NL194949C - Werkwijze voor de bereiding van polynucleotiden en therapeutisch preparaat dat een dergelijk polynucleotide bevat. - Google Patents

Description

1 194949

Werkwijze voor de bereiding van polynucleotiden en therapeutisch preparaat dat een dergelijk polynucleotide bevat

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor de bereiding van polynucleotiden omvattende de 5 volgende sequentie van stappen van: (1) het teweegbrengen van de lyse van een cultuur van een bacteriestam en het leiden van het verkregen medium achtereenvolgens door drie kolommen, waarbij de eerste kolom een ionenuitwisselende hars bevat en de derde kolom een moleculaire zeef bevat, welke behandeling leidt tot een polynucleotidefosforylase-oplossing die nagenoeg zuiver is met betrekking tot stoffen welke de polymerisatie in stap (2), en eventueel 10 in stap (3), zouden kunnen beïnvloeden, (2) het behandelen van een gekozen mononucleotide met het verkregen fosforylase in aanwezigheid van MgCI2, zodat een polymerisatie teweeggebracht wordt, en (3) het afscheiden en wassen van het verkregen polymeer, het eventueel verder gaan met de polymerisatie van een tweede gekozen mononucleotide onder dezelfde omstandigheden als in stap (2) en, in dit geval, 15 het mengen van geschikte hoeveelheden van elk van de gekozen polymeren in water in aanwezigheid van NaCI en tenslotte het precipiteren van het verkregen complex door toevoeging van ethanol. Verder heeft de uitvinding betrekking op een therapeutisch preparaat dat als werkzaam bestanddeel een doeltreffende hoeveelheid van een polymeer of copolymeer bevat dat met een dergelijke werkwijze verkregen is.

Een soortgelijke werkwijze wordt beschreven in de Franse octrooiaanvrage 2.252.350, met dien 20 verstande dat bij de werkwijze volgens voornoemde octrooiaanvrage het fosforylase in stap (2) zich niet in oplossing bevindt maar juist gebonden is aan een hars.

De uitvinding heeft aldus betrekking op een werkwijze voor de verkrijging van polynucleotiden (homo- en copolynucleotiden) en complexen daarvan. Verschillende polynucleotiden zijn met bestaande methoden bereid, maar tot dusverre zijn de meeste van de verkregen producten in het algemeen pyrogeen of meer of 25 minder toxisch door de aanwezigheid van enige verontreinigingen of reagentia die voorkomen in de opeenvolgende stappen welke tot de gewenste producten leiden. Deze verbindingen zijn adjuvantia op verschillende therapeutische gebieden en in het bijzonder bij de behandeling van kanker, bij de behandeling van bepaalde bacteriële en virusziekten en voor vaccins.

In het algemeen worden polynucleotiden verkregen door de werking van een polynucleotidefosforylase 30 op het betreffende nucleotidemonomeer. De verschillende mogelijke monomeren, zoals ADP, CDP, GDP, IDP en UDP worden verkregen met algemeen bekende methoden. Polynucleotidefosforylase wordt eveneens met algemeen bekende methoden verkregen, waarbij men uitgaat van een bacteriële cultuur, en vervolgens de in de cultuur verkregen bacteriën lyseert, gevolgd door extractie van het bij de lyse verkregen polynucleotidefosforylase uit een complex medium, waarin verschillende enzymen kunnen worden 35 gevonden, zoals kinases, fosfatases, nucleases, diêsterases, enz. die alle concurrerende reagentia zijn bij de volgende stap, de polymerisatie van het gekozen nucleotidemonomeer door het polynucleotidefosforylase. De aanwezigheid van de verschillende niet-gewenste enzymen leidt tot gelijktijdig verlopende ongewenste reacties en gedeeltelijke afbraak van het te polymeriseren monomeer en van het gevormde polymeer.

40 Aldus is een aantal verschillende werkwijzen voor het bereiden van gezuiverde polynucleotidefosforyla-ses in de stand van de techniek ontwikkeld.

