NO172902B - Fremgangsmaate ved fremstilling av polynukleotider - Google Patents
Fremgangsmaate ved fremstilling av polynukleotider Download PDFInfo
- Publication number
- NO172902B NO172902B NO884865A NO884865A NO172902B NO 172902 B NO172902 B NO 172902B NO 884865 A NO884865 A NO 884865A NO 884865 A NO884865 A NO 884865A NO 172902 B NO172902 B NO 172902B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- polymerization
- phosphorylase
- poly
- equivalent
- nucleotide
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 10
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 title description 9
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 title description 9
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 title description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 28
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims description 19
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 14
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 14
- 101001066878 Homo sapiens Polyribonucleotide nucleotidyltransferase 1, mitochondrial Proteins 0.000 claims description 12
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 12
- 102000002681 Polyribonucleotide nucleotidyltransferase Human genes 0.000 claims description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 10
- -1 N,N-diethylaminoethyl Chemical group 0.000 claims description 8
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims description 7
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 6
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 4
- 102000009097 Phosphorylases Human genes 0.000 claims description 4
- 108010073135 Phosphorylases Proteins 0.000 claims description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 4
- 229920001425 Diethylaminoethyl cellulose Polymers 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000011837 N,N-methylenebisacrylamide Substances 0.000 claims description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 claims description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 claims description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 claims description 2
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 claims description 2
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 claims description 2
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 2
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 10
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 10
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 3
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 3
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 3
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- MXZRMHIULZDAKC-UHFFFAOYSA-L ammonium magnesium phosphate Chemical compound [NH4+].[Mg+2].[O-]P([O-])([O-])=O MXZRMHIULZDAKC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000001698 pyrogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241001522878 Escherichia coli B Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101000874159 Mus musculus Succinate dehydrogenase [ubiquinone] iron-sulfur subunit, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102100034410 Polyribonucleotide nucleotidyltransferase 1, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 201000008274 breast adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000012994 industrial processing Methods 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 231100001231 less toxic Toxicity 0.000 description 1
- 210000000207 lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012985 polymerization agent Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000011046 pyrogen test Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 108010050327 trypticase-soy broth Proteins 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/30—Nucleotides
- C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/814—Enzyme separation or purification
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/814—Enzyme separation or purification
- Y10S435/815—Enzyme separation or purification by sorption
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
Den foreliggende oppfinnelse angår en forbedret fremgangsmåte for fremstilling av polynukleotider (homo- og kopolynukleotider) og komplekser av disse. Det er blitt fremstilt forskjellige polynukleotider ved eksisterende teknikker, men hittil er de fleste av de oppnådde produkter generelt pyrogene eller mer eller mindre toksiske på grunn av tilstedeværelse av en del forurensninger eller midler som fremkommer ved den rekkefølge av trinn som fører til de ønskede produkter. Disse forbindelser er hjelpestoffer på forskjellige terapeutiske områder og mer spesielt ved behandling av kreft, ved behandling av visse bakterielle og virale sykdommer og for vaksiner.
Vanligvis fås polynukleotider ved innvirkning av en polynukleotidfosforylase på den passende nukleotidmonomer. De forskjellige mulige monomerer, såsom ADP, CDP, GDP, IDP og UDP, fås ved velkjente teknikker. Polynukleotidfosforylase fås også ved velkjente teknikker, idet man starter fra en kultur av bakterier og deretter bearbeider med lyse av de oppnådde bakterier i kulturen, fulgt av ekstraksjon av polynukleotidfosforylase som fås ved lyse fra et komplekst medium hvor det kan finnes forskjellige enzymer såsom kinaser, fosfataser, nukleaser, diesteraser o.s.v., alle produkter som er konkurrerende midler ved det ytterligere polymerisasjons-trinn for den valgte nukleotidmonomer ved polynukleotid-fosf orylasen . Tilstedeværelsen av de forskjellige uønskede enzymer fører til parallelle uønskede reaksjoner og delvis nedbrytning av den monomer som skal polymeriseres såvel som den dannede polymer.
Av disse grunner er de fleste av de således oppnådde polynukleotider defekte når det gjelder enten sin toksisitet og sine pyrogene karakteregenskaper eller begge deler. Skjønt det kan være mulig å fremstille en tilfredsstillende ren polynukleotidfosforylase i liten målestokk for analyseformål eller for en begrenset vitenskapelig utprøvning, oppnås den ikke lett ved anvendelse av industrielle bearbeidelses-teknikker med tilfredsstillende omkostninger.
