JPH0712316B2 - ポリヌクレオチド類の製造法 - Google Patents
ポリヌクレオチド類の製造法Info
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- JPH0712316B2 JPH0712316B2 JP63276359A JP27635988A JPH0712316B2 JP H0712316 B2 JPH0712316 B2 JP H0712316B2 JP 63276359 A JP63276359 A JP 63276359A JP 27635988 A JP27635988 A JP 27635988A JP H0712316 B2 JPH0712316 B2 JP H0712316B2
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
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- C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明はポリヌクレオチド類（ホモ−ポリヌクレオチド
類又はコーポリヌクレオチド類）及びそれらの複合体の
製造法に関する。種々のポリヌクレオチド類が既存の方
法で製造されているが、これ迄に製造されたポリヌクレ
オチド類の大部分は所望のポリヌクレオチド類を調製す
る一連の工程で出現する幾つかの不純物又は使用薬剤が
混入するために、一般に発熱性であるか多少とも有毒性
である。これらのポリヌクレオチド類は種々の治療分野
において、特に癌の治療において、ある種の細菌及びウ
イルス感染疾患においてアジュバント（adjuvant）であ
り、またワクチンのアジュバンドでもある。
類又はコーポリヌクレオチド類）及びそれらの複合体の
製造法に関する。種々のポリヌクレオチド類が既存の方
法で製造されているが、これ迄に製造されたポリヌクレ
オチド類の大部分は所望のポリヌクレオチド類を調製す
る一連の工程で出現する幾つかの不純物又は使用薬剤が
混入するために、一般に発熱性であるか多少とも有毒性
である。これらのポリヌクレオチド類は種々の治療分野
において、特に癌の治療において、ある種の細菌及びウ
イルス感染疾患においてアジュバント（adjuvant）であ
り、またワクチンのアジュバンドでもある。
一般に、ポリヌクレオチド類は適当なヌクレオチド単量
体すなわちモノヌクレオチドに対してポリヌクレオチド
ホスホリラーゼを作用させて重合することによって得ら
れる。ADP,CDP,GDP,IDP及びUDPのような種々のヌクレオ
チド単量体類は、従来周知の方法で得られる。ポリヌク
レオチドホスホリラーゼもまた、周知の方法によって収
得され、例えば細菌の培養物を原料として用い、その細
菌培養物中に得られた細菌菌体の溶解を行ない、続いて
得られた菌体溶解液（この中には種々の酵素例えばキナ
ーゼ類，ホスファターゼ類，ヌクレオターゼ類，ジエス
テラーゼ類等の酵素が含有され、これら全ては前記のポ
リヌクレオチドホスホリラーゼによるヌクレオチド単量
体の重合を行なう次後の工程における競合作用する酵素
であって望ましくない成分である）から前記の菌体溶解
で得られたポリヌクレオチドホスホリラーゼを抽出する
ことによって得られる。前記の種々の望ましくない酵素
が存在すると所望しない副反応が並行して起ることにな
り、また重合させるべきヌクレオチド単量体及び生成し
たヌクレオチド重合体の部分的な分解が生起する。
体すなわちモノヌクレオチドに対してポリヌクレオチド
ホスホリラーゼを作用させて重合することによって得ら
れる。ADP,CDP,GDP,IDP及びUDPのような種々のヌクレオ
チド単量体類は、従来周知の方法で得られる。ポリヌク
レオチドホスホリラーゼもまた、周知の方法によって収
得され、例えば細菌の培養物を原料として用い、その細
菌培養物中に得られた細菌菌体の溶解を行ない、続いて
得られた菌体溶解液（この中には種々の酵素例えばキナ
ーゼ類，ホスファターゼ類，ヌクレオターゼ類，ジエス
テラーゼ類等の酵素が含有され、これら全ては前記のポ
リヌクレオチドホスホリラーゼによるヌクレオチド単量
体の重合を行なう次後の工程における競合作用する酵素
であって望ましくない成分である）から前記の菌体溶解
で得られたポリヌクレオチドホスホリラーゼを抽出する
ことによって得られる。前記の種々の望ましくない酵素
が存在すると所望しない副反応が並行して起ることにな
り、また重合させるべきヌクレオチド単量体及び生成し
たヌクレオチド重合体の部分的な分解が生起する。
このような理由で、前記の従来法で得られたポリヌクレ
オチド類の大部分はそれらの毒性及び（又は）それらの
発熱性特性のいずれかの点で欠点がある。分析化学用又
は限られた科学的な実験用では受容できる純度のポリヌ
クレオチドホスホリラーゼを小規模に製造することは可
能であるが、同じ純度のものを、許容できる費用で工業
的な技術で収得するのは容易ではない。
オチド類の大部分はそれらの毒性及び（又は）それらの
発熱性特性のいずれかの点で欠点がある。分析化学用又
は限られた科学的な実験用では受容できる純度のポリヌ
クレオチドホスホリラーゼを小規模に製造することは可
能であるが、同じ純度のものを、許容できる費用で工業
的な技術で収得するのは容易ではない。
本発明によれば、前述した既存の種々の方法によって得
られるようなポリヌクレオチドホスホリラーゼ酵素剤の
代わりに、望ましくない反応をもたらす不純物のない高
度に精製された酵素をヌクレオチド重合剤として使用す