Zo beschrijft de reeds bovengenoemde Franse octrooiaanvrage 2.252.350 een werkwijze voor de bereiding van een gezuiverd polynucleotidefosforylase-enzym. Volgens deze werkwijze wordt een bacterie-stamcultuur (E. coli B) fijn gewreven en wordt het acellulaire extract bevrijd van DNA door toevoegen van 45 een DNAase en gecentrifugeerd. Na dialyse wordt de verkregen oplossing gechromatografeerd over DEAE cellulose, geprecipiteerd door toevoeging van ammoniumsulfaat en vervolgens gechromatografeerd over Sephadex® A 50 en daarna gefiltreerd over een moleculaire zeef (Sephadex® G 200).

Het nadeel van de met voornoemde werkwijze volgens FR-A-2.252.350 verkregen polynucleotiden is dat deze onvolkomen is voor wat betreft hun toxiciteit of voor wat betreft zowel hun toxiciteit als hun pyrogene 50 eigenschappen. Hoewel men een aanvaardbaar zuiver polynucleotidefosforylase kan bereiken op een kleine schaal voor analysedoeleinden, of voor een beperkt wetenschappelijk onderzoek, kan men een dergelijk zuiver product niet gemakkelijk bereiden op technische schaal tegen een aanvaardbare prijs.

Het doel van de uitvinding is om het bovengenoemde nadeel op te heffen.

Gevonden is dat het bovengenoemde doel bereikt wordt met een werkwijze, zoals omschreven in de 55 aanhef, daardoor gekenmerkt dat in stap (1) de tweede kolom een hydrofobe hars bevat, en stap (2) de reactie omvat van 200-750 fosforylase-units met een oplossing met de gebruikelijke buffers en 194949 2 een concentratie van 0,06-0,2 mmol/ml van het gekozen mononucleotide, waarbij het MgCI2 stapsgewijs wordt toegevoegd voor het regelen van de polymerisatiegraad, gedurende 3-6 dagen, terwijl de pH tussen 7,4 en 8,6 gehouden wordt.

Simüth et al. in Biochimica et Biophysics Acta (1975), 379, biz. 397-407 beschrijven een andere 5 werkwijze voor het bereiden van een gezuiverd polynucleotidefosforylase. Volgens deze werkwijze wordt het enzym gezuiverd door een gelfiltratiestap uit te voeren na een ionchromatografiestap.

Weer een andere werkwijze wordt beschreven door Bauer en Büki in Acta Biochim. et Biophys. Acad.

Sci. Hung. (1981), 16 (3-4), blz. 135-144. Volgens deze werkwijze wordt een gezuiverd polynucleotidefosforylase met een molecuulgewicht van 250.000 bereid door drie chromatografiestappen uit te voeren na een 10 ammoniumsulfaat-fractionering, waarbij de eerste een ionenuitwisselende-chromatografiestap over OEAE cellulose is, de tweede een affiniteitschromatografiestap over Heparine-Sepharose® 4B is, waarvoor verwarmen bij 40°C nodig is (bij een lagere temperatuur wordt geen binding waargenomen), en de derde een chromatografiestap over DEAE-Sephadex® A 25 is.

Volgens de uitvinding is het mogelijk gebleken om onder industrieel aanvaardbare omstandigheden 15 nagenoeg zuivere homopolymeren of copolymeren of complexen van polynucleotiden of van nauw verwante analoga daarvan te verkrijgen door als polymerisatiemiddel, in plaats van de polynucleotidefosforylasepre-paraten zoals verkregen volgens de verschillende eerder beschreven methoden, een zeer gezuiverd enzym te gebruiken dat geen verontreinigingen bevat welke tot ongewenste reacties leiden. Nauw verwante analoga van nucleotiden kunnen bijvoorbeeld 6-hydroxyalkylderivaten van ADP of 5-halogeen- of 5-hydroxy-20 of 5-methylderivaten van UDP zijn.

In het bijzonder is gevonden dat na de kweek van een bacteriestam en de lyse van de aldus verkregen cultuur het verkregen medium achtereenvolgens over drie kolommen moet worden geleid, waarbij de eerste een ionenuitwisselende hars zoals DEAE Sephacel® of een equivalent daarvan bevat, de tweede kolom een hydrofobe hars zoals fenyl Sepharose® of een equivalent daarvan bevat en de derde kolom een moleculaire 25 zeef zoals Sephacryl® S300 of Sephadex® 200 of een equivalent daarvan bevat.

Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding is in stap (1) de hydrofobe hars in de tweede kolom fenyl Sepharose®.

De uitvinding heeft tenslotte betrekking op een therapeutisch preparaat dat als werkzaam bestanddeel een doeltreffende hoeveelheid van een polymeer of copolymeer bevat dat met de werkwijze volgens de 30 uitvinding verkregen is.

Het product dat uit de derde kolom komt, bestaat voornamelijk maar niet uitsluitend uit polynucleotidefosforylase tezamen met sporen van stoffen die niet actief zijn bij het verdere polymerisatieproces.

Als een homopolymeer wordt gewenst, wordt het verkregen polynucleotidefosforylase gebruikt voor de polymerisatie van het gekozen monomeer in aanwezigheid van gebruikelijke reagentia.

35 Als een copolymeer gewenst is, wordt het gekozen monomeer vervangen door een mengsel, in geschikte verhoudingen, van de gekozen monomeren. Het copolymeer zal worden aangeduid als Poly A/Poly U.

Als een complex gewenst is, wordt dezelfde polymerisatie uitgevoerd op elk van de betreffende monomeren, en worden de verkregen homopolymeren in de juiste verhouding gemengd in aanwezigheid van NaCI en met ethanol geprecipiteerd.

40 Volgens een belangrijk kenmerk van de uitvinding wordt de polymerisatie van het gekozen monomeer of van het gekozen mengsel van monomeren uitgevoerd onder omstandigheden die verschillen van wat gewoonlijk wordt gedaan. In het bijzonder zijn de gebruikte concentraties veel groter dan de gebruikelijke concentraties (ongeveer 30 tot ongeveer 100 keer en bij voorkeur 50 keer), wordt de polymerisatie uitgevoerd onder geregelde toevoeging van MgCI2, onder een geregelde pH-waarde van 7,4 tot 8,6 en 45 gedurende ongeveer 3 tot ongeveer 6 dagen.

De verkregen polymeren of copolymeren hebben een moleculair-gewichtstraject dat complexen geeft met moleculairgewichten van ongeveer 250.000 tot ongeveer 1.500.000 met een homogene polymerisatie-snelheid en een polymerisatieopbrengst van wel 90-95%.

De uitvinding zal beter worden begrepen uit de beschrijving van de volgende opeenvolging van vijf 50 stappen, die leiden van een bacteriële startcultuur (hier E. coli maar andere bacteriën zijn eveneens geschikt) tot een complex van Poly A/Poly U.

Stap 1: Kweek van E. coli B 1/5

De cultuur wordt gehouden in steken bij omgevingstemperatuur.

55 Het cultuurmedium bevat per liter 10 g NaCI, 10 g trypticase en 5 g gistextract. Na sterilisatie gedurende 45 min. bij 110°C wordt een afzonderlijk gesteriliseerde glucoseoplossing toegevoegd in een hoeveelheid van 2 g/l. Voorcultures worden bereid met 10 ml, waarna 200 ml medium wordt bereid voor een 10 I cultuur.

3 194949

Er wordt geroerd bij 470 opm met 8 I lucht per minuut. De verdubbelingstijd bij δ 600 bedraagt 30 min. en de bacteriën worden geoogst bij een optische dichtheid van 6 bij 600 nm.

Ongeveer 8 g per liter cultuur wordt verkregen. De pH van de fermentatie wordt ingesteld op 6,5 tot 6,8 door toevoeging van 2N NH4OH. Als de cultuur niet onmiddellijk wordt gebruikt, wordt deze bij -20°C 5 bewaard.

