JPH02500002A

JPH02500002A - 植物の微生物に対する応答の変化

Info

Publication number: JPH02500002A
Application number: JP62503044A
Authority: JP
Inventors: ロルフェ，バリィ　ガース; チェン，ハンカイ; ドジョードジェビック，スチーブン　フィリップ; レッドモンド，ジョン　ウィリアム; バットリィ，マイクル
Original assignee: ジオーストラリアンナショナルユニバーシティー; マックアリー　ユニバーシティー
Priority date: 1986-05-13
Filing date: 1987-05-13
Publication date: 1990-01-11
Also published as: EP0326545A4; WO1987006796A1; EP0326545A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】植物の微生物に対する応答の変化本発明は、植物の微生物に対する応答を変化させるための組成物と方法に関する。ある特定の態様において本発明は、植物のりゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　）属の微生物に対する応答の変化に関するが、広い意味において本発明は、植物の他の微生物（他の細菌、かび及びウィルス、を含む）に対する応答の変化にも関するものと理解するべきである。

公知のように微生物の勢力又は影響を制御する方法としては、従来化学噴霧剤や殺虫剤が使用されてきた。

しかし化学薬剤の多くは許容できない濃度の残存物などを産生ずるために、生態学的に好ましくないと考えられている。従って生物学的に分解可能で生態学的に許容される、微生物の制御手段が強く望まれている。

本発明にいたる研究において、ある種の生体分子は植物の応答を引き起こす（実際には、特に侵入する微生物に対する植物の応答能力を引き起こしたり停止させたりする）ことができることがわかった。従って一般的にこれらの生体分子を基礎にして、例えば病原体となシうる物質からの植物の保護能力を増加させる系を開発できる。

本発明の第一の態様は、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　）属の細菌から得られるエキソポリサッカライド類、又は該エキソポリサッカライド類のひとつ又はそれ以上の繰シ返し単位よシなるか又は該繰シ返し単位を含有するオリゴポリサッカライド類よシなる、植物の微生物に対する応答を変化させるのに使用する組成物を与える。

別の態様において、植物を微生物に接触させる前、後又は同時に、該植物を有効量の広義に記載した上記の組成物で処理する段階よりなる、植物の微生物に対する応答を変化させる方法を与える。

本発明のある特定の実施態様において、該組成物は添付の図１ａ又は図１ｂに記載オリゴポリサッカライｒ繰り返し単位を有することを特徴とする、リゾビラ体から得られるエキソポリサッカライド類よシなる組成物を与える。

一般的に本発明は、例えば作物の収量を増加させるために、又はよシ効率的に窒素産生をさせて生産コストを低下させるために、侵入する微生物に対する植物の防御能力を制御することを目的とする、細菌性のエキソポリサッカライド類又はそこから得られるオリゴポリサッカライド類を使用することを基礎にしている。

本発明の組成物は、侵入する生物に対する応答に影響を与えるため植物（特に若い植物）に局所投与するための、園芸学的に又は農学的に許容される従来の希釈剤又は担体を含む、例えば噴霧剤、粉剤又は散剤として調剤される。

リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　）属の多くの野生株の特徴は、多量のエキソポリサッカライド類を産生じムコイドコｏ　＝　−（ｍｕｃｏｉｄ　ｃｏｌｏｎｙ　）を作ることができることである。これらのエキソポリサッカライド類は、植物−リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　）共生に重要な機能（例えば化種特異性の決定）を有するといわれている。上記に概説したように、これらのエキソポリサッカライド類又は該エキソポリサッカライド類のひとつ又はそれ以上の繰り返し単位よりなるか又は該繰シ返し単位を含有するオリゴポリサッカライド類は、植物の微生物に対する応答を変化させるのに使用できることが明らかになった。

以下の説明においては、具体的に植物の窒素固定性根粒の開発への本発明の広義の応用に関して記載する。

しかしこの記載は例示のためであシ、決して本発明を限定するものではない。

添付の図１は、以下の具体例に使用されるオリゴポリサッカライド類の繰り返し単位の化学構造を示して２３４株の誘導体）の酸性オリゴポリサッカライド類の繰り返し単位の構造であシ、（ｂ）は、ＡＮＵ　８４３　（リゾビクムトリ７オリイ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｔｒｉｆｏｌｉｉ　）のひとつの株）の酸性オリゴポリサッカライド類の繰り返し単位の構造である。

土壌細菌リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　）と特定の豆科植物との複雑な多段階相互作用によシ、豆科植物の根に窒素固定根粒が誘導される（ロルフエら（Ｒｏｌｆｅ　ｅｔ。

