportunity for other pathogens to become infected.
  • oral care products that are alternatives to using antibacterial ingredients (including lower content of antibacterial ingredients) and such There is a strong desire to provide materials that can be incorporated into a variety of products.
  • the problem to be solved by the present invention is an oral care product and oral care that can suppress the adhesion of bacteria floating in the oral cavity to teeth without using an antibacterial component or by reducing the concentration of the antibacterial component. For example, creating materials that are contained in products for use.
  • the present invention has been made to solve the above problems, for example, an oral care product containing a protein fraction having a specific molecular weight contained in an extract of Myrraceae algae, and a material to be contained in the product. (materials for oral care), and so on.
  • an oral care composition containing an extract of Myrraceae algae as an active ingredient.
  • An oral care composition containing, as an active ingredient, a protein fraction having a molecular weight of 5,000 or more contained in an extract of Myrraceae algae.
  • the protein fraction preferably has a molecular weight of 5,000 or more and less than 50,000, more preferably 5,000 or more and less than 30,000. Alternatively, it may be a protein present in a high molecular weight fraction with a molecular weight of 50,000 or more.
  • the composition for oral care according to [1] further comprising an antibacterial component.
  • the antibacterial component includes cetylpyridinium chloride (CPC), chlorhexidine, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, depotassium chloride, chlorhexidine gluconate, protamine, dodecyldiaminoethylglycine, triclosan, 3-methyl-4-isopropylmethylphenol (IPMP), thymol, carvacrol, farnesol, bisabolol, cineol, hinokitiol, sodium lauroyl sarcosinate, l-menthol, one or more selected from the group consisting of l-menthol, oral care according to [1] or [2] composition.
  • CPC cetylpyridinium chloride
  • IPMP 3-methyl-4-isopropylmethylphenol
  • IPMP 3-methyl-4-isopropylmethylphenol
  • thymol carvacrol
  • farnesol bisabolol
  • cineol cineol
  • hinokitiol
  • the oral care composition of the present invention it is possible to suppress adhesion of bacteria floating in the oral cavity to teeth without using an antibacterial component or at a low concentration.
  • FIG. 1 shows the results of bacterial adsorption tests for mill extract (ML), cetylpyridinium chloride (CPC) and their mixture (CPC+ML).
  • FIG. 2 shows the results of the fungal adsorption test for mill extract (ML), benzalkonium chloride and their mixture (benzalkonium chloride+ML).
  • FIG. 3 shows the results of the fungal adsorption test for mill extract (ML), chlorhexidine and their mixture (chlorhexidine+ML).
  • FIG. 4 shows the results of bacterial adsorption test for mill extract (ML), IPMP and their mixture (IPMP+ML).
  • FIG. 5 shows the results of a bacterial adsorption test for four fractions molecular weight-fractionated in Example 2 (molecular weights of 50,000 or more, 30,000 or more and less than 50,000, 5,000 or more and less than 30,000, and less than 5,000).
  • FIG. 6 shows the results of a bacterial adsorption test for three fractions molecular weight-fractionated in Example 2 (molecular weight less than 5000, 5000 or more and less than 30000, and 30000 or more and less than 50000).
  • FIG. 7 shows the results of a bacterial adsorption test when CPC was added as an antibacterial agent to four fractions (molecular weights of 50000 or more, 30000 or more and less than 50000, 5000 or more and less than 30000 and less than 5000) obtained by molecular weight fractionation in Example 2.
  • FIG. 8 shows the results of investigating the combined effect of the mill extract and the mouthrinse, etc., by a bacteria adsorption test using the mill extract and the commercially available mouthrinse.
  • oral care compositions are, for example: To contact substantially all tooth surfaces and/or oral tissues for the purpose of oral activity, rather than intentionally swallowing for the purpose of systemic administration of a particular therapeutic agent in its normal method of use Products that are retained in the mouth for a sufficient period of time (oral care products). ⁇ Materials contained in the product. The material contains an extract of Myrraceae algae.
  • the oral care product may be in the form of mouthwash, mouthwash, dentifrice, toothpaste, gel, solution, or the like. Oral care products may also be incorporated into flosses, strips, or films for direct application or adherence to oral surfaces, or into devices or applicators such as toothbrushes or rolling applicators. Such applicators may be disposable or multi-use.
  • An oral care composition in one embodiment of the present invention contains an extract of Myrrhidae algae or a protein fraction with a molecular weight of 5000 or more contained therein as an active ingredient. The details will be described below.
  • the extract of Myrrhaceae algae used in one embodiment of the present invention includes Chlorophyceae, Codiales, and Bryopsidales in recent classification.
  • Any method for collecting the extract of the present embodiment may be used on the condition that the activity of suppressing or inhibiting the binding of oral bacteria to salivary biopolymers is not substantially impaired.
  • the extract of this embodiment may be collected from any tissue of algal bodies. After washing, the algal body is crushed by a homogenizer or the like, powdered by freeze-drying, or powdered by a grinder and then subjected to an extraction treatment in some cases.
  • the aqueous solution used for extraction includes an aqueous solution containing NaCl and other salts such as physiological saline, a mixture of acetone and other water-soluble organic solvents and/or alcohol and water, and purified water or deionized water. Other aqueous solvents known to those skilled in the art, including but not limited to, can be used.
  • Alcohols herein include, but are not limited to, ethanol, ethylene glycol, butylene glycol, glycerin.
  • Aqueous solvents may have an acidic or alkaline pH.
  • Tris-HCl buffer, Hepes buffer, phosphate buffer, acetate buffer, citrate buffer, glycine-HCl buffer are included, but not limited to these.
  • the extraction method can be appropriately selected from immersion extraction method, pressure extraction method, supercritical or sub-supercritical extraction method, etc., or can be used in combination.
  • the extraction conditions may be any conditions provided that the activity of suppressing or inhibiting the binding of oral bacteria to salivary biopolymers is not substantially impaired, and the extraction time is from 10 minutes to 24 hours. and the extraction temperature may be 4° C. or higher, preferably room temperature or higher, and more preferably 15° C. or higher.
  • the extract of the present embodiment can be obtained as it is, or by purifying or concentrating it, to obtain an active ingredient as an oral care composition.
  • the active ingredient is present in the protein fraction with a molecular weight of 5000 or greater. A fraction with a molecular weight of 5,000 or more and less than 50,000 is more preferable, and a fraction with a molecular weight of 5,000 or more and less than 30,000 is more preferable.
  • Purification and concentration of Myrraceae algae extracts include, but are not limited to, techniques such as centrifugation, salting out, dialysis, vacuum concentration, ultrafiltration, gel filtration, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc. It can be carried out alone or in combination of any two or more. After purification or concentration, the algae extract may be dried under reduced pressure or diluted with a solvent if necessary.
  • One of the candidates for the active ingredient of the present invention is considered to be, for example, a lectin that binds to a sugar chain that competes with GalNAc (see Patent Document 2).
  • this active ingredient does not necessarily bind to all sugar chains having GalNAc at their ends.
  • the 2nd to 3rd sugar residues from the terminal bind only to sugar chains with a specific structure, the binding may be inhibited in the presence of GalNAc.
  • lectin refers to proteins other than antibodies, T-cell receptors, Toll-like receptors, and other immune proteins involved in the immune system of animals, and having the ability to specifically bind to sugar chains. .
  • Lectins are usually capable of agglutinating red blood cells and other animal cells. According to Kanji Hori (Chemistry and Biology, 32:586-594, (1994)), lectins derived from Myrrhaceae algae have in common that they bind to sugar chains that compete with GalNac.
  • the active ingredient of the present invention binds to GalNAc present on the surface of the membrane formed by polysaccharides contained in salivary biopolymers and inhibits adhesion of oral bacteria to it. be done.
  • the active ingredient of the present invention may have any concentration on the condition that it does not substantially impair the activity of suppressing or inhibiting the binding of oral bacteria and salivary biopolymers, but preferably Myrraceae algae It is preferably 0.001% by mass or more, more preferably 0.01% by mass or more, and even more preferably 0.1% by mass or more, relative to the total amount of the oral care composition in terms of extract.
  • the upper limit is 5% by mass or less, preferably 4% by mass or less, more preferably 3% by mass or less, and even more preferably 2% by mass or less.
  • the concentration of the protein contained in the active ingredient of the present invention may be any concentration provided that it does not substantially impair the activity of inhibiting or inhibiting the binding of oral bacteria to salivary biopolymers. 0.5 ⁇ g/mL or more is preferable, and 5 ⁇ g/mL or more is more preferable.
  • the oral care composition of the present embodiment preferably contains an amount of antimicrobial component.
  • An antibacterial ingredient is an ingredient having an antibacterial action.
  • Antibacterial action includes, for example, sterilizing action, bactericidal action, disinfecting action, bacteriostatic action, bacteriostatic action, bactericidal action, antiseptic action, antibacterial action, and antifungal action.
  • An antimicrobial agent is an agent containing an antimicrobial component.
  • Antibacterial agents include, for example, bactericidal agents, antibacterial agents, antifungal agents, antifungal agents, antiseptic agents, deodorants, and insecticides. microbial control agents and deodorants can be suitably used.
  • a known compound having the above action may be appropriately selected and used.
  • antibacterial agents examples include organic synthetic antibacterial agents, natural antibacterial agents, and inorganic antibacterial agents.
  • Antibacterial components contained in the antibacterial agent include, for example, cetylpyridinium chloride (CPC), chlorhexidine, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, depotassium chloride, chlorhexidine gluconate, protamine, dodecyldiaminoethylglycine, triclosan, 3-methyl- 4-isopropylmethylphenol (IPMP), thymol, carvacrol, farnesol, bisabolol, cineol, hinokitiol, sodium lauroyl sarcosinate, l-menthol, and the like.
  • CPC cetylpyridinium chloride
  • IPMP 3-methyl- 4-isopropylmethylphenol
  • IPMP 3-methyl- 4-isopropylmethylphenol
  • these antibacterial agents may be used singly or in combination of two or more.
  • the concentration of these antibacterial ingredients is appropriately determined for each antibacterial ingredient in consideration of the purpose of use and antibacterial activity. , preferably in the range of 0.0001 to 0.01% by mass.