Stap 2: Lyse van bacteriën

Buffer A 5 x 10 2 M Tris-HCI pH 7,9 (bij 25°C) dat 2 x 10'3 M EDTA, 0,233 M NaCI (13,63 g/l) en 5% glycerol (50 ml/l) bevat 10 Buffer B 10‘2 M Tris-HCI pH 7,9 dat ΙΟ"4 M EDTA, 0,2 M NaCI en 5% glycerol bevat Voor 165 g bacteriën (20 I cultuur)

Net voor het gebruik wordt 0,4 ml dithiothreitol (DTT) 0,1 M (15,4 mg/ml) toegevoegd aan 400 ml buffer A bij kamertemperatuur, gevolgd door 28 pl mercaptoethanol, 45 mg lysozym en 14 mg fenylmethylsulfonyl-fluoride (PMSF), opgelost In 4 ml ethanol. De bevroren bacteriën (165 g) worden gedispergeerd in dit 15 medium in een menger (eindtemperatuur ongeveer 10°C), waarna men de suspensie laat opwarmen tot 15°C onder af en toe mengen (ongeveer 20 min.), waarna men 272 mg natriumdeoxycholaat onder mengen toevoegt, gevolgd door 4 mg deoxyribonuclease (DNAase). Men laat het lysemengsel 20 min. staan onder af en toe mengen en houdt de temperatuur op 20°C. Aan dit mengsel wordt 400 ml buffer B plus 0,4 ml 0. 1.M DTT onder mengen toegevoegd, en de suspensie wordt 1 uur bij 5°C gecentrifugeerd bij 16000 g 20 (10.000 opm in een Sorvall-centrifuge).

DNAase 50.679 Dornase-units/mg Lysozym 25.000 units/mg

Het door centrifugeren verkregen supernatans (ongeveer 900 ml) werd verdund tot 1 I met gedestilleerd water en proteïne werd geprecipiteerd door toevoeging van 280 g ammoniumsulfaat (45% verzadiging) bij 25 4°C onder roeren, waarna men het mengsel 2 uur bij 4°C liet staan. Proteïne werd gewonnen door centrifugeren bij 16.000 g gedurende 30 min. bij 5°C. Het precipitaat (supernatantia worden weggezet) werd opgelost in 150 ml 10'2 M Tris HCI pH 7,8 en de oplossing werd 20 min. bij 16.000 g gecentrifugeerd ter verwijdering van onoplosbaar materiaal. De supernatantia werden gedialyseerd tegen vier verse oplossingen van 2 I 5x10 2 M Tris HCI pH 7,8 bij 4°C in 18 uur, waarna de oplossing 1 uur werd gecentrifugeerd bij 30 16.000 g ter verwijdering van onoplosbaar materiaal.

300 ml, pH 7,8, geleidbaarheid < 7,0 mS.

Stap 3: Zuivering van polynucleotidefosforylase coli B 1/5 (PNPase) 1. De boven verkregen supernatantia werden geleid over een kolom van 280 I DEAE Sephacel (40 x 3 cm), 35 die in evenwicht was gebracht in 0,1 M Tris HCI pH 7,4 bij 4°C, en de kolom werd geëlueerd met een gradiënt van 1 I 0,1 M Tris HCI pH 7,4 tot 1 I 0,1 M Tris HCI in 0,4 M NaCI pH 7,4, waarbij fracties van 10 ml werden verzameld. Een piek met diesteraseactiviteit werd geëlueerd, gevolgd door een tweede piek met polynucleotidefosforylase-activiteit in de fracties 105 tot 125, geëlueerd met 0,21 M NaCI, 0,1 M Tris HCI.

40 Volume 210 ml: 107 units/ml. Totaal 22.470.

2. Deze oplossing werd ingesteld op 0,5 M ammoniumsulfaat door toevoeging van 28 g daarvan onder roeren, en vervolgens geleid over een kolom van 60 ml fenylsepharose (19x2 cm), welke in evenwicht was gebracht in 0,5 M (NH4)2S04, 0,05 M Tris HCI pH 7,4. De kolom werd gewassen met ongeveer 20 ml 0,5 M (NH4)2S04 in 0,1 M Tris HCI pH 7,4 en daarna geëlueerd met een omgekeerde gradiënt van 250 ml 0,4 M

45 Tris HCI pH 7,8 in 0,1 M (NH4)2S04 tot 3 x 10‘3 M Tris HCI pH 7,8 bij 4°C. Fracties van ongeveer 10 ml werden verzameld. De actieve fracties werden bij elkaar gevoegd.

