CN116687898A - 莱菔素在制备防龋或/和抗龋产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了莱菔素在制备防龋或/和抗龋产品中的应用，属于生物医学技术领域。本发明采用莱菔素用于防龋抗龋，效果确切，安生性好。莱菔素对变异链球菌具有抑菌和杀菌作用；能有效抑制变异链球菌生物膜的形成；降低变异链球菌的耐酸能力，产乳酸量和产胞外多糖能力，从而抑制体内龋齿的发生和发展。且莱菔素具有良好的生物安全性。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及莱菔素在制备防龋或/和抗龋产品中的应用。
背景技术
龋齿是最常见的疾病之一。根据相关期刊发表的数据，在全球358种主要疾病中，恒牙龋齿的患病率排名第一。它是一种慢性进行性疾病，可导致牙体硬组织的软化和脱矿。细菌是引起龋齿的重要条件，而变异链球菌是参与龋齿发生发展的关键细菌。变异链球菌引起的龋病的原理包括细菌附着、斑块形成、酸的产生、牙釉质脱矿和生物膜形成之间的相互作用。
有效的预防和治疗龋齿需要针对这些过程破坏变异链球菌和其他龋齿细菌的生长和生存。研究植物天然提取物的潜在的抗菌特性和预防龋齿的效果近年来一直在增加。一些植物提取物已被发现对变异链球菌具有抑菌或杀菌作用，包括绿茶提取物、芦荟提取物、蔓越莓提取物、蜂胶提取物等。此外，一些植物提取物还被发现具有预防龋齿的特性。例如，甘草根提取物，已被发现具有抗炎作用，可能有助于预防龋齿。然而，这些提取物的高浓度或长期使用的安全性和毒性也应仔细评估。
十字花科蔬菜，如萝卜、花菜和西兰花等，是世界范围内的重要作物，富含异硫氰酸酯类化合物(ITCs；R-N＝C＝S)。十字花科蔬菜中发现的主要ITCs可分为三类：脂肪族ITCs、芳香族ITCs和吲哚ITCs，ITCs的抗菌特性已被研究，主要用于食品保存和植物病原体控制。莱菔素(sulforaphene，SFE，CAS号592-95-0)属于脂肪族ITC，具有多种药理作用，包括抑制肿瘤，改善炎症等。此外，莱菔素是一种低毒性物质，通常与各种膳食营养补充剂一起食用。
已有研究证明，莱菔素具有抗菌特性。2009年，Aires等(Aires,A.,et al.,Theantimicrobial effects of glucosinolates and their respective enzymatichydrolysis products on bacteria isolated from the human intestinaltract.Journal of Applied Microbiology,2009.106(6):p.2086-2095.)提到莱菔素可以抑制幽门螺杆菌。Hwang等(Hwang,H.J.,J.E.Kim,and K.W.Lee,Sulforaphene AttenuatesCutibacterium acnes-Induced Inflammation.J Microbiol Biotechnol,2022.32(11):p.1390-1395.)提到其可抑制痤疮角杆菌。然而，莱菔素在龋病防治方面的应用尚无报道。
发明内容
本发明的目的在于，提供莱菔素在制备防龋或/和抗龋产品中的应用，其防龋、抗龋效果确切，安生性好。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明公开的莱菔素在制备防龋或/和抗龋产品中的应用。
变异链球菌耐酸性强，在pH 4.5时仍能继续生存并产酸，导致局部pH下降，避开唾液的缓冲作用维持相当长时间，造成局部硬组织脱矿，龋病病变过程开始。申请人经过大量试验，惊奇地发现莱菔素对变异链球菌具有抑菌和杀菌作用；能有效抑制变异链球菌生物膜的形成；降低变异链球菌的耐酸能力，产乳酸量和产胞外多糖能力，从而抑制体内龋齿的发生和发展。同时，莱菔素具有良好的生物安全性。
本发明的部分实施方案中，所述产品包括制剂、医疗器械。
本发明的部分实施方案中，所述医疗器械的表面设有涂层，所述涂层中包括有莱菔素。本发明的部分实施方案中，所述制剂为食品、药品、化妆品或者护理品。