ａ、１）、１９８１年）。この相互作用の初期の特徴は、根毛細胞が変形又は渦巻状になることである。２４時間後に根毛の細胞壁が和合性のりゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）株により貫通され、この細胞の核が感染部位に移行した後感染糸（ｊ、ｎｆｅｃｔ、ｉｏｎ　ｔｈｒｅａｄ　）が合成される（カラハムとトレイ（Ｃａｌｌａｈａｚａｎｄ　Ｔｏｒｒｅｖ　）　１９８１年：リッジとロルフｘ　（Ｒｉｄｇｓ、　ａｎｄ　Ｒｏｌｆｅ）　１９８５年）。細菌は感染系内の根の皮層に運ばれ、そこで活発に分裂する。感染糸の合成開始の少し前又は同時に、おそらく細菌に放出される拡散性の物質により、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）株により皮層の細胞分裂が誘導されると考えられている（パウアー（Ｂａｕｅｒ　）　１９８１年；ｌぐウアーら（Ｂａｕｅｒ　ｅｔ、　ａｌ、）　１９８５年）。

リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　）−豆科植物相互作用のもうひとつの特徴は化種特異性である。例えば増殖の速い（温帯性（”　ｔｅｍｐｅｒａｔｅ″））リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）株は、普通ひとつの植物種にのみ根粒を形成し、増殖の遅いブラジリゾビウ（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　）株は典型的には化種の範囲が広い。一方増殖の速いり・アビウム１９８０年）は、異常に広い化種の範囲を有し、種々の熱帯性（ｔｒｏｐｉｃａｌ　）及び温帯性豆科植物から、非豆科の木であるパラスボニアアンデルソニイ（Ｐａｒａｓｐｏｎｉａａｎｄｅｒｓｏｎｉｉ　）を含む（トリニックとがルブレイス（Ｔｒｉｎｉｃｋ　ａｎｄ　Ｇａ１ｂｒａｉｔｈ　）　１９８０年）。

共生生物同士の最初の相互作用は、細胞表面の分子は両生物の表面で起きるため感染の結果を決定するのに重要である。リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　）細菌は特徴的に、種々の実験室培地上で多量のエキソポリサッカライド類（ＥＰＳ　）を産生じ、形成されるコロニーの外観はムコイｒ状（Ｍｕｃ”）である。

リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　）ポリサッカライド（特にＥＰＳとυ′ポポリサツカライド（ＬＰＳ　）　）は、根毛表面への特異的吸着（タゾら（Ｄａｚｚｏ　ａｔ、　ａｌ、　）　１９７８年）や化種特異性の決定（ダッドマン（Ｄｕｄｍａｎ　）１９７７年）などの、植物と細菌の初期の認識段階に関与していると考えられている。ＥＰＳの真の役割に関しては議論の分かれるところであるが、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　）株が実験室の培地上で普通のＥＰＳを産生ずる能力と、豆科植物上に窒素固定根粒（Ｆｉｘ”）を産生ずる能力の間に良好な相関関係が存在する。リゾビウムトリフオリゴ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｔｒｉｆｏｌｉｉ　）　（チャクラポルティーら（Ｃｈａｋｒａｖｏｒｔｙ　ｅｔ、　ａｌ、　）　１９３５年とＮＧＲ２５４（チェ７ら（Ｃｈｅｎ　ｅｔ、　ａｌ、）　１９８５年）のトランスポゾン（Ｔｎ　５　）誘導性のいくつかの変異株は、（しばしば弱いが）まだ豆科植物に感染できるが、窒素固定根粒を形成することはできない。リゾビウムトリフオリゴ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｔｒｉｆｏｌｉｉ　）とＮＧＲ２３４株のＭｕｃ−変異体に誘導された根粒を顕微鏡観察すると、いくつかの植物上の根粒は発育が悪く、分裂細胞の数は少なく、仮細菌（ｂａｃｔｅｒｏｉｄｓ　）はほとんど又は全く存在しないことが証明される（チャクラざルテイーら（Ｃｈａｋｒａｖｏｒｔｙ　ｅｔ、　ａｌ　）　１９８２年）。こ−ク（ｃａｌｃｏｆｌｏｒ−ｄａｒｋ　）　（Ｍｕｃつ変異体は、アルファルファ植物に検出できるほどの根毛の渦巻又は感染糸形成を誘導することは不可能であシ、ＥＰＳは根粒形成でなく根粒侵入に関与していることを示している（レイら（Ｌｅｉｇｈ　ｅｔ、　ａｌ、　）　１９８５年）。

ＥＰＳが根粒の発育に重要であるかもしれないと最初に指摘されたのは、侵入性Ｍｕｃ−株５Ｕ８４６とＭｕｃ”、Ｎｏｄ−株５Ｕ８４７を使用した細胞混合実験からである。Ｍｕｃ”、Ｎｏｄ−株５Ｕ８４は、多くの基本的な根粒遺伝子及び窒素固定遺伝子を移動させるＳｙｍプラスミツド中で広範囲の欠失がある。クローバ−植物に単独で接種されたＭｕｃ−１Ｎｏｄ＋株は根粒の形成が悪く、窒素を固定することができなかった。しかしこれらの株を含む混合接種液は、クローバ−上にある程度の充分に機能する窒素固定根粒を誘導することができた。この２つの株の間で遺伝子の移動は検出されなかった（ロルフエら（Ｒｏｌｆｅ　ｅｔ、　ａｌ−）　１９８０年）。