  • an acidic antibacterial agent is used, it is used in the range of 0.01 to 0.5% by mass.
  • the range is preferably 0.1 to 5.0% by mass, more preferably 1.0 to 4.0% by mass.
  • composition for oral care of the present embodiment contains these antibacterial agents in predetermined specifications and amounts, thereby enhancing the effect of suppressing or inhibiting the binding of oral bacteria and salivary biopolymers.
  • the antimicrobial agent may be included in a reduced formulation below the amounts (concentrations) described herein. In this case as well, it is possible to enhance the action of suppressing or inhibiting the binding of oral bacteria to salivary biopolymers while reducing the side effects of the antibacterial agent.
  • the synergistic effect of the myrrhaceae algae extract and the antibacterial agent is not bound by any theory, but the synergistic effect of the ionic antibacterial agent is greater than that of the nonionic antibacterial agent. It is believed that the active ingredient of the present invention and the antibacterial agent form a complex in some form to further enhance the lectin activity.
  • the active ingredient of the present invention is thought to inhibit the interaction between saliva-derived biopolymers, particularly sugar chains containing galactose at the end, and oral bacteria. It is also possible that the cell membrane structure changes and the binding force of lectin-like substances derived from oral bacteria on the membrane surface decreases.
  • biofilms formed by microorganisms It can be used as a means to solve various problems caused by For example, in the medical field, it has been pointed out that biofilms formed on the surface of catheters cause serious infections. It is also possible to suppress biofilm formation on the medical device surface by treating the medical device with
  • the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
  • the unit % of numerical values indicating the addition amount of various components means % by mass (w/v %).
  • Example 1 Preparation of Myrraceae Algae Extract (Mill Extract Liquid)
  • Mill Extract Liquid As a raw material, alga bodies of Codium fragile were used. This raw material was purchased from a grower as fresh seaweed that was not dried. The purchased raw seaweed was dried and pulverized by a predetermined method and used as a raw material. Add 10 times the amount of Dulbecco's phosphate-buffered saline (pH 7.3, D5652, Sigma-Aldrich, Ca- and Mg-free, hereinafter referred to as "PBS") to 50 g of the raw material, and allow to stand at room temperature for 30 minutes. and mill extract was prepared.
  • PBS Dulbecco's phosphate-buffered saline
  • the extract was centrifuged at 37000 ⁇ g for 15 minutes and the supernatant was collected.
  • the protein concentration of the extract was measured using a BCA protein assay kit (Thermo Fisher Scientific Co.).
  • a 2-fold dilution series of the extract was prepared with PBS, and subjected to an experiment to evaluate the effect on adhesion and growth of Streptococcus mutans.
  • Example 2 Fractionation of mill extract 10 mL of the mill extract prepared in Example 1 was sequentially treated with Vivaspin 20 (manufactured by Sartorius) having molecular weight cutoffs of 50 k, 30 k, and 5 k, respectively. Four fractions of ⁇ 30,000, ⁇ 30,000 and ⁇ 50,000, and ⁇ 50,000 were obtained. The protein concentration of these four fractions was measured using a BCA protein assay kit (Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.), diluted with PBS to a predetermined concentration, and subjected to the following bacterial adsorption test. rice field.
  • Vivaspin 20 manufactured by Sartorius
  • Example 1 The protein concentration of the mill extract prepared in Example 1 was 765 ⁇ g/mL. This was diluted with PBS to a concentration of 1% and used in the following tests. Each antimicrobial agent used in this study was prepared at twice the test concentration because it was mixed 1:1 with mill extract, its predetermined molecular weight fraction, or PBS.
  • the CPC solution was prepared by dissolving 0.2 g of CPC in 10 mL of ethanol solution to prepare a storage solution (2% CPC). This was diluted 20-fold with purified water to prepare a 0.1% CPC (5% ethanol) solution. This was further diluted with a 5% ethanol solution to prepare 0.05% CPC (5% ethanol) and 0.02% CPC (5% ethanol), respectively.
  • the benzalkonium chloride solution was prepared by dissolving 0.2 g of benzalkonium chloride in 10 mL of ethanol solution to prepare a storage solution (2% benzalkonium chloride). This was diluted 5-fold with ethanol to prepare an ethanol solution of 0.4% benzalkonium chloride solution. This was further diluted 20-fold with purified water to prepare 0.02% benzalkonium chloride (5% ethanol). This was further diluted 2-fold with a 5% ethanol solution to give a 0.01% benzalkonium chloride (5% ethanol) solution, and further diluted 2-fold with 5% ethanol to give a 0.005% benzalkonium chloride (5% ethanol) solution. ) becomes a solution.
  • chlorhexidine solution a 20% aqueous solution was used as the stock solution, diluted 20-fold with ethanol and purified water to obtain a 0.1% chlorhexidine (5% ethanol) solution. Further dilute this 5-fold with a 5% ethanol solution to obtain a 0.02% chlorhexidine (5% ethanol) solution, which is further diluted 10-fold with 5% ethanol to prepare a 0.002% chlorhexidine (5% ethanol) solution. did.
  • IPMP solution was prepared by dissolving 0.4 g of IPMP in 10 mL of ethanol solution to prepare a storage solution (4% IPMP). This was diluted 20-fold with ethanol and purified water to obtain a 0.2% IPMP (20% ethanol) solution. This was further diluted twice with 20% ethanol to prepare a 0.1% IPMP (20% ethanol) solution, and further diluted with 20% ethanol to prepare a 0.04% IPMP (20% ethanol) solution.
  • Saliva was collected 2 hours or more after brushing teeth. Stimulated saliva secreted by chewing Parafilm was collected and centrifuged at 4° C. and 2000 ⁇ g for 30 minutes. The supernatant was suction-filtered through a cellulose mixed ester (0.1 ⁇ m, 90 mm) membrane filter, and the saliva was diluted to an appropriate concentration using PBS.
  • the bacterial solution was discarded from each well of this plate, washed twice with 300 ⁇ L of PBS, and fixed with 100 ⁇ L of 0.25% glutaraldehyde solution at room temperature for 30 minutes. Thereafter, the liquid was discarded, 100 ⁇ L of 0.1% crystal violet solution was added to each well, and the plate was allowed to stand at room temperature for 30 minutes.
  • the staining solution was aspirated and discarded with a pipette, and the plate was thoroughly washed with purified water and dried in a constant temperature bath at 37°C. 100 ⁇ L of 30% acetic acid solution was added to each well, and the dye was eluted using a plate shaker. To quantify the number of cells, the dye concentration in the 30% acetic acid solution in each well was measured at an absorption wavelength of 570 nm using a plate reader.
  • FIG. 1 is a graph showing the inhibitory effect of mill extract (ML), cetylpyridinium chloride (CPC) and a mixture thereof (CPC+ML) on adhesion of Streptococcus mutans to saliva-coated substrates.
  • the adhesion rate in the graph is shown as an average value of five repeated measurements under the same conditions. The smaller the adhesion rate, the more suppressed the adhesion of Streptococcus mutans.
  • Cont. Groups are shown for samples containing PBS only.
  • the BSA group on the horizontal axis is a group to which 100 ⁇ g/mL bovine serum albumin (BSA) was added as a positive control.
  • BSA bovine serum albumin
  • FIG. 1 Cont.
  • Table 1 shows the numerical values (adhesion rate) of each group shown in FIG.
  • FIG. 2 shows similar test results when using benzalkonium chloride instead of CPC as the antibacterial component.
  • Cont The relative value of each sample when the group is set to 100 is shown.
  • Table 2 shows the numerical values (adhesion rate) of each group shown in FIG.
  • FIG. 3 shows similar test results when using chlorhexidine instead of CPC or benzalkonium chloride as the antibacterial component.
  • Cont The relative value of each sample when the group is set to 100 is shown.
  • Table 3 shows the numerical values (adhesion rate) of each group shown in FIG.
  • FIG. 4 shows similar test results when IPMP was used instead of each of the above antibacterial agents.
  • Cont. The relative value of each sample when the group is set to 100 is shown.
  • Table 4 shows the numerical values (adhesion rate) of each group shown in FIG.
  • FIG. 5 shows four fractions of the mill extract (unfractionated extract) of Example 1 and the mill extract subjected to molecular weight fractionation in Example 2 (molecular weight less than 5000, 5000 or more and less than 30000, 30000 or more 50000 or less and 50000 or more), the results of a bacterial adsorption test performed under the same conditions as above using samples with a protein concentration of 10 ⁇ g/mL are shown.
  • ** indicates data showing a significant difference (p ⁇ 0.01) from the control by Student's T-test.
  • Table 5 shows the numerical values (adhesion rate) of each group shown in FIG.
  • a group of mill extracts (no fractionation) of Example 1 As shown in FIG. 5 and Table 5, a group of mill extracts (no fractionation) of Example 1, a group of mill extract fractions with a molecular weight of 50000 or more (50 k or more), and a mill extract with a molecular weight of 5000 or more and less than 30000 It was confirmed that the adherence rate of fungi decreased in the liquid fraction group. Therefore, in the experiment according to FIG. 5 and Table 5, the three groups of mill extract fractions (molecular weight less than 5000, 5000 or more and less than 30000, and 30000 or more and less than 50000) for which a decrease in the adhesion rate was not confirmed, the protein concentration was raised for further analysis.
  • a bacteria adsorption test was performed using a higher concentration sample (diluted from a protein concentration of 50 ⁇ g/mL in a 2-fold dilution series) to confirm concentration dependence.
  • the results of this test are shown in FIG. 6 and Table 6.
  • Table 6 shows the numerical values (adhesion rate) of each group shown in FIG.
  • Test Example 2 Bacteria adsorption test Furthermore, using the mill extract of Example 1 and a commercially available mouthwash, a bacteria adsorption test was performed in the same manner as in Test Example 1 above, and the mill extract and the mouthwash were tested. We confirmed the effect of the combined use of The mill extract from Example 1 was added to a final concentration of 1.0%. In Test Example 2, gum dental rinse (regular type, Sunstar) was used as a commercially available mouthwash. Ingredients contained in the mouthwash are described below.