本发明的部分实施方案中，所述制剂包括食品、药品、化妆品或者护理品。
莱菔素可以用在日常生活中或者医疗过程中，作为食品、药品、化妆品或者护理品中的任意一种被使用。
本发明的部分实施方案中，所述制剂包括液体制剂、固体制剂、半固体制剂、气体制剂。
本发明的部分实施方案中，所述液体制剂包括溶液剂、注射剂、洗剂、搽剂；
所述固体制剂包括散剂、丸剂、片剂、膜剂；
所述半固体制剂包括软膏剂、凝胶剂、栓剂、糊剂；
所述气体制剂包括气雾剂、喷雾剂。
本发明的部分实施方案中，所述制剂为液体制剂时，莱菔素的含量为62.5-500mg/L。
本发明的部分实施方案中，所述制剂为液体制剂时，莱菔素的含量为62.5-250mg/L，优选为125mg/L。
本发明的部分实施方案中，所述制剂为抑制致龋菌生长，或/和降低致龋菌生物膜形成能力，或/和在体内抑制龋病发生发展，或/和防止牙齿脱矿病变的制剂。
本发明的部分实施方案中，所述致龋菌包括变异链球菌。
本发明的部分实施方案中，所述制剂中莱菔素为唯一的活性成分。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明设计科学，构思巧妙。本发明采用莱菔素用于防龋抗龋，效果确切，安生性好。莱菔素对变异链球菌具有抑菌和杀菌作用；能有效抑制变异链球菌生物膜的形成；降低变异链球菌的耐酸能力，产乳酸量和产胞外多糖能力，从而抑制体内龋齿的发生和发展。同时，莱菔素具有良好的生物安全性。
莱菔素是已经工业化批量生产的单一化合物，不需要从天然十字花科植物中提取，生产成本低，来源广。
莱菔素成分单一、疗效确切，不会随产地、生产条件等发生变化，量效关系可以明确指导使用。
附图说明
图1A为溶血性检测外观图；
图1B为溶血性检测的OD540结果图；
图2为莱菔素的细胞毒性试验结果图；其中，HDPC为人牙髓细胞毒性试验结果图，HGF为人牙龈成纤维细胞毒性试验结果图，HGE为人牙龈上皮细胞毒性试验结果图；
图3为莱菔素的生物膜形成抑制实验结果图；
图4为莱菔素抑制变异链球菌生物膜形成的扫描电镜观察图；
图5为莱菔素对变异链球菌产乳酸量的影响结果图；
图6为莱菔素对变异链球菌耐酸能力的影响结果图；
图7为莱菔素对变异链球菌产水不溶性多糖(WIP)的影响结果图；
图8为莱菔素处理期间大鼠体重变化结果图；
图9为莱菔素对大鼠血常规指标的影响结果图；
图10为莱菔素对大鼠血生化指标的影响结果图；
图11为各组组织病理切片观察结果图；
图12为大鼠磨牙染色结果图；
图13为大鼠磨牙光滑面龋评分结果图；
图14为大鼠磨牙窝沟龋评分结果图。
具体实施方式
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明进行详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明公开了莱菔素在制备防龋或/和抗龋产品中的应用。
所述产品包括制剂、医疗器械。
所述医疗器械的表面设有涂层，所述涂层中包括有莱菔素。
作为优选，所述制剂包括食品、药品、化妆品或者护理品。
所述制剂包括液体制剂、固体制剂、半固体制剂、气体制剂。所述液体制剂包括溶液剂、注射剂、洗剂、搽剂；所述固体制剂包括散剂、丸剂、片剂、膜剂；所述半固体制剂包括软膏剂、凝胶剂、栓剂、糊剂；所述气体制剂包括气雾剂、喷雾剂。
这些剂型可以根据使用的便利性和使用场合等因素将其作为食品、药品、化妆品或者护理品使用。
所述制剂为液体制剂时，莱菔素的含量为62.5-500mg/L；优选地，莱菔素的含量为62.5-500mg/L，进一步优选为125mg/L。
所述制剂为抑制致龋菌生长，或/和降低致龋菌生物膜形成能力，或/和在体内抑制龋病发生发展，或/和防止牙齿脱矿病变的制剂。
所述致龋菌包括变异链球菌。
作为优选，所述制剂中莱菔素为唯一的活性成分。
实施例1
本实施例公开了莱菔素对变异链球菌最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)测定。
