NO145540B

NO145540B - Fremgangsmaate for fremstilling av terapeutisk aktive polyribonukleotider.

Info

Publication number: NO145540B
Application number: NO771884A
Authority: NO
Inventors: Mirko Beljanski
Original assignee: Mirko Beljanski
Priority date: 1976-06-03
Filing date: 1977-05-27
Publication date: 1982-01-04
Also published as: LU77460A1; DK243877A; JPS63119495A; FR2353293B1; US4190649A; IE45285L; IE45285B1; NL7705658A; NO771884L; JPS6326088B2; US4335239A; NO145540C; DK169766B1; JPS52148613A; DE2723451A1; FR2353293A1; GB1546322A; CH620691A5; SE7706425L; CA1093000A

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremstilling av terapeutisk aktive polyribonukleotider som har en interessant aktivitet ved dannelsen av leukosytter og blodplater og som anvendes som medisin for å aktivere leukopoiesen, dvs. dannelsen av hvite blodlegemer og dannelsen av plater når der åpenbares en mangel på dette.

Man har nylig beskrevet (FR-PS 2.292.481 og "CR.

Acad. Sei. Paris", serie D, T.280 (20. januar 1975) sidene

363 - 366) en fremstilling for fremstilling av polyribonukleotider som også kalles "RNA-fragmenter", gjennom påvirkning av ribonukleaser som lar frekvensene G-A være intakte og spesielt pankreas ribonuklease på ribosomale ribonukleinsyrer som er rike på nukleotidene G og A, og som er ekstrahert fra bakterier eller fra celler fra dyreorganer. De tilveiebragte polyribonukleotider består av enkle kjeder som inneholder ca.

20 - 80 ribonukleotidenheter og hvor purinbasene er i over-

skudd i forhold til pyrimidinbasene og hvor motivene i rekken G-A dominerer.

Polyribonukleotidene skilles deretter i forskjellige fraksjoner ved å føres gjennom en kolonne med en molekylsikt som selges under betegnelsen "Sephadex G 25 fine" med buffer-

en Tris M/100 og pH 7,4, ved eluering med den samme buffer. Fraksjonene som skilles på denne måten betegnes etter eluer-ingsrekkefølgen P.^<P>2, P3, P4, P5 og de tilsvarer til top-

pene i kurven vist i fig. 1 hvor elueringsvolumene vises som ordinat og hvor absorbsjonen målt ved 260 my er abscisse.

De forskjellige polyribonukleotidfamilier som på

denne måten tilveiebringes er analysert spektrofotometrisk og deres innehold av purinbaser: guanin (G) og adenin (A), og pyridinbaser: cystosin (C) og urasil (U) er bestemt, og de skiller seg fra hverandre ved innholdet og forholdet mellom basene, produktene og P2 er de som er rikest på purinbas-

ene G og A.

Man har allerede beskrevet at produktene som be-

nevnes P^ og P2 og som er tilveiebragt fra ribosomalt RNA

fra Escherichia coli M 500, har en antiviral aktivitet, spesielt overfor virus som er årsak til Shope's fibrom, vaksi-nevirus og herpesvirus.

Man har nå funnet at produktene som inneholder

minst purinbaser G og A og spesielt produktene hvor det to-

tale forhold mellom purinbaser og pyrimidinbaser [(G+A)/

(C+U)] ligger mellom 1,0 og 2,3, har interessant aktivitet ved dannelsen av leukosytter og blodplater og kan anvendes som medisinske preparater for å få igang dannelsen av hvite blodlegemer og dannelsen av plater når der foreligger en

defisiens.

Spesielt kan produktene som benevnes P^ og P^ og som er fremstilt fra robosomalt RNA fra Escherichia coli M 500 Sho-R ved påvirkning av pankreas ribonuklease og som har et forhold på de to gruppene (G+A) / (C+U) på mellom 1,0 og 2,5 og som derfor representerer et medisinsk preparat, anvendes for å øke leukosytter og blodplater.

