DE2056081A1

DE2056081A1 - Poly nucleotides prepn

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Publication number: DE2056081A1
Application number: DE19702056081
Authority: DE
Inventors: Robert Dr. Glendale Wis. Naylor, (V4StA.). P
Original assignee: Pabst Brewing Company, Milwaukee, Wis. (V.StA.)
Priority date: 1970-11-14
Filing date: 1970-11-14
Publication date: 1972-06-22

Abstract

In the production of polynucleotides by alkaline enzymic polymerisation of nucleosides in water, the product is recovered in a pure form by (a) adding a surfactant and an adsorbant; (b) repeatedly extg. (a) with a phenol soln. at the same pH; (c) pptg. the polymer with aqs. salt and absolute alcohol; (d) dissolving the ppt. in water; (e) dialysing the soln. against a metal chelating agent; (f) dialysing against a salt soln. e.g. KOAc; (g) repeatedly dialysing against water and (h) recovering the product e.g. by lyophilisation. Pref. polyinosinic and polycytidilic acids are purified.

Description

VERFAHREN ZUR AUFARBEITUNG UND REINIGUNG VON POLY-NUCLEOT IDEN Diese Erfindung betrifft die Herstellung und Reinigung von Polynucleotiden und insbesondere die Herstellung und Reinigung von Polyinosinsäure und Polycytidylsäure, die durch enzymatische Polymerisation von Inosin-5'-diphosphat bzw. Cytidin-5'-diphosphat erhalten wurden.PROCESS FOR PROCESSING AND CLEANING POLY-NUCLEOT IDEN These Invention relates to the preparation and purification of polynucleotides, and more particularly the manufacture and purification of polyinosinic acid and polycytidylic acid produced by enzymatic polymerization of inosine-5'-diphosphate or cytidine-5'-diphosphate were obtained.

Im folgenden wird Polyinosinsäure als "Poly Iii und Polycytidinsäure als "Poly C" bezeichnet.In the following, polyinosinic acid is referred to as "poly Iii and polycytidic acid referred to as "Poly C".

Im allgemeinen enthalten Nucleotide die folgenden drei Komponenten in ihrem Molekül: eine basische Komponente, eine Zuckerkomponente und eine Phosphatkomponente. Die basische Komponente und die Phosphatkomponente sind getrennt mit der Zuckerkomponente verbunden. Die Kombination der basischen Komponente und der Zuckerkomponente wird in der Regel als Nucleosid bezeichnet. Wenn die basische Komponente ebenfalls in derartigen Verbindungen vorhanden ist, so spricht man häufig von einem Nucleotid. Durch Einwirkung von Enzymen können aus den Nucleosidphosphaten hochmolekulare Verbindungen aufgebaut werden, die als Polynucleotide bekannt sind und bei denen die Zuckerkomponenten miteinander über eine 3 i ne n x verknüpft sind. Im Falle des Inosindiphosphats oder Cytidindiphosphats ist die Zuckerkomponente ein fiinfgliedriger Ring und der Aufbau der Polymeren erfolgt in 3'- oder 5'-Stelhrngen.In general, nucleotides contain the following three components in their molecule: a basic component, a sugar component and a phosphate component. The basic component and the phosphate component are separately connected to the sugar component. The combination of the basic component and the sugar component is usually referred to as a nucleoside. If the basic component is also present in such compounds, it is often referred to as a nucleotide. By the action of enzymes, high molecular weight compounds can be built up from the nucleoside phosphates, which are known as polynucleotides and in which the sugar components are linked to one another via a 3 i ne nx are linked. In the case of inosine diphosphate or cytidine diphosphate, the sugar component is a five-membered ring and the polymers are built up in 3 'or 5' positions.

Es ist bekannt, dass Poly I und Poly C ein doppeladriges Polyinosinsäure:Polycytidylsäure-System bilden, das im folgenden als PI:C bezeichnet wird, wenn sie miteinander gemischt werden. Ausserdem ist bekannt dass PI:C, wenn sie in den Blutstrom von Tieren eine spritzt werden, den Körper veranlassen, eine erhöhte Menge an Interferon zu produzieren, das einen Antivinls-Effekt hat. Dieses ist z.B. in der Zeitschrift Science, 162 (15. November 1968) Seiten 811 - 813, beschrieben.It is known that Poly I and Poly C are a double-core polyinosinic acid: polycytidylic acid system form, hereinafter referred to as PI: C, when mixed together will. It is also known that PI: C when it enters the bloodstream of animals being injected, causing the body to make an increased amount of interferon that has an anti-wrinkle effect. This is e.g. in the journal Science, 162 (November 15, 1968) pages 811-813.

