PT88903B

PT88903B - Processo para a preparacao de polinucleotidos

Info

Publication number: PT88903B
Application number: PT88903A
Authority: PT
Inventors: Pierre-Etienne Cha Lassauniere; Acaye Soudhir Colote
Original assignee: Scras
Priority date: 1987-11-02
Filing date: 1988-10-31
Publication date: 1993-02-26
Also published as: US4927755A; PT88903A; IE61610B1; TNSN88113A1; KR0134624B1; GB2211847A; GB8725606D0; JPH01148196A; DK607388A; JPH0712316B2; NL194949B; FI885045A; CH676248A5; NL194949C; IT8822471A0; GB2211847B; SG40792G; GB8825399D0; CA1339911C; MY103445A

Description

A presente invenção refere-se a um processo aperfeiçoado para a obtenção de polinucleotidos (homo e co-polinucleotidos) e de complexos dos mesmos. Preparam-se diversos polinucleotidos de acordo com as técnicas existentes mas, até agora a maioria dos produtos obtidos era, geralmente hidrogénio ou mais ou menos tóxica, devido a presença de algumas impurezas ou agentes que surgiam ao longo da sucessão de passos que conduziam aos produtos desejados.

Estes compostos são adjuvantes em diversos âmbitos terapêuticos e, mais partieularmente no tratamento do cancro e de determinadas doenças bacterianas ou virais e, em vacinas.

Os polinucleotidos obtêm-se, geralmente,

pela acção de uma polinudleotido-fosforilase no monómero do nucleotido adequado. Obtêm-se, de acordo com técnicas bem conhecidas, os diversos monómeros possíveis tais como ADP,0DP, GDP, IDP e TJDP.

Também se obtém a polinueleotido-fosforilase, segundo técnicas bem conhecidas, a partir de uma cultura de bactérias, prosseguindo-se, depois, com a lise das bactérias obtidas na referida cultura, a que se segue a extraç ção da polinucleotido-fosforilase obtida na lise do complexo do meio de cultura, onde se podem encontrar diversos enzimas, tais como as quinases, as fosfatases, nucleases, di-esterases, etc, todos eles agentes competentes nos passos seguintes da polimerização do monómero do nucleotido escolhido, pela polinucleotido fosforilase. A presença de diversos enzimas não desejados comanda, paralelamente, reacções indesejáveis e a degradação parcial do monómero que se pretende polimerizar bem como o polímero produzido.

Por estaá razões, a maioria dos polinucleotidos assim obtidos, são defeituosos no que respeita às suas características de toxicidade ou firogénicas ou a ambas . Apesar de ser possível preparar uma polinucleotido-fosforilase aceitavelmente pura, numa escala pequena, para fins de análise ou para uma experiência cientifica limitada o mesmo não se verifica, facilmente,.a um preço aceitável utilizando técnicas de processamento industrial.

De acordo com a presente invenção, des cobriu-se ser possível obter em condições industrialmente aceitáveis, homopolimeros, ou copolimeros ou complexos de polinucleotidos ou de análogos muito próxima dos mesmos, subs tancialmente panos, utilizando, como agente de polimerização em vez das preparações de polinucleotido fosforilase, obtidos de acordo com os diversos métodos previamente descobertos, um enzima altamente purificado, isento dos contaminantes que comandam as reacções indesejáveis.

Os análogos mais próximos dos nucleó- 2 tidos podem incluir, por exemplo, derivados de ADP, 6-hidroxi alquilo on derivados de UDP, 5 - halo on 5 - OH on 5 - metilo.

