KR0134624B1 - 폴리뉴클레오티드의 제조 방법, 이와 같이 하여 얻은 생성물 및 이 생성물을 함유하는 약제 - Google Patents

폴리뉴클레오티드의 제조 방법, 이와 같이 하여 얻은 생성물 및 이 생성물을 함유하는 약제

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내용없음

Description

폴리뉴클레오티드의 제조 방법, 이와 같이 하여 얻은 생성물 및 이 생성물을 함유하는 약제
본 발명은 폴리뉴클레오티드(동종(同種) 뉴클레오티드 및 공중합 뉴클레오티드) 및 그의 복합체를 얻기 위한 개선된 방법, 또한 이와 같이 하여 얻은 신규 개질 생성물에 관한 것이다. 현행 기술에 의해 각종 폴리뉴클레오티드를 제조해 왔으나, 아직까지, 이와 같은 방법에 의해 얻은 생성물의 대부분은 목적 생성물을 얻기 위한 연속 단계에서 존재하는 약간의 불순물 또는 약품 때문에 일반적으로 발열성이거나 또는 다소 독성이 있다. 이 화합물들은 각종 치료 분야 및 더욱 구체 적으로는 암치료, 특정 세균성 및 비루성 질환의 치료에서 및 백신용보조제(adjuvant)이다. 결과적으로 본 발명은 활성 성분으로서 이와 같이 개선된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 치료 조성물에 관한 것이다.
일반적으로, 폴리뉴클레오티드는 적당한 뉴클레오티드 단량체에 대한 포릴뉴클레오티드 포스포릴라제의 작용에 의해 얻는다. ADP, CDP,GDP,IDP 및 UDP와 같은 여러가지 가능한 단량체는 널리 공지된 기술로 얻는다. 또한 폴리뉴클레오티드 포스포릴라제는 세균을 배양하고, 이와 같이 배양시켜 얻은 세균을 분해하고, 폴리뉴클레오티드 포스포릴라제에 의해 선택된 뉴클레오티드 단량체의 추가 중합 단계에서 경쟁자인 각종 효소(예, 키나제, 포스파타제, 뉴클레아제, 디에스터라제, 등)가 존재할 수 있는 복합 매질로부터 상기 분해시켜 얻은 풀리뉴클레오티드 포스포릴라제를 추출하는, 널리 공지된 기술에 의해 얻는다. 원치않는 여러가지 효소가 존재함으로써 중합화될 단량체 뿐만 아니라 중합된 중합체의 원치않는 반응 및 부분 분해도 일어난다.
이러한 이유로, 이와 같이 하여 얻은 대부분의 폴리뉴클레오티드는 독성 및 (또는) 발열성의면에서 단점이 있다. 분석용 또는 한정된 과학 실헙용으로 허용되는 순수한 포리뉴클레오티드 포스포릴라제를 소량 제조할 수는 있으나, 적당한 비용으로 공업적인 제조 기술을 사용하여 이를 제조하기는 쉽지 않다.
본 발명에 의하여, 본 발명자들은 공업적으로 수용할 수 있는 조건하에서, 중합제로서 선행 공지된 다양한 방법에 의해 얻은 폴리뉴클레오티드 포스포릴라제 제조물 대신 원치 않는 반응을 일으키는 오염물이 없는 고순도의 효소를 사용하여, 실질적으로 순수한 동종 중합체, 또는 공준합체, 또는 폴리뉴클레오티드의 복합체 또는 그의 유사 화합물의 복합체를얻을 수 있음을 발견하였다. 뉴클레오티드의 유사 동족체로서 예를 들면 ADP의 6-히드록시 알킬 유도체 또는 UDP의 5-할로 또는 5-OH 또는 5-메틸 유도체를 들 수 있다.
더욱 특별하게는 본 발명자들은, 세균 균주의배양 및 이와 같이 하여 얻은 배양균의 분해 후, 얻어진 배지를 3개의 컬럼, 즉 DEAE SephacelR또는 그의 등가물(等價物)과 같은 이온 교환 수지를 함유한 제1 컬럼, 페닐 SepharoseR또는그의 등가물과 같은 소수성 수지를 함유한 제2 컬럼 및 SephacrylRS300 또는 SephadexR200 또는 그의 등가물과 같은 분자체를 함유한 제3 컬럼에 연속 통과시키는 단리 방법으로 발견하였다.