共生におけるＥＰＳの役割を決めるのに使用された方法は、特異的非ムコイド性（Ｍｕｃ−）変異体の単離である。ＮＧＲ２３４の９０以上のＴｎ　５−誘導性ＥＰＳ欠陥株（これらはこの株の染色体上にあることがわかった−（チェノら（Ｃｈｅｎ　ｅｔ、　ａｌ、　）１９８５年））が単離された。さらに化種範囲の広い細菌ＮＧＲ２３４のＥＰＳの正確な構造が決定された（ジョルジェピックら（Ｄｊｏｒｄｊｅｖｉｃ　ｅｔ、　ａｌ−）　１９８６年ａ、ｂ）。

ＮＧＲ２３４のいくつかのＴｎ　５−誘導性変異体は酸性型ＥＰＳをほとんど産生じない（親株ＡＮＵ　２８０が産生ずる量の５チ以下）か又はまったく産生ぜず、数種の化種植物上で窒素固定根粒を誘導することが明らかになった。さらにこれらの１９ζｕｃ−変異体は、ＮＧＲ２３４により合成されるＥＰＳの繰り返し単位を形成する精製したオリゴサツカライド分子の添加によシ補正された、共生表現型を有することが証明された。この結果は、窒素固定性根粒の発育にリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　）ＥＰＳ類が基本的な役割を果たしていることを示している。

材料と方法本研究に使用された細菌株は表１に記載しである。

使用した全ての培地（ＢＭＭ、　ファーラエウスＦａｈｒａｅｕｓ　）　）は既に説明されている（ロルフェら（Ｒｏｌｆｅ　ｅｔ、　ａｌ、）　１９８０年）。

共同接種（ｃｏｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ　）実験ＡＮＵ　２８　［１のＭｕｃ− 変異株とＡＮＵ　２８０とＡＮＵ　８４３の菌株のＳｙｍ　７′ｌ＋ラスミツド −回復（ｐｌａｓｍｉｄ−ｃｕｒｅｄ　）誘導体を、８ＭＭ寒天平板上で２日間増殖させた。菌株を光学密度が同じになるまで増殖させ、約１：１の比率で混合してから、無菌の３日令のルーシーナ（Ｌｅｕｃａｅｎａ　）の苗木に接種した。

ポリサッカライ「類の単離と精製ＡＮＵ　２８０、ＡＮＵ　２８１１、ＡＮＵ　２８２０、そしてＡＮＵ　２８４０　株’に！ルタミン酸−Ｄ−マンニトール塩培地（ジョルジェピックら（Ｄｊｏｒｄｊｅｖｉｃ　ｅｔ、　ａｌ、）１９８６年ｂ）で増殖させた。０．１μのフィルターのついたアミコン（Ａｍ１ｃｏｎ　）　Ｄ　Ｃ１０Ｌホローファイバー濾過装置を用いてＥＰＳを単離し、既に記載されている）ゾヨルジエビックら（Ｄｊｏｒｄｊｅｖｉｃ　ｅｔ−ａｌ、）１９８６年ｂ）セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）として沈澱させてさらに精製した。同様に（Ｈ１０Ｐ３− ２０）フィルターを用いてホローファイバー濾過にょ９酸性オリゴサツカライドを単離した。酸性オリゴ妥ツカライドはＣＴＡＢ塩としては沈澱させなかった。

粗オリゴサツカライド類をＤＥＡＥ−セファデックスＡ２５カラムで分画し、既に記載された方法（ジョルジェビックら（Ｄｊｏｒｄｊｅｖｉｃ　ｅｔ、　ａｌ、）　１９８６年）によりヘキソースとウロン酸を分析した。ＢＭＭ寒天上に発芽した無菌の苗木をファーラエウス（Ｆａｈｒａｅｕｓ　）寒天に移植し、寒天表面上に１６時間放置して安定化させた。

ＥＰＳ又はＥＰＳ由来のオリゴサツカライドの保存溶液（５ｒｎ９／ゴ）を分注したもの（５又は１ｏμｔ）を６日令の苗木の長さに沿って塗った。これらの酸性サツカライドはりゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　）細菌の接種と同時、又は２４時間前又は後に添加した。

ａｔｒｏｐｕｒｐｕｒｅｕｍ　）　（Ｄ　Ｃ）アーバン（Ｕｒｂａｎ　）　（シラｒｅｐｅｎｓ　）　（Ｌ　）　ｃ、ｖ−５８２６（ホワイトクローバ−）につき、平板法（ロルフェら（Ｒｏｌｆｅ　ｅｔ、　ａｌ、）　１９８０年；チェノら（Ｃｈｅｎ　ｅｔ’、　ａｌ、　）　１９８２年）により根粒形成について試験した。ルーシーナルーコセファラ（Ｌｅｕｃａｅｎａ　１ｅｕｃｏｃｅｐｈａｌａ　）ラム（Ｌａｍ　）ウィツト（Ｗｉｔ）ペルー変種（ｖａｒ　ｐｅｒｕ　）について、チェノら（Ｃｈｅｎ　ｅｔ、　ａｌ、）　（１９８５年）の方法に従い根粒形成の試験をした。