  • Solvent Concentrated glycerin, ethanol / Flavor: Fragrance (herb mint type), saccharin Na / Solubilizer: POE hydrogenated castor oil / Medicinal ingredients: Cetylpyridinium chloride (bactericide CPC), glycyrrhizic acid 2K (anti-inflammatory agent GK2) , benzalkonium chloride (bactericide BKC) / pH adjuster: sodium citrate, anhydrous citric acid / cleaning aid: coconut oil fatty acid acyl arginine ethyl DL-PCA salt
  • Example 1 10 mL of the mill extract prepared in Example 1 above was prepared to prepare the following three samples.
  • ⁇ Myrraceae algae extract containing proteins with molecular weights of 5000 or more and less than 30000 extracts containing no proteins with molecular weights other than 5000 or more and less than 30000, hereinafter referred to as "5000 or more and less than 30000 ML”
  • ⁇ Myrraceae algae extract containing proteins with a molecular weight of 30,000 or more and less than 50,000 extracts containing no proteins with a molecular weight other than 30,000 or more and less than 50,000, hereinafter referred to as "30,000 or more and less than 50,000 ML”
  • ⁇ Myrraceae algae extract containing protein with a molecular weight of 50,000 or more extract containing no protein with a molecular weight other than 50,000 or more, hereinafter referred to as "50,000 or more ML”
  • Example 1 10 mL of the mill extract prepared in Example 1 was sequentially treated with Vivaspin 20 (manufactured by Sartorius) having a molecular weight cutoff of 50 k, 30 k, and 5 k, respectively, to obtain 5000 or more and less than 30,000 ML, 30,000 or more and less than 50,000 ML, 50,000 or more ML, Three fractions were obtained.
  • Vivaspin 20 manufactured by Sartorius
  • a given CPC solution was prepared as follows. First, 0.2 g of CPC was dissolved in 10 mL of ethanol solution to prepare a stock solution (2% CPC). This stock solution was diluted 20-fold with purified water to prepare a 0.1% CPC (5% ethanol) solution. This was further diluted with a 5% ethanol solution to prepare 0.05% CPC (5% ethanol), 0.025% CPC (5% ethanol), and 0.0125% CPC (5% ethanol), respectively.
  • Saliva (approximately 2 mL) was collected from a healthy human in his thirties (1 male) by a predetermined method. The collected saliva was centrifuged (2000 ⁇ g, 10 minutes, 25° C. (room temperature)). After the centrifugation, the supernatant was collected. The supernatant was added to 30 mL of Todd Hewitt Broth (Becton, Dickinson and Company, 249240) and incubated at 37° C. for 16 hours. The turbidity (OD660 nm) of the culture solution after this cultivation was measured, and this culture solution was diluted with PBS so that the turbidity was 0.125. The diluted solution (oral bacterial culture solution) was used for the test.
  • Halitosis is defined as "the offensive odor of gases exhaled through the mouth or nose that exceeds socially acceptable limits". Most of the bad breath (80% or more) is considered to be derived from gas in the oral cavity, and the main causative substance is hydrogen sulfide (H 2 S), which is a volatile sulfur compound (VSC). It is considered to be methyl mercaptan (CH 3 SH) and dimethyl sulfide [(CH 3 ) 2 S] (Ministry of Health, Labor and Welfare e-Healthnet, Causes and actual conditions of bad breath, URL: https://www.e-healthnet. mhlw.go.jp/information/teeth/h-07-001.html). Therefore, in this Test Example 3, by measuring the VSC concentration, the effect of suppressing halitosis by a predetermined mill extract or the like was confirmed.
  • Test 3-1 After preparing samples for each group as shown in Table 9, the groups of Test 3-1, Test 3-2, and Test 3-3 were each left at 25°C (room temperature) for 10 minutes.
  • VSC concentration contained in each group was measured three times with a halimator (RH17K, Taiyo), and the average value was calculated. An average value of the obtained results (numerical values) was calculated. Table 10 shows the calculated results.
  • Test 3-1 group In the calculation results, the relative value compared to the 3-1 control group is shown, and "*" is Student's T test compared to the 3-1 control group "p ⁇ 0.05" indicates ⁇ Test 3-2 group: In the calculation results, the relative value compared to the 3-2 control group is shown, and "**" is Student's T test compared to the 3-2 control group "p ⁇ 0.05 ” is shown.
  • Test 3-3 group In the calculation results, the relative value compared to the 3-3 control group is shown, and "***" indicates "p ⁇ 0. 05”.
  • ⁇ Test method> First, the following reagents are listed. - Apatite particles: Bio RAD CHT Ceramic Hydroxyapatite Type I (80 ⁇ m), Cat. #158-8000, Lot. M401076 ⁇ Coffee: commercially available canned coffee, craft boss black (Suntory Foods Co., Ltd.) ⁇ Measuring instrument for color difference measurement: CR-400, Konica Minolta, color difference meter ⁇ Saliva added in the following test process (solution of saliva 1): Prepared as follows. The saliva of a healthy adult human male (30s) was used. Two hours or more after brushing the teeth, saliva was collected with paraffin gum stimulation.
  • the collected saliva was centrifuged (4° C., 2000 g, 30 min) to collect the supernatant.
  • the supernatant was diluted with PBS to prepare a diluted solution.
  • the diluted solution was filtered through a cellulose mixed ester (0.1 ⁇ m, 90 mm) membrane filter.
  • the diluted solution after the filtration was used as saliva to be added in the following test steps.
  • the collected saliva was centrifuged (2000 ⁇ g, 10 minutes, 25° C. (room temperature)). After the centrifugation, the supernatant was collected.
  • apatite particles 100 mg were weighed into a 1.5 mL tube. 1 mL of PBS was added to the tube containing the particles and stirred at 25° C. with a vortex mixer. After the stirring, the tube was spun down and the supernatant was discarded. After discarding, 1 mL of saliva was added to the tube and stirred at 25° C. with a vortex mixer. After the stirring, the mixture was allowed to stand at 37°C for 1 hour. After standing and spinning down, the supernatant was discarded from the tube. The particles in the tubes were rinsed twice (vortex, spin down, discard supernatant) by adding 1 mL of PBS to each tube.
  • the particles in the tubes were rinsed twice by adding 1 mL of PBS to each tube (rinsing in the process of vortexing, spinning down, and discarding the supernatant).
  • the particles were transferred from the tube to a Petri dish for each group. After transferring to the petri dish, the particles were dried at 50° C. for 2 hours. After drying, each group was subjected to color difference measurement using the measuring instrument. The background color during color measurement was white, and the particles were placed on a standard white board for measurement. The colorimetric value obtained by measuring the color of the particles before adding the coffee was used as the reference value.
  • the L * a * b * color system (CIE1976 L * a * b * uniform color space) was used for color specification.
  • the L * value represents the brightness, and ranges from 0 to 100, and the larger the value, the brighter the image.
  • Color is represented by a * b * , and when both a * b * are 0, the color is achromatic.
  • the more positive a * the more reddish, the more negative a*, the more greenish, the more positive b * , the more yellowish, and the more negative b*, the more bluish.
  • the value of ⁇ E* (Delta E Star), which is used to express the difference between colors, is obtained by calculating how far the straight line distance between two colors is in this color space. .
  • Table 12 lists the mean values calculated from the values measured three times in each group. "*" in Table 12 indicates “p ⁇ 0.01" compared to group 4-3 by Student's T-test. In the "oral bacterial culture”, group 4-2 (group to which mill extract or the like was added) showed better results (especially L * value (brightness) results) than group 4-3. rice field.
  • Toothpaste containing the mill extract prepared in Example 1 of Formulation Examples 1 to 3 listed in Table 13 below was prepared.
  • Comparative Example 1 a toothpaste not containing the mill extract shown in Table 13 below was prepared. Toothbrushing was performed using the toothpastes of Formulation Examples 1 to 3 and Comparative Example 1 shown in Table 13 to confirm the effect.
  • a mouthwash containing the mill extract prepared in Example 1 of Formulation Examples 4 to 6 listed in Table 14 below was prepared.
  • Comparative Example 2 a mouthwash not containing the mill extract shown in Table 14 below was prepared. Mouthwashes were performed using the mouthrinses of Formulation Examples 4 to 6 and Comparative Examples shown in Table 14 to confirm the effect.
  • composition of the present invention may be used as oral care cosmetics, quasi-drugs, and the like.