最小抑菌浓度MIC(Minimal inhibitory concentration)是指在体外试验中，抗菌药物能抑制培养基中细菌生长的最低浓度。最小杀菌浓度MBC(Minimal bactericidalconcentration)指在体外试验中，抗菌药物能杀灭培养基中活菌的最小浓度。MIC与MBC是药物抗菌活性的指标，显示出药物抑杀病原微生物的能力。
本实施例采用常见的口腔致龋菌对莱菔素进行活性测试。以洗必泰(Chlorhexidine，CHX)为阳性对照，1％ DMSO(v/v)为溶剂对照，无菌去离子水为阴性对照。
本实施例中所用的口腔致龋菌为：
变异链球菌(Streptococcus mutans UA159)购自美国模式培养物集存库；
变异链球菌(Streptococcus mutans GS-5)购自广东省培养物集存库；
变异链球菌菌株(Streptococcus mutans COCC32-3、COCC33-17、COCC31-8、COCC33-4、COCC33-14、COCC33-8)，由成都华西口腔医院提供。
具体的试验步骤为：
1、挑取单菌落于10mL BHI液体培养基中37℃恒温厌氧培养罐(80％N2、10％H2、10％CO2)过夜培养。
2、吸取100μL菌液于10mL BHI液体培养基中置于恒温厌氧培养罐(80％N2、10％H2、10％CO2)培养6小时，将菌液稀释至2×10 6CFU/mL备用。
3、莱菔素用10％DMSO(v/v)进行溶解，采用2倍稀释法加入U形96孔板，每孔20μL。
4、每孔加入80μL BHI培养基、100μL备用菌液，使莱菔素最终浓度为500mg/L～15.625mg/L。
5、无菌去离子水作为阴性对照，洗必泰为阳性对照，1％DMSO(v/v)为溶剂对照。
6、96孔板置于37℃恒温厌氧培养罐(80％N2、10％H2、10％CO2)培养48h。
7、MIC为孔板内澄清的最低莱菔素浓度。
8、吸取澄清孔内100μL菌液涂布于BHI平板，37℃恒温厌氧培养罐(80％N2、10％H2、10％CO2)过夜培养48h
9、MBC为平板上无菌落生长的最低莱菔素浓度。
实验至少重复3次。
结果数据如表1所示
表1莱菔素对不同变异链球菌的药敏活性
由表1可知，莱菔素对不同的变异链球菌均有抑菌作用。且在上述8株变异链球菌中，莱菔素对其中6株的MIC为125mg/L。
实施例2
本实施例考察了莱菔素的体外生物相容性
1.莱菔素的溶血性检测考察
具体实验操作为：
(1)通过离心(2000g，5分钟)收集脱纤维羊血中的红细胞
(2)将步骤(1)收集的红细胞在含莱菔素的PBS中37℃孵育30分钟。
(3)以Triton X-100(1％，(v/v))为阳性对照，以PBS为阴性对照。
(4)将孵育后的细胞悬液离心(2000g，10分钟)后，收集上清液，用微孔板分光光度计记录上清液在540nm处的吸光度值OD540。
重复三次进行。
结果如图1A和图1B所示，表明莱菔素在不超过500mg/L时没有明显的红细胞破裂，未见溶血现象。
2.莱菔素的细胞毒性试验
试验材料：人牙髓细胞(HDPC，CP-H240)，人牙龈成纤维细胞(HGF，CP-H231)，人牙龈上皮细胞(HGE，CP-H203)均购自武汉普诺赛生命科技有限公司。
分别考察莱菔素对人牙髓细胞、人牙龈成纤维细胞、人牙龈上皮细胞的细胞毒性。对于每个细胞的细胞毒性考察均设实验组和对照组。
具体的试验操作为：
(1)实验组、对照组均按每孔3×103细胞接种于96孔板中，培养48小时；
(2)待细胞贴壁后，吸出上清液，替换为含有不同浓度莱菔素的细胞培养基，作为莱菔素实验组，继续培养1，3，7天。
(3)待细胞贴壁后，吸出上清液，替换为含有PBS的细胞培养基，作为对照组，继续培养1，3，7天。
(4)在1，3和7天这三个时间点，使用细胞计数试剂盒-8(CCK-8；上海碧云天生物技术有限公司)评估莱菔素处理后的细胞的活力。吸出上清液，加入CCK-8试剂，孵育2小时，使用微孔板分光光度计测定450nm处吸光度(OD450)。
实验重复3次。
结果如图2所示，时间为横坐标，纵坐标表示OD450值，OD450值越高，细胞活力越好。在第1天，任何浓度的任何细胞均未观察到细胞毒性。此外，莱菔素组在第3天和第7天的OD450值显著增加，说明莱菔素在不同程度地提高了细胞活力。