光学顕微鏡用の根粒切片の調製既に記載された方法（チェノら（Ｃｈｅｎ　ｅｔ、　ａｌ、）１９８５年）に従い光学顕微鏡用の試料を調製した。

変異体ＡＮＵ　２８０、ＡＮＵ　２８１１、ＡＮＵ　２８２０　。

そしてＡＮＵ　２８４０は、エキンポリサッヵライド合成能に欠陥のあるＮＧＲ２３４株のＴｎ　５−誘導変異体である。これらの株は全ての実験室培地上で非ムコイド性（Ｍｕｃ−）コロニーを形成し、異なる豆科植物上で欠陥のある共生表現型（性質）を有する（チェノら（Ｃｈｅｎ　ｅｔ、　ａｌ、）　１９８５年）。これらの株中のＴｎ５挿入部分は異なるｒツムＤＮＡ断片中に存在することが証明された（表１）。ホローファイバー濾過にょシ得られた両保持部分の比色分析から、ウロン酸含有サツカライドはほとんど又は全く検出されなかった。これらのＭｕｃ−株の表面ポリサッカライドのクロマトグラフィー分析により、これらの株は検出できるほどの酸性オリゴサツカライドを産生じないことが分かった。

これに対して親株のＡＮＵ　２８０は同じ条件で培養する時、ダラム量のＥＰＳと関連オリゴサツカライドを産生ずる。これらＭｕｃ−変異体の各々のＴｎ　５の位置が異なっているにもかかわらず、ＡＮＵ　２８１１、ＡＮＵ２８４０、そしてＡＮＵ　２８２０株はルーシーナ（Ｌｅｕｃａｅｎａ　）植物上で共通の根粒欠陥性表現型を有しておシ、シラトロ（５ｉｒａｔｒｏ　）植物上で異なる表現型を有している。これらのＭｕｃ−変異体はルーシーナ（Ｌｅｕｃａｅｎａ　）植物上に無秩序なカルス（ｃａｌｌｕｓ　）様の構造を形成し空気中の窒素を固定しないが、及び株は不定形の窒素固定根粒を誘導する（チェノら（Ｃｈｅｎ　ｅｔ、　ａｌ、）　１９８５年）。シラトｏ　（ｓｉｒａｔｒｏ　）上ではＭｕｃ−変異体ＡＮＵ２８３０とＡＮＵ　２８１１は小さな非窒素固定根粒を産（チェノら（Ｃｈｅｎ　ｅｔ、、ａｌ、）　１９８５年）。Ｍｕｃ−株ＡＮＵ　２８４０は検出できるほどの酸性オリゴサツカライドを産生しないが、（ＡＮＤ２８４０株よシ単離された）０．１μｍ保持体の比色分析は、少量の酸性ＢＰＳが産生されることを示している。酸性オリゴサツカライドが全く存在しないことを考えると、０．１μｍ保持体中の見かけ上低濃度のウロン酸含有物質はアーチファクト（ａｒｔｉｆａｃｔ　）の可能性がある。

ＮＧＲ２３４のＳｙｍシラスミツド回復誘導体（ＡＮＵ２６５）はＭｕｃ＋コロニーを産生ずるが、この株には全ての基本的な根粒形成遺伝子とニドロケ９ナーゼ（ｎｉｔｒｏｇｅｎａｓｅ　）遺伝子が欠失しているため（モリソンら（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ　ｅ”ｒ、、、　ａｌ、）　１９８５年）豆科植物上に検出できるほどの共生応答を開始させることはできない。

ＡＮＵ　２６５株から単離されたオリゴサツカライド繰υ返し単位のＮＭＲ分析により、その化学構造は親株ＡＮＵ２８０に極めて類似していることが証明された。ＡＮＵ２６５株を各Ｍｕｃ−変異体と等量混合しルーシーナ（Ｌｅｕｃａｅｎａ　）植物上に共同接種すると、窒素固定根粒が産生された（表２）。これらの根粒の切片は、充分発達した維管束を有する分裂組織と棒状の非膨大細菌を含有する広範囲の「仮細菌帯」（”ｂａｃｔｅｒｏｉｄｚｏｎｅ　”）を示していた。窒素固定根粒からＡＮＵ　２６５株とＭｕｃ−変異体を単離した。単離された細菌はルーシーナ（Ｌｅ’ｕＣａｅｎａ　）植物上で本来のコロニーの形態（ＡＮＵ　２６５についてはＭｕｃ＋で、変異体についてはＭｕｃ”）、抗生物質耐性マーカー□　（ＡＮＵ　２６５については３　ｐ　ｒで、Ｍｕｅ−変異体についてはＲｆ５、ＳｍｒそしてＫｍｒ　）そして本来の根粒表現型を有してお９、これらの株間に検出できる遺伝子の移動はなかつたことを示している。Ｍｌ、１　Ｃ−変異体の補正にＡＮＤ２６５のバックグランドの重要性を確認するために、ＡＮＵ２６５の代わりに別のりデビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　）株を使用した。Ｓｙｍプラスミツド回復リデすウムトリフオリイ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｔ、ｒｉｆｏｌｉｉ　）株ＡＮＵ　８４５　（ＡＮＵ　２６５の代わり）をＭｕｃ −変異体ＡＮＵ　２８４０と混合した。窒素固定根粒は産生されなかった（表２）。