ることにより、ヌクレオチド類の実質的に純粋なホモ重
合体もしくは共重合体又は純粋なポリヌクレオチド複合
体（complex）、あるいはヌクレオチド類縁体の重合体
を工業的に許容できる条件で製造できることが見出され
た。そのヌクレオチド類類縁体としては、例えばADPの
６−ヒドロキシアルキル誘導体又はUDPの５−ハロもし
くは５−OHもしくは５−メチル誘導体を挙げることがで
きる。
られるようなポリヌクレオチドホスホリラーゼ酵素剤の
代わりに、望ましくない反応をもたらす不純物のない高
度に精製された酵素をヌクレオチド重合剤として使用す
ることにより、ヌクレオチド類の実質的に純粋なホモ重
合体もしくは共重合体又は純粋なポリヌクレオチド複合
体（complex）、あるいはヌクレオチド類縁体の重合体
を工業的に許容できる条件で製造できることが見出され
た。そのヌクレオチド類類縁体としては、例えばADPの
６−ヒドロキシアルキル誘導体又はUDPの５−ハロもし
くは５−OHもしくは５−メチル誘導体を挙げることがで
きる。
特に、細菌菌株の培養と得られた細菌培養物の菌体溶解
を行なった後に、得られた菌体溶解液を３種のカラム、
すなわちイオン交換樹脂例えばDEAEセファセル（Sephac
el:登録商標）又はその均等物を入れた第１のカラム
と、疎水性樹脂例えばフェニルセファロース（Sepharos
e:登録商標）又はその均等物を入れた第２のカラムと、
分子篩例えばセファクリル（Sephacryl:登録商標）S 30
0もしくはセファデックス（Sephadex:登録商標）200又
はそれらの均等物を入れた第３のカラムとに次々に通す
ことが必要であることが今回見出された。
を行なった後に、得られた菌体溶解液を３種のカラム、
すなわちイオン交換樹脂例えばDEAEセファセル（Sephac
el:登録商標）又はその均等物を入れた第１のカラム
と、疎水性樹脂例えばフェニルセファロース（Sepharos
e:登録商標）又はその均等物を入れた第２のカラムと、
分子篩例えばセファクリル（Sephacryl:登録商標）S 30
0もしくはセファデックス（Sephadex:登録商標）200又
はそれらの均等物を入れた第３のカラムとに次々に通す
ことが必要であることが今回見出された。
前記の第３のカラムから溶出された酵素溶液は、ポリヌ
クレオチドホスホリラーゼを専ら含有するものであり、
次段のヌクレオチド重合工程に対する作用を失なった物
質の痕跡量を含む。
クレオチドホスホリラーゼを専ら含有するものであり、
次段のヌクレオチド重合工程に対する作用を失なった物
質の痕跡量を含む。
ヌクレオチド類のホモ重合体を製造しようと望む場合に
は、上記の得られたポリヌクレオチドホスホリラーゼ
を、通常の使用薬剤の存在下で、原料として選択したヌ
クレオチド単量体に作用させ重合するのに使用する。
は、上記の得られたポリヌクレオチドホスホリラーゼ
を、通常の使用薬剤の存在下で、原料として選択したヌ
クレオチド単量体に作用させ重合するのに使用する。
ヌクレオチド類の共重合体を製造しようとする場合に
は、原料として選択した複数のヌクレオチド単量体の適
当な割合の混合物を代わりに使用する。得られるヌクレ
オチド類の共重合体はポリA/ポリＵと呼ばれるものであ
る。
は、原料として選択した複数のヌクレオチド単量体の適
当な割合の混合物を代わりに使用する。得られるヌクレ
オチド類の共重合体はポリA/ポリＵと呼ばれるものであ
る。
ポリヌクレオチド類同士の複合体を製造しようとする場
合には、適当なヌクレオチド単量体の２種又はそれ以上
の各々について同じ重合を行ない、そしてそれぞれ得ら
れた複数のヌクレオチドホモ重合体を適当な割合でNaCl
の存在下で水中で混合し、次いでエタノール添加で沈澱
させると、所望の複合体を収得できる。
合には、適当なヌクレオチド単量体の２種又はそれ以上
の各々について同じ重合を行ない、そしてそれぞれ得ら
れた複数のヌクレオチドホモ重合体を適当な割合でNaCl
の存在下で水中で混合し、次いでエタノール添加で沈澱
させると、所望の複合体を収得できる。
本発明の重要な特徴としては原料として選択したヌクレ
オチド単量体又は選択した複数のヌクレオチド単量体の
重合を、通常慣用の条件とは異なる条件で実施すること
である。特に、ヌクレオチド単量体の使用濃度が通常の
慣用の濃度値をはるかに越えており（約30〜約100倍好
ましくは約50倍）、重合はMgCl2を加減して添加しなが
ら7.4〜8.6の調節されたpH範囲内で且つ約３日〜約６日
の間実施するのが本発明の特徴である。
オチド単量体又は選択した複数のヌクレオチド単量体の
重合を、通常慣用の条件とは異なる条件で実施すること
である。特に、ヌクレオチド単量体の使用濃度が通常の
慣用の濃度値をはるかに越えており（約30〜約100倍好
ましくは約50倍）、重合はMgCl2を加減して添加しなが
ら7.4〜8.6の調節されたpH範囲内で且つ約３日〜約６日
の間実施するのが本発明の特徴である。
得られるヌクレオチド類のホモ重合体類又は共重合体類
は約250,000〜約1,500,000の分子量を有する複合体を与
えるような分子量範囲を有するものであり、重合速度は
均一で且つ重合収率は90〜95％に達する。
は約250,000〜約1,500,000の分子量を有する複合体を与
えるような分子量範囲を有するものであり、重合速度は
均一で且つ重合収率は90〜95％に達する。
本発明を次の実施例によって説明する。本例では酵素原
料として大腸菌（E.coli）を用いるが他の細菌もまた適
当に使用できる。本例では、大腸菌の培養から出発して
ポリA/ポリＵの複合体の製造に至る連続する５段階につ