实施例3
本实施例考察了莱菔素对变异链球菌生物膜形成的影响
1.生物膜形成抑制实验
最小抑生物膜浓度MBIC(Minimal biofilm inhibitory concentration)是反映药物抗生物膜形成能力的指标。本实施例采用变异链球菌(Streptococcus mutans UA159)考察莱菔素对其生物膜形成的影响，无菌去离子水作为阴性对照，1％DMSO(v/v)作为溶剂对照。
实验步骤如下：
1、挑取单菌落于10mL BHI液体培养基中37℃恒温厌氧培养罐(80％ N2、10％ H2、10％ CO2)过夜培养。
2、吸取100μL菌液于10mL BHI液体培养基中置于恒温厌氧培养罐(80％N2、10％H2、10％CO2)培养6小时，将菌液稀释至2×10 6CFU/mL备用。
3、莱菔素用10％ DMSO(v/v)溶解，采用2倍稀释法加入U形96孔板，每孔20μL。
4、每孔加入80μL BHIS(BHI加1％蔗糖(w/w))培养基、100μL备用菌液，使莱菔素最终浓度为500mg/L～15.625mg/mL，无菌去离子水作为阴性对照，1％DMSO为溶剂对照。
5、96孔板置于37℃恒温厌氧培养罐(80％N2、10％H2、10％CO2)培养24h。
6、吸走培养液，检测形成的生物膜的量：用PBS洗两次，甲醇固定15分钟，0.1％结晶紫(w/w)染色5分钟，95％乙醇(v/v)脱色30分钟，测量595nm下的吸光度。
7、MBIC50为吸光度较阴性对照组减少50％以上的最低莱菔素浓度。
实验至少重复3次。
结果如图3所示。横坐标表示药物浓度，纵坐标表示吸光度，吸光度反映生物膜量，吸光度越高，生物膜量越多。药物组形成的生物膜量较阴性对照组明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)。莱菔素对生物膜形成的抑制作用呈剂量依赖性。62.5mg/L的莱菔素开始抑制变异链球菌生物膜的形成。250mg/L的莱菔素完全阻止了变异链球菌生物膜的形成。与对照组相比，1/2MIC组(62.5mg/mL)的生物膜形成减少了34.88％。
2.扫描电子镜观察莱菔素对生物膜形成的影响
实验采用变异链球菌(Streptococcus mutans UA159)考察莱菔素对生物膜形成的影响，以无菌去离子水为阴性对照，1％ DMSO(v/v)为溶剂对照。
实验步骤如下：
(1)挑取变异链球菌单菌落于10mL BHI液体培养基中37℃恒温厌氧培养罐(80％N2、10％ H2、10％ CO2)过夜培养。
(2)吸取100μL菌液于10mL BHI液体培养基中置于恒温厌氧培养罐(80％N2、10％H2、10％ CO2)培养6小时，将菌液稀释至1×106CFU/mL备用。
(3)将无菌圆形载玻片加入24孔板，每孔加入不同浓度的莱菔素，加入菌液至总体积1mL，37℃恒温厌氧培养24小时。
(4)吸走培养液，用PBS润洗三次玻片上的生物膜，加入4％多聚甲醛固定过夜。
(5)吸出多余的固定液，用PBS润洗两次，在不同浓度的乙醇溶液(25％、50％和75％，90％，100％，每30分钟)中进行梯度脱水。样品临界点干燥，喷金镀膜，使用扫描电镜观察。
结果如图4所示，65.2mg/L以上浓度的莱菔素可显著抑制变异链球菌生物膜形成量。
实施例4
本实施例考察了莱菔素对变异链球菌产乳酸量的影响。
细菌代谢碳水化合物产酸，引起牙体硬组织脱矿形成龋，亚抑菌药物浓度下对细菌的生长无影响，用产乳酸量来反应莱菔素对细菌产酸能力的抑制作用，实验采用变异链球菌(Streptococcus mutans UA159)察了莱菔素对变异链球菌产乳酸量的影响，以无菌去离子水为阴性对照，1％DMSO(v/v)为溶剂对照。
实验步骤如下：
1、挑取变异链球菌单菌落于10mL BHI液体培养基中37℃恒温厌氧培养(80％N2、10％H2、10％CO2)过夜培养。