Mais particularmente, deseobriu-se que após a cultura de uma estirpe de bactéria e de lise da cultura assim obtida, deve passar-se o meio resultante, sucessivamente por três colunas, contendo a primeira uma resina de permuta R de iões, tal como DEAE Sephacel ou um equivalente , contendo a segunda uma resina hidrofólica tal como fenil Sepharosâ ou um equivalente e a terceira coluna contendo um filtro moR R leoular tal como Sephacryl S300 ou Sephadex “ 200 ou qualquer equivalente.

produto que emerge da referida terceira coluna, compreende, esseneialmente mas não exclusivamente, polinucleotido-fosforilase conjuntamente com vestígios de substâncias desprovidas de acção no processo de polimerização posterior.

Se se pretender um homopolimero, utiliza-se a polinucleotido-fosforilase obtida para polimerização do monómero escolhido na presença dos agentes habituais.

Se se pretender um copolimero, substitui-se o monómero escolhido por uma mistura, em proporção a de, quadas, dos monómeros escolhidos. Designar-se-à o referido copolímero por Poli A/Poli H.

Se se pretender um complexo, efectuar-se-à a mesma polimerização, de cada um dos monómeros adequados e misturar-se-ão os homopolimeros resultantes, na proporção adequada, na presença de MaCe e e efectuar-se-à a precipitação oom etanol.

De acordo com uma característica importante da presente invenção, a polimerização do monómero ou escolhido ou da mistura escolhida, efectua-se em condições que diferem das habitualmente utilizadas. Mais particularmente, as concentrações utilizadas, estão muito além dos números habituais (de cerca de 30 vezes a cerca de 100 vezes e mais preferencialmente cerca de 50 vezes); efectua-se a polimerização

sob a àdição controlada de Mg Cl^, a valores de pH controlados entre 7,4 e 8,6 , com a duração de cerca de 3 a 6 dias.

Os polímeros e copolimeros resultantes possuem uma amplitude de pesos moleculares que proporciona complexos com pesos moleculares de cerca de 250 000 a cerca de 1500 000 com uma proporção de polimerização homogénea e uma produção de polimerização superior a 90-95 % .

Comprender-se-à melhor a invenção a partir da descrição da sucessão dos cincos passos seguintes, que exemplifica a partir de uma cultura de bactérias (aqui utilizau-se a E.Coli mas também se pode utilizar outra bacté ria), até a um complexo Poli A/Poli V.

Passo 1; Desenvolvimento da E. Coli B

1/5.

Guardou-se a cultura em orifícios, à temperatura ambiente.

meio de cultura contém, por litro, g de ffaCl, lOg de tripticase e 5g de extracto de levedura. Após esterilização durante 45 m a 110 °C, adicionou-se uma solução de glucose, esterilizada separadamente, a 2g/litro.

Efectuaram-se culturas prévias com 2ml, depois, preparou-se 200 ml de meio para 101 de cultura.

Agitou-se a 470 rpm com 81 de ar por minuto. 0 tempo de duplicação a ^600 é de 30 minutos e recolheram-se as bactérias a uma densidade óptica de a 600 nm. Obtiveram-se cerca de 8g por litro de cultura. Controlou-se o pH da fermentação entre 6,5 e 6,8 pela adição de 2Ϊ5Γ HH4 OH. Se não se utilizar de imediato, deverá armazenar-se a cultura a - 20 °C.

Passo 2: lise das Bactérias

Tampão A : Tris-HCl 5xl0“²M a pH 7,9 (a 25 °C contendo E D T A 2x10 M, HaCl 0,235 M (l3,63g/l) e glicerol a 5% (50 ml/l)

Tampão Bí Tris-HCl IO^-2 M a pH 7,9

contendo EDTA 10^ M, Na Cl 0,2 M e glioerol a 5$.