いて以下に説明する。
料として大腸菌（E.coli）を用いるが他の細菌もまた適
当に使用できる。本例では、大腸菌の培養から出発して
ポリA/ポリＵの複合体の製造に至る連続する５段階につ
いて以下に説明する。
実施例 段階1:大腸菌（E.coli）B1/5の培養 使用する大腸菌B1/5は多くの菌保存機関から入手できる
公知菌であり、用いた大腸菌培養物は室温で穿刺培養物
として保存されたものである。
公知菌であり、用いた大腸菌培養物は室温で穿刺培養物
として保存されたものである。
１当り10gのNaClと10gのトリプチケースと5gの酵母エ
キスとを含有する培地を用いた。この培地を110℃で45
分間滅菌した後に、別に滅菌したグルコース溶液を2g/
加えた。このように調製された培地の10mlを用いて前
培養を行ない、次いで200mlずつの培地を用いて培養し
て計10の細菌培養液を得た。
キスとを含有する培地を用いた。この培地を110℃で45
分間滅菌した後に、別に滅菌したグルコース溶液を2g/
加えた。このように調製された培地の10mlを用いて前
培養を行ない、次いで200mlずつの培地を用いて培養し
て計10の細菌培養液を得た。
１分間当り８の空気で通気下に470rpmで撹拌培養した
δ600での菌体培加時間は30分であり、菌体は600nmでの
光学的濃度６で集菌した。培養液１当り約8gの菌体が
得られた。培養液pHは2NのNH4OHを添加して6.5〜6.8に
調整した。すぐに使用しない場合には大腸菌培養液は−
20℃で保存した。
δ600での菌体培加時間は30分であり、菌体は600nmでの
光学的濃度６で集菌した。培養液１当り約8gの菌体が
得られた。培養液pHは2NのNH4OHを添加して6.5〜6.8に
調整した。すぐに使用しない場合には大腸菌培養液は−
20℃で保存した。
段階2:細菌の溶解 本段階は下記の２種の緩衝液を用いた。
緩衝液A:2×10-3M−EDTAと0.233M−Nacl（13.63g/）
と５％グリセロール（50ml/）とを含有する５×10-2M
トリス−Hcl（25℃でpH7.9）． 緩衝液B:10-4M−EDTAと0.2M−Naclと５％グリセロール
とを含有する10-2Mトリス−Hcl（pH7.9） 使用細菌量は165g（20培養液）であった。
と５％グリセロール（50ml/）とを含有する５×10-2M
トリス−Hcl（25℃でpH7.9）． 緩衝液B:10-4M−EDTAと0.2M−Naclと５％グリセロール
とを含有する10-2Mトリス−Hcl（pH7.9） 使用細菌量は165g（20培養液）であった。
使用直前に、前記の緩衝液A400mlに室温で0.1M（15.4mg
/ml）−ジチオトレイトール（DTT）0.4mlを加え、続い
てメルカプトエタノール28μ，リゾチーム45mg,及び
エタノール4mlに溶解したフェニルメチルスルホニルフ
ルオリド（PMSF）14mgを加えた。得られた混合溶液に撹
拌器中で前記の大腸菌の凍結物（165g）を分散させ（最
終温度，約10℃）、次いで、この得られた菌体懸濁液を
時折撹拌混合しながら（約20分）15℃迄昇温させ、次い
で撹拌下にデオキシコール酸ナトリウム272mgを加え、
続いてデオキシリボヌクレアーゼ（DNAアーゼ）4mgを加
えた。得られた菌体溶解混合液を時折撹拌混合しながら
20分間放置し、温度を20℃に保持した。これに前記の緩
衝液B400mlと0.1M−DTT0.4mlを撹拌しながら加え、得ら
れた懸濁液を５℃で１時間（Sorvall 遠心分離機で10,0
00rpm）で遠心分離（16,000G）した。上記の使用したDN
Aアーゼ、リゾチームは次の単位を有する。
/ml）−ジチオトレイトール（DTT）0.4mlを加え、続い
てメルカプトエタノール28μ，リゾチーム45mg,及び
エタノール4mlに溶解したフェニルメチルスルホニルフ
ルオリド（PMSF）14mgを加えた。得られた混合溶液に撹
拌器中で前記の大腸菌の凍結物（165g）を分散させ（最
終温度，約10℃）、次いで、この得られた菌体懸濁液を
時折撹拌混合しながら（約20分）15℃迄昇温させ、次い
で撹拌下にデオキシコール酸ナトリウム272mgを加え、
続いてデオキシリボヌクレアーゼ（DNAアーゼ）4mgを加
えた。得られた菌体溶解混合液を時折撹拌混合しながら
20分間放置し、温度を20℃に保持した。これに前記の緩
衝液B400mlと0.1M−DTT0.4mlを撹拌しながら加え、得ら
れた懸濁液を５℃で１時間（Sorvall 遠心分離機で10,0
00rpm）で遠心分離（16,000G）した。上記の使用したDN
Aアーゼ、リゾチームは次の単位を有する。
DNAアーゼ:50,679ドルナーゼ（Dornase）単位/mg リゾチーム:25,000単位/mg 遠心分離で得た上澄液（約900ml）を蒸留水で１に希
釈し、撹拌しながら４℃で硫酸アンモニウム（45％飽和
溶液）280gを加えて蛋白質を沈澱させ、得られた混合物
を４℃で２時間放置した。蛋白質は５℃で30分間16,000
Gで遠心分離して回収した。沈澱（上澄液を捨てる）をp
H7.8の10-2Mトリス−Hcl150mlに溶解し、得られた溶液
を20分間16,000Gで遠心分離し、不溶物を除去した。得
られた上澄液を４℃で18時間にわたって、pH7.8の５×1
0-2Mトリス−Hcl2に対して４回透析し、次いで透析後
の溶液を１時間16,000Gで遠心分離し不溶物を除去し
た。得られた菌体溶解上澄液は液量300mlでpH7.8、導電
率＜7.0mSを示した。
釈し、撹拌しながら４℃で硫酸アンモニウム（45％飽和
溶液）280gを加えて蛋白質を沈澱させ、得られた混合物