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Abstract

【課題】抗菌成分を用いることなしに又は抗菌成分の濃度を薄くして、口腔に浮遊する細菌の歯への付着を抑制しうる口腔ケア製品及びこのような製品に含有される素材などを生み出す。 【解決手段】ミル科藻類抽出物を含有し、このミル科藻類抽出物に含まれる分子量５０００以上のタンパク質画分を有効成分として含有する口腔ケア用組成物。

Description

口腔ケア用組成物 クロスリファレンス
　本出願は、日本国において、２０２１年２月１２日に出願された特願２０２１－２０８７６及び２０２１年８月３１日に出願された特願２０２１－１４０９９７号に基づく優先権を主張するものであり、当該出願に記載された内容は全て、参照によりそのまま本明細書に援用される。また、本願において引用した全ての特許、特許出願及び文献に記載された内容は全て、参照によりそのまま本明細書に援用される。
　本発明は、ミル科藻類抽出物から得られる特定の分子量を有するタンパク質画分を有効成分として含有する口腔ケア用組成物などに関する。
　歯周病は、口腔内の病原性細菌の１種である歯周病原因菌が口腔内に定着することにより始まる炎症性疾患である。口腔清掃が不十分であると歯垢（口腔細菌とその代謝物）が歯肉と歯の境目に付着後、定着し、増殖する。この異物に反応して好中球やマクロファージが浸潤し、炎症が起こる。早めの段階でブラッシング等により口腔清掃ができればこの炎症は改善される。しかし、歯垢が蓄積した状態を放置すると炎症は拡大し、歯周ポケットが形成されると、そこに蓄積された歯垢はブラッシング等では除去し難くなる。そのため、歯周病の予防・改善に有効な手段として歯垢の抑制、即ち、口腔内の病原性細菌を殺菌・静菌することが有用であると言われている。
　近年、歯垢はバイオフィルムとして捉えられ、口腔バイオフィルム（歯垢）中の細菌は、浮遊性細菌と比較すると細菌のタンパク質発現パターンや薬剤耐性が大きく異なり、浮遊性細菌に有効であった薬剤がバイオフィルム構成細菌に対して有効でないことが明らかになってきた。
　これまでに殺菌手段として数多くの抗菌剤、例えば塩化セチルピリジニウム、塩化ベンゼトニウム、クロルヘキシジン等のカチオン性抗菌剤や、トリクロサン等の非イオン性抗菌剤が、口腔用組成物に配合され有効であることが知られている。しかしながら、これら抗菌剤は、バイオフィルム細菌の薬剤耐性メカニズムにより、これだけでは十分なバイオフィルム抑制効果が得られない。これら抗菌剤の殺菌力を向上させるべく、他の成分との併用による改善技術が提案されているが、いずれもバイオフィルムへの薬剤浸透性の低さなどにより顕著な効果が得られていない。
　これに対し、特許文献１には、Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃ及びＧｌｃＮＡｃの末端構造を有する糖鎖を認識する、マッシュルーム由来のレクチンＡＢＡ等には、口腔内のプラーク又はバイオフィルムに対する口腔内細菌の付着及び増殖を抑制する効果があることが開示されている。また、ミル科藻類の藻体抽出物中に含まれ、ＧａｌＮＡｃと競合する糖鎖に結合するレクチンが口腔内細菌、特に、ミュータンス菌の付着と増殖を抑制して虫歯を予防しうることが報告されている（例えば、特許文献２参照）。
特許第５５５８３６２号公報 特許第５９２５４３１号公報
Dental Medicine Research 30（1）：9-14，2010 昭歯誌 22：214-219,2002
　マウスウォッシュなど口腔ケア用製品に抗菌成分が含有される口腔ケア用製品を使用する場合、例えば、下痢などの副作用が生じる可能性があり、これらの副作用は通常抗菌薬の服用を中止すると消失するものである。加えて、抗菌成分は元々体内に定着している病原性のない細菌を減少させ、他の病原体が感染する機会を与える可能性もある。さらに、抗菌成分に耐性のある細菌が発生することも懸念されるため、抗菌成分を用いることの代わり（抗菌成分の含有量を低くすることも含め）となるような口腔ケア用製品及びこのような製品に含有させ得る素材を提供することが強く望まれている。
　本発明が解決しようとする課題は、抗菌成分を用いることなしに又は抗菌成分の濃度を低くして、口腔内に浮遊する細菌の歯への付着などを抑制しうる口腔ケア用製品及び口腔ケア用製品に含有される素材を生み出すことなどである。
　本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、例えば、ミル科藻類抽出物に含まれる特定の分子量を有するタンパク質画分を含有する口腔ケア用製品、当該製品に含有させる素材（口腔ケア用素材）、などである。
　すなわち、本発明は以下の実施形態を含む。
［１］ミル科藻類抽出物を有効成分として含有する口腔ケア用組成物。ミル科藻類抽出物に含まれる分子量５０００以上のタンパク質画分を有効成分として含有する口腔ケア用組成物。このタンパク質画分は、分子量が５０００以上で５００００未満であることが好ましく、当該分子量が５０００以上で３００００未満であることがさらに好ましい。あるいは、分子量が５００００以上の高分子画分に存在するタンパク質であってもよい。
［２］さらに抗菌成分を含む［１］に記載の口腔ケア用組成物。
［３］抗菌成分が、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）、クロルヘキシジン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化デカリウム、グルコン酸クロルヘキシジン、プロタミン、ドデシルジアミノエチルグリシン、トリクロサン、３－メチル－４－イソプロピルメチルフェノール（ＩＰＭＰ）、チモール、カルバクロール、ファルネソール、ビサボロール、シネオール、ヒノキチオール、ラウロイルサルコシンナトリウム、ｌ－メントールからなる群から選ばれる１種又は２種以上である、［１］又は［２］に記載の口腔ケア用組成物。
［４］有効成分が、ミル科藻類抽出物換算で組成物の全量に対して０．００１～５質量％含有される［１］から［３］のいずれかに記載の口腔ケア用組成物。
［５］抗菌成分が、組成物の全量に対して０．０００１～１質量％含有される［２］から［４］のいずれかに記載の口腔ケア用組成物。
　本発明の口腔ケア用組成物によれば、抗菌成分を用いることなしに又はその濃度を低くして、口腔内に浮遊する細菌の歯への付着を抑制することなどができる。
図１は、ミル抽出液（ＭＬ）、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）及びそれらの混合物（ＣＰＣ＋ＭＬ）についての菌吸着試験の結果を示す。 図２は、ミル抽出液（ＭＬ）、塩化ベンザルコニウム及びそれらの混合物（塩化ベンザルコニウム＋ＭＬ）についての菌吸着試験の結果を示す。 図３は、ミル抽出液（ＭＬ）、クロルヘキシジン及びそれらの混合物（クロルヘキシジン＋ＭＬ）についての菌吸着試験の結果を示す。 図４は、ミル抽出液（ＭＬ）、ＩＰＭＰ及びそれらの混合物（ＩＰＭＰ＋ＭＬ）についての菌吸着試験の結果を示す。 図５は、実施例２で分子量分画した４つの画分（分子量５００００以上、３００００以上５００００未満、５０００以上３００００未満及び５０００未満）についての菌吸着試験の結果を示す。 図６は、実施例２で分子量分画した３つの画分（分子量５０００未満、５０００以上３００００未満及び３００００以上５００００未満）についての菌吸着試験の結果を示す。 図７は、実施例２で分子量分画した４つの画分（分子量５００００以上、３００００以上５００００未満、５０００以上３００００未満及び５０００未満）について、抗菌剤としてＣＰＣを添加した場合の菌吸着試験の結果を示す。 図８は、ミル抽出液及び市販の洗口液を用いた菌吸着試験により、ミル抽出液と当該洗口液との併用効果などを調べた結果を示す。
　次に、本発明の実施形態について、図面を参照して説明する。なお、以下に説明する各実施形態は、特許請求の範囲に係る発明を限定するものではなく、また、各実施形態の中で説明されている諸要素及びその組み合わせの全てが本発明の解決手段に必須であるとは限らない。
（口腔ケア用組成物）
　本明細書において、「口腔ケア用組成物」は、例えば以下である。
・通常の使用方法において、特定の治療剤の全身投与を目的として意図的に飲み込むのではなく、むしろ、口腔内活動の目的で実質的にすべての歯面及び／又は口腔組織に接触するのに十分な時間、口腔内に保持される製品（口腔ケア用製品）。
・当該製品に含有される素材。当該素材に、ミル科藻類抽出物が含有される。
　口腔ケア用製品は、マウスウォッシュ、口内洗浄剤、歯磨き剤、練り歯磨き、ジェル、又は溶液などの形態であってもよい。口腔ケア用製品はまた、口腔表面への直接塗布若しくは付着のためのフロス、ストリップ、又はフィルムに組み込まれてもよく、又は歯ブラシ若しくは回転塗布剤などのデバイス若しくはアプリケータに組み込まれてもよい。かかるアプリケータは、使い捨て又は複数回使用用であってもよい。
　本発明の１つの実施形態における口腔ケア用組成物は、ミル科藻類抽出物又はそれに含まれる分子量５０００以上のタンパク質画分を有効成分として含有する。以下、その詳細について説明する。
（ミル科藻類抽出物）
　本発明の一実施形態で用いられるミル科藻類抽出物（以下、「本実施形態の抽出物」と称する。）は、緑藻綱（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｅ）、ミル目（Ｃｏｄｉａｌｅｓ、最近の分類ではハネモ目（Ｂｒｙｏｐｓｉｄａｌｅｓとされる場合がある。）のミル科（Ｃｏｄｉａｃｅａｅ）に属する藻類から抽出されたものである。この藻類は、ミル（Ｃｏｄｉｕｍ　ｆｒａｇｉｌｅ）、イセモミル（Ｃｏｄｉｕｍ　ｔｏｍｅｎｔｏｓｕｍ）、タマミル（Ｃｏｄｉｕｍ　ｍｉｎｕｓ）、コブシミル（Ｃｏｄｉｕｍ　ｓｐｏｎｇｉｏｓｕｍ）、クロミル（Ｃｏｄｉｕｍ　ｓｕｂｔｕｂｕｌｏｓｕｍ）、モツレミル（Ｃｏｄｉｕｍ　ｉｎｔｒｉｃａｔｕｍ）、ハイミル（Ｃｏｄｉｕｍ　ａｄｈａｅｒｅｎｓ）、ナンバンハイミル（Ｃｏｄｉｕｍ　ａｒａｂｉｃｕｍ）、ネザシミル（Ｃｏｄｉｕｍ　ｃｏａｃｔｕｍ）、ヒゲミル（Ｃｏｄｉｕｍ　ｂａｒｂａｔｕｍ）、サキブトミル（Ｃｏｄｉｕｍ　ｃｏｎｔｒａｃｔｕｍ）、ヒラミル（Ｃｏｄｉｕｍ　ｌａｔｕｍ）及びナガミル（Ｃｏｄｉｕｍ　ｃｙｌｉｎｄｒｉｃｕｍ）を含むが、これらに限られない、ミル属（Ｃｏｄｉｕｍ）の生物種に属する場合がある。