Para 165 g de bactérias (201 de cultura)

Imediatamente antes de se utilizar, adicionou-se 0,4 ml de ditiotreitol (DTT) O,1M (l5,4mg/ml a 400 ml de tampão A à temperatura ambiente seguindo-se 28 ml de mercaptoetanol, 45 mg de lizosima e 14 mg de fluoreto de £enil-metil-sulfonilo (PMSP) dissolvido em 4 ml de etanol. Dispersou-se neste meio as bactérias congeladas (l65g), num misturador (temperatura final ~i0°0) e deixou-se a suspensaã aquecer até 15 °C, misturando ocasionalmente (cerca de 20 minutos), adicionaram-se, depois, 272 mg de desoxi-colato de sódio, e misturou-se, seguindo-se 4 mg de desoxi-ribonuclease, (ADN ase). Deixou-se repousar a mistura de lise durante 20 minutos, misturando ocasionalmente e, manteve-se a temperatura a 20 °C.

Adicionou-se a tudo isto, misturando,

400 ml de tampão B mais 0,4 ml de DTT 0,1 M e centrifugou-se a suspensão a 16000 g (10000 rpm na centrífugadora Sorvall) durante 1 hora a 5 °0.

ADN ase: 50 679 unidades Domase/mg

Lisozima: 25 000 unidades/mg

Diluiu-se o sobrenadante ( ~ 900 ml) de centrifugação para 1 litro, com água destilada e preciputou -se a proteína pela adição de 280 g de sulfato de amónio (45$ de saturação a 4 °C com agitação, e deixou-se a mistura durante 2 horas a 4 °C,Recuperou-se a proteína por centrifugação a 16 000 g durante 30 minutos a 50 °C. Dissolveu-se o precipitado (puseram-se de parte os sobrenadantes) em 150 ml de Tris-HCl 10 M a pH 7,8 e centrifugou-se a solução durante 20 minutos a 16 000 g para remover o material insolúvel. Efectuou-se a diálise dos sobrenadantes com 4 mudanças de 21 de 5x 10 M Tris-HCl a pH 7,8 a 4 °C durante mais de 18 horas, e depois, centrifugou-se a solução durante 1 hora a 16 000 g para remover o material insolúvel.

300 ml, ρΗ 7,8, condâtividade 7,0 mS

Passo 3i Purificação da Folinucleotido-Fosforilase Ooli B 1/5 (PNP ase)

Verteram-se os sobrenadantes anteriores numa coluna de DEAE Sephacel (40x3 cm) de 280 ml, equilibrada em Tris-HCl 0,1 M a pH 7,4, a 4 °C e eluiu-se a coluna com um gradiente de 1 litro de Tris-HCl 0,1 M a pH 7 para 1 litro de Tris-HCl 0,1 em 0,4 de HaCl a pH 7,4, recolhendo fracções de 10 ml.

Eluiu-se um pico de actividade de di( esterose seguido por um segundo pico de actividade de polinucleotido fosforilase localizada nas fracções 105 a 125 eluidas com HaCl 0,21 M, Tris-H01 0,1 M.

Volume 210 ml : 107 unidades/ml Total 22470

Ajustou-se esta solução para 0,5 M em Sulfato de amónio pela adição de 28 g com agitação, depois verteram-se numa coluna de 60 ml de fenil Sepharose (19x2 cm) equilibrada com (NHn)₂ SO^ 0,5 M, Tris-HOl 0,05 M a pH 7,4. Lavou-se a coluna com cerca de 20 ml de (HH^ )₂ SO^ 0,5 M em Tris-HCl 0,1 M a pH 7,4 depois eluiu-se com 0 gradiente inverso de 250 ml de Tris-HOl 0,4 M a pH 7,8 em (HH^)₂ SO^ a 0,1 M para 3x10 M de Tris-HCl a pH 7,8 a 4 °C,. Fracções de 10 ml aproximadamente. Agrupargm-se as fracções activas.

Volume 55 ml : 355 unidades/ml Total 19525

Adicionou-se sulfato de amónio (20g) com agitação (55 $ de saturação) para precipitar a proteína e deixou-se 0 precipitado durante 1 hora a 4 °C, depois centrifugou-se durante 15 minutos a 16 000 g. Lissolveu-se 0 resíduo num mínimo de Ha01 0,1 M / 0,05 M Tris-HCl a pH 7,4 (cerca de 10 ml) e aplicou-se a solução numa coluna de 350 ml de Sephacryl S 3000 (50x3 cm) equilibrada com HaCl O,l/Tris—HC1 0,05 M a pH 7,4 e eluiu-se 0 enzima com 0 mesmo tampão (fracções de aproximadamente 10 ml).