Da die enzymatische Polymerisation eines Nucleotides wahrscheinlich zur Bildung von Verbindungen von unterschiedlichem Molekulargewicht und auch zur Bildung von Nebenprodukten führt, ist es sehr erwünscht, die Herstellung und die Reinigung von Poly I und Poly C in derartiger Weise durchzuführen, dass die Zusammensetzung des erhaltenen Produktes innerhalb gut definierter Grenzen liegt und dass Nebenprodukte, die giftig sind oder in anderer Weise stören können, ausgeschlossen werden.Since the enzymatic polymerization of a nucleotide is likely to form compounds of different molecular weights and also to Formation of by-products results, it is very desirable to the manufacture and the Purification of poly I and poly C to carry out in such a way that the composition of the product obtained is within well-defined limits and that by-products, that are poisonous or can cause interference in other ways can be excluded.

Es ist deshalb eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren für die Aufarbeitung und Reinigung von Polynucleotiden zu schaffen, die man durch enzymatische Polymerisation eines Nucleotides, wie Inosindiphosphat oder Cytidinphosphat erhält.It is therefore an object of the present invention to provide a method for the reconditioning and purification of polynucleotides that can be passed through enzymatic polymerization of a nucleotide such as inosine diphosphate or cytidine phosphate receives.

Eine spezifische Aufgabe der Erfindune ist ein verbessertes Verfahren zur Aufarbeitung und Reinigung von Poly I und Poly C.A specific object of the invention is an improved method for processing and purification of poly I and poly C.

Diese Aufgaben werden durch das erfindungsgemäße Verfahren gelöst. Dieses Verfahren zur Aufarbeitung und Reinigung eines Polynucleotides, das durch enzymatische Polymerisation eines Nucleotides in Gegemçart von Wasser unter alkalischen Bedingungen erhalten wurde, ist dadurch gekennzeichnet, dass (a) die wässrige Enzym-Reaktionsmischung mit einem oberflächenaktiven Mittel und einem feinverteilten festen Adsorptionsmittel zur Beendigung der Enzymreaktion und zur Entfernung der Nucleasen gemischt wird; (b) die Restlösung wiederholt mit flüssigem Phenol, das auf das pH der Enzymreaktionsmischung gepuffert ist, zur Entfernung des Proteins extrahiert wird; (c) durch Zugabe von einer wässrigen Salzlösung und von Äthylalkohol zur Flüssigkeit von (b) das Polyniicleotid ausgefällt wird; (d) die Fällung von (c) abgetrennt und in Wasser wieder aufgelöst wird; (e) die wässrige LosunR von (d) gegen eine Lösung eines Chelatbildners, der in der lage ist, Metallionen zu binden, dialysiert wird; (f) die Lösung von (e) gegen eine Salzlösung, die in der Lage ist, nicht umgesetzte Nucleotide zu entfernen, dialysiert wird; (g) die Lösung von (f) wiederholt gegen destilliertes Wasser dialysiert wird und (h) das erhaltene Polynucleotid isoliert wird.These objects are achieved by the method according to the invention. This process for the work-up and purification of a polynucleotide produced by enzymatic polymerization of a nucleotide in the presence of water under alkaline conditions Conditions obtained is characterized in that (a) the aqueous enzyme reaction mixture with a surfactant and a finely divided solid adsorbent to terminate the enzyme reaction and to Removal of the nucleases is mixed; (b) Repeat the residual solution with liquid Phenol buffered to the pH of the enzyme reaction mixture for removal the protein is extracted; (c) by adding an aqueous salt solution and from ethyl alcohol to the liquid of (b) the polyniicleotide is precipitated; (d) the precipitate of (c) is separated and redissolved in water; (e) the aqueous Solution of (d) against a solution of a chelating agent capable of metal ions to bind, being dialyzed; (f) the solution of (e) against a salt solution contained in is able to remove unreacted nucleotides, is dialyzed; (g) the Solution of (f) is repeatedly dialyzed against distilled water and (h) that obtained polynucleotide is isolated.