　本実施形態の抽出物を回収する方法は、口腔細菌と唾液の生体高分子との結合を抑制又は阻害する活性を実質的に損なわないことを条件として、いかなる方法であってもかまわない。
　本実施形態の抽出物は、藻体のいかなる組織から採取されてもかまわない。藻体は、洗浄後、ホモジナイザー等で破砕された後か、あるいは凍結乾燥で粉末状にされるか、粉砕機で粉末状にされた後に抽出処理を施される場合がある。抽出に用いる水溶液には、生理食塩水のようにＮａＣｌその他の塩類を含む水溶液と、アセトンその他の水溶性有機溶媒及び／又はアルコールと水との混合液と、精製水又は脱イオン水とを含むが、これらに限定されない、その他の当業者に周知の水性溶媒を用いることができる。ここで、アルコールは、エタノール、エチレングリコール、ブチレングリコール、グリセリンを含むが、これらに限定されない。水性溶媒は酸性又はアルカリ性のｐＨを有する場合がある。水性溶媒のｐＨを調整するためには、アジピン酸、クエン酸、グルコン酸、コハク酸、酢酸、酒石酸、乳酸、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸塩類のカリウム又はナトリウム塩を含むが、これらに限られない。またｐＨを一定に保つために、トリス塩酸バッファー、Ｈｅｐｅｓバッファー、リン酸バッファー、酢酸バッファー、クエン酸バッファー、グリシン－塩酸バッファーを含むが、これらに限られない。抽出方法は、浸漬抽出方法、加圧抽出方法、超臨界又は亜超臨界抽出方法などから適宜選択するか又はこれらを組み合わせて用いることができる。抽出条件は、口腔細菌と唾液の生体高分子との結合を抑制又は阻害する活性を実質的に損なわないことを条件として、いかなる条件であってもかまわないが、抽出時間は１０分間から２４時間が好ましく、抽出温度は、４℃以上であってもよく、室温以上であることが好ましく、１５℃以上であることがより好ましい。
（有効成分）
　続いて、上記本実施形態の抽出物をそのままで、あるいは精製若しくは濃縮することにより、口腔ケア用組成物としての有効成分を得ることができる。好ましい実施形態において、この有効成分は、分子量５０００以上のタンパク質画分中に存在する。より好ましくは分子量５０００以上５００００未満の画分、さらに好ましくは分子量５０００以上３００００未満の画分、である。
　ミル科藻類抽出物の精製及び濃縮は、遠心分離、塩析、透析、減圧濃縮、限外濾過、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等を含むが、これらに限られない技術を、単独で、あるいは、いずれか２種以上を組み合わせて行うことができる。精製又は濃縮後は、必要に応じて、藻類抽出物を減圧乾燥してもかまわないし、溶媒で希釈して用いてもかまわない。
　本発明の有効成分の候補の１つは、例えば、ＧａｌＮＡｃと競合する糖鎖に結合するレクチンである、とも考えられる（特許文献２参照）。しかし、この有効成分は、末端にＧａｌＮＡｃを有する全ての糖鎖と結合するとは限らない。また、末端から２番目ないし３番目の糖残基が特定の構造の糖鎖とだけ結合するが、ＧａｌＮＡｃ存在下では結合が阻害される可能性がある。
　本明細書においてレクチンとは、動物の免疫系に関与する抗体、Ｔ細胞レセプター、Ｔｏｌｌ様受容体その他の免疫タンパク質以外のタンパク質であって、糖鎖に特異的に結合する能力を有するタンパク質をいう。通常、レクチンは赤血球その他の動物細胞を凝集することができる。堀貫治（化学と生物、３２：５８６－５９４、（１９９４））によると、ミル科藻類由来のレクチンはＧａｌＮａｃと競合する糖鎖に結合するという共通点がある。
　いかなる理論にも拘束されないが、本発明の有効成分は、唾液の生体高分子に含まれる多糖類によって形成される膜の表面に存在するＧａｌＮＡｃに結合し、これに対する口腔細菌の付着を阻害すると考えられる。
　本発明の有効成分は、口腔細菌と唾液の生体高分子との結合を抑制又は阻害する活性を実質的に損なわないことを条件として、いかなる濃度であってもかまわないが、好ましくはミル科藻類抽出物換算で上記口腔ケア用組成物の全量に対して、０．００１質量％以上が好ましく、０．０１質量％以上がより好ましく、０．１質量％以上がさらに好ましい。また、その上限は、５質量％以下であり、４質量％以下が好ましく、３質量％以下がさらに好ましく、２質量％以下がさらになお好ましい。
　本発明の有効成分に含まれるタンパク質濃度は、口腔細菌と唾液の生体高分子との結合を抑制又は阻害する活性を実質的に損なわないことを条件として、いかなる濃度であってもかまわないが、０．５μｇ／ｍＬ以上が好ましく、５μｇ／ｍＬ以上がより好ましい。
（抗菌成分）
　本実施形態の口腔ケア用組成物は所定量の抗菌成分を含むことが好ましい。抗菌成分は、抗菌作用のある成分である。抗菌作用は、例えば、滅菌作用、殺菌作用、消毒作用、静菌作用、制菌作用、除菌作用、防腐作用、防菌作用、防カビ作用である。抗菌剤は、抗菌成分が含有される剤である。抗菌剤としては、例えば、殺菌剤、抗菌剤、防カビ剤、抗カビ剤、防腐剤、消臭剤、殺虫剤が挙げられ、中でも、殺菌剤、抗菌剤、防カビ剤、抗カビ剤等の微生物制御剤や消臭剤を好適に用いることができる。本実施形態の口腔ケア用組成物に含有される抗菌成分としては、上記の作用を有する公知の化合物を適宜選択して使用すればよい。
　公知の抗菌剤としては、例えば、有機合成系抗菌剤、天然物系抗菌剤、無機物系抗菌剤などが挙げられる。当該抗菌剤に含有される抗菌成分は、例えば、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）、クロルヘキシジン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化デカリウム、グルコン酸クロルヘキシジン、プロタミン、ドデシルジアミノエチルグリシン、トリクロサン、３－メチル－４－イソプロピルメチルフェノール（ＩＰＭＰ）、チモール、カルバクロール、ファルネソール、ビサボロール、シネオール、ヒノキチオール、ラウロイルサルコシンナトリウム、ｌ－メントールなど、である。これらの抗菌剤は１種単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。また、これら抗菌成分の使用濃度は、使用目的と抗菌活性を考慮して、抗菌成分ごとに適宜決定されるが、例えばカチオン系抗菌剤の場合は０．００００１～０．５質量％の範囲で、好ましくは０．０００１～０．０１質量％の範囲で用いることが出来る。酸性抗菌剤を用いる場合は０．０１～０．５質量％の範囲で用いられる。炭素数５～６のポリオールの場合は０．１～５．０質量％の範囲が好ましく、１．０～４．０質量％がより好ましい。
　薬用歯みがき類に関する効能又は効果をうたう口腔用の外用剤についての製造販売承認基準（薬食発０３２５第３７号、平成２７年３月２５日、厚生労働省医薬食品局長）には、効能又は効果ごとに、使用できる有効成分の種類、規格及び分量が規定されている。例えば、歯周炎（歯槽膿漏）の予防に使用できる抗菌成分として、塩酸クロルヘキシジンの配合濃度は０．００１～０．０５質量％であることが記載されている。また、歯肉炎の予防に使用できる抗菌成分としては、塩化セチルピリジニウムの配合濃度は０．０１～０．０５成分％であり、塩化ベンザルコニウムの配合濃度は０．０１成分％であり、イソプロピルメチルフェノールの配合濃度は０．０２～０．１成分％であることが記載されている（製造販売承認基準（薬食発０３２５第３７号、平成２７年３月２５日、厚生労働省医薬食品局長）別表１参照）。本実施形態の口腔ケア用組成物は、これらの抗菌剤について記載された所定の規格及び分量にて含むことにより、口腔細菌と唾液の生体高分子との結合を抑制又は阻害する作用が増強されるとともに、口腔細菌に対する殺菌又は静菌作用も同時に発揮することが可能となる。あるいは、ここに記載された分量（濃度）以下の低減された配合量にて上記抗菌剤を含んでもよい。この場合においても、抗菌剤の副作用を低減しながら、口腔細菌と唾液の生体高分子との結合を抑制又は阻害する作用を増強することが可能である。
　ミル科藻類抽出物と抗菌剤との相乗効果については、いかなる理論にも拘束されるものではないが、イオン性の抗菌剤の方が非イオン性の抗菌剤よりも相乗効果が大きいことから、本発明の有効成分と抗菌剤とが何らかの形で複合体を形成しレクチン活性をより高めていると考えられる。
　あるいは、本発明の有効成分が唾液由来の生体高分子、特に、ガラクトースを末端に含む糖鎖と口腔内細菌との相互作用を阻害すると考えられるところ、抗菌成分が共存することによって口腔内細菌の細胞膜構造が変化し、膜表面に存在する、口腔内細菌由来のレクチン様物質の結合力が低下することによる可能性もある。
　いずれにしても、きわめて低濃度の抗菌成分存在下において、ミル科藻類抽出物が有する口腔細菌と唾液の生体高分子との結合抑制又は阻害活性が増強されることから、微生物が形成するバイオフィルムによって引き起こされる様々な問題を解決する手段として利用できる可能性がある。例えば、医療分野においては、カテーテルの表面に形成されたバイオフィルムが重篤な感染症を引き起こす原因になることが指摘されているが、ミル科藻類抽出物と抗菌成分とを含む組成物を用いて医療機器を処理することで、医療機器表面におけるバイオフィルムの生成を抑制することも可能である。
　次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。なお、以下の実施例において、各種成分の添加量を示す数値の単位％は、質量％（ｗ／ｖ％）を意味する。
［実施例１］ミル科藻類抽出物（ミル抽出液）の調製
　原料として、ミル（Ｃｏｄｉｕｍ　ｆｒａｇｉｌｅ）の藻体を用いた。この原料は、乾燥されない生の海藻を栽培業者から購入した。所定の方法で、当該購入した生の海藻を乾燥及び粉砕して、原料として用いた。原料５０ｇに１０倍量のＤｕｌｂｅｃｃｏリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．３、Ｄ５６５２、シグマアルドリッチ、Ｃａ及びＭｇを含まないもの、以下、「ＰＢＳ」という。）を添加し、室温で３０分間静置し、ミル抽出液を調製した。抽出液は、３７０００×ｇで１５分間遠心分離し、上清を採取した。抽出液のタンパク質濃度は、ＢＣＡプロテインアッセイキット（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を用いて測定した。抽出液のＰＢＳによる２倍希釈系列を調製し、ミュータンス菌の付着及び増殖に対する効果を評価する実験などに供した。