Volume 55 ml: 355 units/ml. Totaal 19.525.

3. Ammoniumsulfaat (20 g) werd onder roeren toegevoegd (55% verzadiging) om proteïne te precipiteren en men liet het mengsel daarna 1 uur bij 4°C staan, waarna men het 15 min. bij 16.000 g centrifugeerde.

50 Het residu werd opgelost in een minimale hoeveelheid 0,1 M NaCI, 0,05 M Tris-HCI pH 7,4 (ongeveer 10 ml) en de oplossing werd gebracht op een kolom van 350 ml Sephacryl S300 (50 x 3 cm) welke in evenwicht was gebracht in 0,1 M NaCI, 0,05 M Tris HCI pH 7,4, waarna het enzym met dezelfde buffer werd geëlueerd (fracties van ongeveer 10 ml). De actieve fracties (13-17) werden bij elkaar gevoegd.

Volume 60 ml: 312,5 units/ml. Totaal 18.750.

55 540 units δ 280

Het enzym werd geprecipiteerd door toevoeging van 26 g (NH4)2S04 (65% verzadiging) en de suspensie werd bij -30°C bewaard.

li 194949 4

Stap 4: Bereiding van polymeren 100 g ADP Na2 (of 100 g UDP Na3) werd opgelost in ongeveer 600 ml water en toegevoegd aan: 200 ml M Tris HCI pH 8,3 250 ml M ammoniumacetaat 5 20 ml 0,1 M EDTA pH 8,0 100 ml M MgCI2 in een 21 kolf. Het volume werd aangevuld tot 2 I met water en de pH werd ingesteld op 8,6 bij kamertemperatuur met 5 N NH40H. Het oppervlak werd bedekt met een laag tolueen. De gebruikte nucleosidedifosfaten moeten geen verontreinigende metalen als Fe3* of Cu2* bevatten.

10 Aan een gedeelte van het mengsel (80 ml) werd 200 units enzym en 2 ml van een eerder bereid poly A (of poly U) als beginstuk ("primer”) toegevoegd, waarna de oplossing 2 uur bij 37°C werd geïncubeerd en daarna overgebracht naar de hoofdlading welke op 37°C werd gehouden. Na 4 uur werd nog eens 300 units enzym toegevoegd, waarna de incubatie werd voortgezet. De pH daalde tot ongeveer 8,3 na 24 uur en de pH werd daarna gehandhaafd op 8,0 tot 8,3 door toevoeging van 5 N NH4OH.

15 Het totale aantal units enzym bedraagt 500, dat is 5 units per g. Als de polymerisatie verloopt met een snelheid van minder dan 25% per 24 uur kan meer enzym worden toegevoegd op geschikte tijden om de snelheid te verhogen.

Extra hoeveelheden van 25 ml M MgCI2 worden onder krachtig roeren toegevoegd bij ongeveer 30%, 55% en 75% polymerisatie (in totaal 175 mmol Mg voor 200 nmol ADP of UDP), waarbij de pH wordt 20 gehandhaafd op 8,0 tot 8,3 (gemeten bij 37°C). De polymerisatie moet 80-90% bedragen na 3 tot 4 dagen.

De stapsgewijze toevoeging van MgCI2 handhaaft de verhouding van vrij ADP (UDP) tot Mg op ongeveer 2 bij de bovengenoemde polymerisatiepercentages.

Aan het eind van de incubatie wordt het mengsel gecentrifugeerd teneinde het geprecipiteerde ammoniummagnesiumfosfaat te verwijderen, waarna het precipitaat met een weinig water wordt uitgewas-25 sen en de gecombineerde supernatantia worden gebruikt om het complex poly A - poly U te bereiden.

Optimale polymerisatieomstandigheden zijn een pH van 8,0 tot 8,3, stapsgewijze toevoeging van MgCI2 en voldoende enzym om een polymerisatiesnelheid van ongeveer 30% per dag te verkrijgen. Een hogere incubatie pH (8,3 tot 8,6) geeft kleinere polymeren. Toevoeging van de totale hoeveelheid Mg aan het begin van de incubatie geeft eveneens kleinere polymeren.