Ifølge denne oppfinnelse er det funnet mulig under industrielt tilfredsstillende betingelser å oppnå hovedsakelig rene homopolymerer eller kopolymerer eller komplekser av polynukleotider eller av nære analoger til disse, ved at man som polymerisasjonsmiddel, i stedet for de polynukleotid-fosforylasepreparater som fås ifølge de forskjellige fremgangsmåter som er beskrevet tidligere, anvender et høytrenset enzym som er fritt for forurensninger som fører til uønskede reaksjoner. Nære analoger til nukleotider kan innbefatte for eksempel 6-hydroksyalkylderivater av ADP eller 5-halogen- eller 5-0H- eller 5-metylderivater av UDP.
Nærmere bestemt er det funnet at det
a) fremstilles en polynukleotidfosforylaseoppløsning som er hovedsakelig ren når det gjelder substanser som kan
påvirke en videre polymerisasjonsprosess ved (i) lysing av en bakteriestammekultur og
(ii) det resulterende medium ledes suksessivt gjennom tre
kolonner:
den første inneholder en ionebytterharpiks, såsom N,N-dietylaminoetylcellulose eller en eventuell ekvivalent, den annen inneholder en hydrofob harpiks såsom
fenylhydroksyfenylpropyleter eller en eventuell ekvivalent, og - den tredje inneholder en molekylsikt såsom Sephakryl® S3 00, (kryssbundet kopolymer av allyl-dekstran og N,N-metylenbisakrylamid), Sephadex ® 2 00 (kryssbundet dekstran) eller en eventuell ekvivalent, (b) det valgte nukleotid behandles med den således oppnådde fosforylase, ved at fra 200 til 750 fosforylaseenheter omsettes på en oppløsning som inneholder de vanlige buffere og en konsentrasjon på 0,06-0,2 mmol/ml av det valgte mono-nukleotid i nærvær av MgCl2/ trinnvis tilsatt for regulering av polymerisasjonsnivået, med en varighet på fra 3 til 6 dager, mens pH-verdiene holdes på 7,4-8,6, og (c) den således oppnådde polymer separeres og vaskes, idet man eventuelt fortsetter til polymerisasjon av et andre valgt nukleotid ved de samme betingelser som ovenfor, og i dette tilfelle blandes passende mengder av hver valgt polymer i vann, i nærvær av NaCl, og til slutt utfelles det resulterende kompleks ved tilsetning av etanol.
Hvis man ønsker en homopolymer, anvendes den oppnådde polynukleotid-fosforylase for polymerisasjon av den valgte monomer i nærvær av vanlige midler.
Hvis man ønsker en kopolymer, erstattes den valgte monomer av en blanding, i passende forhold, av de valgte monomerer. Kopolymeren vil bli betegnet som Poly A / Poly U.
Hvis man ønsker et kompleks, foretas den samme polymerisasjon for hver av de passende monomerer, og de resulterende homopolymerer, i passende forhold, blandes i nærvær av NaCl og utfelles med etanol.
Ifølge et viktig trekk ved oppfinnelsen utføres polymerisasjonen av den valgte monomer eller av den valgte blanding av monomerer under betingelser som er forskjellige fra det som vanligvis gjøres. Mer spesielt er de anvendte konsentrasjoner langt over de vanlige tall (fra 3 0 til 100 ganger og for-trinnsvis 50 ganger), polymerisasjonen utføres under kon-trollert tilsetning av MgCl2, under kontrollerte pH-verdier på 7,4-8,6 og med varighet på fra 3 til 6 dager.
De resulterende polymerer eller kopolymerer har et mole-kylvektområde som gir komplekser med molekylvekter på fra 250 000 til 1 500 000 med en homogen polymerisasjonsgrad og et polymerisasjonsutbytte på opp til 90-95%.
Oppfinnelsen vil bedre forstås ut fra beskrivelsen av den følgende rekkefølge av fém trinn, som fører fra en utgangs-bakteriekultur (her E. Coli, men andre bakterier er også egnet) til et kompleks av Poly A/Poly U.
Trinn 1 : Dyrkning av E. Coli B 1/5
Kulturen holdes i stikk ved omgivelsestemperatur. Dyrkningsmediet inneholder pr. liter 10 g NaCl, 10 g
Trypticase og 5 g gjærekstrakt. Etter sterilisering i 45 minutter ved 110°C, tilsettes en glukoseoppløsning på 2 g/l som er sterilisert atskilt. For-kulturer fremstilles med 10 ml, og deretter fremstilles 200 ml medium for en 10 liters kultur.