親株ＡＮＵ　２８０からの酸性ＥＰＳは単離され化学配列が決定されており（ジョルジエビックら（Ｄｊ　ｏｒｄｊ　ｅｖｉｃｅｔ、　ａｌ、　）　１９８６年ａ）、オリゴサツカライド繰少返し単位の図１ａに再現しである。親株ＡＩＪＵ　２３　Ｑから単離し精製されたＥＰＳ又は関連のオリゴサツカライドを、次にＭｕｃ−変異体のひとつと共にルーシーナ（Ｌｅｕｃａｅｎａ　）植物上に接種した。これは、ＡＮＵ　２６５のヘルパー（ｈｅｌｐｅｒ　）効果が、親株ＡＮＵ　２８０又は３７ｍシラスミツド−回復味ＡＮＵ　２６５からのＥＰＳの添加で代替されるかどうかを決めるために行った。（まだいくつかのカルスは産生されたが）全ての場合で、ＥＰＳ又はオリゴサツカライド繰り返し単位の共同接種によシ、Ｍｕｃ−変異体はルーシーナ（Ｌｅｕｃａｅｎａ　）植物上に窒素固定性根粒を誘導できるようになった（表６）。

予想されたように８７ｍプラスミツド−回復味ＡＮＵ　２６５のＥｐｓと親株ＡＮＵ　２８０のＥＰＳは同一であることが証明されたため、ＡＮＵ　２６５から単離されたＥＰＳもまた、Ｍｕｃ−変異体がルーシーナ（Ｌｅｕｃａｅｎａ　）植物上に窒素固定性根粒を形成開始させることを可能にした。

６０個の着色したルーシーナ（Ｌｅｕｃａｅｎａ）根粒を解析してもＭｕｃ＋細菌（ルークーナ（ＬｅｕＣａｅｎａ　）に根粒形成が可能）は認められず、根粒から単離されたＭｕｃ−細菌はいつも欠陥性の表現型を有していた。

上記結果に対するＥＰＳ濃度の効果を調べるため、Ｍｕｃ″″変異体ＡＮＵ　２８１１とＡＮＵ　２８４０に加えて、ＡＮＵ　２８０からの精製ＥＰＳの異なる量を植物に添加した。細菌接種の前に０．１ｍ９７ｍ１からＩｐｍ９／ｍｊの濃度範囲の１０μｔの標準容量をルーシーナ（Ｌｅｕｃａｅｎａ　）の苗木に添加した。わずかに５μｓのｇａｓを加えるだけで１ルーシーナ（Ｌｅｕｅａｅｎａ　）の側根上にカルス様構造とは明瞭に区別できる根粒が見いだされた（表４° ）。

ルーシーナ（Ｌｅｕｅａｅｎａ　）へのＭｕｃ−″変異体の接種の前する（ａ）　２４時間前、（ｂ）同時、又は（ｃ）　２４時間後に、５０μｇずつのＥＰＳを１０個のルーシーナ（ＬｅｕＣａｅｎａ　）植物に添加した。各々の場合に窒素固定根粒が形成され、試験した範囲内で時間は絶対的な条件ではないことがわかった。