2、吸取100μL菌液于10mL BHI液体培养基中置于恒温厌氧培养罐(80％N2、10％H2、10％CO2)培养6小时，将培养至对数生长中期的细菌9000r/m离心5分钟，弃多余的BHI培养基，加入10mLPBS溶液重悬细菌，再次离心清洗细菌，弃多余PBS溶液，最后重悬于含有0.2％蔗糖的BPW中，将菌液稀释至1×107CFU/mL，作为备用菌液，备用。
3、莱菔素用10％DMSO进行溶解稀释后加入24孔板，每孔200μL。
4、每孔加入800μL BHI培养基、1mL备用菌液，使莱菔素最终浓度分别为1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC浓度。
5、无菌去离子水作为阴性对照，1％DMSO(v/v)为溶剂对照。
6、24孔板置于恒温厌氧培养罐培养2h。
7、吸取上清液，离心(8000g，5分钟，4℃)去除浮游细胞。
7、用乳酸试剂盒测定产乳酸量。
实验至少重复3次。
结果如图5所示，当莱菔素以62.5mg/L处理变异链球菌培养物时，其乳酸的产生受到显著抑制(P<0.05)。溶剂对照组与阴性对照组相比比，乳酸产量无明显变化。
实施例5
本实施例考察了莱菔素对变异链球菌耐酸能力的影响。
变异链球菌耐酸性强，在pH 4.5时仍能继续生活并产酸。局部pH下降维持相当长时间，避开唾液的缓冲作用，从而造成局部硬组织脱矿，龋病病变过程开始。
本实施例采用变异链球菌(Streptococcus mutans UA159)，考察莱菔素对细菌耐酸能力的影响；以无菌去离子水为阴性对照，1％DMSO(v/v)为溶剂对照。
实验步骤如下：
1、挑取变异链球菌单菌落于10mL BHI液体培养基中37℃恒温厌氧培养(80％N2、10％H2、10％CO2)过夜培养。
2、吸取100μL菌液于10mL TPY液体培养基中置于恒温厌氧培养罐(80％N2、10％H2、10％CO2)培养6小时，将培养至对数生长中期的细菌9000r/m离心5分钟，弃多余的TPY培养基，加入10mL 40mM磷酸-柠檬酸缓冲液的TPY培养基中(pH＝5.0)重悬细菌。
3、莱菔素用10％DMSO(v/v)进行溶解稀释后加入24孔板，每孔200μL。
4、每孔加入800μL TPY培养基(pH＝5.0)、1mL备用菌液，使莱菔素最终浓度为至1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC浓度。
5、无菌去离子水作为阴性对照，1％ DMSO(v/v)为溶剂对照。
6、24孔板置于恒温厌氧培养罐培养2h后取出样品，进行活菌计数，计算Δlg(CFU/mL)。
实验重复3次。
结果如图6所示：在pH值为5.0时，莱菔素在31.3mg/L(1/4MIC)和62.5mg/L(1/2MIC)时的Δlg(CFU/mL)显著升高(P<0.05)。增加的差异表明变异链球菌的耐受性受损。
实施例6
本实施例考察了莱菔素对变异链球菌产水不溶性多糖(WIP)的影响
变异链球菌能以蔗糖为底物合成胞外葡聚糖、果聚糖及胞内多糖。葡聚糖介导细菌的黏附，促进菌斑的形成，是变链球菌重要的致龋毒力因子。
本实施例考察了莱菔素对细菌产胞外多糖的作用。本实施例采用变异链球菌菌株为Streptococcus mutans UA159，以无菌去离子水为阴性对照，1％DMSO(v/v)为溶剂对照。
实验步骤如下：
1、挑取变异链球菌单菌落于10mL BHI液体培养基中37℃恒温厌氧培养(80％N2、10％H2、10％CO2)过夜培养。
2、吸取100μL菌液于10mL BHI液体培养基中置于恒温厌氧培养罐(80％N2、10％H2、10％CO2)培养6小时，将菌液稀释至2×10 6CFU/mL备用。
3、莱菔素用10％DMSO(v/v)溶解，采用2倍稀释法加入U形48孔板，每孔100μL。
4、每孔加入400μL BHIS(BHI加1％蔗糖)培养基、500μL备用菌液，得到含有细菌浓度为1×106CFU/mL和药物浓度为1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC的1mL体系，无菌去离子水作为阴性对照，1％DMSO(v/v)为溶剂对照。
5、48孔板置于37℃恒温厌氧培养罐(80％N2、10％H2、10％CO2)培养24h。