Medisinske preparater kan fremstilles ved den fremgangsmåte som er beskrevet i FR-PS 2.292.481 fra forskjellige kilder (gjær, bakterier, dyreorganer) og spesielt fra E-coli M 500 Sho-R ved å føre fraksjonene eller RNA-fragmentene

hvor forholdet (G+A) / (C+U) ligger mellom 1,0 og 2,5 gjennom en molekylsikt.

Oppfinnelsen har til formål å tilveiebringe en forbedret fremgangsmåte for fremstilling av disse polyribonukleotider som gjør det mulig å fremstille dem på en enklere måte og med et meget større utbytte.

Ifølge den forbedrede fremgangsmåten er metodene for bakteriedyrking, isoleringen av de robosomale ribonukle-ider (r-RNA) og deres bevaring identisk med de som er beskrevet i FR-PS 2.292.481.

Forbedringene består i tre punkter:

- i valg av bakteriestamme eller annet utgangs-materiale (sopp, gjær eller dyreorganer), - i valg av nedbrytningsmiddel som anvendes for å spalte r-RNA i RNA-fragmenter, - i avbrytelsen av seleksjonsfasen for RNA-fragmenter i kolonnen.

Oppfinnelsen angår således en fremgangsmåte for fremstilling av polyribonukleotider ved fragmentering av ribosome ribonukleinsyrer, oppnådd fra en mikroorganisme, og denne fremgangsmåte karkateriseres ved at man fragmenterer en RNA som oppviser et forhold (G + A) / (C + U) mellom 1,0 og 2,5, f.eks. oppnådd fra Escherichia coli T 3000, og at fragmenteringsreaksjonen gjennomføres ved tilsetning til en oppløsning av RNA, av ribonuklease eller 0,1 N NaOH eller 0,1 N KOH.og at den oppnådde oppløsning etter at reaksjonen er stoppet behandles med kloroform hvoretter den vandige fase separeres, dialyseres mot destillert vann og lyofili-

seres.

Som nevnt anvender man således fortrinnsvis en

vill stamme av E. coli T 3000 (K 12) som ikke er patogen og som opptrer som snyltedyr i tarmfloraen, i denne stammen er forholdet mellom purinbaser og pyrimidinbaser mindre enn det tilsvarende forhold i stammen E. coli M 500 Sho-R og den er i nærheten av 1,0.

Men man kan anvende r-RNA isolert fra andre bakteri-estammer, sopp, gjær eller dyreorganer hvor forholdet mellom purinbaser og pyrimidinbaser er tilstrekkelig.

Nedbrytningsmidlene for r-RNA som anvendes ifølge oppfinnelsen kan ikke bare være ribonukleaser såsom pankreas ribonuklease eller et ribonukleaseekstrakt fra Neurospora crassa, men likeledes en sterk base (natrium- eller kaliumhydroksyd), fortrinnsvis i en endelig konsentrasjon på 0,1 N

i reaksjonsoppløsningen.

RNA-fragmentene tilveiebragt på denne måten med utgangspunkt i et første materiale har et totalt forhold mellom (G + A) / (C + U) på mellom 1,0 og 2,5 og det er ikke nødven-

dig å foreta en fraksjonering i en kolonne.

Man gir nedenunder eksempler på fremstilling av

og P^ med utgangspunkt i en stamme E. coli som er resi-

stent mot showdomycin beskrevet av M. Beljanski et al ("CR. Acad. Sei. Paris", serie D. 272, sidene 2107 - 2110) og regi-strert i Centraal Bureau Voor Schimmelcultures under nr. CBS 615-74 og betegnet i det etterfølgende med E. coli M 500-Sho-R.