ルーシーナ（Ｌｅｕｃａｅｎａ　）植物について記載した上記の実験と同様の実験をシラトロ（５ｉｒａｔｒｏ　）植物について行った。ここで親株は窒素固定性の明確な根粒を誘導するが、Ｍｕｃ−変異体ＡＮＵ　２８１１とＡＮＵ２８２［１単独では外観の正常な根粒が誘導されるが窒素固定はしない。Ｍｕｃ−変異体ＡＮＤ　２８１１とＡＮＵ　２８２０の接種２４時間前にＡ、ＮＵ　２８０からのＥＰＳを添加すると、これらの細菌も親株と同様にシラトロ（５ｉｒａｔｒｏ　）植物上に明確な窒素固定性根粒を産生ずることが可能に（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｔｒｉｆｏｌｉｉ　）　ＥＰＳ又は関連オリゴサラカラ試験した第２群の植物は温帯豆科植物のクローバ−である。リゾビウムトリフオリゴ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｔｒｉｆｏｌｉｉ）ＭＵ　８４６株のＥＰＳの構造は、ＮＧＲ２３４ＥＰＳの構造を決めた方法と同様の方法を用いて決定した。これらの植物の測定に使用したＡＮＵ　８４３のオリゴサツカライドの構造は図１ｂに再現しである。Ｍｕｃ″″リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　）　ＡＮＵ　４３７株はＡＮＵ　７９４株由来のＴｎ５−誘導変異体である。以前の研究により　ＡＮＵ　４３７株は、親株の産生ずるＥＰＳより少なくとも１０００倍は少ない量のＥＰＳを産生じ、クローバ−上に急速に老衰していく小さく非効率的な根粒を形成することが証明されている（チャクラがルティーら（Ｃｈａｋｒａｖｏｒｔｙｅｔ、　ａｌ、）　１９８２年）。

リゾビウムトリフオリゴ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｔｒｉｆｏｌｉｉ　）ＡＮＵ　８４３株ＥＰＳ又は関連オリゴサツカライドの添加によりＡＮＵ　４３７　Ｍｕｃ−変異体の根粒形成欠陥性表現箆が補正されるかどうかを調べるために、ＡＮＵ　４３７株の接種の２４時間前にホワイトクローバ−の苗木にリゾビウムトリフオリゴ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｔｒｉｆｏｌｉｉ　）ＥＰＳ又は関連オリゴサッカライｒを５０μｓ添加した。

５週間後苗木の２５チは、親株の産生ずる着色した窒素固定性根粒に類似したある程度の根粒を産生した。

アセチレン還元定量法によシ窒素の還元が起きていることを確認した（表６）。

このクローバ−から単離した細菌は接種物の全ての特徴を有し、ＡＮＵ４３７のみを含んでいた。

リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　）種ＡＮＵ　２８０株由来のＳｙｍプラスミツド−回復ＡＮＵ　２６５株の表現型はＭｕｃ”である。しかしこれは、根粒形成又は窒素固定に必要な遺伝子を含まないため、試験植物に根粒を形成することができない。この株をＡＮＵ　２３　Ｑ株の異なるＭｕｃ−変異体と共同接種すると、窒素固定性根粒の形成が可能になり、これは接種した株の両方を含有することが証明された。この共同感染は温帯豆科植物について既に報告されている（　０　＃　７エら（Ｒｏｌｆｅ　ｅｔ、　ａｌ、）１９８０年ａ、１））。

共同接種実験で使用されたＭｕｃ”、非侵入性株ＡＮＵ２６５の添加の代わりを、精製１〜たＥＰＳ又は関連オリゴサツカライドで代替することができるかどうかを調べるために、感染可能な根にこれらのサツカライドと６力ｊした。同種の精製上そノボリザノカライド類又は誘導されたオリゴサツカライドの使用により、同様の表現型の補正が達成された。この同種のサツカライドは種々の濃度で使用した場合も、Ｍｕｃ−細菌の接種の２４時間前から２４時間後までに添加した場合も有効であった。Ｍｕｃ＋リゾビウムトリフオリイ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｔｒｉｆｏｌｉｉ　）　ＡＮＵ　３４５株（ＡＮＵ　Ｆ３４３のＳｙｍシラスミツド回復誘導体）とＡＮＵ　２　Ｆ３　（］のＭｕｃ−変異体を用いた混合実験では、ルーシーナ（Ｌｅｕｃａｅｎａ　）上に窒素固定性根粒を誘導できなかったため、ヘルパー（ｈｅｌｐｅｒ　）株に対するサツカライドの型の性質は重要である。これは混合実験においてＦｉｘ＋表現型全現型できる能力は、同種ＥＰＳを産生するＳｙｍシラスミツド回復株に依存する回復管示していた。同様にＭｕｃ−リゾビウムトリリボサツカライドの添加により補正された。ＡＮＵ　２８０株からの異種のＥＰＳとオリゴサンカライドは、有効な根粒表現型をＡＮＵ　４３７株に回復することはできなかった。この表面サツカライドの作用の特異性は、これらが単にリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　）表面の表面決定基（５ｕｒｆａｃｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ　）をマスクするという受身的な役割以外のものがあることを示している。最近、宿主又は植物の病原体の細胞壁の切断によシ得られる特異的オリゴサツカライドが、植物の特異的な機能（例えば生長、分化及び疾患耐性）を制御するということが言われている（ケイムら（Ｋｅｉｍ　ｅ’ｔ、　ａｌ、）　１９８５年：とアルパーシャイムら（Ａｌｂｅｒｓｈｅｉｍ　ｅｔ、　ａｌ、）１９８５年）。ＥＰＳ又はこの分子の特異的誘導体が、オリゴサッカリン類に類似の機能を有することは充分考えられる。ＥＰＳ及び／又は関連オリゴサツカライドの作用はまた、細菌のＥＰＳポリマーを（有効な根粒形成に特異的な役割を示す）活性オリゴマーへ分解する植物酵素の存在に依存する（ダシら（Ｄａｓｓｏ　ｅｔ、　ａｌ、）１９８２年；ゾルハイムら（Ｓｏｌｈｅｉｍ　ｅｔ、　ａｌ。）　１１９８４年及びバグワットら（Ｂｈａｇｗｈａｔ　ｅｔ、　ａｌ、）１９８４年）。