Omrøring ved 470 rpm (omdreininger pr. minutt) med 8 liter luft pr. minutt. Doblingstiden ved 6600 er 30 minutter og bakteriene høstes ved en optisk densitet på 6 ved 600 nm. Det oppnås ca. 8 gram pr. liter kultur. Fermenteringens pH reguleres ved 6,5-6,8 ved tilsetning av 2N NH^OH. Hvis kulturen ikke anvendes straks, må den lagres ved -20°C.
Trinn 2 : Lyse av bakterier
Buffer A 5 x IO"<2> M Tris-HCl pH 7,9 (ved 25°C) inneholdende
2 x 10"<3> M EDTA, 0,233 M NaCl (13,63 g/l) og 5% glycerol (50 ml/l)
Buffer B IO"<2> M Tris-HCl pH 7,9 inneholdende 10"* M EDTA,
0,2 M NaCl og 5% glycerol.
For 165 g bakterier (2 0 1 kultur)
Like før anvendelse tilsettes 0,4 ml ditiotreitol (DTT) 0,1 M (15,4 mg/ml) til 400 ml buffer A ved romtemperatur, fulgt av 28 ul merkaptoetanol, 45 mg lysozym og 14 mg fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) oppløst i 4 ml etanol. De frosne bakterier (165 g) dispergeres i dette medium i en blander (slutt-temperatur -5- 10°C) , og suspensjonen får oppvarmes til 15°C med leilighetsvis blanding (ca. 20 minutter), deretter tilsettes 272 mg natriumdeoksycholat under omrøring, fulgt av 4 mg deoksyribonuklease (DNAase). Lyseblandingen får stå i 2 0 minutter med leilighetsvis blanding og temperaturen holdes ved 20°C. Til dette tilsettes 400 ml buffer B pluss 0,4 ml 0,1 M DTT under omrøring, og suspensjonen sentrifugeres ved 16 000 g (10 000 rpm i Sorvall-sentrifuge) i 1 time ved 5°C.
DNAase 50 679 Dornase-enheter/g
Lysozym 25 000 enheter/mg.
Supernatanten (-5- 900 ml) fra sentrifugeringen ble fortynnet til 1 liter med destillert vann og proteinet utfelt ved tilsetning av 280 g ammoniumsulfat (45% metning) ved 4°C under omrøring og blandingen fikk stå ved 4°C i 2 timer. Proteinet ble gjenvunnet ved sentrifugering ved 16 000 g i 30 minutter ved 5°C. Utfeiningen (supernatantene kastes) ble oppløst i 150 ml <x>0"<2> M Tris-HCl pH 7,8 og oppløsningen sentrifugert i 2 0 minutter ved 16 000 g under fjerning av uløselig materiale. Supernatantene ble dialysert mot 4 skift på 2 1 av 5 x IO"<2> M Tris-HCl pH 7,8 ved 4°C i løpet av 18 timer, og deretter ble oppløsningen sentrifugert i 1 time ved 16 000 g under fjerning av uløselig materiale.
300 ml, pH 7,8, ledningsevne < 7,0 mS.
Trinn 3 : Rensning av Polynukleotid Fosforylase coli B 1/5
(PNPase)
1. Ovennevnte supernatanter ble kjørt på en kolonne av 280 ml DEAE-Sephacel (N,N-dietylaminoetylcellulose) (40 x 3 cm) ekvilibrert i 0,1 M Tris-HCl pH 7,4 ved 4°C og kolonnen eluert med en gradient på fra 1 liter 0,1 M Tris-HCl pH 7,4 til 1 liter 0,1 M Tris-HCl i 0,4 M NaCl pH 7,4 med oppsamling av 10 ml fraksjoner. En topp av diesteraseaktivitet elueres, fulgt av en andre topp av polynukleotidfosforylase-aktivitet lokalisert i fraksjonene 105-125 eluert ved 0,21 M NaCl 0,1 M Tris-HCl.
Volum 210 ml : 107 enheter/ml totalt 22 470.
2. Denne oppløsning ble justert til 0,5 M i ammoniumsulfat ved tilsetning av 28 g under omrøring og deretter kjørt på en kolonne av 60 ml fenylhydroksyfenylpropyleter (19 x 2 cm) ekvilibrert i 0,5 M (NHJ2S0A 0,05 M Tris-HCl pH 7,4. Kolonnen ble vasket med ca. 2 0 ml 0,5 M (NHJ2S04 i 0,1 M Tris-HCl pH 7,4 og deretter eluert med en revers gradient på fra 250 ml 0,4 M Tris-HCl pH 7,8 i 0,1 M (NHJ2SOA til 3 x IO"<3> M Tris-HCl pH 7,8 ved 4°C. Ca. 10 ml fraksjoner. Aktive fraksjoner ble gruppert.