Eksempel 1

Fremstilling av P, og P^ med utgangspunkt i E. coli M 500 - Sho- R

Bakteriene i denne stammen kultiveres ved 37°C i et godt luftet miljS eller i et miljo som inneholder pr. liter miljo:

10 g Bacto tryptone

5 " soppekstrakt

5 " natriumklorid og

natriumhydroksydopplosning for å justere pH til 7., 3;

eller, hvis man samtidig vil isolere de antivirale produkter Pl °<£><P>2 °£ produktene P, og P^ et syntetisk mil jo som pr.

liter inneholder:

100 ml monokaliumfosfat på 136 g/l,

10 ml ammoniumsulfat på 20%,

1 ml jernsulfat på 0,05%,

1 ml magnesiumsulfat på 20 g/100 ml,

2 ml vitamin B-,^ på 0,5 til 1000 og kåliumhydroksydopplSsning for å justere pH til 7,2 hvor dette miljo etter sterilisering tilsettes 4 eller 5 g pr. 1000 av glukose som er sterilisert for seg selv (oppløs-ning på 20%).

Etter at kulturen er avsluttet samles bakterie-cellene opp ved sentrifugering og oppbevares nedfrosset. De homogeniseres deretter kalt i en buffer A (Tris-HCl 2M : 5 ml, KC1 2M : 30 ml, opplesning av 30 g/100 ml magnesiumacetat : 10 ml) hvoretter de knuses og destrueringen avsluttes med lyd-behandling.

Etter fortynning med en buffer B (som tilsvarer buffer A, men som bare inneholder 0,1 ml magnesiumacetat og 0,1 ml merkaptoetanol), sentrifugerer man i 20 minutter (25 til 30.000 g), hvoretter man tilsetter den ovenstående væske 10 til 20 ^ug desoksyribonuklease pr. ml. Man lar denne virke i 15 minutter ved 30 - 37°V hvoretter man sentrifugerer 20 minutter (25 - 30.000 g). Den ovenstående væske resentrifugeres deretter i 2 timer ved 40.000 rotasjoner pr. minutt i en ultrasentrifuge for å foreta en fullstendig oppsamling av ribosomer og å eliminere alt det unyttige RNA 4 S.

Ribosomene (bunnfallet) homogeniseres i et kar i nærvær av buffer B. Man tilsetter 2-3 dråper laurylsulfat på 20% og underkaster det hele en god mekanisk omroring. Ribo-som RNA ekstraheres på vanlig fremgangsmåte med fenol i nærvær av buffer B. Flere ekstraheringer er nbdvendige. En endelig ekstrahering med kloroform er nødvendig for å få eli-minert fenol og proteiner som måtte være tilstede.

Vannfasene slås sammen og tilsettes 96% alkohol som er avkjolt og som inneholder litt KC1 for å lette utfellingen av RNA. En sentrifugering på 5 minutter ved 5000 g gjor det mulig å samle opp RNA som deretter dialyseres en natt mot

destillert vann som inneholder 0,1 M KC1.

Om morgenen fortsetter man dialysen i 1 time mot bare destillert vann. Man bestemmer RNA ved 260 nm (U.V.) ved hjelp av et spektrofotometer.

Forholdet 260/280 gjor det mulig å kontrollere ren-heten ved fremstillingen av RNA. Dette forholdet bor være i nærheten av 2.

RNA oppbevares avkjolt eller i form av lyofilisert

pulver.

Fraksjoneringen av RNA i polyribonukleotider (RNA-fragmenter) utfores på folgende måte: 70 mg ribosomt RNA (ca. 10 ml) tilsettes 0,2 ml av en opplosning av krystallisert pankreas ribonuklease. (Pankreas ribonuklease-opplosning-en på 5 mg/ml er forutkokt i 10 minutter og deretter avkjolt).

Man lar RNA påvirkes av ribonuklease i 30 minutter ved nbyaktig 36°C (vannbad). Nedbrytningen stoppes ved tilsats av et likt volum kloroform og heftig omroring i noen minutter. Man sentrifugerer i 5 minutter ved 5.000 g. Vannfasen (den ovre fase) fjernes og tilsettes en annen gang av et tilsvarende volum kloroform, omrores og sentrifugeres. Vannfasen til-fores umiddelbart til en "Sephadex G-25 fine" kolonne som er bragt til likevekt med en buffer H~20 - Tris HC1 0,1 M, pH 7,4.