表　１細菌株　植物応答の表現型ＮＧＲ２３４誘導体、関連する遺伝的特徴、　□−−−−−ｋｏＲＩ消化全ＤＮＡ中のＴａ２の位置　ルーシーナ　シラトロ（Ｔａ２は存在しない）（Ｔａ２−１８−Ｏｋｂ）（Ｔａ２−９．４ｋｂ）（Ｔａ２は存在しない）表２−ルーシーナ（Ｌｅｕｅａｅｎａ）に対する混合実験接種法　接種した植物の　試験した植物の　窒素固定性根粒表現型　数　形成植物の比率チＡＮＵ２６５　Ｎｏｄ−１４０ＡＮＵ２８１１　カルスのある根　１４　０ＡＮＵ２８１ｉ　＆ＡＮＵ　２６５　Ｆ　ｉ　ｘ＋根粒（Ｃ２Ｈ２還元性）−１４６０ＡＮＵ　２８２０　カルスのある根　１２　０ＡＮＵ２８２０　＆ＡＮＵ　２６５　Ｆ　ｉ　ｘ＋根粒　１２６０（Ｃ２Ｈ２還元性）ＡＮＵ２８４０　カルスのある根　３５０ＡＮＵ２８４Ｄ　＆ＡＮＵ２６５　Ｆｉｘ＋根粒　６５９０（Ｃ２Ｈ２還元性）ＡＮＵ８４５　Ｎ０ｄ−１２０ＡＮＵ２８４０　＆Ａ）ＪＵ８４５　小さいＦｉｘ−根粒　１２０Ｆｉｘ＋根粒を有する植物は、親株の約３０−４０％の効率でアセチレンを還元する。

表５　ＡＮＵ２８０より単離したＥＰＳ又はオリゴサツカライド繰り返し単位の添加のルーシーナルーコセファラ（Ｌｅｕｃａｅｎａ　１ｅｕｃｏｃｅ　ｈａｌａ）の根粒形成への影響接種した株　植物の根粒形成　試験した　Ｆｉｘ十根粒を形成ＡＮＵ２８０　（親株）　大きいＦｉｘ＋根粒と　１００　１００時々小さなカルスＡＮＵ２８１１　小さなカルス　１００　＜２ＡＮＵ２８４０　小さなカルス　１００　１ＡＮＵ２８２０　小さなカルス　２［］　［ＩＡＮＵ２８１１とＡＮＵ２８０のＥＰＳ大きいＦｉｘ＋根粒と　３０６５小さなカルスＡＮＵ２８１１　ｈ　ＡＮＵ２８０のオリゴサツカライド繰り返し単位大きいＦｉｘ＋根粒と　１０３０小さなカルスＡＮＵ２８４０とＡＮＵ　２８０のＥＰＳ大きいＦｉｘ＋根粒と　１００　４０小さなカルスＡＮＵ２８４０　、！：　ＡＮＵ２８０のオリゴサツカライド繰り返し単位大きいＦｉｘ＋根粒と　２０４０小さなカルスＡＮＵ２８２０とＡＮＵ２８０のＥＰＳ大きいＦｉｘ＋根粒と　１７２５小さなカルスＡＮＵ２８２０とＡＮＵ２８０のオリゴサツカライド繰り返し単位大きいＦｉｘ＋根粒と　１０６０ＥＰＳ又はオリゴサツカライド繰り返し単位とＭｕｅ−変異体のルーシーナ（Ｌｅｕｃａｅｎａ）への添加により誘導される窒素固定性根粒は、親株ＡＮＵ　２８０に誘導されたＦｉｘ＋根粒の１０−３０％の効率でアセチレンを還元する。

Ｆｉｘ＋根粒を形成する植物の比率は１０個の植物を含有するパッチ実験の平均である。１０個の植物の各パッチにおいて、Ｆｉｘ＋根粒を形成する植物の比率は、各Ｍｕｃ−変異体により　３０−８０％の間で変動する。Ｍｕｃ−細菌を接種する２４時間前に、ＥＰＳとオリゴサツカライド繰シ返し単位を添加した。

表４　Ｍｕｃ−変異体ＡＮＵ２８１１とＡＮＵ２８４０と一緒に異なる量のＥＰＳを添加した場合のルーシーナ（Ｌｅｕｃａｅｎａ）根粒形成への影響ＥＰＳの添加量　試験した植物の数　Ｆｉｘ＋根粒を形成する＜ｌｉｇ＞　植物の比率　チＦｉｘ＋根粒を形成する植物の比率は１０個の植物を含有するパッチ実験の平均である。各Ｍｕｃ−変異体を接種する２４時間前に、ＥＰＳ　′！ｉ−添加した。