［実施例２］ミル抽出液の分画
　実施例１で調製したミル抽出液１０ｍＬを、それぞれ分画分子量５０ｋ、３０ｋ、及び５ｋのビバスピン２０（ザルトリウス製）で順に処理し、分子量５０００未満、５０００以上３００００未満、３００００以上５００００未満、及び５００００以上の４つの画分を得た。この４つの画分のタンパク質濃度をＢＣＡプロテインアッセイキット（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を用いて測定し、所定の濃度となるようにＰＢＳを用いて希釈し、以下の菌吸着試験などを行った。
［試験例１］菌吸着試験
＜菌液の調製＞
　ミュータンス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ（ＮＢＲＣ１３９５５））は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）から購入した。Ｔｏｄｄ－Ｈｅｗｉｔｔ　Ｂｒｏｔｈで３７℃、一晩（約１６時間）培養後、６６０ｎｍで測定した吸光度ＯＤ６６０が０．８～１．４になるまで増殖したものを用いた。測定された吸光度を基に、ＰＢＳでＯＤ６６０が０．１２５になるように希釈して以下の試験に用いる菌液を調製した。
＜評価サンプルの調製＞
　実施例１で調製したミル抽出液のタンパク質濃度は、７６５μｇ／ｍＬであった。これを１％の濃度となるようにＰＢＳで希釈し、以下の試験に用いた。
　本試験に用いた各抗菌剤は、ミル抽出液、その所定の分子量画分又はＰＢＳと１：１で混合されるため試験濃度の２倍の濃度で調製した。
　ＣＰＣ溶液は、１０ｍＬのエタノール溶液に０．２ｇのＣＰＣを溶解して保存液（２％ＣＰＣ）とした。これを精製水で２０倍希釈して０．１％ＣＰＣ（５％エタノール）溶液を調製した。これをさらに５％エタノール溶液で希釈して、それぞれ、０．０５％ＣＰＣ（５％エタノール）及び０．０２％ＣＰＣ（５％エタノール）を調製した。
　塩化ベンザルコニウム溶液は、１０ｍＬのエタノール溶液に０．２ｇの塩化ベンザルコニウムを溶解して保存液（２％塩化ベンザルコニウム）とした。これをエタノールで５倍希釈して０．４％塩化ベンザルコニウム溶液のエタノール溶液を調製した。これをさらに精製水で２０倍希釈して、０．０２％塩化ベンザルコニウム（５％エタノール）を調製した。これをさらに５％エタノール溶液で２倍希釈して０．０１％塩化ベンザルコニウム（５％エタノール）溶液とし、さらに５％エタノールで２倍希釈すると０．００５％塩化ベンザルコニウム（５％エタノール）溶液となる。
　クロルヘキシジン溶液は、２０％水溶液を原液として使用し、エタノールと精製水で２０倍希釈し、０．１％クロルヘキシジン（５％エタノール）溶液とした。これをさらに５％エタノール溶液で５倍希釈すると０．０２％クロルヘキシジン（５％エタノール）溶液となり、これをさらに５％エタノールで１０倍希釈して０．００２％クロルヘキシジン（５％エタノール）溶液を調製した。
　ＩＰＭＰ溶液は、１０ｍＬのエタノール溶液に０．４ｇのＩＰＭＰを溶解して保存液（４％ＩＰＭＰ）とした。これをエタノールと精製水で２０倍希釈して０．２％ＩＰＭＰ（２０％エタノール）溶液とした。これをさらに２０％エタノールで２倍希釈して０．１％ＩＰＭＰ（２０％エタノール）溶液とし、さらに２０％エタノールで希釈して０．０４％ＩＰＭＰ（２０％エタノール）溶液を調製した。
＜菌吸着試験＞
　歯磨き後２時間以上経過後の唾液を採取した。パラフィルムを咀嚼することによって分泌される刺激唾液を採取し、４℃、２０００×ｇで３０分間遠心分離した。セルロース混合エステル（０．１μｍ、９０ｍｍ）のメンブレンフィルターにて上清を吸引ろ過し、ＰＢＳを用いて適切な濃度に唾液を希釈した。
　９６ウェルのマルチプレート（ポリスチレン製、サーモフィッシャーサイエンティフィック製、マルチソープ）に上記のように調製したヒト唾液を１００μＬ添加し、プレートシールして３７℃で１時間インキュベートした。その後、各ウェルを３００μＬのＰＢＳで２回洗浄し、上述した各サンプル１００μＬを添加し、プレートシールして３７℃で１時間インキュベーションした。その後、各ウェルから液を廃棄し、３００μＬのＰＢＳで２回洗浄し、ＯＤ６６０が０．１２５になるように調製した菌液を各ウェルに１００μＬずつ添加した。プレートシールして３７℃で１６時間インキュベートした。このプレートの各ウェルから菌液を廃棄し、３００μＬのＰＢＳで２回洗浄し、０．２５％のグルタルアルデヒド溶液１００μＬ添加して室温で３０分間固定した。その後、液を廃棄し、０．１％のクリスタルバイオレット溶液を各ウェルに１００μＬずつ添加して室温で３０分間静置した。染色液をピペットで吸引廃棄し、精製水で十分に洗浄したプレートを３７℃の恒温槽で乾燥した。３０％酢酸溶液を各ウェルに１００μＬ添加し、プレートシェイカーを用いて染料溶出した。菌体数の定量は、プレートリーダーを用いて各ウェルの３０％酢酸溶液中の色素濃度を吸光波長５７０ｎｍで測定した。
　その結果を図１～図７に示す。図１は、唾液がコーティングされた基質へのミュータンス菌の付着に対するミル抽出液（ＭＬ）、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）及びそれらの混合物（ＣＰＣ＋ＭＬ）による抑制効果を示すグラフである。当該グラフの付着率を、同一条件ごとに５回繰り返した測定値の平均値として示す。当該付着率が小さいほどミュータンス菌の付着が抑制されたことを示す。Ｃｏｎｔ．群は、ＰＢＳのみを含むサンプルの測定結果て示したものである。横軸のＢＳＡ群は、陽性コントロールとして、１００μｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加した群である。図１では、Ｃｏｎｔ．群を１００としたときの各サンプルの相対値を示す。図１に示す各群の数値（付着率）を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　図１及び表１に示すように、Ｃｏｎｔ．群と比べ、ミル抽出液を１．０ｗ／ｖ％添加した群（ＭＬ）では、有意に（ＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定で、ｐ＜０．０１）付着率が低下した。また、図１及び表１に示すように、ミル抽出液を１．０ｗ／ｖ％添加した群（ＭＬ）と比べ、所定量のＣＰＣ及びミル抽出物を添加した群（ＣＰＣ０．０５０＋ＭＬ、ＣＰＣ０．０２５＋ＭＬ、ＣＰＣ０．０１０＋ＭＬ）では、有意に（ＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定で、ｐ＜０．０１）付着率が低下した。
　図２は、抗菌成分として、ＣＰＣの代わりに塩化ベンザルコニウムを用いた場合の同様の試験結果を示す。図２では、Ｃｏｎｔ．群を１００としたときの各サンプルの相対値を示す。図２に示す各群の数値（付着率）を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　図２及び表２に示すように、Ｃｏｎｔ．群と比べ、ミル抽出液を１．０ｗ／ｖ％添加した群（ＭＬ）では、有意に（ＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定で、ｐ＜０．０１）付着率が低下した。また、図２及び表２に示すように、ミル抽出液を１．０ｗ／ｖ％添加した群（ＭＬ）と比べ、所定量の塩化ベンザルコニウム及びミル抽出物を添加した群（塩化ベンザルコニウム０．０１０＋ＭＬ、塩化ベンザルコニウム０．００５＋ＭＬ、塩化ベンザルコニウム０．００３＋ＭＬ）では、有意に（ＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定で、ｐ＜０．０１）付着率が低下した。
　図３は、抗菌成分として、ＣＰＣ又は塩化ベンザルコニウムの代わりにクロルヘキシジンを用いた場合の同様の試験結果を示す。図３では、Ｃｏｎｔ．群を１００としたときの各サンプルの相対値を示す。図３に示す各群の数値（付着率）を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　図３及び表３に示すように、Ｃｏｎｔ．群と比べ、ミル抽出液を１．０ｗ／ｖ％添加した群（ＭＬ）では、有意に（ＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定で、ｐ＜０．０１）付着率が低下した。また、図３及び表３に示すように、ミル抽出液を１．０ｗ／ｖ％添加した群（ＭＬ）と比べ、所定量のクロルヘキシジン及びミル抽出物を添加した群（クロルヘキシジン０．０５０＋ＭＬ、クロルヘキシジン０．０２５＋ＭＬ、クロルヘキシジン０．０１０＋ＭＬ）では、有意に（ＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定で、ｐ＜０．０１）付着率が低下した。
　図４は、上記各抗菌剤の代わりにＩＰＭＰを用いた場合の同様の試験結果を示す。図４では、Ｃｏｎｔ．群を１００としたときの各サンプルの相対値を示す。図４に示す各群の数値（付着率）を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　図４及び表４に示すように、Ｃｏｎｔ．群と比べ、ミル抽出液を１．０ｗ／ｖ％添加した群（ＭＬ）では、有意に（ＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定で、ｐ＜０．０１）付着率が低下した。また、図４及び表４に示すように、ミル抽出液を１．０ｗ／ｖ％添加した群（ＭＬ）と比べ、所定量のＩＰＭＰ及びミル抽出物を添加した群（ＩＰＭＰ０．１００＋ＭＬ、ＩＰＭＰ０．０５０＋ＭＬ、ＩＰＭＰ０．０２０＋ＭＬ）では、有意に（ＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定で、ｐ＜０．０１）付着率が低下した。