RNA-fragmentene elueres med den samme buffer.

Under disse betingelser vil 5 påvisbare topper ved absorbsjon ved 260 nm regelmessig komme til syne som vist i elueringskurven. De betegnes etter elueringsrekkefolgen fra kolonnen fra 1-5.

RNA-fragmentene som utgjor toppene 1 og 2 har en

antiviral aktivitet.

RNA-fragmentene med toppene 3 og 4 har alltid en meget spesiell aktivitet som "forsterker" for leukosytter og plater og utgjor et medisinsk preparat.

RNA-fragmentene som utgjor toppen 5 bevares ikke. Fraksjonene som utgjor hver av toppene samles og lyofiliseres. Man oppnår på denne måte produktene P-^, P2, P^ og P^ etter å ha tatt opp det torre residuum i en minimal mengde destillert vann, behandles de heftig med et tilsvarende volum kloroform og sentrifugeres, den ovenstående væske dialyseres i 24 timer (ved akseniske betingelser) mot destillert vann som er sterilisert og produktet lyofiliseres tort. Produktene P^ og P^ er produktene ifolge oppfinnelsen og likeledes

blandinger av disse i alle forhold.

<1> Sammensetningen av RNA-fragmentene P^ og P^ som består av enkle kjeder sammensatt av 25 - 50 nukleotider, er blitt studert ifb'lge den fremgangsmåte som er beskrevet i fransk patent nr. 2.292.461 for å bestemme innholdet av purinbaser og pyrimidinbaser.

Man hydrolyserer 150 ^ug RNA-fragmenter i 1 time ved 100°C (kokende vannbad). Etter fordampning i en dessikkator, tas residuet opp i 0,02 ml destillert vann og tynnsjiktkroma-tograferes (ekteola cellulose) ifolge den fremgangsmåte som beskrives av G.R. Bjork og L. Svensson (1967, Biochim. Biophys. acta, 138, sidene 430 - 432). Hydrolysen frigir purinbasene og pyrimidinbasene blir igjen i form av nukleotider.

Bestanddelene av RNA-fragmentene P^ og P^ er skilt ved kromatografi med lukket kolonne og identifisert ifolge den teknikk som tidligere er beskrevet for RNA-fragment ene P-^ og P2.

RNA-fragment P^ består av: A : 29,0

G : 41,1

C : 15,2

U : 15,0 (G-A/C+U=2,3)

RNA-fragment P^ består av: A : 25,6

G : 26,3 C : 21,0 (G+A/C+U=l,06)

U : 27,1

og disse tallene er uttrykt i mol pr. 100 mol analysert nukle-otid under anvendelse av fblgende utbredelseskoeffisienter A = 13; G = 12,8; C = 11,5; U = 10 og som korresponderer til maksimal absorbsjon (se"Methods in Enzymology" XII,"Nucleic Acides", del A, Ed. Grossman og K. Moldave, Academic Press

(1967), sode 386).

Pg Pi fragmentene inneholder ikke spor av ADN.

Dette er meget noyaktig kontrollert ved kolorimetri (difenyl-amin) og med enzymologi (aktivitet i nærvær av DNA-polymerase).

Man beskriver nå i eksempel 2-4 fremgangsmåtene for fremstilling av RNA-fragmenter ifolge oppfinnelsen med utgangspunkt i r-RNA fra E." coli T 3000 for forskjellige ribonukleaser

og med en alkalisk base.