Volum 55 ml : 355 enheter/ml totalt 19 525.
3. Ammoniumsulfat (20 g) ble tilsatt under omrøring (55% metning) for utfelling av protein, og utfelningen fikk stå ved 4°C i 1 time og ble deretter sentrifugert i 15 minutter ved 16 000 g. Residuet ble oppløst i minimum 0,1 M NaCl 0,05 M Tris-HCl pH 7,4 (ca. 10 ml) og oppløsningen påført på en kolonne av 350 ml Sephacryl S300 (50 x 3 cm) ekvilibrert i 0,1 M NaCl 0,05 M Tris-HCl pH 7,4 og enzymet eluert med den samme buffer (ca. 10 ml fraksjoner). Aktive fraksjoner (13-17) ble gruppert.
Volum 60 ml : 312,5 enheter/ml totalt 18 750.
54 0 enheter. S 280
Enzymet ble utfelt ved tilsetning av 26 g (NHj2SO<, (65% metning) og suspensjonen lagret ved -30°C.
Trinn 4 : Fremstilling av polymerer
100 g ADP-Na2 (eller 100 g UDP-Na3) oppløses i ca. 600 ml vann og tilsettes til :
200 ml M. Tris-HCl pH 8,3
2 50 ml M. ammoniumacetat
2 0 ml 0,1 M EDTA pH 8,0
100 ml M. MgCl2
i en 2 1 flaske. Volumet ble fylt opp til 2 1 med vann og pH justert til 8,6 ved romtemperatur med 5 N NHAOH. Overflaten ble dekket med et lag toluen. Anvendte nukleosid-difosfater bør være fri for forurensende metaller såsom Fe<3+> eller Cu<2+>.
Til en porsjon av ovennevnte blanding (80 ml) ble det tilsatt 200 enheter enzym og 2 ml av et forhåndspreparat av poly A (eller poly U) som primer, og oppløsningen ble inkubert ved 37°C i 2 timer og deretter overført til hovedmengden som ble holdt på 37°C. Etter 4 timer ble ytterligere 300 enheter enzym tilsatt og inkuberingen fortsatt. pH faller til ca. 8,3 etter 24 timer og pH holdes deretter på 8,0-8,3 ved tilsetning av 5 N NHAOH.
Total enzym-enhetsmengde = 500 d.v.s. 5 enheter pr. g. Hvis polymeriseringen går ved mindre enn 25% pr. 24 timer, kan mer enzym tilsettes for økning av hastigheten ved egnede tids-punkter.
Ytterligere mengder på 25 ml M. MgCl2 tilsettes under kraftig omrøring ved ca. 30, 55 og 75% polymerisasjon (totalt 175 mmol Mg pr. 200 nmol ADP eller UDP), idet pH holdes på 8,0-8,3 (målt ved 37°C) . Polymerisasjonen bør være 80-90% ved slutten av 3-4 dager.
Trinnvis tilsetning av MgCl2 holder forholdet mellom fritt ADP (UDP) og Mg på ca. 2 ved de polymerisasjonsnivåer som er nevnt ovenfor.
Ved slutten av inkuberingen sentrifugeres blandingen under fjerning av det utfelte ammoniummagnesiumfosfat, utfeiningen vaskes med litt vann og de blandede supernatanter anvendes for fremstilling av komplekset poly A - poly U.
Optimale polymerisasjonsbetirtgelser er pH 8,0-8,3 med trinnvis tilsetning av MgCl2 og tilstrekkelig enzym til at man får en polymerisasjonshastighet på ca. 30% pr. dag. Høyere inkuberings-pH (8,3-8,6) gir mindre polymerer. Tilsetning av total mengde Mg ved begynnelsen av inkuberingen gir også mindre polymerer.
Trinn 5 : Fremstilling av kompleks Poly A - Poly U
Totalt nukleotidinnhold i oppløsningene bestemmes ved hydrolyse av inkubasjonsblandingen i 0,1 N NaOH ved 100°C i 5 minutter under anvendelse av en fortynning på 1000 for poly A og 500 for poly U (f.eks. 10 /il poly A eller 20 /il poly U i 10 ml 0,1 N NaOH eller mer nøyaktig ved mellomfortynning på 100 Ml A og 200 /il U) . Absorpsjon ved 260 nm måles og molariteten beregnes under anvendelse av følgende verdier.
S26o nm x 10 3 f°r molare oppløsninger.