상기 제3 컬럼에서 단리한 생성물은, 필수적으로 그러나 비독점적으로, 포리뉴클레오티드 포스포릴라제와 추가 중합 반응에 작용하지 않는 미량 물질로 이루어진다.
동종 중합체를 원하는 경우에는, 얻어진 폴리뉴클레오티드 포스포릴라제를 일반적인 시약 존재 하에서 선택된 단량체의 중합 반응에 사용한다.
공중합체를 원하는 경우에는, 단량체 대신에 적당한 비율의 선택된 단량체의 혼합물을 사용한다. 상기한 공중합체를 폴리 A/폴리 U라고 명명한다.
복함체를 원하는 경우에는, 각 적합한 단량체 별로 동일한 중합 반응을 수행하고, 생성된 각 동종 중합체를 NaCl 존재 하에서 적당한 비율로 혼합한 후 에탄올로 침전시킨다.
본 발명의 중요한 특징에 따라서, 선택된 단량체 또는 단량체의 선택된 혼합물의 중합 반응은 일반적인 중합 반응과 상이한 조건하에서 수행한다. 더욱 특별하게는, 사용된 농도는 일반적인 수치를 상당히 초과하는 양이고(약 30 내지 약 100 배 및 바람직하기로는 50 배), 중합 반응은 MgCl2를 조절 첨가하며 pH를 7.4내지 8.6으로 조절하며 약 3 내지 약 6일 동안 수행한다.
생성된 중합체 또는 공중합체는 일치하는 중합속도를 갖으며 중합률은 90-95%이며 분자량 약 250,000 내지 약 1,500,000인 복합체를 생성하는 분자량 범위를 갖는다.
본 발명은, 세균 배양(본 발명에서는 대장균을 사용하나 또한 기타 세균도 적합함)에서 시작하여 폴리 A/폴리 U의 복합체에 이르는 5가지 연속 단계에 대한 하기 상세한 설명에서 보다 쉽게 이해될 수 있다.
단계 1 : 대장균 B 1/5의 배양
배양균은 실온에서 천자(穿刺)중에 보관하였다.
배지는 1:1당 NaCl 10g, 트립티카제 10g 및 이스트 추출물 5g 을 함유하였다. 110℃에서 45분 동안 살균시킨 후, 따로 살균시킨 글루코오스 용액을 2g/1가 되도록 첨가하였다. 예비 배양액 10ml를 제조한 후, 배양액 10:1에 대한 배지 200ml를 제조하였다.
470 rpm에서 1분당 에어(air) 8:1를 공급하여 교반시켰다. δ600에서 배가 시간(doubling time)은 30분이었고, 600nm에서 광학 밀도가 6일때 세균을 수확하였다. 배양액 1:1당 균체 약 8g을 얻었다. 발효액의 pH를 2N NH4OH를 첨가하여 6.5 내지 6.8로 조절하였다. 바로 사용하지 않는 경우, 이 배양물을 -20℃에서 보관하였다.
단계 2 : 세균의 분해
완충액 A : 2×10-3M EDTA, 0.233M(13.63g/1) NaCl 및 (50m1/1) 글리세롤을 함유한, 5×10-2M Tris- HC1(pH 7.9, 25℃)
완충액 B : 10-4M EDTA, 0.2M NaCl 및 5% 글리세롤을 함유하는 10-2M Tris-HC1.(pH 7.9)
세균 165g을 얻기 위하여 20:1 배양.