Eksempel 2

Nedbrytning av r-RNA av E. coli T. 3000 ved pankreas ribonuklease A

r-RNA tilveiebringes med utgangspunkt av en kultur

av E. coli T 3000 ved en fremgangsmåte som tilsvarer den som er beskrevet i eksempel 1 for r-RNA fra E. coli M 500 Sho-R. Nedbrytningen av det tilveiebragte RNA utfores ifolge oppfinnelsen ved en pankreas ribonuklease-opplbsning (grad A)

på 5 mg/ml som på forhånd er holdt ved 100°C i 10 minutter (kokende vannbad) og deretter raskt avkjolt.

Man holder en blanding av r-RNA og ribonuklease

med den samme konsentrasjon av ribonuklease som i eksempel 1 ved 36°C, men i kortere tid: 20 minutter (istedenfor 30 minutter). /Hvis man anvender en forskjellige pankreas ribonukle-aseprbve, mer eller mindre krystallisert, må man tilpasse konsentrasjonen av ribonuklease eller behandlingstiden/.

Reaksjonen stoppes ved tilsats av en opplesning av fenol som inneholder 10% destillert vann (1 volumdel av denne opplbsning for 1 volumdel reaksjonsblanding) og blandingen omrores heftig for å eliminere ribonukleasen. Etter sentrifugering i 5 minutter ved 10.000 omdr./min., tilsettes vannfasen (den ovre) deretter til et tilsvarende volum av fenol, blandingen omrores og sentrifugeres. Operasjonen gjentas med kloroform (volumdel for volumdel). Etter skilling av fasene og gjentagelse to eller tre ganger, dialyseres vannfasen ved akseniske betingelser i 16 timer mot sterilisert destillert vann ved 4°C.

Mengden RNA-fragmenter som ikke er dialyserbare bestemmes ved absorbsjon i ultrafiolett ved 260 nm. Utbyttet av aktive RNA-fragmenter i forhold til den opprinnelige mengden ribosomt RNA varierer mellom 50 og 60%.

RNA-fragmentene bevares etter lyofilisering.

Elektroforese av akrylamidgel av RNA-fragmenter viser nærvær av en enkel topp RNA-fragmenter med mindre hbyde enn den tilsvarende RNA transfert 4 S som vist i fig. 2 hvor man som ordinat har absorbsjonen i 260 nm og som abscisse avstand-en etter 1 time 30 minutter (metode beskrevet av M. Beljanski, P. Bourgarel og Mme M. Beljanski, "Ann. Inst. Pasteur"' 1970, 118,

side 253).

Eksempel 5

Nedbrytning av r-RNA av E. coli T 3000 ved ribonuklease N,

Ribonuklease fra Neurospora crassa og fremstilt og renset ifolge K. Kasai et al, "J. Bio. Chem." 1969, 66,

side 389, krystallisert én gang, nedbryter polyribonukleo-tidkjeder på nivå med G-basen og dens virkning på r-RNA gjor det mulig å tilveiebringe RNA-fragmenter som er aktive i leukopiese og ved dannelsen av blodplater. Feigende betingelser anvendes: 100 mg av r-RNA fra E. coli T 3000 i opplesning i destillert vann behandles med 0,73 ml ribonuklease N-^ (opp-rinnelig opplosning 1000 enheter/2 ml). Behandlingstid: 30 minutter ved 36°C. Ribonukleasen elimineres umiddelbart med fenol og kloroform som beskrevet når det gjelder ribonuklease A; fragmentene dialyséres mot sterilt destillert vann. Det tilveiebragte produkt lyofiliseres.

Eksempel 4

Nedbrytning av r-RNA fra E. coli T 3000 ved hjelp av natriumhydroksyd eller kaliumhydroksyd

En opplbsning på 7 - 10 mg r-RNA/ml tilsettes en opplesning av NaOH eller KOH slik at den endelige konsentrasjon på de sistnevnte er 0,1N.

Behandlingen utfores ved 36°C i 30 minutter. Man nbytraliserer umiddelbart med et tilsvarende volum 0,1N HC1. Man dialyserer opplesningen mot destillert vann i 16 timer ved 4°C. Det ikke-dialyserbare produkt som tilveiebringes lyofiliseres. Etter hydrolyse av de forskjellige RNA-fragmenter fra eksemplene 2, 3 og 4 har man bestemt forholdet mellom pyrinbaser og pyrimidinbaser. Resultatene er gitt i etterfeigende tabell og er uttrykt i mol pr. 100 mol analy-serte nukleotider.