Bei der Durchführung der Erfindung kann man so vorgehen, dass man ein Polynucleotid verwendet, das man durch enzymatische Polymerisation bzw. durch enzymatischen Aufbau eines Nucleotides, z.B. Inosindiphosphat oder Cytidindiphosphat erhalten hat. Man kann das Nucleotid der enzymatischen Einwirkung eines Enzyms, wie z.B. der Polynucleotid-Phosphorylase aus Micrococcus lysodeikticus in einem wässrigen Medium unterwerfen, wobei dieses Medium auf einen alkalischen pH-Wert, zweckmäßigerweise um etwa 9,0 gepuffert ist. Zweckmäßigerweise verwendet man hierzu Tris-hydroxymethylaminomethan und das Medium enthält ausserdem Harnstoff, einen Chelatbildner und Magnesiumchlorid.In carrying out the invention, one can proceed in such a way that one a polynucleotide used, which is obtained by enzymatic polymerization or by enzymatic structure of a nucleotide, e.g. inosine diphosphate or cytidine diphosphate had received. One can determine the nucleotide of the enzymatic action of an enzyme, such as the polynucleotide phosphorylase from Micrococcus lysodeikticus in one subject to aqueous medium, this medium to an alkaline pH, is appropriately buffered by about 9.0. Appropriately, one uses this Tris-hydroxymethylaminomethane and the medium also contains urea, a Chelating agents and magnesium chloride.

Als Chelatbildner kann man z.B. Äthylendiamin-tetraessingsäure, Diäthylentriaminpentaessigäure, Hydroxyäthylendiamintriessigsäure und Trans-1,2-diaminocyclohexan-tetraessigsäure-Monohydrat verwenden. Die Polymerisation kann bei den üblichen Temperaturen, z.B. bei etwa 250 C erfolgen, und wird zweckmäßigerweise so weit geführt, bis die maximale Viskosität erreicht worden ist Dann wird die enzymatische Polymerisation unterbrochen und das erhaltene Produkt aufgearbeitet und gereinigt. Dabei wird (lie Enzymreaktionsmischung mit einem oberflächenaktiven Mittel, einem feinverlten festen Adsorptionsmittel und einem konzentrierten flüssigen Phenol extrahiert. Die konzentrierten flüssigen Phenole sind bei Raumtemperatur flüssige Mischungen aus Phenol und Wasser, die in der Rege] etwa 10 bis etwa 30"' Wasser enthalten. Die erhaltene Nischung läßt man absetzen, trennt die überstehende Flüssigkeit und entfernt alle etwa vorhandenen suspendierten festen Teilchen aus der über stehenden Flüssigkeit. Das in der Fliissigkeit gelöste Polynucleotid wird dann durch Zugabe einer wässrigen Salzlösung, die zweckmäßigerweise gesättigt ist, und von Athylalkohol gefällt, wobei vorzugsweise bei niedrigen Temperaturen, z.B. bei etwa 3 bis 50 C gearbeitet wird. Das ausgefällte Polynucleotid wird abgetrennt und in Wasser wieder aufgelöst und die erhaltene wässrige Lösung des Polynucleotides nacheinander gegen eine Lösung eines Chelatbildners, z.B. Ethylendiamintetraessigsäure, gegen eine Salzlösung und gegen Wasser dialysiert. Zur weiteren Aufarbeitung kann man die Lösung filtrieren, z.B. über ein Papierfilter (vorzugsweise ein 8 Mikron Papierfilter) oder ein Filter aus einer reQenerierten Cellulosemembran, und kann dann die Lösung lypholisieren, z.B. durch Gefriertrocknung.Ethylenediamine-tetraessing acid, diethylenetriaminepentaacetic acid, Hydroxyethylenediamine triacetic acid and trans-1,2-diaminocyclohexane-tetraacetic acid monohydrate use. The polymerization can take place at the usual temperatures, for example at about 250 C take place, and is expediently carried out until the maximum viscosity Then the enzymatic polymerization is interrupted and that product obtained worked up and purified. In doing so, (lie enzyme reaction mixture with a surface active agent, a finely wound solid adsorbent and one focused liquid phenol extracted. The concentrated liquid phenols are mixtures of phenol and water that are liquid at room temperature, which usually contain about 10 to about 30 "'of water. The resulting mixture allowed to settle, the supernatant separated and removed any existing suspended solid particles from the supernatant liquid. That in the liquid The dissolved polynucleotide is then added by adding an aqueous salt solution, which is expedient is saturated, and precipitated from ethyl alcohol, preferably at low temperatures, e.g. working at about 3 to 50 C. The precipitated polynucleotide is separated and redissolved in water and the resulting aqueous solution of the polynucleotide one after the other against a solution of a chelating agent, e.g. ethylenediaminetetraacetic acid, dialyzed against a saline solution and against water. For further work-up can filter the solution, e.g. through a paper filter (preferably an 8 micron Paper filter) or a filter made from a regenerated cellulose membrane, and can then lyophilize the solution, e.g. by freeze drying.