30

Stap 5: Bereiding van complex Poly A - Poly U

Het totale nucleotidegehalte van de oplossingen wordt bepaald door hydrolyse van het incubatiemengsel in 0,1 N NaOH bij 100°C gedurende 5 min. onder toepassing van een verdunning van 1000 voor poly A en 500 voor poly U (bijv. 10 pi poly A of 20 μΙ poly U in 10 ml 0,1 N NaOH of nauwkeuriger door tussenlig-35 gende verdunning van 100 μΙ A en 200 μΙ U). Absorptie bij 260 nm wordt gemeten en de molariteit wordt geschat met behulp van de volgende waarden.

δ260 nm x 10'3 voor molaire oplossingen 40 pH 7,0 0,1 N NaOH (hydrolyse)

Ap 15,3 15,3

Poly A 9,8 15,3

Up 10,0 7,7 45 PolyU 9,5 7,7

De polymeerconcentraties worden bepaald uit de totale hoeveelheid nucleotide en het percentage polymerisatie. De volumina voor een stoechiometrische verhouding A/U = 1:1 worden vervolgens berekend.

50 Aan het poly U in een 10 I fles wordt 200 ml 25% waterig NaCI toegevoegd, gevolgd door de poly A-oplossing, en de oplossingen worden grondig gemengd (eindconcentratie NaCI ongeveer 0,18 M), waarna men het mengsel minimaal 3 uur bij 4°C laat staan.

Een gelijk volume ethanol wordt vervolgens onder roeren toegevoegd teneinde poly A- poly U te precipiteren, waarna men het mengsel 1 uur bij 4°C laat staan. Het complex wordt verzameld door 55 centrifugeren in een Sorvall 3B (1 I vaten) bij 5000 opm gedurende 3 min. en vervolgens gewassen met 2 I 55% ethanol. Het residu wordt opgelost in ongeveer 4 I zuiver water en gecentrifugeerd teneinde eventuele sporen ammoniummagnesiumfosfaat te verwijderen. Aan de heldere supernatantia wordt 200 ml 25% NaCI

Claims (3)