　図５は、実施例１のミル抽出液（分画を行っていない抽出液）及び実施例２で分子量分画したミル抽出液の４つの画分（分子量５０００未満、５０００以上３００００未満、３００００以上５００００未満及び５００００以上）について、そのタンパク質濃度を１０μｇ／ｍＬとしたサンプルを用いて上記と同様の条件で行った菌吸着試験の結果を示す。図５において、ＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定で、Ｃｏｎｔｒｏｌに対して有意差（ｐ＜０．０１）が認められたデータを＊＊で示す。図５に示す各群の数値（付着率）を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　図５及び表５に示すように、実施例１のミル抽出液（分画無し）の群、分子量５００００以上（５０ｋ以上）のミル抽出液の画分の群及び分子量５０００以上３００００未満のミル抽出液の画分の群において菌の付着率が低下したことを確認した。そこで、図５及び表５に係る実験では当該付着率の低下が確認されなかった３つのミル抽出液の画分の群（分子量５０００未満、５０００以上３００００未満及び３００００以上５００００未満）について、タンパク質濃度を上げてさらに解析した。
　当該３つのミル抽出液の画分について、濃度依存性を確認するためにより高濃度のサンプル（タンパク質濃度５０μｇ／ｍＬから２倍希釈系列で希釈した）を用いて菌吸着試験を行った。この試験の結果を図６及び表６に示す。図６において、ＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定で、Ｃｏｎｔｒｏｌに対して有意差（ｐ＜０．０１）が認められたデータを＊＊で示す。図６に示す各群の数値（付着率）を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　図６及び表６に示すように、分子量５０００以上３００００未満のミル抽出液の画分の群においては、タンパク質の濃度依存的に、当該付着率の低下が確認された。
　更に、実施例１のミル抽出液（分画を行っていない抽出液）及び実施例２で分子量分画したミル抽出液の４つの画分（分子量５０００未満、５０００以上３００００未満、３００００以上５００００未満及び５００００以上）について、最終濃度が０．０５％となるようにＣＰＣ（抗菌成分）を添加して上記と同様の菌吸着試験を行った。実施例１のミル抽出液及び分画後のミル抽出液の各サンプルを、最終濃度１．５％となるように添加した。当該試験結果を図７及び表７に示す。図７において、ＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定で、Ｃｏｎｔｒｏｌに対して有意差（ｐ＜０．０１）が認められたデータを＊＊で示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　図７及び表７に示すように、少なくとも、分画なしの群、５ｋ以上３０ｋ未満の群及び３０ｋ以上５０ｋ未満の群において、Ｃｏｎｔｒｏｌ　群と比べ、付着率の低下が確認された。
［試験例２］菌吸着試験
　更に、実施例１のミル抽出液及び市販の洗口液を用いて、上述の試験例１と同じように菌吸着試験により、ミル抽出液と当該洗口液との併用した場合の効果などを確認した。実施例１のミル抽出液を最終濃度１．０％となるように添加した。この試験例２では、市販の洗口液として、ガム・デンタルリンス（レギュラータイプ、サンスター）を用いた。当該洗口液の含有成分を以下に記載する。
［当該洗口液の含有成分］
　溶剤：濃グリセリン、エタノール／香味剤：香料（ハーブミントタイプ）、サッカリンＮａ／可溶化剤：ＰＯＥ硬化ヒマシ油／薬用成分：塩化セチルピリジニウム（殺菌剤ＣＰＣ）、グリチルリチン酸２Ｋ（抗炎症剤ＧＫ２）、塩化ベンザルコニウム（殺菌剤ＢＫＣ）／ｐＨ調整剤：クエン酸Ｎａ、無水クエン酸／清掃助剤：ヤシ油脂肪酸アシルアルギニンエチル・ＤＬ－ＰＣＡ塩
　当該確認結果を図８及び表８に示す。図８において、ＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定で、Ｃｏｎｔｒｏｌに対して有意差（ｐ＜０．０１）が認められたデータを＊＊で示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　図８及び表８に示すように、少なくともミル抽出物を添加した群及びミル抽出液及び洗口液を添加した群では、Ｃｏｎｔｒｏｌに比べ、付着率の低下が確認された。
［試験例３］口臭抑制効果の確認
　所定のミル抽出液などによる当該効果の有無の確認を行った。以下試験方法などを記載する。
＜試験サンプルの準備＞
（所定のミル抽出液の準備）
　分子量５０００以上のタンパク質を含有するミル科藻類抽出物（分子量５０００未満のタンパク質は含有しない抽出物、以下「５０００以上ＭＬ」と記載）を作製するために、上述の実施例１で調製したミル抽出液１０ｍＬを準備した。分画分子量５ｋのビバスピン２０（ザルトリウス製）を用いて、５０００以上ＭＬを作製した。
　さらに、以下３つのサンプルを作製するために、上述の実施例１で調製したミル抽出液１０ｍＬを準備した。
　・分子量５０００以上３００００未満のタンパク質を含有するミル科藻類抽出物（分子量５０００以上３００００未満以外の分子量のタンパク質は含有しない抽出物、以下「５０００以上３００００未満ＭＬ」と記載）
　・分子量３００００以上５００００未満のタンパク質を含有するミル科藻類抽出物（分子量３００００以上５００００未満以外の分子量のタンパク質は含有しない抽出物、以下「３００００以上５００００未満ＭＬ」と記載）
　・分子量５００００以上のタンパク質を含有するミル科藻類抽出物（分子量５００００以上以外の分子量のタンパク質は含有しない抽出物、以下「５００００以上ＭＬ」と記載）
　実施例１で調製したミル抽出液１０ｍＬを、それぞれ分画分子量５０ｋ、３０ｋ、及び５ｋのビバスピン２０（ザルトリウス製）で順に処理し、５０００以上３００００未満ＭＬ、３００００以上５００００未満ＭＬ、５００００以上ＭＬ、という３つの画分を得た。
（所定のＣＰＣ溶液の準備）
　所定のＣＰＣ溶液を、次のように作製した。まず、１０ｍＬのエタノール溶液に０．２ｇのＣＰＣを溶解して保存液（２％ＣＰＣ）を作製した。この保存液を精製水で２０倍希釈して０．１％ＣＰＣ（５％エタノール）溶液を調製した。これをさらに５％エタノール溶液で希釈して、それぞれ、０．０５％ＣＰＣ（５％エタノール）、０．０２５％ＣＰＣ（５％エタノール）、０．０１２５％ＣＰＣ（５％エタノール）を調製した。
（ＶＳＣ濃度測定で用いる試料の作製（口腔細菌培養液の作製））
　所定の方法で３０代の健常なヒト（男性１名）の唾液（約２ｍＬ）を採取した。採取した唾液を遠心分離（２０００×ｇ、１０分間、２５℃（室温））した。当該遠心分離後、上清を回収した。当該上清を、Ｔｏｄｄ　Ｈｅｗｉｔｔ　Ｂｒｏｔｈ　（Ｂｅｃｔｏｎ，　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ、２４９２４０）を３０ｍＬに加え、３７℃で１６時間培養した。この培養後の培養液の濁度（ＯＤ６６０ｎｍ）を測定し、当該濁度が０．１２５となるように、この培養液を、ＰＢＳを用いて希釈した。当該希釈した液（口腔細菌培養液）を試験に用いた。
＜ＶＳＣ濃度測定＞
　口臭は「口あるいは鼻を通して出てくる気体のうち、社会的容認限度を超える悪臭」と定義されている。当該口臭の大部分（８割以上）は口腔内の気体由来であると考えられており、その主要原因物質は揮発性硫黄化合物（ＶＳＣ：Ｖｏｌａｔｉｌｅ　Ｓｕｌｆｕｒ　Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）である硫化水素（Ｈ２Ｓ）、メチルメルカプタン（ＣＨ３ＳＨ）、ジメチルサルファイド［（ＣＨ３）２Ｓ］であるとされている（厚生労働省ｅ－ヘルスネット、口臭の原因・実態、ＵＲＬ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅ－ｈｅａｌｔｈｎｅｔ．ｍｈｌｗ．ｇｏ．ｊｐ／ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ／ｔｅｅｔｈ／ｈ－０７－００１．ｈｔｍｌ）。よって、この試験例３では、ＶＳＣ濃度を測定することにより、所定のミル抽出液などによる口臭抑制効果の確認を行った。
（ＶＳＣ測定用のプレートの準備）
　９６ウェルのマルチプレート（ポリスチレン製、サーモフィッシャーサイエンティフィック製、マルチソープ）に、試験例１に記載のように、調製したヒト唾液を１００μＬ添加し、プレートをシールして、３７℃で１時間インキュベートした。その後、各ウェルを３００μＬのＰＢＳで２回洗浄した。なお、以下表９に記載の各群にて、各５ウェル使用するように、以下も含め準備した。
　この洗浄後、以下試験例（試験例３―１、試験例３－２、試験例３－３）ごとに、表９に記載のサンプル１００μＬを添加し、プレートをシールして、３７℃で１時間インキュベーションした。その後、各ウェルから液を廃棄し、３００μＬのＰＢＳで２回洗浄した。
　この洗浄後、当該口腔細菌培養液を各ウェルに１００μＬずつ添加した。プレートをシールして、３７℃で１６時間インキュベートした。このプレートの各ウェルから菌液を廃棄し、３００μＬのＰＢＳで２回洗浄した。
　この洗浄後、各ウェルに３．３ｍＭシステイン溶液を１００μｌ加え、プレートをシールして、３７℃で１時間インキュベートした。
　３Ｍリン酸（２５０μｌ、反応停止剤、キシダ化学、２６０－６１９２５）を加えたガラスバイアル（アズワン、ラボランスクリュー管瓶、Ｎｏ．３、９ｍＬ、９－８５２－０５）を準備した。当該ガラスバイアルに、各群の当該システインを加えてインキュベートした液（合計５００μｌ（＝１００μｌ×５））を加えた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　表９に記載のように各群のサンプルを準備後、試験３－１の群、試験３－２の群、試験３－３の群について、それぞれ２５℃（室温）で１０分間静置した。
　当該静置後、各群に含まれるＶＳＣ濃度をハリメーター（ＲＨ１７Ｋ、タイヨウ）で３回測定し、平均値を算出した。得られた結果（数値）の平均値を算出した。算出した結果を表１０に示す。
　表１０では、試験３－１の群、試験３－２の群、試験３－３の群、それぞれのコントロール群の平均値を１００として、当該コントロール群と比べての相対値（例えば以下）で示す。
　・試験３－１の群：算出結果において、３－１コントロール群と比べての相対値を示し、「＊」はＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定で３－１コントロール群と比べて「ｐ＜０．０５」を示す。