Bei diesem Verfahren wird durch die Zugabe des oberflächenaktiven Mittels und des Adsorptionsmittels jede weitere Tätigkeit des Enzyms unterbrochen. Als oberflächenaktive Mittel kann man beliebige bekannte oberflächenaktive Mittel verwenden, z.B. Alkoholsulfate von natürlichen oder synthetischen Fettalkoholen mit 8 bis 18 Kohlenstoffatomen im Molekül, wie Natriumdodecylsulfat. Als Adsorptionsmittel wird Bentonit bevorzugt, obwohl auch Diatomeenerde und andere bekannte Adsorptionsmittel verwendet werden können. Das flüssige Phenol ist vorzugsweise eine 90%ige Lösung von Phenol in Wasser, die auf das pH der Enzymreaktionsmischtlng gepuffert ist, wobei bevorzugt der gleiche Puffer wie bei der Durchführung der Enzymreaktion verwendet wird.In this process, the surfactant is added Any further activity of the enzyme is interrupted by means of and the adsorbent. As the surface active agent, any known surface active agent can be used use, e.g. alcohol sulfates from natural or synthetic fatty alcohols with 8 to 18 carbon atoms in the molecule, such as sodium dodecyl sulfate. As an adsorbent bentonite is preferred, although diatomaceous earth and other known adsorbents are also preferred can be used. The liquid phenol is preferably a 90% solution of phenol in water that is buffered to the pH of the enzyme reaction mixture, the same buffer as used for carrying out the enzyme reaction is preferred will.

Das Phenol extrahiert aus dem Reaktionsprodukt Proteine und ermöglicht dadurch die Erhaltung einer klaren I.ösung. Die Extrak tion mit Phenol wird vorzugsweise 2- oder 3-mal wiederholt und dann wird die gesamte wässrige Phase, die von dem Phenol abgetrennt worden ist, zentrifligiert und die abgeschiedene Flüssigkeit aufgearbeitet.The phenol extracts proteins from the reaction product and enables thereby maintaining a clear solution. Extraction with phenol is preferred Repeated 2 or 3 times and then the entire aqueous phase that is made up of the phenol has been separated, centrifuged and the separated liquid worked up.

Die Ausfällung des Polynucleotids mit Alkohol und einer Salzlösung wird vorteilhafterweise unter Verwendung einer gesättigten Lösung von Kaliumchlorid und vergälltem Äthylalkohol durchgeführt, wobei in der Regel ein vergällter Äthylalkohol verwendet wird, der 95von Äthanol und 5 Methanol enthält. Anstelle von Kaliumchlorid können andere Salze verwendet werden, die in Wasser-Alkohol-Lösung löslich sind, z.B. Natriumchlorid, Kaliumacetat oder Natriumacetat.The precipitation of the polynucleotide with alcohol and a saline solution is advantageously made using a saturated solution of potassium chloride and denatured ethyl alcohol, usually denatured ethyl alcohol which contains 95% of ethanol and 5% of methanol is used. Instead of potassium chloride other salts that are soluble in water-alcohol solution can be used, e.g. sodium chloride, potassium acetate or sodium acetate.