を４℃で２時間放置した。蛋白質は５℃で30分間16,000
Gで遠心分離して回収した。沈澱（上澄液を捨てる）をp
H7.8の10-2Mトリス−Hcl150mlに溶解し、得られた溶液
を20分間16,000Gで遠心分離し、不溶物を除去した。得
られた上澄液を４℃で18時間にわたって、pH7.8の５×1
0-2Mトリス−Hcl2に対して４回透析し、次いで透析後
の溶液を１時間16,000Gで遠心分離し不溶物を除去し
た。得られた菌体溶解上澄液は液量300mlでpH7.8、導電
率＜7.0mSを示した。
段階3:大腸菌B1/5ポリヌクレオチドホスホリラーゼ（PN
Pアーゼ）の精製 1.前記の上澄液を、４℃でpH7.4の0.1Mトリス−Hcl中で
平衡にさせたDEAEセファセル280mlのカラム（40×3cm）
にかけ、カラムをpH7.4の0.1MトリスHcl1〜0.4M NaCl
に溶解した0.1MトリスHcl（pH7.4）の１で勾配溶出法
で溶離させ、10mlずつの画分で溶出液を分画した。ジエ
ステラーゼ活性のピークをもつ画分が先ず出現し、続い
て0.21M NaCl−0.1MトリスHclで溶離させると、ポリヌ
クレオチドホスホリラーゼ活性のピークをもつ画分が画
分No.105〜125として得られた。これらの画分の総液量
は210mlであり力価が107単位/mlであるから総単位22,47
0のポリヌクレオチドホスホリラーゼが得られた。
Pアーゼ）の精製 1.前記の上澄液を、４℃でpH7.4の0.1Mトリス−Hcl中で
平衡にさせたDEAEセファセル280mlのカラム（40×3cm）
にかけ、カラムをpH7.4の0.1MトリスHcl1〜0.4M NaCl
に溶解した0.1MトリスHcl（pH7.4）の１で勾配溶出法
で溶離させ、10mlずつの画分で溶出液を分画した。ジエ
ステラーゼ活性のピークをもつ画分が先ず出現し、続い
て0.21M NaCl−0.1MトリスHclで溶離させると、ポリヌ
クレオチドホスホリラーゼ活性のピークをもつ画分が画
分No.105〜125として得られた。これらの画分の総液量
は210mlであり力価が107単位/mlであるから総単位22,47
0のポリヌクレオチドホスホリラーゼが得られた。
2.この酵素溶液に撹拌しながら硫安28gを加えることに
よって硫酸アンモニウム濃度0.5Mに調整し、次いで、0.
05M（NH4）2SO4−0.05MトリスHcl（pH7.4）中で平衡に
させたフェニルセファロース60mlカラム（19×2cm）に
通した。このカラムを0.5M（NH4）2SO4−0.1MトリスHcl
（pH7.4）の約20mlで洗滌し、次いで４℃で0.1M（NH4）
2SO4−0.4MトリスHcl（pH7.8）〜３×10-3MトリスHcl
（pH7.8）250mlで逆勾配溶出法で溶離させた。溶出液を
約10mlずつの画分で分画し、活性な画分を集めた。活性
画分の総液量は55mlであり、酵素力価355単位/mlであ
り、総単位19,525の酵素量である。
よって硫酸アンモニウム濃度0.5Mに調整し、次いで、0.
05M（NH4）2SO4−0.05MトリスHcl（pH7.4）中で平衡に
させたフェニルセファロース60mlカラム（19×2cm）に
通した。このカラムを0.5M（NH4）2SO4−0.1MトリスHcl
（pH7.4）の約20mlで洗滌し、次いで４℃で0.1M（NH4）
2SO4−0.4MトリスHcl（pH7.8）〜３×10-3MトリスHcl
（pH7.8）250mlで逆勾配溶出法で溶離させた。溶出液を
約10mlずつの画分で分画し、活性な画分を集めた。活性
画分の総液量は55mlであり、酵素力価355単位/mlであ
り、総単位19,525の酵素量である。
3.硫酸アンモニウム（20g）を撹拌しながら上記の活性
画分に加え（55％飽和）、蛋白質を沈澱させ、この沈澱
を４℃で１時間放置し、次いで16,000Gで15分遠心分離
した。得られた残渣を0.1M NaCl−0.05MトリスHcl（pH
7.4）と最小量（約10ml）に溶解し、得られた溶液を0.1
M NaCl−0.05MトリスHcl（pH7.4）中で平衡させたセフ
ァクリルS300 350mlカラム（50×3cm）にかけ、次いで
同じ緩衝液で酵素を溶出させた（約10mlずつ分画）。活
性な画分（画分No.13〜No.17）を集めた。得られた活性
画分の総液量は60mlであり、酵素力価は312.5単位/mlで
あり、総単位18,750の酵素量である。540単位．δ280 活性画分へ（NH4）2SO426gを加えて（65％飽和）、酵素
を沈澱させ、得られた酵素懸濁液を−30℃で保存した。
画分に加え（55％飽和）、蛋白質を沈澱させ、この沈澱
を４℃で１時間放置し、次いで16,000Gで15分遠心分離
した。得られた残渣を0.1M NaCl−0.05MトリスHcl（pH
7.4）と最小量（約10ml）に溶解し、得られた溶液を0.1
M NaCl−0.05MトリスHcl（pH7.4）中で平衡させたセフ
ァクリルS300 350mlカラム（50×3cm）にかけ、次いで
同じ緩衝液で酵素を溶出させた（約10mlずつ分画）。活
性な画分（画分No.13〜No.17）を集めた。得られた活性
画分の総液量は60mlであり、酵素力価は312.5単位/mlで
あり、総単位18,750の酵素量である。540単位．δ280 活性画分へ（NH4）2SO426gを加えて（65％飽和）、酵素
を沈澱させ、得られた酵素懸濁液を−30℃で保存した。
段階4:ヌクレオチド重合体の製造 ヌクレオチドADP Na2100g（又はヌクレオチドUDP Na310
0g）を約600mlの水に溶解し、その溶液を、２のビン