表５　ｎ製ＥＰＳとオリゴサツカライド繰り返し単位の添加のシラトロ（５ｉｒａｔｒｏ　）根粒形成への影響接種した株　植物の根粒形成　試験した　Ｆｉｘ＋根粒を形成応答　植物の数　する植物の比率ＡＮＵ２８０　（親株）　大きいＦｉｘ＋根粒　２５０　＞　９０ＡＮＵ２８１１　小さなＦｉｘ−８０２ＡＮＤ２８２０　小さなＦｉｘ−２００ＡＮＵ２８１１とＡＮＵ２８０のＥＰＳ大きいＦｉｘ＋根粒　４０４ＤＡｌｌＪＵ２８０とＡＮＵ２８０のＥＰＳ大きいＦコＸ＋根粒　３０４０ＡＮＵ２８２０とＡＮＵ２８０のオリゴサツカライド繰り返し単位大きいＦｉｘ＋根粒　２０４０２Ｏ４０細菌を接種する２４時間前に、ＥＰＳとオリゴサツカライド繰り返し単位を添加した。

！６７−＃−）リフオリイ（Ｒ，ｔｒｉｆｏｌｉｉ　）株ＡＮＵ８４３から単離したＥＰＳとオリゴサツカライド繰り返し単位の添加の、ホワイトクローバ−の根粒形成への影響株　植物の根粒形成　試験した　Ｆｉｘ＋根粒を形成応答　植物の数　する植物の比率ＡＮＴＪ７９４　（親株）　着色したＦｉｘ＋根粒　＞　２５０　＞　９５ＡＮＵ４３７　小さなＦｉｘ−＞２００　０４３７　＆　ＡｘｑＵ８４３のＢＰＳ着色したＦｉｘ＋根粒と　２０２５小さなＦｉｙ：’ ４５７　＆　ＡＮＵ８４５のオリゴサンカライド繰り返し単位着色したＦｉｘ＋根粒と　２ｏ６０小さなＦｉｘ− ４３７＆　ＡＮＤ２８０のオリゴサツカライド繰り返し単位小さなＦｉｘ−２００Ｍｕ　Ｃ−変異体ＡＮＵ　４ろ７を接種する２４時間前に、ＥＰＳとオリゴサツカライド繰り返し単位を添加した。

一″ こ（手続補正書（睦）昭和６３年ノ２月梠日

Claims

【特許請求の範囲】

１．植物の微生物に対する応答を変化させるのに使用する組成物において、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属の細菌から得られるエキソポリサツカライド類、又は該エキソポリサツカライド類のひとつ又はそれ以上の繰り返し単位よりなるか又は該繰り返し単位を含有するオリゴポリサツカライド類よりなる、上記組成物。
２．リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種ＮＧＲ２３４株又はリゾビウムトリフオリイ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｔｒｉｆｏｌｉｉ）、又はそれらの誘導体から得られるエキソポリサッカライド類よりなる、請求の範囲第１項に記載の組成物。
３．エキソポリサツカライド類又はオリゴポリサツカライド類は、図１ａ又は図１ｂに記載のひとつ又はそれ以上の繰り返し単位よりなるか又は該繰り返し単位を含有することを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の組成物。
４．リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属のエキソポリサツカライド産生性の細菌よりなる、請求の範囲第１項に記載の組成物。
５．従来の園芸学的に又は農学的に許容される希釈剤又は担体を更に含む、請求の範囲第１項から第４項までのいずれか１項に記載の組成物。
６．植物への局所投与用に噴霧剤、粉剤又は散剤として調剤されている、請求の範囲第４項に記載の組成物。
７．植物の微生物に対する応答を変化させる方法において、植物を微生物に接触させる前、後又は同時に、該植物を有効量の組成物（ここで該組成物は、リゾビウム（Ｒｈｌｚｏｂｉｕｍ）属の細菌から得られるエキソポリサツカライド類、又は該エキソポリサツカライド類のひとつ又はそれ以上の繰り返し単位よりなるか又は該繰り返し単位を含有するオリゴポリサツカライド類よりなる）て処理する段階よりなる、上記方法。
８．請求の範囲第２項から第６項までのいずれか１項に記載の組成物で植物を処理することよりなる、請求の範囲第７項に記載の方法。
９．請求の範囲第７項に記載の方法にむいて、植物の処理は、植物感染性又は植物病原性の可能性のある微生物に植物を接触させる前、後又は同時に行うことよりなる、上記方法。
１０．請求の範囲第７項に記載の方法において、植物の処理は、該植物の窒素固定に関与する微生物に植物を接触させる前、後又は同時に行うことよりなる、上記方法。