SE503401C2 - Förfarande för framställning av polynukleotider, så erhållen produkt och farmaceutiska beredningar innehållande densamma - Google Patents

Description

15 20 25 30 35 503 401 bristfälliga när det gäller endera eller både deras toxicítet och deras pyrogena egenskaper. Även om det kan vara möjligt att framställa ett acceptabelt rent polynukleotidfosforylas í liten skala för analysändamål eller för en begränsad veten- skaplig experimentering uppnås inte detsamma lätt med använd- ning av industriella processtekniker Enligt denna uppfinning har det visat sig vara möjligt att under industriellt godtagbara betingelser erhålla väsentligen rena homopolymerer eller sampolymerer eller komplex av poly- nukleotider eller nära analoger därav genom att såsom polyme- riseringsmedel istället för polynukleotidfosforylasberedningar erhållna enligt de tidigare beskrivna olika metoderna, använda ett högrenat enzym fritt från föroreningar, som leder till icke önskvärda reaktioner. Nära analoger av polynukleotider kan inkludera 6-hydroxi-alkylderivat av ADP eller 5-halo- eller S-OH- eller 5-metyl-derivat av UDP t ex.

Isynnerhet har det visat sig att efter odling av en bakterie- stam och lys av den så erhållna kulturen bör det resulterande mediumet successivt passeras igenom tre kolonner. varvid den första innehåller ett jonbytarharts såsom DEAE-Sephacel® eller en ekvivalent, den andra kolonnen innehåller ett hydro- fobt harts såsom fenyl Sepharose® eller en ekvivalent och den tredje kolonnen innehåller en molekylsil såsom Sephacryl® S300 eller Sephadex® 200 eller vilken som helst ekvivalent därav.

Den produkt. som kommer ut från den tredje kolonnen innehåller huvudsakligen men inte uteslutande polynukleotidfosforylas tillsammans med spårmängder av substanser, som saknar inverkan på det vidare polymeriseringsförloppet.

Om en homopolymer önskas användes det erhållna polynukleotid- fosforylaset för polymerisation av den utvalda monomeren i närvaro av vanliga medel. till en godtagbar kostnad. 10 15 20 25 30 35 503 401 Om en sampolymer önskas ersättes den utvalda monomeren med en blandning i lämpliga proportioner av de utvalda monomererna, vilken sampolymer kan betecknas som poly A/poly U.

Om ett komplex önskas utföres samma polymerisation på varje lämplig monomer. och de resulterande homopolymererna blandas i ett lämpligt förhållande i närvaro av NaCl och utfälles med etanol.

Enligt en viktig faktor enligt uppfinningen utföres polymeri- sationen av den utvalda monomeren eller av den utvalda bland- ningen av monomerer under betingelser, som skiljer sig från vad som vanligen genomföres. Närmare bestämt ligger de använda koncentrationerna vida över de vanliga siffrorna (från ca 30 till 100 gånger och företrädesvis 50 gånger), varvid polymeri- sationen utföres under kontrollerad tillsats av MgCl2 under kontrollerade pH-värden från 7.4 till 8.6 och under en tid av ca 3 till ca 6 dagar.

De resulterande polymererna eller sampolymererna har ett mole- kylviktsintervall. som ger komplex med molekylvikter från ca 250 000 till ca l 500 000 med en homogen polymerisations- hastighet och ett polymerisationsutbyte upptill 90-95%.

Uppfinningen förstås bättre genom beskrivning av de följande fem stegen, som från en utgångsbakteriekultur (här E. Coli men andra bakterier är även lämpliga) leder till ett komplex av poly A/poly U.

Steg 1: Odling av E. Coli B 1/5 Kulturen hålles i stickkulturer vid rumstemperatur.

Odlingsmediumet innehåller per l 10 g NaCl, 10 g trypticas och 5 g jästextxrakt. Efter sterilisering 45 minuter vid ll0°C tillsättes en separat steriliserad glykoslösning innehållande 2 g/l. Förkulturer göres med 10 ml. varefter 200 ml medium framställes från en 10 l odling. 10 15 20 25 30 35 503 401 Omrörning vid 470 p/m med 8 1 luft per minut. 6600 är 30 minuter, Dubbeltiden vid och bakterierna skördas vid en optisk densitet om 6 vid 600 nm. Ungefär 8 g per l kultur erhålles.