　・試験３－２の群：算出結果において、３－２コントロール群と比べての相対値を示し、「＊＊」はＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定で３－２コントロール群と比べて「ｐ＜０．０５」を示す。
　・試験３－３の群：算出結果において、３－３コントロール群と比べての相対値を示し、「＊＊＊」はＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定で３－３コントロール群と比べて「ｐ＜０．０５」を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　表１０に示すように、所定のミル抽出液による口臭抑制効果が確認できた。
［試験例４］アパタイト粒子を用いた色素沈着試験
　例えば、前歯部に用いられる歯冠補綴物において、審美性が要求される（非特許文献１、非特許文献２）。そこで、実施例１で調製したミル抽出液及びＣＰＣを含む組成物（溶液）により、アパタイト粒子を用いて色素沈着を抑制できるかを試験した。当該試験は、非特許文献１及び非特許文献２の記載に基づき以下記載のように行った。
＜試験方法＞
　先ず、以下の試薬などを列記する。
・アパタイト粒子：Ｂｉｏ　ＲＡＤ　ＣＨＴ　Ｃｅｒａｍｉｃ　Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ　Ｔｙｐｅ　Ｉ（８０μｍ）、Ｃａｔ．＃１５８－８０００、Ｌｏｔ．Ｍ４０１０７６
・コーヒー：市販の缶コーヒー、クラフトボスブラック（サントリーフーズ株式会社）
・色差測定のための測定機器：ＣＲ－４００、コニカミノルタ、色彩色差計
・以下試験工程で添加する唾液（唾液の溶解液その１）：以下のように作製した。
　健常なヒト成人男性（３０歳代）の唾液を用いた。歯磨きしてから２時間以上経過後の唾液をパラフィンガム刺激で回収した。当該回収した唾液を、遠心分離（４℃、２０００ｇ、３０ｍｉｎ）を行い、上清を回収した。当該上清をＰＢＳにより希釈して希釈液を作製した。当該希釈液をセルロース混合エステル（０．１μｍ、９０ｍｍ）のメンブレンフィルターにより濾過した。当該濾過後の希釈液を以下試験工程で添加する唾液とした。
・以下試験工程で添加する口腔細菌培養液：所定の方法で３０代の健常なヒト（男性１名）の唾液（約２ｍＬ）を採取した。採取した唾液を遠心分離（２０００×ｇ、１０分間、２５℃（室温））した。当該遠心分離後、上清を回収した。当該上清を、Ｔｏｄｄ　Ｈｅｗｉｔｔ　Ｂｒｏｔｈ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ、２４９２４０）を３０ｍＬに加え、３７℃で１６時間培養した。この培養後の培養液の濁度（ＯＤ６６０ｎｍ）を測定し、当該濁度が０．１２５となるように、この培養液を、ＰＢＳを用いて希釈した。当該希釈した液を以下試験工程で添加する口腔細菌培養液とした。
・ＣＰＣ：試験例１で用いたＣＰＣ
　１．５ｍＬチューブにアパタイト粒子を１００ｍｇずつ量り取った。当該粒子が入った当該チューブにＰＢＳ１ｍＬを加え、ボルテックスミキサーにより２５℃で攪拌した。当該攪拌後にスピンダウンして、チューブから上清を廃棄した。
　当該廃棄後、チューブに唾液１ｍＬ添加して、ボルテックスミキサーにより２５℃で攪拌した。当該攪拌後、３７℃で１時間静置した。当該静置してスピンダウン後に、チューブから上清を廃棄した。
　当該チューブに入っている当該粒子に対して、各チューブにＰＢＳ１ｍＬを添加することにより２回リンス（ボルテックス、スピンダウン、上清廃棄という過程のリンス）を行った。
　当該チューブに、以下群（群４―１、群４－２、群４－３）ごとに、表１１に記載のサンプル１ｍＬを添加して、ボルテックスミキサーにより２５℃攪拌した。当該攪拌後、３７℃で１時間静置した。当該静置してスピンダウン後に、チューブから上清を廃棄した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　当該上清を廃棄後、当該チューブに入っている当該粒子に対して、各チューブにＰＢＳ１ｍＬを添加することにより２回リンス（ボルテックス、スピンダウン、上清廃棄という過程のリンス）を行った。
　当該チューブに、上述の群４－２及び群４－３に、当該「口腔細菌培養液」を１ｍＬ添加して、ボルテックスミキサーにより攪拌した。上述の群４－１には、当該「口腔細菌培養液」を添加しなかった。当該攪拌後、３７℃で１時間静置した。当該静置してスピンダウン後に、チューブから上清を廃棄した。
　当該チューブに入っている当該粒子に対して、各チューブにＰＢＳ１ｍＬを添加することにより２回リンス（ボルテックス、スピンダウン、上清廃棄という過程のリンス）を行った。
　当該チューブに、コーヒーを１ｍＬ添加して、ボルテックスミキサーにより攪拌した。当該攪拌後、３７℃で１時間静置した。当該静置してスピンダウン後に、チューブから上清を廃棄した。
　当該チューブに入っている当該粒子に対して、各チューブに精製水１ｍＬを添加することにより３回リンス（ボルテックス、スピンダウン、上清廃棄という過程のリンス）を行った。
　当該３回リンス後、各群それぞれ、当該チューブから当該粒子をシャーレに移した。当該シャーレに移した後、５０℃で２時間、粒子を乾燥させた。当該乾燥後、当該測定機器により、各群において、色差測定を行った。測色時の背景色は白色とし、標準白板上に粒子を置いて測定した。コーヒーを添加する前の粒子を測色して、得られた測色値を基準値とした。
　表色にはＬ＊ａ＊ｂ＊表色系（ＣＩＥ１９７６　Ｌ＊ａ＊ｂ＊均等色空間）を用いた。Ｌ＊値は明るさを表し、０から１００までで数値が大きい程明るくなる。色みはａ＊ｂ＊で表し、ａ＊ｂ＊ともに０の場合には無彩色となる。ａ＊がプラスの方向になるほど赤みが強くなり、マイナスの方向になるほど緑みが強くなり、またｂ＊がプラスの方向になるほど黄みが強くなり、マイナスの方向になるほど青みが強くなる。なお、色の違いを表すために使われる、ΔＥ＊（デルタ・イー・スター）の値はこの色空間の中での２つの色の間の直線距離がどのくらい離れているかを計算して求められる。
＜試験結果＞
　色差測定の結果を以下表１２に示す。表１２では、各群において３回測定した値から算出された平均値を記載する。表１２に記載の「＊」は、ＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定で、群４－３と比べて「ｐ＜０．０１」を示す。当該「口腔細菌培養液」において、群４－３に比べ、群４－２（ミル抽出液などを添加した群）では、良好な結果（特にＬ＊値（明るさ）の結果）が得られた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
［試験例５］ミル抽出液を含有する練り歯磨きの効果の効果確認
　実施例１で調製したミル抽出液を含有する練り歯磨きをヒト口腔内で用いた際の効果を確認した。健常なヒト成人男性（３０歳代）の３名での試験にて効果を確認した。
　以下表１３記載の処方例１から処方例３の実施例１で調製したミル抽出液を含有する練り歯磨きを作製した。比較例１として、以下表１３記載の当該ミル抽出液を含有しない練り歯磨きを作製した。表１３記載の処方例１～３及び比較例１の練り歯磨きをそれぞれ用いて歯磨きを行って効果を確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　比較例１を用いた場合は、３名共に、歯磨き直後にスッキリ感があるが、一定時間経過後（約３時間後）、口腔内にべたつきが感じられた。一方で、処方例（処方例１～３）を用いた場合は、３名共に、歯磨き直後にスッキリ感があり、一定時間経過後（約３時間後）に、比較例１を用いた場合と異なり、口腔内にべたつきが感じられなかった。
［試験例６］ミル抽出液を含有する洗口液の効果の効果確認
　実施例１で調製したミル抽出液を含有する洗口液をヒト口腔内で用いた際の効果を確認した。健常なヒト成人男性（３０歳代）の３名での試験にて効果を確認した。
　以下表１４記載の処方例４から処方例６の実施例１で調製したミル抽出液を含有する洗口液を作製した。比較例２として、以下表１４記載の当該ミル抽出液を含有しない洗口液を作製した。表１４記載の処方例４～６及び比較例の洗口液をそれぞれ用いて洗口液を行って効果を確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　比較例２を用いた場合は、３名共に、洗口液を用いた直後にスッキリ感があるが、一定時間経過後（約３時間後）、口腔内にべたつきが感じられた。一方で、処方例（処方例４～６）を用いた場合は、３名共に、洗口液を用いた直後にスッキリ感があり、一定時間経過後（約３時間後）に、比較例２を用いた場合と異なり、口腔内にべたつきが感じられなかった。
　本発明の組成物を用いて、口腔細菌と唾液の生体高分子との結合を抑制又は阻害しうることが確認できた。したがって、本発明の組成物は、口腔ケア用の化粧品、医薬部外品などとして利用できる可能性がある。
 

 

Claims (5)

  1. 　ミル科藻類抽出物を含有し、当該ミル科藻類抽出物に含まれる分子量５０００以上のタンパク質を有効成分として含有する、口腔ケア用組成物。
  2. 　さらに抗菌成分を含む請求項１に記載の口腔ケア用組成物。
  3. 　前記抗菌成分が、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）、クロルヘキシジン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化デカリウム、グルコン酸クロルヘキシジン、プロタミン、ドデシルジアミノエチルグリシン、トリクロサン、３－メチル－４－イソプロピルメチルフェノール（ＩＰＭＰ）、チモール、カルバクロール、ファルネソール、ビサボロール、シネオール、ヒノキチオール、ラウロイルサルコシンナトリウム、ｌ－メントールからなる群から選ばれる１種又は２種以上である、請求項１又は２に記載の口腔ケア用組成物。
  4. 　前記有効成分が、前記ミル科藻類抽出物換算で前記組成物の全量に対して０．００１～５質量％含有される請求項１～３のいずれか一項に記載の口腔ケア用組成物。
  5. 　前記抗菌成分が、前記組成物の全量に対して０．０００１～１質量％含有される、請求項２～４のいずれか一項に記載の口腔ケア用組成物。
     

     
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