Das bei der Alkohol-Salz-Fällung erhaltene Polynucleotid wird vorzugsweise in Wasser wieder aufgelöst und ein zweites Mal wieder mit Alkohol und Salz ausgefällt. Die letzte Fällung wird dann in Wasser gelöst und nacheinander, vorzugsweise bei einer niedrigen Temperatur von 30 C bis 50 C, gegen eine Lösung eines Chelatbildners, der in der Lage ist, Magnesiumchlorid zu entfernen, wie Äthylendiamintetraessigsäure, gegen eine Lösung eines Salzes, die in der Isge ist, nicht umgesetztes Diphosphat zu entfernen, wie Kaliumacetat, und zum Schluß gegen destilliertes Wasser, vorzugsweise 5-bis 6-mal dialysiert, bis ein reines Produkt von einer konstanten Zusammensetzung erhalten wird.The polynucleotide obtained in the alcohol-salt precipitation is preferred redissolved in water and reprecipitated a second time with alcohol and salt. The last precipitation is then dissolved in water and successively, preferably at a low temperature of 30 C to 50 C, against a solution of a chelating agent, capable of removing magnesium chloride, such as ethylenediaminetetraacetic acid, against a solution of a salt which is in the isge, unreacted diphosphate to remove, such as potassium acetate, and finally against distilled water, preferably Dialyzed 5 to 6 times until a pure product of constant composition is obtained.

Zur Isolierung des Polynucleotides ist es dann vorteilhaft, die dialysierte Lösung vor der Lypholisierung zu filtrieren.To isolate the polynucleotide, it is then advantageous to use the dialyzed Filter solution prior to Lypholization.

Bei der Lypholisierungsstufe wird zweckmäßigerweise die filtrierte dialysierte Lösung in Schalen oder ähnliche Gefäße gegeben und das Wasser wird durch Gefriertrocknung entfernt.In the Lypholisierungsstufe the filtered dialyzed solution in bowls or similar vessels and the water is poured through Freeze drying removed.

Bei der Herstellung und Reinigung von Poly I und Poly C sind die Verfahrensstufen die gleichen mit der Ausnahme des Nucleotides, das als Ausgangsmaterial verwendet wird und der weiteren Ausnahme, dass bei der Reinigung von Poly I nach der letzten Alkohol-Salz-Pällung und vor der Dialyse PolyI in Wasser gelöst werden kann und eine Lösung von Kaliumacetat mit einem pH von etwa 7,6 zugegeben wird, wobei die Konzentration der Kaliumacetatlösung derartig ist, dass im Endeffekt eine Lösung erhalten wird, die zu einem Viertel gesättigt ist hinsichtlich des Kalhimacetats. Dadurch wird Poly I ausgefällt und nicht umgesetztes Diphosphat bleibt in der l,ösung. Das Poly I wird erneut in Wasser gelöst und durch Dialysleren weiter in der bereits angebenen Weise gereinigt.In the manufacture and purification of Poly I and Poly C are the process stages the same except for the nucleotide used as starting material and the further exception that when cleaning poly I after the last Alcohol-salt peeling and before dialysis PolyI can be dissolved in water and a solution of potassium acetate with a pH of about 7.6 is added, the Concentration of the potassium acetate solution is such that in the end a solution which is a quarter saturated with respect to the kalhim acetate. As a result, poly I is precipitated and unreacted diphosphate remains in the solution. The poly I is redissolved in water and continued in the already under dialyser Purified specified way.

In den folgenden Beispielen wird die Erfindung näher erläutert, wobei die Mengenangaben Gewichtsangaben sind, falls nicht ausclriicklich etwas anderes angegeben ist.The invention is explained in more detail in the following examples, wherein the quantities given are given by weight, unless otherwise stated is specified.