5 194949 toegevoegd, waarna men de oplossing minimaal 3 uur bij 4°C laat staan. Het complex wordt opnieuw geprecipiteerd door toevoeging van een gelijk volume ethanol onder roeren, verzameld door centrifugeren, uitgewassen met 55% ethanol (ongeveer 2 I), 75% ethanol en 2 maal met 96% ethanol, en vervolgens onder vacuüm gedroogd. 5 Opbrengst ongeveer 100-120 g. In de regel moet voor de precipitatie van het complex met 50% ethanol NaCI (0,15 tot 0,02 M) aanwezig zijn. Voor de wassing moet niet minder dan 55% waterige ethanol worden gebruikt (het geprecipiteerde complex wordt opgelost door 50% ethanol). 10 Toxiciteit De LD.*, is onderzocht bij muizen en ratten via de IP- en IV-routes. Geen lethaal effect wordt waargenomen bij de maximaal toegediende doses via de IV-route, noch bij muizen noch bij ratten. Een lethaal effect werd evenmin waargenomen bij IP toediening bij ratten, maar een LD^ van ongeveer 3 g/kg werd gevonden bij IP toediening aan muizen. De gebruikelijke proeven ter bepaling van een pyrogeen effect waren volledig 15 negatief. Farmacologie Aangezien de polymeren en copolymeren volgens de uitvinding in het algemeen bekend zijn, maar tot nu toe nooit op industriële schaal in een voldoende zuivere toestand waren verkregen, zijn in de afgelopen 20 jaren verschillende farmacologische onderzoeken uitgevoerd op monsters van speciaal gezuiverde producten welke niet verkrijgbaar waren op redelijke commerciële voorwaarden. Het belang van de uitvinding kan worden onderkend uit de bestaande bibliografie, zoals bijvoorbeeld de volgende artikelen: - Modulation of the immune system by synthetic polynucleotides - A.G. Johnson - Springer Semin. 25 Immunopathol., 2, p. 149-168 (1979), - Regulation of the immune system by synthetic polynucleotides - ^Characteristics of adjuvant action on antibody synthesis - J.R. Schidtke en A.G. Johnson - J. Immunol., 106, p. 1191-1200 (1971), - Changes in lymphocyte subpopulations in mice receiving a single injection of poly A - poly U - M. Donner, D. Vallier en F. Lacour - Ann. Immunol. (Inst. Pasteur) 128C, p. 1039-1052 (1977), 30. Spectrum and mode of action of poly A - poly U in the stimulation of immune responses - V. Braun, M. Ishizuka, U. Yajima, D. Webb en R. Winchurch in: Beers R.F., Braun W., ’’Biological effects of polynucleotides” New York: Springle-Verlag, p. 139-156 (1971), - Reduced incidence of spontaneous mammary tumors in C3H/He mice after treatment with polyadenylate-polyridylate - F. Lacour, G. Delage en C. Chianale - Science, 187, p. 256-257 (1975), 35. Poly A - poly U as an adjunct tot surgery in the treatment of spontaneous murine mammary adenocarcinoma - F. Lacour, J. Lacour en A. Spira - Recent results in cancer research, vol. 47, p. 352-356, - Polyadenylic-polyuridylic acid: Biological response-modifying activities in mice. In vivo organ distribution and pharmacokinetics in rabbits - F. Lacour: J. Biol. Resp. Modif., 4, p. 490-494 (1985), - A phase I clinical tolerance study of polyadenylic-polyuridylic acid in cancer patients - J.P. Ducret, 40 P. Caille, H. Sancho-Garnier, J.L. Amiel, M. Michelson, R.G. Hovanessian, J.K. Youn en F. Lacour - J. Biol. Resp. Modif., 4, p. 129-133 (1985). Presentatie en posologie Bij voorkeur wordt IV een isotonische oplossing met 0,01 tot 0,1 g werkzaam bestanddeel toegediend. Een 45 wekelijkse injectie zal gedurende 6 weken worden herhaald.

1. Werkwijze voor de bereiding van polynucleotiden omvattende de volgende sequentie van stappen van: (1) het teweegbrengen van de lyse van een cultuur van een bacteriestam en het leiden van het verkregen medium achtereenvolgens door drie kolommen, waarbij de eerste kolom een ionenuitwisse-lende hars bevat en de derde kolom een moleculaire zeef bevat, welke behandeling leidt tot een polynucleotidefosforylase-oplossing die nagenoeg zuiver is met betrekking tot stoffen welke de polymeri- 55 satie in stap (2), en eventueel in stap (3), zouden kunnen beïnvloeden, (2) het behandelen van een gekozen mononucleotide met het verkregen fosforylase in aanwezigheid van MgCI2, zodat een polymerisatie teweeggebracht wordt, en 194949 6 (3) het afscheiden en wassen van het verkregen polymeer, het eventueel verder gaan met de polymeri- ^ satie van een tweede gekozen mononucleotide onder dezelfde omstandigheden als in stap (2) en, in dit geval, het mengen van geschikte hoeveelheden van elk van de gekozen polymeren in water in aanwezigheid van NaCI en tenslotte het precipiteren van het verkregen complex door toevoeging van ethanol, met 5 het kenmerk, dat in stap (1) de tweede kolom een hydrofobe hars bevat, en stap (2) de reactie omvat van 200-750 fosforylase-units met een oplossing met de gebruikelijke buffers en een concentratie van 0,06-0,2 mmol/ml van het gekozen mononucleotide, waarbij het MgCI2 stapsgewijs wordt toegevoegd voor het regelen van de polymerisatiegraad, gedurende 3-6 dagen, terwijl 10 de pH tussen 7,4 en 8,6 gehouden wordt.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat in stap (1) de hydrofobe hars in de tweede kolom fenyl Sepharose® is.

3. Therapeutisch preparaat dat als werkzaam bestanddeel een doeltreffende hoeveelheid van een polymeer of copolymeer bevat dat met een werkwijze volgens conclusie 1 of 2 verkregen is.