6、吸走培养液，用PBS润洗三次，刮取各孔的生物膜，重悬于1mL的PBS溶液中，离心清洗弃上清，再加入DDW离心清洗2次，并重悬于0.4mol/L NaOH中离心后取上清液。
7、吸取150μL上清液与450μL蒽酮试剂混合，95℃下水浴反应6分钟，并记录在625nm处的吸光度(A625)。吸光度值越大，则生成的胞外多糖越多。
实验重复三次。
结果如图7所示，横坐标为实验分组，纵坐标为在625nm处的吸光度。结果表明，实验组的胞外多糖产量和对照组相比均有减少，莱菔素的浓度为1/2MIC时，产生的胞外多糖的量显著减少。
实施例7
本实施例考察了莱菔的体内防龋性能及安全性评价
1.建立大鼠龋齿模型
1)从四川大学动物实验中心购买32只年龄17天，体重110±5g的雄性无特定病原体(specific-pathogen-free,SPF)SD大鼠。
2)首先饲喂含有0.1％氨苄青霉素、0.1％氯霉素、0.1％羧苄青霉素的饮食和含有4000U/mL青霉素的水3天以抑制口内的原始菌群，便于S.mutans定植。
3)从第4天开始，连续3天在大鼠口腔内涂布对数期的S.mutans UA159菌液，并给予致龋饲料Keyes 2000(56wt.％蔗糖，南通，中国)，饮水为5wt.％蔗糖溶液。
4)第7天使用口腔拭子采样，通过S.mutans选择培养基，轻唾-杆菌肽(Mitis-Salivarius-Bacitracin,MSB)平板检查S.mutans的定植情况，若培养后的MSB平板上可见典型S.mutans的霜蓝色粗糙型菌落，则表示S.mutans在大鼠口内成功定植，大鼠龋病模型建立。
2.将模型大鼠按不同处理随机分为4组，每组8只：
1)阴性对照组(NC)：不对模型大鼠做任何处理；
2)阳性对照组：采用500ppmF-(氟化钠)处理大鼠龋齿；
3)溶剂对照组：采用1％ DMSO(v/v)处理大鼠龋齿；
4)治疗组：采用125mg/L莱菔素处理大鼠龋齿。
3.采用牙科小毛刷蘸取不同组的溶液，对大鼠磨牙进行刷牙处理，每日3次(8：00，12：00，20：00)，每次5分钟，连续4周。
4.在治疗期间，每周测量每只大鼠的体重，并记录其身体状态。
5.第36天，麻醉下锁骨下静脉穿刺采集静脉血。
6.采血后采用二氧化碳窒息法安乐死。
7.采血后2小时内，使用自动血常规分析仪(TEK-VET5，南昌泰康科技)进行血常规测定。
8.静脉血样本室温静置2小时后，1000g，4℃，离心15分钟收集血清。使用全自动血生化分析仪(BK-200，济南博科)检测血生化指标，包括丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、血尿素(UREA)、肌酐(CREA)、甘油三酯(TG)和胆固醇(CHO)。
9.无菌解剖将肝脏、肾脏和口腔黏膜组织(颊、腭和舌)，进行组织病理学评估；无菌分离大鼠颌骨用于龋病评分。
10.离体组织样品在4％多聚甲醛溶液中固定24小时。
11.肝脏、肾脏和口腔黏膜组织(颊、腭和舌)包埋、切片、乙醇脱水，用苏木精染色5分钟，在1％盐酸醇中分化2秒。然后，样品在0.2％的氨水中孵育2分钟，然后用伊红染色1分钟。
12.染色后的肝脏、肾脏和口腔黏膜组织(颊、腭和舌)切片使用中性树脂封片，数字载玻片扫描系统对载玻片进行扫描。使用CaseViewer 2.1(3DHISTECH，布达佩斯，匈牙利)进行图像分析。
13.清洗所有的颌骨，在室温下干燥，并用0.4％紫脲酸铵溶液染色12小时。
14.使用体视显微镜拍照，用于评估平滑面龋坏。然后使用涡轮切割机，矢状分割上下颌磨牙，以充分暴露窝沟龋坏，超声清洗后，体视显微镜拍照用于窝沟龋损评分。
15.根据Keyes诊断和评分方法对平滑面及窝沟龋损进行评分，将病变深度分为仅釉质(E)、牙本质浅层(Ds)、牙本质中层(Dm)和牙本质深层(Dx)。
体重记录如图8所示，在为期4周的实验中，所有大鼠均保持明显良好的健康状态，无意外死亡，所有治疗组间体重增加均无显著差异(P<0.05)。
各组血常规结果如图9所示，对照组与莱菔素治疗组的红细胞(RBC)、白细胞(WBC)、血小板计数(PLT)、血红蛋白(HGB)值均无明显差异。