사용하기 직전에, 실온에서 완충액 A 400ml에 0.1 M(15.4mg/ml) 디티오트레이톨(DTT) 0.4ml, 이어서 메르캅토에탄올 28μ1를 첨가하고, 리소자임 45mg및 에탄올 4ml 중에 용해시킨 페닐머틸술포닐플루오라이드(PMSF) 14mg을 첨가하였다. 냉동균 165g을 혼합기 중의 이 배지에 분산시키고(최종 온도 약 10℃이하), 이 현탄액을 때때로 혼합하면서 약 20분 동안 15℃까지 가온시킨 후, 나트륨 데옥시 콜레이트 272mg을 혼합하면서 첨가하고, 이어서 데옥시리보뉴클레아제(DN아제) 4mg을 첨가하였다. 온도를 20℃로 유지하며 분해 혼합물을 때때로 혼합시키면서 20분 동안 방치하였다. 여기에, 완충액 B 400ml 및 0.1M DTT 0.4ml를 혼합 시키면서 첨가하고, 5 ℃에서 현탄액을 16,000g로 (Sorvall 원심 분리기에서 10,000rpm) 1시간 동안 원심 분리하였다.
DN아제 50,679 Dornase 단위/mg.
리소자임 25,000 단위/mg.
원심 분리하여 얻은 상징액 약900ml를 증류수로 1:1까지 희석하고, 4℃ 에서 황산암모늄 280g을 교반시키면서 첨가하여(45% 포화) 단백질을 침전시킨 후, 이 혼합물을 4℃ 에서 2시간 동안 방치하였다. 5℃, 16,000g에서 30분 동안 원심분리하여 단백질을 회수하였다. 침전물을(상징액은 버림) 10-2M Tris-HC1(pH 7.8) 150ml 중에 용해시키고, 용액을 16,000g에서 20분 동안 원심 분리하여 불용성물질을 제거하였다. 4℃에서 상징액을 5×10-2M Tris-HCl(pH 7.8)에 대하여 18시간 동안 투석시킨 후(21×4), 16,000g에서 1시간 동안 원심분리하여 불용성 물질을 제거하였다.
300ml, pH 7.8, 전도율 7.0mS.
단계 3 : 폴리뉴클레오티드 포스포릴라제 콜리(coli) B 1/5 (PNP아제)의 정제
1.4℃에서, 상기 상징액을 0.1 M Tris-HCl(pH 7.4) 중에 평형시킨 DEAE Sephacel 280 ml의 컬럼(40×3cm) 상에 적재하고, 이 컬럼을 0.1 M Tris-HCl(pH 7.4) 11에서 0.4 M NaCl 중의 0.1 M Tris-HCl(pH 7.4) 11까지의 구배로 용출시켜 10ml씩 분획물을 모았다. 디에스터라제의 활성 피크 부분이 용출된 후, 이어서 제105 내지 제125 분획에 걸친 폴리뉴클레오티드 포스포릴라제 활성의 제2 피크를 0.1M Tris-HCl, 0.21 M NaCl로 용출시켰다.
용적 210 ml : 107 단위/ml (총 22,470)
2, 이 용액에 항산 암모늄 28g을 교반시키면서 첨가하여 0.5 M로 맞추고, 이어서 0.05 M Tris-HCl(pH 7.4), 0.5 M(NH4)2SO4중에서평형화시킨 페닐 Sepharose 60 ml의 컬럼(19×2cm) 상에 적재하였다. 이 컬럼을 0.1 M Tris-HCl(pH 7.4), 0.5 M(NH4)2SO4약 20 ml로 세척하고, 이어서 4℃에서 0.1 M(NH4)2SO4, 0.4 M Tris-HCl(pH 7.8) 250 ml에서 3×10-3M Tris=HCl([pH 7.8)까지의 역구배로 용출시켰다. 약 10ml씩 분획물을 받았다. 활성 분획을 모았다.
용적 55ml : 355 단위/ml(총 19.525).
3. 황산암모늄 20g을 교반시키면서 첨가하여 (55 % 포화) 단백질을 침전시키고 4℃에서 이 침전물을 1시간 동안 방치한 후, 16,000 g에서 15분 동안 원심 분리하였다. 잔류물을 0.05 M Tris-HCl(pH 7.4), 0.1 M NaCl 최소량(약 10 ml) 중에 용해시키고, 용액을 0.05 M Tris-HCl(pH 7.4), 0.1 M NaCl 중에 평형화시킨 Sephacryl S300 350 ml의 컬럼(50 x 3 cm)에 붓고, 효소를 동일한 완충액으로 용출시켰다(분획물 약 10 ml씩 받음). 활성 분획(13-17번)을 모았다.