Der er ikke noen synbar, forskjell mellom RNA-fragmentene tilveiebragt_yed.de forskjellige nedbrytningsmidler som beskrevet foran og .i de,betingelser-som er beskrevet: hoydene er. praktisk talt like og alltid mindre enn hoyden for RNA 4 S (se fig. 2). -~ Farmakologiske egenskaper

Man har studert fordelingen, i organismen av .RNA-fragmentene P^ o.g P^ fra eksempel 1 merket med C- , etter, inn-sprøytning i mus eller kaniner, på intravenøs, .måte..

''RNA-fragmentene .P^ merket,. med.rC*£ oppsamles hovedsakelig i milten, mindre i leveren og finnes likeledes-i. • benmargen. RNA-fragmentet Py merket C 14, fins.likeledes og hovedsakelig i de samme, organer, men med et mindre- innhold. Ved å ofre de" behandlede mus, konstaterer man en. 8kning av volumet og vekten av milten (vist. i. fig,.. 3,. og..4) som bare gjelder de dyr * som ér behandlet .med P^.... I., fig. -3/ har.,man.:i.., ordinåteh vekten av milten ]i mg). og i. fig..4 vekten,,av-, leveren (i g) som eh funksjon av antall dager i som .abscisse)^ som., er

gått 'etter at dyret har mott att...en, dose--, på...0,3. mg., av,, produktet.. P^ (kurve 3) eller P^ (kurve. 4) pr. 20 g vekt av musen gjennom munnen "eller intraperitonealt. De, to, organer . har vunnet,, tilr bake sin normalvekt etter 5_-" 6. uker og. man,, finner ingen

radioaktiv rest noe som angir en naturlig eliminering. - -r -.

Virkningen på dannelsen .av leukosytter.og blodplater er blitt studert i kaniner,som...behandles, med..metqtreksat«.-.•• Hos de dyr som har'.'mottatt metotreksat_ (35 .mg..,I.M. pr.-kanin) observerer man en senkningen, på .ca... 3Q% av leukqsyttene . 48 . timer etter tilfbrsel av det antimitotetiske middel. Av 3 forsbks-dyr mottar så én kanin 2 mg subkutant-blandingen P^• + (i vektforholdet 1:1); én kanin mottar den-samme dose intra-. peritonealt og en tredje kanin inntar bare metotreksat (sam-menlignings dyr ) . De to kaniner behandlet med P^ + P^ har i lopet av 5 - 7 timer igjen fått et praktisk talt normalt nivå på leukosytter mens prøvekaninen, ikke har nådd dette nivå for etter ca.' 15 dager.

De samme kaniner mottar endelig en annen dose metotreksat ('55 mg I.':V;."pr. kanin)'pa dag 0 i fig. 5."-

To dager senere mottar én kanin 5 mg P^ + P^ (vekt-forhold: 1/1,5) I;.P.,1 én kanin mottar den samme dose sub^

kutant og den tredje kanin (det samme prbvedyr som i det forangående eksperiment) mottar bare metotreksat. - Resultat--

ene av analysen av innholdet: av leukosytter :i lopet av de to dager og etterpå etter 20. dager er -vist i fig. 5.

I fig. 5 hvor ordinaten viser innholdet .av leukosytter som en funksjon av antall dager (som-abscisse.) som er lbpt etter innsprøytningen av metotreksat, ser man at-virkningen av metotreksat-når-et meget lavt nivå med hensyn på leukosyttinnhold (prbvedyr:. kurve l)ymen dette er mindre fremtredende for de1 to kaniner "som er behandlet med P^ +- P^ subkutant (kurve 2) eller intraperitonealt,'. enri det er for : • provedyret.