各组血生化结果如图10所示，与阴性对照组相比，莱菔素、氟化钠、DMSO治疗血清丙氨酸转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)，均略有降低，提示无肝损伤或肝感染。在4周的实验后，与其他三组相比，使用莱菔素的血清尿素(UREA)、肌酐(CREA)、甘油三酯(TG)和胆固醇(CHO)水平都没有显著变化。
各组组织病理切片观察结果如图11所示，在局部处理周后，口腔黏膜未见充血、积水、侵蚀或溃疡形成。治疗组的肝、肾结构模式与对照组无明显的器官异常。
大鼠磨牙染色结果如图12所示，龋坏区域被染成红色。如箭头所示，未经治疗的阴性对照组(NC)组和采用1％ DMSO(v/v)处理的溶剂对照组有明显更广泛的光滑表面和沟表面病变。
大鼠磨牙光滑面龋评分如图13所示，局部应用莱菔素(125mg/L)和氟化物(500ppmF-)可降低光滑表面龋的发生率。采用莱菔素的治疗组的表面病变平滑评分最低。
大鼠磨牙窝沟龋评分如图14所示。局部使用莱菔素和氟化物可降低沟道表面龋的发生率和严重程度。采用莱菔素的治疗组和采用氟化钠的阳性对照组的Keyes评分无统计学差异。其中附图14中的E表示局限在牙釉质层的龋坏，Ds表示病变深度达到牙本质浅层的龋坏，Dm表示病变深度达到牙本质中层的龋坏，Dx表示病变深度达到牙本质深层的龋坏。
综上，莱菔素从抑制致龋菌生长、抑制致龋菌的粘附、生物膜形成、产酸、耐酸等多个方面发挥防治龋病的作用，其具在体内外的龋病控制潜力和口服生物相容性，此对抗菌防龋有重要意义。
最后应说明的是：以上各实施例仅仅为本发明的较优实施例用以说明本发明的技术方案，而非对其限制，当然更不是限制本发明的专利范围；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明。但凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内；另外，将本发明的技术方案直接或间接的运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
1.莱菔素在制备防龋或/和抗龋产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括制剂、医疗器械。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述医疗器械的表面设有涂层，所述涂层中包括有莱菔素。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述制剂包括食品、药品、化妆品或者护理品。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述制剂包括液体制剂、固体制剂、半固体制剂和气体制剂。
6.根据权利要求5所述的的应用，其特征在于，所述液体制剂包括溶液剂、注射剂、洗剂、搽剂；
所述固体制剂包括散剂、丸剂、片剂、膜剂；
所述半固体制剂包括软膏剂、凝胶剂、栓剂、糊剂；
所述气体制剂包括气雾剂、喷雾剂。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述制剂为液体制剂时，莱菔素的含量为62.5-500mg/L；优选为62.5-250mg/L，更优选为125mg/L。
8.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述制剂为抑制致龋菌生长，或/和降低致龋菌生物膜形成能力，或/和在体内抑制龋病发生发展，或/和防止牙齿脱矿病变的制剂。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述致龋菌包括变异链球菌。
10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述制剂中莱菔素为唯一的活性成分。
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