용적 60ml : 312.5 단위/ml (총 18.750)
540 단위. δ280.
효소를 (NH4)2SO426g을 첨가하여(65%)포화 침전시키고, 현탄액을 -30℃ 에서 보관하였다.
단계 4 : 중합체 제조
ADP Na2100g(또는 UDP Na3100g)을 물 약 600ml에 용해시키고, 1M Tris-HCl(pH 8.3) 200ml, 1M 암모늄아세테이트 250ml, 0.1M EDTA(pH 8.0) 20ml, 1M MgCl2100ml가 들어있는 2 1들이 병에 첨가하였다. 용적을 물로 2 1가 되게하고, 실온에서 5N NH4OH로 pH를 8.6으로 조절하였다. 표면을 톨루엔층으로 피복하였다. 사용된 뉴클레오시드 디포스페이트는 Fe3+또는 Cu2+와 같은 오염 금속이 없는 것이어야 한다.
상기 혼합물의 일부(80ml)에 효소 200 단위 및 프라이머로서 상기 폴리A(또는 폴리 U) 제조물 2ml를 첨가하고, 이 용액을 37℃에서 2시간 동안 배양한 후 37℃로 유지시킨 주 배치(batch)로 옮겼다. 4시간 후 효소 300 단위를 더 첨가하고 계속 배양시켰다. 24시간 후 pH가 약 8.3까지 감소되었고, 그 후 5 N NH4OH를 첨가하여 pH를 8.0 내지 8.3으로 유지하였다.
전체 효소 단위 = 500, 즉 1g당 5단위.
중합 반응이 24시간 당 25%미만으로 일어날 경우, 효소를 더 첨가하여 속도를 적당한 배수로 증가시킬 수 있었다.
약 30 %, 55 % 및 75 % 중합 반응에서 1 M MgCl2추가량 25ml를 격렬하게 교반시키면서 첨가하고 ADP 또는 UDP 200 나노몰에 대해 Mg 총 175 밀리몰, pH를 8.0 내지8.3(37℃)으로 유지하였다. 3 내지 4일의 마지막에 중합 반응은80-90 % 일어나야 한다.
MgCl2를 조금씩 첨가하여 유리 ADP(UDP) 대 Mg의 비율을 상기한 중합 반응 수준에서 약 2로 유지시켰다.
반응 종결시에, 이 혼합물을 원심 분리하여 침전된 인산 암모늄 마그네슘을 제거하고, 침전물을 소량의 물로 세척하고, 합친 상징액을 폴리 A-폴리 U의 복합체 제조에 사용하였다.
중합 반응의 최적 조건은 pH 8.0 내지 8.3에서 MgCl2및 충분량의 효소를 조금씩 첨가하며 1일 약 30 % 중합율로 중합화하는 것이다. 반응 pH가 높으면(8.3 내지 8.6) 중합체의 수율이 감소하였다. 또한 반응 초기에 모든 Mg를 한꺼번에 첨가하면 중합체의 수율이 감소하였다.
단계 5 : 폴리 A - 폴리 U 복합체의 제조
100℃에서 0.1N NaOH 중에서 반응 혼합물을 5분 동안 가수 분해하고 폴리 A 에 대하여는 1000배 희석액 및 폴리 U에 대하여는 500배 희석액(예, 0.1N NaOH 10ml 중의 폴리 A 10㎕ 또는 폴리 U 20㎕ 또는 보다 정확하게는 A 100μ 및 U 200μ 의 중간 희석액)을 사용하여 용액의 총 뉴클레오티드 함량을 결정하였다.
260nm에서 흡광도를 측정하여 하기 값을 사용하여 몰농도를 측정하였다.
Figure kpo00001
중합체의 농도는 총 뉴클레오티드 농도 및 중합율로부터 결정하였다. 이어서 화학양론적 비 A/U=1:1에 대한 용적을 계산하였다. 10 1들이 병 중의 폴리 U에 25 % NaCl 수용액 200ml, 이어서 폴리 A 용액을 첨가하고, 이 용액을 완전히 혼합한 후(NaCl의 최종 농도 0.81 M 이하), 4℃에서 최소한 3시간 동안 방치하였다.