に入れた下記の４種の溶液 1MのトリスHcl（pH8.3）200ml 1Mの酢酸アンモニウム250ml 0.1MのEDTA（pH8.0）20ml 1MのMgCl2100ml の混液に加えた。このようにして得られた混合溶液の液
量を水で２に希釈し、5N−NH4OHで室温でpH8.6に調整
した。その溶液の表面をトルエン層で覆った。使用した
ヌクレオシド二燐酸はFe3+又はCu2+のような金属が混入
していないものである。
0g）を約600mlの水に溶解し、その溶液を、２のビン
に入れた下記の４種の溶液 1MのトリスHcl（pH8.3）200ml 1Mの酢酸アンモニウム250ml 0.1MのEDTA（pH8.0）20ml 1MのMgCl2100ml の混液に加えた。このようにして得られた混合溶液の液
量を水で２に希釈し、5N−NH4OHで室温でpH8.6に調整
した。その溶液の表面をトルエン層で覆った。使用した
ヌクレオシド二燐酸はFe3+又はCu2+のような金属が混入
していないものである。
前記の希釈混合溶液の一部（80ml）を取出し、これに20
0単位の酵素と、予め別に調製したポリＡ（又はポリ
Ｕ）2mlをプライマーとして加え、得られた溶液を37℃
で２時間酵素反応させ、その反応液を次いで37℃に保持
した前記の希釈混合溶液の主要残部（main batch）に加
えた。４時間後に、更に300単位の酵素を追加し、反応
を続けた。24時間後に、pHは約8.3に下がり、その後5N
−NH4OHを加えてpHを8.0〜8.3に維持した。
0単位の酵素と、予め別に調製したポリＡ（又はポリ
Ｕ）2mlをプライマーとして加え、得られた溶液を37℃
で２時間酵素反応させ、その反応液を次いで37℃に保持
した前記の希釈混合溶液の主要残部（main batch）に加
えた。４時間後に、更に300単位の酵素を追加し、反応
を続けた。24時間後に、pHは約8.3に下がり、その後5N
−NH4OHを加えてpHを8.0〜8.3に維持した。
力価５単位/gの酵素を総計500単位使用した。重合が24
時間当り25％未満しか進まないならば酵素を追加して適
当な時間で進むように重合速度を増加させる。
時間当り25％未満しか進まないならば酵素を追加して適
当な時間で進むように重合速度を増加させる。
重合率がそれぞれ約30％,55％及び75％の時に、激しく
撹拌しながら1M−MgCl2を25mlずつ追加し（ADP又はUDP
の200ナノモルに対しMgの全量は175ミリモルであっ
た）、pHを8.0〜8.3（37℃で測定）に維持する。重合率
は反応３〜４日目には80〜90％であるべきである、 MgCl2を段階的に分けて添加することにより前述の種々
の重合率の時に遊離ADP（又はUDP）をMgとの比が約２で
あるように維持する。
撹拌しながら1M−MgCl2を25mlずつ追加し（ADP又はUDP
の200ナノモルに対しMgの全量は175ミリモルであっ
た）、pHを8.0〜8.3（37℃で測定）に維持する。重合率
は反応３〜４日目には80〜90％であるべきである、 MgCl2を段階的に分けて添加することにより前述の種々
の重合率の時に遊離ADP（又はUDP）をMgとの比が約２で
あるように維持する。
反応終了時に、得られた反応混合物を遠心分離し、沈澱
したリン酸マグネシウムアンモニウムを除去し、得られ
た沈澱を少量の水で洗滌した。得られた上澄液は、原料
としてADP（又はUDP）を用いた時にポリＡ（又はポリ
Ｕ）を含有する。複合体ポリＡ−ポリＵを製造するため
には、ポリＡを含む上澄液とポリＵを含む上澄液とを合
併して使用する。
したリン酸マグネシウムアンモニウムを除去し、得られ
た沈澱を少量の水で洗滌した。得られた上澄液は、原料
としてADP（又はUDP）を用いた時にポリＡ（又はポリ
Ｕ）を含有する。複合体ポリＡ−ポリＵを製造するため
には、ポリＡを含む上澄液とポリＵを含む上澄液とを合
併して使用する。
最適重合条件はpHを8.0〜8.3に維持し、しかも１日当り
約30％の重合率を得るように十分な酵素とMgCl2とを段
階的に分けて添加することである。反応時のpH（8.3〜
8.6）を高くすると得られる重合体の量が少なくなる。
反応開始時にMg全部を一辺に添加すると得られる重合体
の量が減少する。
約30％の重合率を得るように十分な酵素とMgCl2とを段
階的に分けて添加することである。反応時のpH（8.3〜
8.6）を高くすると得られる重合体の量が少なくなる。
反応開始時にMg全部を一辺に添加すると得られる重合体
の量が減少する。
段階5:ポリＡ−ポリＵ複合体の製造 使用するポリＡ又はポリＵの溶液の全ヌクレオチド含量
は、ポリＡについては1000倍の希釈率及びポリＵについ
ては500倍の希釈率（例えば0.1N NaOH 10ml当りにポリA
10μ又はポリU20μの量になるように希釈し、また
より正確にはポリA100μ及びポリU200μになるよう
に中間希釈を行なう）を使用して、0.1N NaOH 中で反応
混合物を100℃で５分間加水分解することによって定量
する。260nmでの吸光度を測定し、且つ次の値を用いて
モル濃度を求めた。
は、ポリＡについては1000倍の希釈率及びポリＵについ
ては500倍の希釈率（例えば0.1N NaOH 10ml当りにポリA
10μ又はポリU20μの量になるように希釈し、また
より正確にはポリA100μ及びポリU200μになるよう
に中間希釈を行なう）を使用して、0.1N NaOH 中で反応
混合物を100℃で５分間加水分解することによって定量
する。260nmでの吸光度を測定し、且つ次の値を用いて
モル濃度を求めた。
重合体濃度は、全ヌクレオチド量と重合率（％）とから