Polymerkonsentrasjonene bestemmes ut fra total mengde nukleotid og prosentvis polymerisasjon. Volumer for et støkiometrisk forhold mellom A og U = 1:1 beregnes deretter. Til poly U i en 10 1 flaske tilsettes 200 ml 25% vandig NaCl fulgt av oppløsningen av poly A, og oppløsningene blandes grundig (sluttkonsentrasjon av NaCl t 0,18 M) og får deretter stå ved 4°C i minimum 3 timer.
Et likt volum etanol tilsettes så under omrøring under utfelling av poly A - poly U, og blandingen får stå ved 4°C i 1 time. Komplekset oppsamles ved sentrifugering i en Sorvall 3 B (1 liters begre) ved 5000 rpm i 3 minutter og vaskes deretter med 2 1 55% etanol. Residuet oppløses i ca. 4 1 rent vann og sentrifugeres under fjerning av eventuelle spor av ammonium-magnesium-fosfat. Til de klare supernatanter tilsettes 200 ml 25% NaCl, og oppløsningen får stå ved 4°C i minimalt tre timer.
Komplekset utfelles igjen ved tilsetning av et likt volum etanol under omrøring, oppsamles ved sentrifugering, vaskes med 55% etanol (ca. 2 1), 75% etanol og to ganger med 96% etanol, og tørkes deretter under vakuum.
Utbytte ca. 110 - 120 g.
Som en regel må NaCl (0,15 M til 0,02 M) være tilstede for utfelling av komplekset med 50% etanol. For vasking må det ikke anvendes mindre enn 55% vandig etanol (det utfelte kompleks oppløses ved 50% etanol).
TOKSISITET
LD50 er blitt undersøkt for mus og rotter ved IP- og IV-metoder.
Det ble ikke observert noen dødelighet ved de maksimale administreringsdoser IV, verken for mus eller rotter.
Det ble heller ikke observert noen dødelighet ved IP administrasjon til rotter, men en LD50 på ca. 3 g/kg ble funnet for mus IP.
Vanlige pyrogen-forsøk var fullstendig negative.
FARMAKOLOGI
Siden polymerene og kopolymerene ifølge oppfinnelsen er generelt kjent, men inntil nå aldri er blitt oppnådd industrielt i en tilstrekkelig ren tilstand, er forskjellige farmakologiske forsøk blitt utført i flere år når det gjelder prøver av spesielt rensede produkter som ikke i virkeligheten kunne oppnås ved rimelige kommersielle betingelser.
Hele betydningen ved oppfinnelsen kan forstås ut fra den eksisterende bibliografi og for eksempel følgende artikler: . MODULATION OF THE IMMUNE SYSTEM BY SYNTHETIC POLYNUCLEOTIDES - A.G. JOHNSON - Springer Semin. Immunopathol., 2, s. 149-168 (1979), . REGULATION OF THE IMMUNE SYSTEM BY SYNTHETIC POLYNUCLEO-TIDES - I. Characteristics of Adjuvant Action on Antibody Synthesis - J.R. SCHIDTKE og a.G. JOHNSON - J. Immunol., 106, s. 1191-1200 (1971), . CHANGES IN LYMPHOCYTE SUBPOPULATIONS IN MICE RECEIVING A SINGLE INJECTION OF POLY A - POLY U - M. DONNER, D. VALLIER og F. LACOUR - Ann. Immunol. (Inst. Pasteur) 128C, s. 1039-1052 (1977), . SPECTRUM AND MODE OF ACTION OF POLY A - POLY U IN THE S TIMULATION OF IMMUNE RESPONSES - V. BRAUN, M. ISHIZUKA, U. YAJIMA, D. WEBB og R. WINCHURCH i : BEERS R.F. , BRAUN W., "Biological effeets of polynucleotides" New-York : Springle-Verlag, s. 139-156 (1971), . REDUCED INCIDENCE OF SPONTANEOUS MAMMARY TUMORS IN C3H/He MICE AFTER TREATMENT WITH POLYADENYLATE-POLYRIDYLATE - F. LACOUR, G. DELAGE og C. CHIANALE - Science, 187, s. 256-257 (1975), . POLY A - POLY U AS AN ADJUNCT TO SURGERY IN THE TREATMENT OF SPONTANEOUS MURINE MAMMARY ADENOCARCINOMA - F. LACOUR, J. LACOUR og A. SPIRA - Recent Results in Cancer Research, vol. 47, s. 352-356, . POLYADENYLIC-POLYURIDYLIC ACID : BIOLOGICAL RESPONSE--MODIFYING ACTIVITIES IN MICE. IN VIVO ORGAN DISTRIBUTION AND PHARMACOKINETICS IN RABBITS - F. LACOUR - J. Biol. Resp. Modif., 4, s. 490-494 (1985) . A PHASE I CLINICAL TOLERANCE STUDY OF POLYADENYLIC-POLYURIDYLIC ACID IN CANCER PATIENTS - J.P. DUCRET, P. CAILLE, H. SANCHO-GARNIER, J.L. AMIEL, M. MICHELSON,
R.G. HOVANESSIAN, J.K. YOUN og F. LACOUR - J. Biol. Resp. Modif., 4, s. 129-133 (1985).