Hos den.lcanin som :for annen gang. har mottatt P^ + P^ intravenøst (fig. 3) blir leukosyttriivået normalt etter 48 timer, oker mellom 24 og 48 timer, hvoretter." det stabiliserer . seg raskt. Hos den .kanin som har mottatt .P^ -.+ P^ ;subkutant.■... viser kurve 2 bkningen av leukosyttinnholdet '.og. at dette får sitt maksimum på den sjette dag for' deretter å 'stabilisere'

seg (fig. 5). I motsetning til dette vil innholdet av leukosytter hos prøvekaninen (som ikke? er. Ubehandlet medP^ + P^ holde seg på et lavt?nivå og dyret'får ikkei-normalt innhold av leukosytter i lopet av observasjonstiden.

Innholdet av rode" blodlegemer i:-de behandlede kaniner varierer ikke.

De farmakologiske- studier som er utfort med RNA- . fragmenter som er fremstilt med de forskjellige nedbrytningsmidler ifolge eksempel 2 -~ 4 har vist at det -ikke *er .noen vesentlig forskjell .på virkningen på leukopoiesen og .ved dannel-.. sen av plater mellom produktene og P^ fra eksempel 1 tilfort alene eller i blanding i et hvilket som helst forhold og. hvert av produktene fra eksempel 2-4.

En enkelt dose av hvert av produktene fra eksemplene- .. 2 - 4 (2 - 5 mg) tilfort intravenøst til kaniner som er sterkt,r.:-: og konstant immunosvekket (Daakosyttinnholdet er senket med. 60 - 70%) gjor det mulig å gjenopprette et normalt innhold.:Il leukosytter på 24 - 48 timer. Antall plater kan bkes med■ disse RNA-fragmenter med 50 - 100% i forhold til det antall, z..2 plater som finnes hos prbvedyrene. Fig. 6 viser resultatene.

i lopet av et eksperiment (20 - 30 dager) hos kaniner som er. ~ v kontinuerlig behandlet med "Endoxan" (65 mg/dag) og periodisk.-'.'7 med RNA-fragmenter tilveiebragt ved et av eksemplene -1 - 4.

I fig. 6 viser abscissen antall dager under eksperi-:: i - mentet hvor kaninene har mottatt 65 mg "Endoxan" per dag.. ;På '. i det tidspunkt som er angitt med pilen A mottar kaninene. 2 mg" RNA-fragmenter intravenbst. En av kurvene fra fig. -6 viser

som ordinat antall leukosytter og den andre kurven viser som -:"" ordinat antall plater.

Alle inntaksmåter kan anvendes for tilfbrsel ~av aktive RNA-fragmenter; intramuskulært (I.M.), intravenostr" :~

(I.V.), subkutant (S.C.), intradermisk (I.D.) og gjennom .: munnen. Reaksjonstiden varierer med den valgte tilf ors els-i- -. - metode og er en funksjon av doseringen av produktet. ^ I de i-, kaniner som ikke er behandlet med "Endoxan" og hvor blodsam- -"-mensetningen er normal, vil tilfbrsel av RNA-fragmenter "intra-ra-vens st ikke forandre innholdet av hvite blodlegemer r*: Hvis : : dosen er sterk, vil man konstatere en bkningi, men i .lbpét-av. 24 timer vil igjen innholdet av hvite blodlegemer være nor-~ - malt.

Virkningen av de forskjellige kjemiske og fysiskér.s preparater ("Endoxan", "Methotrexate.", "Thiotépa", -stråler) 7~

og likeledes en genetisk defisiens som fbrer til for lav' " dannelse av hvite blodlegemer og et for lavt innhold av plater": kan fra dette synspunkt balanseres ved hjelp av de forskjelligé-h-forannevnte RNA-fragmenter. Virkningen på dannelsen av plater. - : er mindre rask enn på hvite blodlegemer, men tillatér~en & k-' z.' :~ ning som raskt blir viktigere. Kliniske prover har -bekreftet resultatene.