이어서 폴리 A-폴리 U를 침전시키기 위하여 동일 부피의 에탄올을 교반시키면서 첨가하고, 이 혼합물을 4℃ 에서 1시간 동안 방치하였다. Sorvall 3B(1 1들이 용기) 중에서 5,000 rpm에서 3분 동안 원심분리하여 복합체를 모은 후, 55 % 에탄올 2 1로 세척하였다. 잔류물을 정제수 약 4 1에 용해시키고 원심분리하여 남아있는 미량의 황산 암모늄 마그네슘을 제거하였다. 맑은 상징액에 25 % NaCl 200 ml를 첨가하고, 이 용액을 4℃에서 최소한 3시간 동안 방치하였다.
동일한 용적의 에탄올을 교반시키면서 첨가하여 이 복합체를 다시 침전시키고, 원심분리하여 모으고, 55 % 에탄올 약 2 1, 75 % 에탄올 및 96 % 에탄올로 세척한 후(2회), 진공 건조시켰다.
수율 약 110-120 g.
일반적으로, 50 % 에탄올로 복합체를 침전시키기 위하여, NaCl 0.15 M내지 0.02 M이 존재해야 한다. 세척하기 위해서는 적어도 55 %의 에탄올 수용액을 사용해야 한다.(침전된 복합체는 50 % 에탄올에서는 용해됨).
[독성]
복강내 및 정맥내 경로에 의해 마우스 및 쥐에 대해 LD50을 조사하였다.
마우스 또는 쥐에 정맥내 최대량 투여시 치사는 관찰되지 않았다.
또한 쥐에 복강내 투여시 치사는 관찰되지 않았으나 마우스 복강내 투여시 LD50은 3g/kg이었다.
일반적인 발열질 시험 결과는 완전히 음성이었다.
[약물학]
본 발명에 의한 중합체 및 공중합체가 일반적으로 공지되었으나, 지금까지, 공업적으로는 충분히 순수한 상태로 얻을 수 없으므로, 적합한 상업 조건 하에서는 실지로 얻을 수 없는 특별히 정제된 생성물의 시료에 대해서만 수년 동안 각종 약물학적 실험을 행하여왔다.
본 발명의 모든 중요성은 현존하는 참고 문헌 및 예를 들면 다음과 같은 논문에 의해 평가될 것이다.
MODULATION OF THE IMMUNE SYSTEM BY SYNTHETIC POLYNUCLEOTIDES - 에이. 쥐. 존슨(A. G. JOHNSON) - Springer Semin. Immunopathol, 제2호, 제149-제168페이지(1979년),
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CHANGS IN LYMPHOYTE SUBPOPULATIONS IN MICE RECEIVING A SINGLE INJECTION OF POLY A - POLY U - 엠, 도너(M. DONNER), 디. 발리어(D. VALLIER)와 에프, 라코르 (F. LACOUR) - Ann. Immunol. (Inst. Pasteur) 128C, 제1039 - 제1052페이지(1977년)
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REDUCED INCIDENCE OF SPONTANEOUS MAMMARY TUMORS IN C3H/He MICE AFTER TREATMENT WITH POLYADENYLATE - POLYRIDYLATE - 에프. 라코프, 쥐. 드라게(G. DELAGE) 및 씨. 췌이날레(C. CHIANALE) - Science, 제187호, 제256-제257페이지(1975년),
POLY A-POLY U AS AN ADJUNCT TO SURGERY IN THE TREATNENT OF SPONTANEOUS MURINE MAMMARY ADENOCARCINOMA - 에프. 라코르, 제이. 라코르(J. LACOUR) 및 에이. 스피라(A. SPIRA) - Recent results in Cancer Research, 제47권, 제352-제356페이지,
POLYADENYLIC-POLYURIDYLIC ACID : BIOLOGICAL RESPONSE-MODIFYING ACTIVITIES IN VIVO ORGAN DISTRIBUTION AND PHARMACOKINETICS IN RABBITS - 에프. 라코르 - J. Biol. Resp. Modif., 제4권, 제490권-제494페이지(1985년),
A PHASE I CLINICAL TOLERANCE STUDY OF POLYADENYLIC - POLYURIDYLIC ACID IN CANCER PATIENTS - 제이. 피. 듀크리트(J. P. DUCRET), 피. 카일(P. CAILLE), 에이취. 산쵸-가르니어(H. SANCHO-GARNIER), 제이. 엘.아미엘(J. L. AMIEL),엠. 미켈슨(M. MICHELSON), 알. 쥐. 호바네시안(R. G. HOVANESSLAN), 제이. 케이. 연(J. K. YOUN) 및 에프. 라코르 - J. Biol. Resp. Modif., 제4호, 제129-제133페이지(1985년),
상기 문헌의 방법에 따라, 폴리 A - 폴리 U의 항종양 효과를 다양한 실험적인 모델에서 몇가지 수준으로 실험하였다. 예를 들면, 신생 마우스에서의 이중 투여는 C3H 마우스에서의 백혈병 및 유방 선암의 두가지의 바이러스 유래의 종양에서 예방 효과를 나타내었다.