PRESENTASJON OG POSOLOGI
Foretrukket administreringsmåte er ved IV av en isoton oppløsning som inneholder 0,01-0,1 g aktiv bestanddel. En ukentlig injeksjon vil bli gjentatt i 6 uker.
Claims (1)
- Fremgangsmåte for fremstilling av polymerer av nukleotider,karakterisert ved at det a) fremstilles en polynukleotidfosforylaseoppløsning som er hovedsakelig ren når det gjelder substanser som kan påvirke en videre polymerisasjonsprosess ved (i) lysing av en bakteriestammekultur og (ii) det resulterende medium ledes suksessivt gjennom trekolonner: den første inneholder en ionebytterharpiks, såsomN,N-dietylaminoetylcellulose eller en eventuell ekvivalent, den annen inneholder en hydrofob harpiks såsomfenylhydroksyfenylpropyleter eller en eventuell ekvivalent, og den tredje inneholder en molekylsikt såsomSephakryl® S300, (kryssbundet kopolymer av allyl-dekstran og N,N-metylenbisakrylamid), Sephadex ® 200 (kryssbundet dekstran) eller en eventuell ekvivalent, (b) det valgte nukleotid behandles med den således oppnådde fosforylase, ved at fra 200 til 750 fosforylaseenheter omsettes på en oppløsning som inneholder de vanlige buffere og en konsentrasjon på 0,06-0,2 mmol/ml av det valgte mono-nukleotid i nærvær av MgCl2, trinnvis tilsatt for regulering av polymerisasjonsnivået, med en varighet på fra 3 til 6 dager, mens pH-verdiene holdes på 7,4-8,6, og (c) den således oppnådde polymer separeres og vaskes, idet man eventuelt fortsetter til polymerisasjon av et andre valgt nukleotid ved de samme betingelser som ovenfor, og i dette tilfelle blandes passende mengder av hver valgt polymer i vann, i nærvær av NaCl, og til slutt utfelles det resulterende kompleks ved tilsetning av etanol.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB878725606A GB8725606D0 (en) | 1987-11-02 | 1987-11-02 | Preparation polynucleotides |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO884865D0 NO884865D0 (no) | 1988-11-01 |
| NO884865L NO884865L (no) | 1989-05-03 |
| NO172902B true NO172902B (no) | 1993-06-14 |
| NO172902C NO172902C (no) | 1993-09-22 |
Family
ID=10626275
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO884865A NO172902C (no) | 1987-11-02 | 1988-11-01 | Fremgangsmaate ved fremstilling av polynukleotider |
Country Status (29)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4927755A (no) |
| JP (1) | JPH0712316B2 (no) |
| KR (1) | KR0134624B1 (no) |
| AR (1) | AR244342A1 (no) |
| AT (1) | AT396251B (no) |
| AU (1) | AU610792B2 (no) |
| BE (1) | BE1001938A4 (no) |
| CA (1) | CA1339911C (no) |
| CH (1) | CH676248A5 (no) |
| DE (1) | DE3837203A1 (no) |
| DK (1) | DK607388A (no) |
| ES (1) | ES2009099A6 (no) |
| FI (1) | FI95135C (no) |
| FR (2) | FR2622451B1 (no) |
| GB (2) | GB8725606D0 (no) |
| GR (1) | GR1000715B (no) |
| HK (1) | HK47692A (no) |
| IE (1) | IE61610B1 (no) |
| IT (1) | IT1227447B (no) |
| MY (1) | MY103445A (no) |
| NL (1) | NL194949C (no) |
| NO (1) | NO172902C (no) |
| NZ (1) | NZ226643A (no) |
| OA (1) | OA10206A (no) |
| PT (1) | PT88903B (no) |
| SE (1) | SE503401C2 (no) |
| SG (1) | SG40792G (no) |
| TN (1) | TNSN88113A1 (no) |
| ZA (1) | ZA888180B (no) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9108085D0 (en) * | 1991-04-16 | 1991-06-05 | Scras | Complexes of polyadenylic acid with polyuridylic acid |
| AR013269A1 (es) * | 1997-08-04 | 2000-12-13 | Scras | Producto que contiene por lo menos un rna de doble filamento combinado con por lo menos un agente anti-viral, para la utilizacion terapeutica en eltratamiento de una enfermedad viral, en especial de la hepatitis viral |