Agruparam-se as fracçães activas (13-17).

ml de volume s 312,5 unidades/ml

Total 18 750

540 unidades . ^280 ^recipitou-se o enzima pela adição de 26 g de (NH^)g SO^ (65 $)âe saturação) e armazenou-se a sus pensão a - 30 °0.

Passo 4 : Preparação de Polímeros

Dissolveram-se 100 g de ADP Da2 (ou 100 g de uUDP Daj) em cerca de 600 ml de água e adicionou-se a;

200 ml de Tris-HOl M a pH 8,3 250 ml de acetato de amónio M ml delEDTA 0,:l M a pH 8,0 100 ml de MgClg M

Dum recipiente de 2 litros. Completou-se 0 volume até 2 litros com água e ajustou-se o pH para

8,6 à temperatura ambiente com 5 D. DH^ OH. Cobriu-se a superfície com uma camada de tolueno. Os difosfatos de nucleósidos utilizados deverão estar isentos de metais contaminantes

3+ 2+ tais como Pe ou Ou .

A uma aliquota da mistura anterior (80 ml) adicionaram-se 200 unidades de enzima e 2 ml de uma preparação prévia de poli A (ou poli XJ) como percursos e incubou-se a solução a 37 °C durante 2 horas, depois transferiu-se para 0 lote principal e manteve-se a 37 °C.

Após 4 horas adicionaram-se mais 300 unidades de enzima'e a incubação continuou. 0 pH deseer para cerca de 8,3 apóq 24 horas e, depois disso, manteve-se 0 pH de 8,0 a 8,3 pela adição de 5 D. DH^ OH.

Total de unidades de enzima = 500, isto é, 5 unidades por g. Se a polimerização prosseguir, pode adicionar-se, pelo menos 25 $ de enzima por 24 horas, para

aumentar a proporção para tempos apropriados.

Adicionaram-se quantidades adicionais de 25 ml de M. MgCl₂ com agitação vigorosa a uma polimerização de cerca de 30 #, 55 $ e 75 # (total de 175 nmoles para 200 nmoles de ADP ou UDP), mantendo-se o pH entre 8,0 e 8,3 (medição efectuada a 37 °C). No fim de três ou quatro dias a polimerização será de 80 - 90 #.

A adição passo a passo de MgCl₂ mantém a proporção do ADP (UDP) livre para Mg a cerca de 2, nos níveis de polimerização mencionados antes.

final da incubação, centrifugou-se a mistura para se remover o fosfato de magnés e amónio precipitado, sendo a precipitação.lavada com um pouco de água e os sobrenadantes combinados utilizados para preparar o complexo Poli A - Poli U.

As condiçães óptimas de polimerização são pH de 8,0 a 8,3 com adição, passp a passo de MgCl₂ e enzima suficiente para existir uma produção de polimerização de cerca de 30 # por dia. Um pH de incubação superior (8,3 ate 8,6) proporciona polímeros menores. A adição do Mg total no início da incubação também proporciona polimeros menores.