이외에도, 폴리 A - 폴리 U는 외과 수술에 대한 보조제로서 사용되는 경우 현저한 항종양 효과를 나타내었다. 이 효과는 C3H 마우스에서의 자생 유방 선암 및 햄스터에서이 전이성이 높은 흑색종의 두가지 실험적인 종양 모델에서 시험되었다.
[표시 및 약량학]
바람직한 투여 방법은 활성 성분을 0.01 내지 0.1g 함유한 등장액의 정맥내 투여하는 것이다. 6주 동안 주 1회 반복하여 주사한다.

Claims (8)

  1. 세균 배양물을 분해하고, 얻어진 배지를 연속적으로, 이온 교환 수지를 함유한 제1 컬럼, 소수성 수지를 함유한 제2 컬럼, 및 분자체를 함유한 제3 컬럼의 세 컬럼에 통과시켜 장차 중합 반응에 영향을 미칠 수 있는 물질이 없는 실질적으로 순수한 폴리뉴클레오티드 포스포릴라제 용액을 얻고, 통상적인 완충액 및 0.06 내지 0.2밀리몰/ml 농도의 선택된 모노뉴클레오티드를 함유한 용액을 pH를 7.4 내지 8.6으로 유지하면서 중합 반응의 정도를 조절하기 위하여 MgCl2를 조금씩 첨가하며 3내지 6일 동안 포스포릴라제 200 내지 750 단위로 처리함으로써 선택된 뉴클레오티드를 상기에서 얻은 포스포릴라제로 처리하고 상기에서 얻은 중합체를 분리 및 세척하고, 임의로 상기 동일한 조건 하에서 선택된 제2 뉴클레오티드의 중합 반응을 진행시키고, 이때, NaCl 존재 하에서 가가 선택된 중합체의 적당량을 물 중에서 혼합하고, 최종적으로 에탄올을 첨가하여 생성된 복합체를 침전시키는 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드 중합체의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 제1 컬럼이 DEAE SephacelR또는 그의 등가물(等價物)과 같은 이온 교환 수지를 함유하는 제조 방법.
  3. 제1항에 있어서, 베2 컬럼이 페닐 SepharoseR또는 그의 등가물과 같은 소수성 수지를 함유하는 제조 방법.
  4. 제1항에 있어서, 제3 컬럼이SephacrylRS300, SephadexR200 또는 그의등가물과 같은 분자체를 함유하는 제조 방법.
  5. 제1항 내지 제4항의 방법에 의해 얻은 뉴클레오티드 중합체 또는 공중합체.
  6. 제5항에 있어서, 출발 뉴클레오티드가 아데닐산 및 우리딜산인 공중합체.
  7. 제6항에 있어서, 폴리아데닐산 및 폴리우리딜산의 몰비가 약 50/50인 공중합체.
  8. 활성 성분으로서 제5항 내지 제7항에 의한 중합체 또는 공중합체의 유효량을 함유하는 암 치료를 위한 보조제로서의 치료 조성물.
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