| EP2258712A3 (en) * | 2002-03-15 | 2011-05-04 | Multicell Immunotherapeutics, Inc. | Compositions and Methods to Initiate or Enhance Antibody and Major-histocompatibility Class I or Class II-restricted T Cell Responses by Using Immunomodulatory, Non-coding RNA Motifs |
| EP1582584A4 (en) * | 2002-12-26 | 2006-05-31 | Nippon Shinyaku Co Ltd | PROCESS FOR PRODUCING PNPASE |
| WO2005068662A1 (en) * | 2003-12-30 | 2005-07-28 | Sigma-Aldrich Co. | Rapid preparation of nucleic acids by enzymatic digestion |
| CA2722589A1 (en) | 2008-04-25 | 2009-10-29 | Innate Pharma | Improved tlr3 agonist compositions |
| WO2012092540A1 (en) * | 2010-12-30 | 2012-07-05 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for the synthesis of polyadenylic acid |
| US20220389050A1 (en) * | 2020-01-24 | 2022-12-08 | Aim Immunotech Inc. | Therapeutic double stranded rna and methods for producing the same |
Family Cites Families (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU6012A1 (ru) * | 1927-04-04 | 1928-07-31 | Л.С. Кравцов | Горизонтальный вод ной двигатель с поворотными лопаст ми |
| JPS4940954B1 (no) * | 1970-02-16 | 1974-11-06 | ||
| DE2056081A1 (en) * | 1970-11-14 | 1972-06-22 | Pabst Brewing Company, Milwaukee, Wis. (V.StA.) | Poly nucleotides prepn |
| IL37076A (en) * | 1971-06-16 | 1974-05-16 | Littauer U | A method for stepwise synthesis of oligoribonucleotides of defined sequence using 2'(3')-o-acyl-nucleoside diphosphates and polynucleotide phosphorylase |
| JPS524633B2 (no) * | 1972-07-21 | 1977-02-05 | ||
| GB1435571A (en) * | 1973-04-02 | 1976-05-12 | Searle & Co | Polynucleotides |
| DE2319495C2 (de) * | 1973-04-17 | 1985-01-10 | Yeda Research And Development Co., Ltd., Rehovot | Verfahren zum selektiven, reversiblen Binden von Biomolekülen an ein Adsorbens in einer chromatographischen Säule |
| FR2252350A1 (en) * | 1973-11-22 | 1975-06-20 | Choay Sa | Polynucleotide phosphorylase - extraction from E coli, fixation on sepharose, and use in preparing polynucleotides |
| JPS50107187A (no) * | 1974-02-08 | 1975-08-23 | ||
| US4006059A (en) * | 1974-07-29 | 1977-02-01 | Purdue Research Foundation | Hydrophobic noncovalent binding of proteins to support materials |
| US4000098A (en) * | 1974-08-16 | 1976-12-28 | Palo Alto Medical Research Foundation | Separation of proteins by hydrophobic adsorption |
| SU601287A1 (ru) * | 1976-05-12 | 1978-04-05 | Предприятие П/Я М-5043 | Способ получени полирибонуклеотидов |
| US4075195A (en) * | 1976-08-31 | 1978-02-21 | Kraft, Inc. | Debittered protein product and method for manufacture |
| SU619508A1 (ru) * | 1976-12-07 | 1978-08-15 | Предприятие П/Я Г-4740 | Способ получени полинуклеотидов, обладающих полирибонуклеотидфосфорилазной активностью |
| JPS5922518B2 (ja) * | 1977-03-09 | 1984-05-26 | 三菱化学株式会社 | ポリグアニル酸の製造方法 |
| JPS5618597A (en) * | 1979-07-23 | 1981-02-21 | Mitsubishi Chem Ind Ltd | Production of oligonucleotide |
| US4379843A (en) * | 1981-01-26 | 1983-04-12 | Peter Cashion | Immobilization of polynucleotides and polypeptides with tritylated polysaccharides |
| US4617376A (en) * | 1985-07-01 | 1986-10-14 | Eli Lilly And Company | Process for recovering glucagon from pancreas glands |
| US4771128A (en) * | 1986-10-10 | 1988-09-13 | Cetus Corporation | Method of purifying toxin conjugates using hydrophobic interaction chromatography |
-
1987
- 1987-11-02 GB GB878725606A patent/GB8725606D0/en active Pending
-
1988
- 1988-10-20 NZ NZ226643A patent/NZ226643A/en unknown
- 1988-10-24 AR AR88312284A patent/AR244342A1/es active
- 1988-10-24 CH CH3951/88A patent/CH676248A5/fr not_active IP Right Cessation
- 1988-10-25 NL NL8802617A patent/NL194949C/nl not_active IP Right Cessation