Jäsningens pH kontrolleras till 6,5-6.8 genom tillsats av 2N NH40H. Om kulturen inte användes omedelbart ska den lagras vid -20°C.

Steg 2: Lys av bakterierna 2 M Tris HC1 pH 7,9 (vid 25°C) innehållande 1o'3 M EDTA. 0,233 M Nacl (13.s3 g/1) och glycerol (50 ml/1) ßuffer: A s x 10' 2 X 00 ßuffert B 1o'2 M fras-Hci ps 1,9 innehållande 10"* 0.2 M NaCl och 5% glycerol.

M EDTA.

För 165 g bakterier (20 1 od1ing)f Omedelbart före användning tillsättes o.4 ml ditiotreitol (DTT) 0.1 M (l5.4 mg/ml) till 400 ml buffert A vid rumstempe- ratur. följt av 28 ul merkaptoetanol. 45 mg lysozym och 14 mg fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) löst i 4 ml etanol. De frusna bakterierna (165 g) dispergeras i detta medium i en blandare (sluttemperatur l0°C). och suspensionen får värma till l5°C med tillfällig omrörning (ca 20 min), varefter 272 mg natruimdeoxicholat tillsättes under blandning, följt av 4 mg deoxiribonukleas (DNAase). Lysblandningen lämnas 20 min under tillfällig omrörning. och temperaturen hålles vid 20°C.

Till detta sättes 400 ml buffert B plus 0.4 ml 0,1 M DTT under blandning, och suspensionen centrifugeras vid 16 000 g (10 000 p/m i Sorvall-centrifug) under 1 timme vid 5°C.

DNAase 50 679 Dornasenheter/mg.

Lysozym 25 000 enheter/mg. Övervätskan (~ 900 ml) från centrifugeringen späddes till l l med destillerat vatten, och protein utfälldes genom till- sats av 280 g ammoniumsulfat (452 mättnad) vid 4°C under om- rörning. och blandningen fick stå vid 4°C under 2 timmar. 10 15 20 25 30 35 503 401 Protein utvanns genom centrifugering vid 16 000 g under 30 min vid 5°C. Fällníngen (övervätskan kastas bort) löstes i iso ml 10-2 under 20 min vid 16 000 g för avlägsning av olösligt material. Övervätskorna dialyserades mot 4 utbyten av 2 1 x 5 x 10-2 M M Tris HCl pH 7.8. och lösningen centrifugerades Tris HC1 pH 7.8 vid 4°C under 18 timmar. varefter lösningen centrifugerades 1 timme vid 16 000 g för avlägsning av olös- ligt material. 300 ml, pH 7,8, konduktivitet < 7.0 m8.

Steg 3: Rening av polynukleotidfosforylas coli Bl/S (PNPase) 1. Övervätskorna ovan sattes på en kolonn av 280 ml DEAE Sephacel (40 x 3 cm) i jämnvikt i 0,1 M Tris HCl pH 7.4 vid 4°C. och kolonnen eluerades med en gradient av 1 l 0.1 M Tris HC1 pH 7.4 till 1 l 0.1 M Tris HCl i 0,4 M NaCl pH 7.å under uppsamlande av 10 ml fraktioner. En topp av diesterasaktivitet elueras följt av en andra topp av polynukleotídfosforylas- aktivitet lokaliserad i fraktioner 105-125 eluerade med 0.21 M NaCl 0.1 M Tris HCI.

Volym 210 ml: 107 enheter/ml totalt 22 470. 2. Denna lösning justerades till 0.5 M i ammoniumsulfat genom tillsats av 28 g under omrörning och sattes sedan på en kolonn av 60 ml fenylsepharos (19 x 2 cm) i jämnvikt i 0.5 M (NH4)2S04 0.05 M Tris HCl pH 7,4. Kolonnen tvättades med ca 20 ml 0.5 M (NH4)2SO4 i 0,1 M Tris HC1 pH 7.4 eluera- des sedan med en omvänd gradient av 250 ml 0.4 M Tris HCl pH 7.8 i 0.1 M (NH4)2SO4 till 3 X 10v3 M Tris HCI pH 7,8 vid 4°C. Ca 10 ml fraktioner. Aktiva fraktioner grupperades.