決定した。次いで、化学量論比ポリA/ポリＵ＝1:1の容
量を算出した。10ビン中のポリＵに25％ NaCl水溶液2
00mlを加え、続いてポリＡの溶液を加え、次いでこの溶
液を十分に混合し（NaClの最終濃度、約0.18M）、４℃
で最小３時間放置した。
決定した。次いで、化学量論比ポリA/ポリＵ＝1:1の容
量を算出した。10ビン中のポリＵに25％ NaCl水溶液2
00mlを加え、続いてポリＡの溶液を加え、次いでこの溶
液を十分に混合し（NaClの最終濃度、約0.18M）、４℃
で最小３時間放置した。
次いで撹拌しながら等容量のエタノールを加えポリＡ−
ポリＵの複合体を沈澱させ、得られた混合物を４℃で１
時間放置した。複合体ポリＡ−ポリＵをSorvall 3B遠心
分離機（複数の１ポット）中5,000rpmで３分間遠心分
離することによって集め、次いで55％エタノール２で
洗滌した。残渣として得られた前記の複合体は４の純
水に溶解し、次いで遠心分離し微量のリン酸マグネシウ
ムアンモニウムを除去した。清澄な上澄液に25％NaCl 2
00mlを加え、得られた溶液を４℃で最小３時間放置し
た。
ポリＵの複合体を沈澱させ、得られた混合物を４℃で１
時間放置した。複合体ポリＡ−ポリＵをSorvall 3B遠心
分離機（複数の１ポット）中5,000rpmで３分間遠心分
離することによって集め、次いで55％エタノール２で
洗滌した。残渣として得られた前記の複合体は４の純
水に溶解し、次いで遠心分離し微量のリン酸マグネシウ
ムアンモニウムを除去した。清澄な上澄液に25％NaCl 2
00mlを加え、得られた溶液を４℃で最小３時間放置し
た。
前記の複合体を、撹拌しながら等容量のエタノールを加
えることによって再び沈澱させ、遠心分離によって集
め、55％エタノール（約２）で１回、75％エタノール
１で回及び96％エタノールで２回洗滌し、次いで減圧下
で乾燥した。収量約110〜120g。
えることによって再び沈澱させ、遠心分離によって集
め、55％エタノール（約２）で１回、75％エタノール
１で回及び96％エタノールで２回洗滌し、次いで減圧下
で乾燥した。収量約110〜120g。
一般に、50％エタノールで複合体を沈澱させるには、Na
Cl（0.15M〜0.02M）を存在させねばならない。洗滌には
55％以上の濃度の水性エタノールを使用しなければなら
ない（沈澱した複合体も50％濃度のエタノールを用いる
と再溶解する）。
Cl（0.15M〜0.02M）を存在させねばならない。洗滌には
55％以上の濃度の水性エタノールを使用しなければなら
ない（沈澱した複合体も50％濃度のエタノールを用いる
と再溶解する）。
毒性 前記の実施例で得たポリＡ−ポリＵ複合体のLD50をIP
（腹腔内）及びIV（静脈内）投与によりマウスとラット
について調査した。
（腹腔内）及びIV（静脈内）投与によりマウスとラット
について調査した。
IV投与の場合には最大投与量でマウス又はラットのいず
れについても死亡例は認められなかった。
れについても死亡例は認められなかった。
IP投与の場合にはラットに対しては死亡例は認められな
かったが、マウスに対してはLD50が約3g/kgであった。
かったが、マウスに対してはLD50が約3g/kgであった。
通常の発熱性試験は完全に陰性であった。
薬理作用 本発明の方法によって製造されるヌクレオチド重合体及
び共重合体は一般に知られているが、これ迄は十分に純
粋な状態で工業的製法で得られたことがなかった。適当
に工業的な条件では実際には入手できない特別に精製さ
れたポリヌクレオチド生成物の試料を用いて種々の薬理
試験はすでに数年間行なわれている。
び共重合体は一般に知られているが、これ迄は十分に純
粋な状態で工業的製法で得られたことがなかった。適当
に工業的な条件では実際には入手できない特別に精製さ
れたポリヌクレオチド生成物の試料を用いて種々の薬理
試験はすでに数年間行なわれている。
本発明の方法によって製造されたポリヌクレオチド生成
物の利点は下記の既存の参考文献及び例えば以下の論説
から認め得る。
物の利点は下記の既存の参考文献及び例えば以下の論説
から認め得る。
・MODULATION OF THE IMMUNE SYSTEM BY SYNTHETIC POL
YNUCLEOTIDES−A.G.JOHNSON−「Springer Semin.Immuno
pathol.」，第２巻第149−168頁（1979年）， ・REGULATION OF THE IMMUNE SYSTEM BY SYNTHETIC POL
YNUCLEO TIDES−I.Characteristics of Adjuvant Actio
n on Antibody Synthesis−J.R.SCHIDTKE及びA.G.JOHNS
ON−「J.Immunol.」，第106巻第1191−1200頁（1971
年）， ・CHANGES IN LYMPHOCYTE SUBPOPULATIONS IN MICE REC
EIVING A SINGLE INJECTION OF POLY A−POLY U−M.DON
NER,D.VALLIER及びF.LACOUR−「Ann.Immunol.」（Inst.
Pasteur）128C,第1039−1052頁（1977）， ・SPECTRUM AND MODE OF ACTION OF POLY A−POLY U IN
THE STIMULATION OF IMMUNE RESPONSES−V.BRAUN,M.IS
HIZUKA,U.YAJIMA,D.WEBB及びR.WINCHURCH in:BEERS R.