- 1988-10-26 GR GR880100728A patent/GR1000715B/el not_active IP Right Cessation
- 1988-10-28 BE BE8801243A patent/BE1001938A4/fr not_active IP Right Cessation
- 1988-10-28 MY MYPI88001231A patent/MY103445A/en unknown
- 1988-10-28 AU AU24429/88A patent/AU610792B2/en not_active Ceased
- 1988-10-31 PT PT88903A patent/PT88903B/pt not_active IP Right Cessation
- 1988-10-31 AT AT0267788A patent/AT396251B/de not_active IP Right Cessation
- 1988-10-31 ES ES8803317A patent/ES2009099A6/es not_active Expired
- 1988-10-31 IT IT8822471A patent/IT1227447B/it active
- 1988-10-31 GB GB8825399A patent/GB2211847B/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-10-31 SE SE8803930A patent/SE503401C2/sv not_active IP Right Cessation
- 1988-11-01 NO NO884865A patent/NO172902C/no unknown
- 1988-11-01 DK DK607388A patent/DK607388A/da not_active Application Discontinuation
- 1988-11-01 CA CA000581851A patent/CA1339911C/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-11-01 US US07/265,561 patent/US4927755A/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-11-01 ZA ZA888180A patent/ZA888180B/xx unknown
- 1988-11-01 IE IE329088A patent/IE61610B1/en not_active IP Right Cessation
- 1988-11-01 KR KR1019880014332A patent/KR0134624B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1988-11-02 FR FR888814251A patent/FR2622451B1/fr not_active Expired - Fee Related
- 1988-11-02 FR FR888814252A patent/FR2622586B1/fr not_active Expired - Fee Related
- 1988-11-02 TN TNTNSN88113A patent/TNSN88113A1/fr unknown
- 1988-11-02 DE DE3837203A patent/DE3837203A1/de active Granted
- 1988-11-02 FI FI885045A patent/FI95135C/fi not_active IP Right Cessation
- 1988-11-02 JP JP63276359A patent/JPH0712316B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1988-11-18 OA OA59474A patent/OA10206A/fr unknown
-
1992
- 1992-04-14 SG SG407/92A patent/SG40792G/en unknown
- 1992-07-02 HK HK476/92A patent/HK47692A/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Daly et al. | Purine and pyrimidine contents of some desoxypentose nucleic acids | |
| JPH07501684A (ja) | 抗凝固剤およびその調製方法 | |
| US3737524A (en) | Medicaments derived from nucleic acids,processes for their preparation and their use | |
| NO172902B (no) | Fremgangsmaate ved fremstilling av polynukleotider | |
| CN110678555B (zh) | 制作普鲁兰的方法 | |
| CN113249360A (zh) | 一种几丁质酶突变体ChiM及应用 | |
| Barber et al. | Synthesis of cellulose by enzyme preparations from the developing cotton boll | |
| SU933001A3 (ru) | Способ получени синтетической двунитчатой РНК, обладающей интерферониндуцирующей активностью | |
| GB2076418A (en) | Hydrolyzed polysaccharide | |
| US4614733A (en) | Polysaccharides pharmaceutical compositions and the use thereof | |
| US6120772A (en) | Oral drugs for treating AIDS patients | |
| NO145540B (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av terapeutisk aktive polyribonukleotider. | |
| Parodi | Protein glycosylation through dolichol derivatives in baker's yeast | |
| Anderson et al. | The action of dilute aqueous NN-dimethylhydrazine on bacterial cell walls | |
| Tamm et al. | Specific requirements for the action of deoxyribonuclease | |
| US3637462A (en) | Purification of enzymes | |
| Knight | [100] Preparation of ribonucleic acid from plant viruses | |
| GB1581315A (en) | Polysaccharides and process for the preparation thereof | |
| JPS61101501A (ja) | 制癌作用を有する多糖及びその製法 | |
| JPS5836395A (ja) | 多糖類の製造方法 | |
| 阿部辰一 | Nucleic Acids | |
| SU819118A1 (ru) | Способ получени -рибулозо-1,5-дифОСфАТА | |
| Abe | Nucleic Acids XII. Comparison of DNA from Gastric Cancer with That from Gastric Mucosa | |
| JPH0763365B2 (ja) | 酵母細胞壁溶解酵素およびこれを用いる酵母菌体成分の抽出方法 | |
| JPH0144721B2 (no) |