Passo 5 : Preparação do complexo Poli A - Poli U

Determinou-se o conteúdo nucleotidico total das soluçães por hidrólise da mistura de incubação em 0,1 N Na OH a 100 °C durante 5 minutos utilizando uma diluição de 1000 para poli A e de 500 para poli U (por exemplo 10 1 de poli A ou 20 1 de poli U em 10 ml de 0,1 N NaOH ou mais precisamente pela diluição intermédia de 100 1 de

A e 200 1 de U) mediu-se a absorção a 260 nm e estimou-se molaridade utilizando os seguintes valoees:

260 nmxlO p_ara soluçães molares pH 7.0 0.1 N NaOH (hidroli se)

Ap		15.3	15.3
Poli	A	9.8	15.3
Up		10.0	7.7
Poli	U	9.5	7.7

Determinaram-se as concentrações de polímeros a partir dos nucleotidos totais e da percentagem de polimerização. Calcularam-se, depois, os volumes para a proporção estequiométrica A/U = 1:1. Adicionou-se a poli U, num recipiente de 101, 200 ml de ITaCl aquosa a 25 %. Seguido pela solução de poli A e depois, deixaram-se as soluções completamente misturadas (concentração final de NaCl ~ 0,18 I) a 4 °C durante um mínimo de 3 horas.

Adicionou-se, então, igual volume de etanol com agitação ao precipitado poli A - poli U e deixou-se a mistura a 4 °C durante 1 hora. Recolheu-se o complexo por centrifugação num Sorvall” 3B (recipientes de 1 litro/) a 5000 rpm durante 3 minutos, depois lavou-se com 2 1 de etan a 55 %. Dissoveu-se o resíduo em cerca de 4 1 de égua pura e centrifugou-se para remover quaisquer vestígios de fosfato de magnésio amónio. Adicionou-se 200 ml de NaCl a 25 % aos sobrenadantes límpidos e deixou-se a solução a 4 °C durante um mínimo de 3 horas.

Precipitou-se novamente o complexo pela adição de um volume idêntico de etanol, com agitação recolheu -se por centrifugação, lavou-se com etanol a 55 % (cerca de 21), etanol a 75 % e duas vezes com etanol a 96 % e, depois secou-se no vacuo.

Proporcionou cerca de 110 - 12o g

Em gefcal, para a precipitação do complexo com etanol a 50 % tem de estar presente NaCl (0,15' M a 0,02 M). Para a lavagem deve utilizar-se etanol aquoso não inferior a 50 %. (0 complexo precipitado dissolve-se com eta nol a 50 %).

TOXICIDADE

Investigou-se o LD^q em ratos e ratazanas pelas vias IP e IV.

Hão foi referida qualquer morte quer em ratos quer em ratazanas pela administração IV de doses máximas.

Hão foi referida qualquer morte com a administração I P em ratazanas mas descobriu-se um de cerca de 3g/Kg no IP dos ratos.

Os ensaios pirogénicos habituais foram totalmente negativos.

Farmacologia

Uma vez que os polímeros e copolimeros de acordo com a presente invenção são, geralmente, conhecidos, mas, atá agora nunca àe obtiveram industrialmente num estado suficientemente puro, fizeram-se durante anos diversos ensaios farmacológicos em amostras de produtos especialmente purificados que não se obtinham fácilmente em condiçães comerciais razoáveis.

Todo o interesse da presente invenção poderá ser apreciado a partir da bibliografia existente, de que se fornecem os seguintes exemplos:

MODUDATIOH OF THE IMMUHE SYSTEM BY SYHTHETIC POLYOTOLEOTIDES

- A.G. JOHHSOlí - Springer Semin. Immunopathol., 2, pp 149-166 (1979),

REGULATIOU OF THE IMMUUE SYSTEM BY SYHTHTIC POLYEUOLEOΪIDES

- I. Characteristics of Adjuvant Action on Antibody

Synthesis - J.E. SOHIDTEE and A.G. JOHHSOH - J. Immunol.,

106, pp 1191-1200 (1971),

CHANGES IN LYMPHOOYTE SUBPOPULATIONS IN MICE RECEIVING A SINGLE INJECTION OE POLY A - POLY N-M. DONNER, D. VALLIER e E. LÁCONR - Ann. Immunol. (Inst. Pasteur) 1280, pp 1039-1052 (1977),