F.,BRAUN W.,「Biological effects of polynucleotide
s」New−York:Springle−Verlag,第139−156頁（1971
年）， ・REDUCED INCIDENCE OF SPONTANEOUS MAMMARY TUMORS
IN C3H/He MICE AFTER TREATMENT WITH POLYADENYLATE
−POLYRIDYLATE−F.LACOUR,G.DELAGE及びC.CHIANALE−
「Science」第187巻第256−257頁（1975年）， ・POLY A−POLY U AS AN ADJUNCT TO SURGERY IN THE T
REATMENT OF SPONTANEOUS MURINE MAMMRY ADENOCARCINO
MA−F.LACOUR,J.LACOUR及びA.SPIRA−「Recent Results
in Cancer Research」第47巻第352−356頁， ・POLYADENYLIC−POLYURIDYLIC ACID:BIOLOGICAL RESPO
NSE−MODIFYING ACTIVITIES IN MICE.IN VIVO ORGAN DI
STRIBUTION AND PHARMACOKINETICS IN RABBITS−F.LACO
UR−「J.Biol.Resp.Modif.」，第４巻第490−494頁（19
85年） ・A PHASE I CLINICAL TOLERANCE STUDY OF POLY ADENY
LIC−POLYURIDYLIC ACID IN CANCER PATIENTS−J.P.DUC
RET,P.CAILLE,H.SANCHO−GARNIER,J.L.AMIEL,M.MICHELS
ON,R.G.HOVANESSIAN,J.K.YOUN及びF.LACOUR−「J.Biol.
Resp.Modif.」，第４巻第129−133頁（1985年）． 薬量学的投与方法 好ましい投与方法は有効成分0.01〜0.1gを含有する等張
性溶液のIV（静脈内）投与によるものである。毎週の投
与は６週間繰り返される。
YNUCLEOTIDES−A.G.JOHNSON−「Springer Semin.Immuno
pathol.」，第２巻第149−168頁（1979年）， ・REGULATION OF THE IMMUNE SYSTEM BY SYNTHETIC POL
YNUCLEO TIDES−I.Characteristics of Adjuvant Actio
n on Antibody Synthesis−J.R.SCHIDTKE及びA.G.JOHNS
ON−「J.Immunol.」，第106巻第1191−1200頁（1971
年）， ・CHANGES IN LYMPHOCYTE SUBPOPULATIONS IN MICE REC
EIVING A SINGLE INJECTION OF POLY A−POLY U−M.DON
NER,D.VALLIER及びF.LACOUR−「Ann.Immunol.」（Inst.
Pasteur）128C,第1039−1052頁（1977）， ・SPECTRUM AND MODE OF ACTION OF POLY A−POLY U IN
THE STIMULATION OF IMMUNE RESPONSES−V.BRAUN,M.IS
HIZUKA,U.YAJIMA,D.WEBB及びR.WINCHURCH in:BEERS R.
F.,BRAUN W.,「Biological effects of polynucleotide
s」New−York:Springle−Verlag,第139−156頁（1971
年）， ・REDUCED INCIDENCE OF SPONTANEOUS MAMMARY TUMORS
IN C3H/He MICE AFTER TREATMENT WITH POLYADENYLATE
−POLYRIDYLATE−F.LACOUR,G.DELAGE及びC.CHIANALE−
「Science」第187巻第256−257頁（1975年）， ・POLY A−POLY U AS AN ADJUNCT TO SURGERY IN THE T
REATMENT OF SPONTANEOUS MURINE MAMMRY ADENOCARCINO
MA−F.LACOUR,J.LACOUR及びA.SPIRA−「Recent Results
in Cancer Research」第47巻第352−356頁， ・POLYADENYLIC−POLYURIDYLIC ACID:BIOLOGICAL RESPO
NSE−MODIFYING ACTIVITIES IN MICE.IN VIVO ORGAN DI
STRIBUTION AND PHARMACOKINETICS IN RABBITS−F.LACO
UR−「J.Biol.Resp.Modif.」，第４巻第490−494頁（19
85年） ・A PHASE I CLINICAL TOLERANCE STUDY OF POLY ADENY
LIC−POLYURIDYLIC ACID IN CANCER PATIENTS−J.P.DUC
RET,P.CAILLE,H.SANCHO−GARNIER,J.L.AMIEL,M.MICHELS
ON,R.G.HOVANESSIAN,J.K.YOUN及びF.LACOUR−「J.Biol.
Resp.Modif.」，第４巻第129−133頁（1985年）． 薬量学的投与方法 好ましい投与方法は有効成分0.01〜0.1gを含有する等張
性溶液のIV（静脈内）投与によるものである。毎週の投
与は６週間繰り返される。
Claims (4)
- 【請求項１】ヌクレオチドの重合体又は共重合体あるい
はこれらの複合体の製造法において、下記の一連の工
程；すなわち、 （ａ）細菌菌株培養物の菌体溶解を行ない、得られた菌
体溶解液を３種のカラム、すなわちイオン交換樹脂を入
れた第１のカラムと、疎水性樹脂を入れた第２のカラム
と、分子篩を入れた第３のカラムとに次々に通してカラ
ム処理し、これらのカラム処理によって、次後の重合工
程に影響を及ぼす物質を含有しない実質的に純粋なポリ
ヌクレオチドホスホリラーゼの溶液を収得する工程と、 （ｂ）前記の工程（ａ）で得られたポリヌクレオチドホ
スホリラーゼを作用させて、原料として選択したモノヌ
クレオチドを重合させる工程であって、ヌクレオチドの
重合度を調節するために段階的に分けて加えられるMgCl
2の存在下で、慣用の緩衝液と0.06〜0.2ミリモル/ml濃
度の前記モノヌクレオチドとを含有する溶液に対して20
0〜750単位の前記ホスホリラーゼをpH7.4〜8.6の範囲で
３〜６日間反応させることからなるヌクレオチドを重合
させる工程と、 （ｃ）前記の工程（ｂ）で得られたヌクレオチド重合体
を分離し且つ洗浄してヌクレオチド重合体を収得する工
程と、所望ならば （ｄ）原料として第２のヌクレオチドを選択してその重
合を前記と同じ条件で行なって第２のヌクレオチド重合
体を生成させ、次いで前記第１のヌクレオチド重合体と
該第２のヌクレオチド重合体とを水中でNaClの存在下に
混合してこれらのヌクレオチド重合体の複合体を生成さ
せ、得られた複合体をエタノール添加によって最後に沈
澱させる工程 とからなることを特徴とするヌクレオチドの重合体又は
共重合体あるいはこれらの複合体の製造法。 - 【請求項２】前記の第１のカラムがDEAEセファセル又は
その均等物のようなイオン交換樹脂を収容するカラムで
ある請求項１記載の製造法。 - 【請求項３】前記の第２のカラムがフェニルセファロー
ス又はその均等物のような疎水性樹脂を収容するカラム
である請求項１記載の製造法。 - 【請求項４】前記の第３のカラムがセファクリルS300、
セファデックス200又はそれらの均等物のような分子篩
を収容するカラムである請求項１記載の製造法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB878725606A GB8725606D0 (en) | 1987-11-02 | 1987-11-02 | Preparation polynucleotides |
| GB8725606 | 1987-11-02 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01148196A JPH01148196A (ja) | 1989-06-09 |
| JPH0712316B2 true JPH0712316B2 (ja) | 1995-02-15 |
Family
ID=10626275