Forlengelse av kjemoterapi gjor det nbdvendig med

ny tilfbrsel av RNA-fragmenter uten at dette reduserer virkningen.

Toksikologi

Produktene. P^. og P^. fra eksempel 1. og produktene

fra eksemplene 2-4 opplost i fysiologisk sterilt vann er tilfort mus og kaniner intravenøst, intraperitonealt, intramuskulært, subkutant og gjennom munnen. Doser på 1 - 5 mg i en enkel tilførsel til. mus og ,4,^ - 25 .mg til kaniner er an-vendt, og disse tilførsler er gjentatt på flere dager og opptil 15 dager if trekk uten at man .har kunnet påvise noen toksisk effekt.

Høyere enkeltdoser tilført gjennom munnen har ikke vist noen toksisk effekt.

Teratologiske studier har vist at tilførsel av produkter ifølge oppfinnelsen til drektige hunnmus ..ikke har noen negativ påvirkning hverken på .den første generasjon eller på etterfølgende generasjoner.

Produktene ifølge oppfinnelsen har derfor ingen uheldig virkning på dyret.

Terapeutisk anvendelse ....

Kliniske prøver har vist at produktene ifølge oppfinnelsen kan tilføres mennesket når der foreligger en leuko-feni eller en platedefi s i ens for å igjen få et normalt innhold av leukosytter og. plater uten ,å forandre resten av blod-sammensetningen. Det oppstår en ny likevekt mellom de forskjellige typer hvite blodlegemer.

Produktene er oppløselige i vann og kan tilføres •. parenteralt i form "av fysiologiske oppløsninger eller gjennom T munnen i form av kjente preparater (drikkelige oppløsninger, konsentrater, kapsler etc). Dosen som tilføres kan variere mellom 10 og 20 mg alt etter den sykdom som skal behandles og preparatene ifølge oppfinnelsen inneholder som aktivt produkt minst ett av produktene ifølge oppfinnelsen i en enkeltdose på fra 2 - 100 mg tilført et passende farmasøytisk bærestoff.

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av polyribonukleotider ved fragmentering av ribosome ribonukleinsyrer, oppnådde fra en mikroorganisme, karakterisert ved at man fragmenterer en RNA som oppviser et forhold (G + A)/(C + U) mellom 1,0 og 2,5, f.eks. oppnådd fra Escherichia coli T 3000, og at fragmenteringsreaksjonen gjennomføres ved tilsetning til en opp-løsning av RNA, av ribonuklease eller 0,1 N NaOH eller 0,1 N KOH og at den oppnådde oppløsning etter at reaksjonen er stoppet behandles med kloroform hvoretter den vandige fase separeres, dialyseres mot destillert vann og lyofiliseres.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man som mikroorganisme anvender Escherichia coli T 3000.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 og 2, karakterisert ved at nedbrytningen av ribonukleinsyrene utføres ved påvirkning av pankreas ribonuklease.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1 og 2, karakterisert ved at nedbrytningen av ribonukleinsyrene ut-føres ved påvirkning av en ribonuklease ekstrahert fra Neurospora crassa.

5. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-4,karakterisert ved at man etter å la ribonukleasen påvirke blandingen av ribosomale ribonukleinsyrer i 20-30 minutter ved 36°C stopper reaksjonen ved tilsetning av fenol, deretter kloroform og hver gang skiller vannfasen som man endelig dialyserer mot destillert vann og koker fraksjonen som ikke er dialyserbar som man lyofiliserer.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1 og 2, karakterisert ved at man lar 0,1 N natriumhydroksyd eller 0,1 N kaliumhydroksyd virke i 30 minutter ved 36°C hvoretter man umiddelbart nøytraliserer med et tilsvarende volum 0,1N salt-syre for deretter å dialysere den tilveiebragte oppløsning mot destillert vann i 16 timer hvoretter man lyofiliserer den ikke-dialyserbare fraksjon.