SPECTRUM AND MODE OE ACTION OE POLY A - POLY N IN THE STIMULATION OE IMMUNE RESPONSES - V. BRAUN; M. ISHIZUKA U. YAJIMA, D. WEBB e R. WINCHURCH in : BEERS R. E.,BRAUN W., Biological effects of polynucleotid.es

New-York : Springle-Verlag, pp 139-156 (1971)

RELUCED INCIDENCE OE SPONTANEOUS MAMMARY TUMORS IN C3H/He MICE AETER TREATMENT WITH POLYADENYDATE-POLYRIDYLATE - E. LACOUR, G. DELAGE and C. CHIANALE - Science, 187, pp 256-257 (1975),

POLY A - POLY U AS AN ADJUNOT TO SURGERY IN THE TREATMENT OE SPONTANEOUS MURINE MAMMARY ADENOCARCINOMA - E. LACOUR J. LACOUR and A. SPIRA - Recent Results in Câncer Research, vol. 47, pp 352-356,

POLYADENYLIC-POLYURIDYLIC ACID : BIOLOGICAL RESPONSE-MODIEYING ACTIVITIES IN MICE. IN VIVO ORGAN DISTRIBUTION AND PHÂRMAOOKINETICS IN RABBITS - E: LACOUR - J. Biol.

Resp. Modif., 4, pp 390-494 (1985)

A PHASE I ClINICAL TOLERANCE STUDY OE POLYADENYLIC-POLYURIDYLIC ACID IN CÂNCER PATIENTS - J.P. DUCRET, P. CAILLE,

H. SANCHO-GARNIER, J. L. AMIEL, M. MICÉELSON , R. G. HOVANESSIAN, J.K. YOUN e E. LACOUR - J. Biol. Resp.

Modif., 4, pp 129-133 (1985).

Apresentação e Posologia modo preferido de administração é a administração IV de uma solução isotónica contendo entre 0,01 e 0,1 g do ingrediente activo. Deverá repetir-se durante 6 semanas uma injecção semanal.

Claims

- ia Processo para a preparação de polímeros de nucleótidos caracterizado por incluir a seguinte sequência de passos:

- indução da lise de uma cultura de estirpe de bactérias e passagem do meio resultante sueessivamente através de três colunas :

. a primeira contendo uma resina persutadora de ides.

. a segunda contendo uma resina hidrofóbica.

. a terceira contendo um crivo molecular.

tratamento esse que proporciona uma solução de poli-nucleotido-fosforilase substancialmente pura no que se refere a su bstâncias que podem afectar um processo de polimerizaçãa posterior.

- tratamento do nucleotido seleccionado com a fosforilase assim obtida incluindo a reacção de 200 a 750 unidades aproximadamente de fosforilase numa solução que contém os tampões usuais e uma concentração de 0,06 a 0,2 nmoles/ml do mononucleotido seleccionado na presença de MgCl₂,. adicionada passo a passo para controlar o nível de polimerização, durante 5 a 6 dias aproximadamente enquanto se mantém os valores de pH entre 7,4 e 8,6.

- separação e lavagem do polímero assim obtido, procedendo eventualmente à polimerização de um segundo nucleotido seleccionado nas mesmas condições anteriores e, neste caso, misturando quantidades apropriadas de cada polímero seleccionado em água, iia presença de Na01 e finalmente precipitando o com plexo resultante por adição de etanol.

- 2§ Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a primeira coluna conter uma resina

- 12 y permutadora de ides tal como LEAE Sephacel⁺ ou qualquer equivalente.

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por _a segunda coluna conter uma resina hidrç, fóbica tal como fehil Sepharose ⁺ ou qualquer equivalente.

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a terceira coluna conter um crivo molecular tal como Sephcryl⁺ S 300, Sephadex⁺ 200 ou qualquer equivalente.

A requerente declara que o primeiro pedido desta patente foi apresentado na Grã-Bretanha em 2 de Novemhro de 1987, sob o n^ 87 25606.