Volym 55 ml: 355 enheter/ml totalt 19 525. 3. Ammoniumsulfat (20 g) sattes under omrörning (55% mättnad) för utfällning av protein, och fällningen lämnades vid 4°C under l timme, centrifugerades sedan 15 min vid 16 000 g. 10 15 20 25 30 35 503 401 Återstoden löstes i minimum av 0,1 M NaCl 0,05 M Tris HC1 pH 7,4 (ca 10 ml) och lösningen sattes på en kolonn av 350 ml Sephacryl S300 (S0 x 3 cm) bringad i jämnvikt i 0.1 NaCl 0.05 M Trís HC1 pH 7,4, buffert (ca 10 ml fraktioner). och enzymet eluerades med samma Aktiva fraktioner (13-17) grupperades.

Volym 60 ml: 312.5 enheter/ml total 18 750. 540 enheter 6280 Enzymet renades genom tillsats av 26 g (NH4)2SO4 (652 mättnad) och suspensionen lagrades vid -30°C. §;gg_g¿ Framställning av polymerer 100 g ADP Na: (eller 1oo g UDP m3) löses i ca soo m1 vatten och sättes till: 200 ml M Tris HC1 pH 8.3 250 ml M ammoniumacetat 20 ml 0.1 M EDTA pH 8.0 100 ml M MgCl2 i en 2 1 flaska. Volymen fylldes på till 2 l med vatten, och pH justerades till 8,6 vid rumstemperatur med 5 N NH40H.

Ytan täcktes med ett skikt av toluen. Nukleosiddifosfater som användes skall vara fria från kontaminerande metaller såsom Fe3+ eller Cu2+.

Till ett prov av ovanstående blandning (80 ml) sattes 200 en- heter enzym och 2 ml av en tidigare beredning av poly A (eller poly U) som primer. och lösningen inkuberades vid 37°C under 2 timmar. överfördes sedan till en huvudsats, som hölls vid 37°C. Efter 4 timmar tillsattes ytterligare 300 enheter enzym. och inkuberíngen fortsattes. pH sjunker till ca 8.3 efter 24 timmar. och pH hålles därefter vid 8.0 till 8,3 genom tillsats av 5 N NH4OH. 10 15 20 25 30 35 503 401 Totala enzymenheter = 500 I.E. 5 enheter per g. Om polymerisa- tion sker vid mindre än 25% per 24 timmar kan mer enzym till- sättas för att öka hastigheten vid lämpliga tidpunkter.

Ytterligare mängder av 25 ml M MgCl2 tillsättes under kraf- tig omrörning vid ca 30%. 55% och 75% polymerisation (totalt 175 mmol Mg för 200 nmol ADP eller UDP), varvid pH hålles vid 8,0 till 8,3 (mätt vid 37°C). Polyerisation skall vara 80-90% i slutet av tre till fyra dagar.

Stegvis tillsats av MgCl2 upprätthåller förhållandet mellan fritt ADP (UDP) och Mg vid ca 2 vid de ovan nämnda polymerisa- tionsnivâerna.

Vid slutet av inkuberingen centrifugeras blandningen för av- lägsning av det utfällda amooniummagnesiumfosfatet, varvid fällningen tvättas med litet vatten och de kombinerade över- vätskorna användes för framställning av komplexet poly A - poly U.

Optimala betingelser för plymerisering är pH 8.0 till 8.3 med stegvis tillsats av MgCl2 och tillräckligt enzym för att få en polymeriseringshastighet om ca 30% per dag. Högre inkuba- tions pH (8,3 till 8,6) ger mindre polymerer. Tillsats av to- talt Mg i början av inkuberingen ger också mindre polymerer.