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63276359A Expired - Fee Related JPH0712316B2 (ja) | 1987-11-02 | 1988-11-02 | ポリヌクレオチド類の製造法 |
Country Status (29)
| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JPH0712316B2 (ja) |
| KR (1) | KR0134624B1 (ja) |
| AR (1) | AR244342A1 (ja) |
| AT (1) | AT396251B (ja) |
| AU (1) | AU610792B2 (ja) |
| BE (1) | BE1001938A4 (ja) |
| CA (1) | CA1339911C (ja) |
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| DK (1) | DK607388A (ja) |
| ES (1) | ES2009099A6 (ja) |
| FI (1) | FI95135C (ja) |
| FR (2) | FR2622451B1 (ja) |
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| GR (1) | GR1000715B (ja) |
| HK (1) | HK47692A (ja) |
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| IT (1) | IT1227447B (ja) |
| MY (1) | MY103445A (ja) |
| NL (1) | NL194949C (ja) |
| NO (1) | NO172902C (ja) |
| NZ (1) | NZ226643A (ja) |
| OA (1) | OA10206A (ja) |
| PT (1) | PT88903B (ja) |
| SE (1) | SE503401C2 (ja) |
| SG (1) | SG40792G (ja) |
| TN (1) | TNSN88113A1 (ja) |
| ZA (1) | ZA888180B (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| GB9108085D0 (en) * | 1991-04-16 | 1991-06-05 | Scras | Complexes of polyadenylic acid with polyuridylic acid |
| AR013269A1 (es) * | 1997-08-04 | 2000-12-13 | Scras | Producto que contiene por lo menos un rna de doble filamento combinado con por lo menos un agente anti-viral, para la utilizacion terapeutica en eltratamiento de una enfermedad viral, en especial de la hepatitis viral |
| EP2258712A3 (en) * | 2002-03-15 | 2011-05-04 | Multicell Immunotherapeutics, Inc. | Compositions and Methods to Initiate or Enhance Antibody and Major-histocompatibility Class I or Class II-restricted T Cell Responses by Using Immunomodulatory, Non-coding RNA Motifs |
| EP1582584A4 (en) * | 2002-12-26 | 2006-05-31 | Nippon Shinyaku Co Ltd | PROCESS FOR PRODUCING PNPASE |
| WO2005068662A1 (en) * | 2003-12-30 | 2005-07-28 | Sigma-Aldrich Co. | Rapid preparation of nucleic acids by enzymatic digestion |
| CA2722589A1 (en) | 2008-04-25 | 2009-10-29 | Innate Pharma | Improved tlr3 agonist compositions |
| WO2012092540A1 (en) * | 2010-12-30 | 2012-07-05 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for the synthesis of polyadenylic acid |
| US20220389050A1 (en) * | 2020-01-24 | 2022-12-08 | Aim Immunotech Inc. | Therapeutic double stranded rna and methods for producing the same |
Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| JPS53110697A (en) * | 1977-03-09 | 1978-09-27 | Mitsubishi Chem Ind Ltd | Preparation of polyguanylic acid |
Family Cites Families (18)
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|---|---|---|---|---|
| SU6012A1 (ru) * | 1927-04-04 | 1928-07-31 | Л.С. Кравцов | Горизонтальный вод ной двигатель с поворотными лопаст ми |
| JPS4940954B1 (ja) * | 1970-02-16 | 1974-11-06 | ||
| DE2056081A1 (en) * | 1970-11-14 | 1972-06-22 | Pabst Brewing Company, Milwaukee, Wis. (V.StA.) | Poly nucleotides prepn |
| IL37076A (en) * | 1971-06-16 | 1974-05-16 | Littauer U | A method for stepwise synthesis of oligoribonucleotides of defined sequence using 2'(3')-o-acyl-nucleoside diphosphates and polynucleotide phosphorylase |
| JPS524633B2 (ja) * | 1972-07-21 | 1977-02-05 | ||
| GB1435571A (en) * | 1973-04-02 | 1976-05-12 | Searle & Co | Polynucleotides |
| DE2319495C2 (de) * | 1973-04-17 | 1985-01-10 | Yeda Research And Development Co., Ltd., Rehovot | Verfahren zum selektiven, reversiblen Binden von Biomolekülen an ein Adsorbens in einer chromatographischen Säule |
| FR2252350A1 (en) * | 1973-11-22 | 1975-06-20 | Choay Sa | Polynucleotide phosphorylase - extraction from E coli, fixation on sepharose, and use in preparing polynucleotides |
| JPS50107187A (ja) * | 1974-02-08 | 1975-08-23 | ||
| US4006059A (en) * | 1974-07-29 | 1977-02-01 | Purdue Research Foundation | Hydrophobic noncovalent binding of proteins to support materials |
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