Steg 5: Framställning av komplex poly A - poly U Totala nukleotidhalten i lösningarna bestämmes genom hydrolys av inkuberingsblandningen i 0.1 N Na0H vid l00°C under 5 min med användning av en spädning av 1000 för poly A och 500 för poly U (t ex 10 ul poly A eller 20 ul poly U i 10 ml 0,1 N NaOH eller mer exakt genom intermediär spädning av 100 ul A och 200 nl U). Absorption vdi 260 nm mätes och molaritet be- stämmes med användning av följande värden. 8 nm x 10-3 för molära lösningar 260 10 15 20 25 30 35 503 401 8 pH 7,0 0.1 N NaOH (hydrolys) AP 15.3 15.3 Poly A 9,8 15,3 Up 10.0 7,7 Poly U 9.5 7,7 Polymerkoncentrationer bestämmes från total nukleotid och procentpolymerisation. Volymer för ett stökiometriskt förhål- lande A/U = 1:1 beräknas sedan. Till poly U i en 10 l flaska sättes 200 ml 25% vattenhaltig NaCl följt av lösningen av poly A och lösningarna blandas grundligt (slutkoncentration av NaCl ~ 0.18 M) får sedan stå vid 4°C under ett minimum av 3 timmar.

En ekvivalent volym etanol tillsättes under omrörning för att fälla ut poly A - poly U, och blandningen lämnas vid 4°C under 1 timme. Komplexet uppsamlas genom centrifugering i ett Sorvall 3 B (l l kärl) vid S000 p/m under 3 min, tvättas sedan med 2 l 55% etanol. Återstoden löses i ca 4 1 rent vatten och centrifugeras för avlägsning av eventuella spårmängder av am- moníummagnesiumfosfat. Till de klara övervätskorna sättes 200 ml 25% NaCl. och lösningen lämnas vid 4°C under ett mini- mum av 3 timmar.

Komplexet utfälles igen genom tillsats av en ekvivalent volym etanol under omrörning. uppsamlas genom centrifugering. tvät- tas med 55% etanol (ca 2 1). 75% etanol och två gånger med 96% etanol, torkas sedan under vacuum.

Utbyte ca 110 - 120 g.

Som regel för utfällning av komplexet med 50% etanol måste NaCl (0,l5 M till 0,02 M) vara närvarande. För tvätt får inte mindre än 55% vattenhaltig etanol användas (det utfällda komp- lexet upplöses med 50% etanol). 10 15 20 25 30 35 503 401 Toxicitet LD50 har undersökts på möss och råttor med intraperitoneal och intravenös administrering.

Inget dödsfall noterades vid de maximala administrerade doserna intravenöst varken på möss eller råttor.

Inget dödsfall noterades heller vid intraperitoneal administ- rering till råttor men ett LD50 om ca 3 g/kg återfanns vid intraperitoneal administrering till möss.

Vanliga pyrogentester var totalt negativa.

Farmakologi Eftersom polymererna och sampolymererna enligt uppfinningen är allmänt kända men hittills inte erhållits industriellt i till- räckligt rent tillstånd har olika farmakologiska experiment utförts många år på prov av speciellt renade produkter. som inte i verkligheten kunde erhållas under rimliga kommersiella betingelser.

Allt intresse i uppfinningen kan uppskattas från existerande bibliografi och t ex från följande artiklar: Modulering av immunsystemet med syntetiska polynukleo- tider - A.G. Johnson - Springer Semin. Immunopathol.. 2, sid 149-168 (1979).

Regulering av immunsystemet med syntetiska polynukleo- tider - I. syntes - J.R. Scidtke and A.G. Johnson - J. Immunol.. 106, sid 1191-1200 (1971), Karakteristik av adjuvansverkan på antikropps- . Förändringar i lymfocytsubpopulatíoner hos möss som fått en enda injektion av poly A - poly U - M. Donner, D. Vallier and (Inst. Pasteur) l28C, sid 1039-1052 F. Lacour - Ann. Immunol. (1977), 10 15 20 25 30 503 401 10 Spektrum och verkningssätt hos poly A - poly U vid stimule- Ishizuka. U. Yajíma. D. Webb and R. Winchurch i: Beers R.F., Braun W.. "Biological effects of polynucleotides“ New-York: Springle-Verlag. sid 139-156 (1971), ring av immunsvar - V. Braun, M.

Reducerade fall av spontana mammarietumörer i C3H/He möss efter behandling med polyadenylat-polyridylat - F. Lacour, G.

Delage and C. Chianale - Science, 187, sid 256-257 (1975).

Poly A - poly U som tillskott till kirurgi vid behandling av spontana musmammarieadenokarcinom - F. Lacour, J. Lacour and A. Spira - Recent Results in Cancer Research, vol, 47. sid 352-356.

Polyadenyl-polyuridylsyra: biologiskt svar - modifierande aktiviteter på möss. Organfördelning in vivo och farmakokin- etik på kaniner - F. Lacour - J. Biol. Resp. Modif.. 4. sid 490-494 (1985), En fas i klinisk toleransstudie av polyadenyl-polyuridylsyra hos cancerpatienter - J.P. Ducret. P. Caille, H.

Sancho-Garnier. J.L. Amiel, M. Michelson. R.G. Hovanessian.

J.K. Youn and F. Lacour - J. Giol. Resp. Modif.. 4. sid 129-133 (1985).

Bgesentation och dosering Föredraget administreringssätt är intravenöst med en isoton lösning innehållande 0,01 till 0,1 g aktiv ingrediens. En injektion per vecka upprepas under 6 veckor.

Claims (9)

10 15 20 25 30 35 503 401 11 Patentkrav

1. Framställningsförfarande för nukleotidpolymerer känne- tecknat av följande stegfrekvens: - inducering av lys av en bakteriestamkultur och överföring av det resulterande mediumet successivt genom tre kolonner: . den första innehållande ett jonbytarharts, . den andra innehållande ett hydrofobt harts och . den tredje innehållande en molekylsil, vilken behandling leder till en polynukleotidfosforylas- lösning, huvudsakligen ren med avseende på substanser, som kan påverka en ytterligare polymeriseringsprocess, - behandling av den utvalda nukleotiden med det så erhållna fosforylaset varvid ca 200 till ca 750 fosforylasenheter omsättes med en lösning innehållande de vanliga buffertarna och en koncentration av 0,06 till 0,2 mmol/ml av den utvalda mononukleotiden i närvaro av MgCl2, stegvis tillsatt för kontroll av polymerisationsgraden under en tid av ca 3 till ca 6 dagar, under det att pH-värdena hålles mellan 7,4 och 8,6, - separation och tvätt av den så erhållna polymeren, varigenom en väsentligen pyrogenfri och/eller väsentligen icke-toxisk polymer erhålles varvid man eventuellt fortsätter till polymerisation av en andra utvald nukleotid under samma betingelser som ovan och i detta fall, blandas lämpliga mängder av varje utvald polymer i vatten i närvaro av NaCl och slutligen utfälles det resulterande komplexet genom tillsats av etanol. 10 15 20 25 30 503 401 12

2. Förfarande enligt krav 1, kännotecknat av att man utför polymerisationen av en andra utvald nukleotid under samma betingelser som i krav 1 och av att varje utvald polymer blandas i lämpliga mängder i vatten i närvaro av NaCl och slutligen utfälles det erhållna komplexet med etanol.

3. Framställningsförfarande enligt krav 1, kännotocknat av att den första kolonnen innehåller ett jonbytarharts såsom DEAE-Sephacel® eller en ekvivalent därtill.

4. Framställningsförfarande enligt krav 1, kännetocknat av att den andra kolonnen innehåller ett hydrofobt harts såsom fenyl-Sepharosefl eller en ekvivalent därtill.

5. Framställningsförfarande enligt krav 1, kännotecknat av att den tredje kolonnen innehåller en molekylsil såsom Sephacrylfl S300, Sephadexfl 200 eller en ekvivalent därtill.

6. En polymer eller sampolymer av nukleotider, kännotocknat av att den erhålles enligt förfarandet i kraven 1-4.

7. En sampolymer enligt krav 5, kännetocknad av att utgångs- nukleotiderna är adenylsyra och uridylsyra.

8. Sampolymeren enligt krav 6, kännotocknad av att propor- tionerna av polyadenylsyra och polyuridylsyra är ca 50/50 uttryckt i mol.

9. En terapeutisk materialkomposition, kännetecknad av att en aktiv ingrediens där är en effektiv mängd av en polymer eller en sampolymer enligt kraven 5-7.