Beispiel 1 Herstellung von Poly C 260 g Cytidin-5'-diphosphat wurden in einer derartigen Menge von destilliertem Wasser gelöst, dass insgesamt 4 1 einer Lösung entstanden. Das pH wurde mit Kaliumhydroxid auf 9,0 eingestellt. Es wurden 2,6 1 einer l-molaren wässrigen Lösung von Tris-hydroxymethylaminomethan zugegeben. Ausserdem wurden 1040 ml einer 8 - molaren wässrigen Lösung von Harnstoff, 1300 ml einer 0,02 - molaren wässrigen Lösung des Dinatriumsalzes von Äthylendiamintetraessigsäure und 328 ml einer 0,2 - molaren wässrigen Lösung von Magnesiumchlorid hinzugefügt. Zu dieser Mischung wurde dann das Enzym Polynucleotid-Phosphorylase aus Micrococcus,iysodeikticus hinzugegeben. Diese Zugabe erfolgte aus drei verschiedenen Enzymansätzen bestehend aus einer wässrigen Lösung von 300 ml mit einer Aktivität von 12,6 Einheiten pro Liter, 400 ml mit einer Aktivität von 28 Einheiten pro Liter und 150 ml mit einer Aktivität von 31 Einheiten pro I,iter. Die Gesamtaktivität entsprach deshalb 17,68 Gramm-Einheiten. Es wurde weiteres Wasser zugegeben, so dass ein Gesamtvolumen von 26 Litern entstand. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur (250 C) begonnen. In Abständen von einer halben Stunde wurden Proben entnommen, deren Viskosität durch Bestimmung der Anzahl an Sekunden für das Ausfließen der Mischung alls einem Rohr ermittelt wurde. Die maximale Viskosität wurde nach vier Stunden und 45 Minuten erreicht, aber die Umsetzung wurde eine weitere halbe Stunde fortgesetzt, bei deren lande es sich zeigte, dass ein Viskositätsabfall begonnen hatte.Example 1 Preparation of Poly C 260 g of cytidine-5'-diphosphate were made dissolved in such an amount of distilled water that a total of 4 liters of one Solution emerged. The pH was adjusted to 9.0 with potassium hydroxide. There were 2.6 1 of a 1 molar aqueous solution of tris-hydroxymethylaminomethane were added. In addition, 1040 ml of an 8 molar aqueous solution of urea, 1300 ml of a 0.02 molar aqueous solution of the disodium salt of ethylenediaminetetraacetic acid and 328 ml of a 0.2 molar aqueous solution of magnesium chloride were added. The enzyme polynucleotide phosphorylase from Micrococcus, iysodeikticus was then added to this mixture added. This addition was made from three different enzyme batches from an aqueous solution of 300 ml with an activity of 12.6 units per Liter, 400 ml with an activity of 28 units per liter and 150 ml with a Activity of 31 units per I, iter. The total activity was therefore 17.68 Gram units. More water was added so that a total volume of 26 liters was created. The reaction was started at room temperature (250 ° C.). At intervals samples were taken from half an hour, their viscosity by determination the number of seconds for the mixture to flow out through one pipe became. The maximum viscosity was reached after four hours and 45 minutes, but the implementation continued for another half hour, when they landed it was found that a drop in viscosity had started.

Zu diesem Zeitpunkt wurden 260 ml einer 107igen wässrigen Lösung von Natriumdodecylsulfat zu der Reaktionsmischung zugegeben, die dann 20 Minuten gerührt wurde. Nachher wurden 65 ml einer 4%igen Suspension von Bentonit in Wasser hinzugefügt und die Mischung wurde 20 Minuten gerührt. Die Mischung wurde dann in einen mit einer Glasemaille ausgekleideten Behälter mit einem Volumen von etwa 114 Litern überführt.At this point, 260 ml of a 10 7 aqueous solution of Sodium dodecyl sulfate was added to the reaction mixture, which was then stirred for 20 minutes became. Then 65 ml of a 4% strength suspension of bentonite in water were added and the mixture was stirred for 20 minutes. The mixture was then in a with a glass enamel-lined container with a volume of about 114 liters convicted.

In einem getrennten Behälter mit einem Auslaß am Boden wurden 610 ml einer wässrigen 2 - molaren lösung von Tris-hydroxymethylaminomethan (pH 9,0) mit 5000 ml Wasser und 27 litern flüssigem Phenol, bestehend aus 90% Phenol und 10o/ Wasser, gemischt. Diese Mischung wurde gerührt und clntn zu der Enzymreaktionsmischung zugegeben. Nach einstündigem Rühren wurde die erhaltene Mischung für einen Zeitraum von etwa 17 Stunden zur Abtrennung stehengelassen. Nach der Entmischung wurde die Phenolschicht dann abgezogen.In a separate container with a bottom outlet, 610 ml of an aqueous 2 molar solution of tris-hydroxymethylaminomethane (pH 9.0) with 5000 ml of water and 27 liters of liquid phenol, consisting of 90% phenol and 10o / water, mixed. This mixture was stirred and added to the enzyme reaction mixture admitted. After stirring for one hour, the resulting mixture was left to stand for a period of time from allowed to stand for about 17 hours for separation. After the segregation the phenolic layer was then peeled off.

Die restliche Lösung wurde mit 260 ml einer 10%igen wässrigen Lösung von Natriumdodecylsulfat behandelt und 15 Minuten zcrührt. Dann wurden 65 ml einer 4%igen Bentonitsuspension zugegeben und 19 Minuten gerührt. Zu der erhaltenen Mischung wurde eine gepufferte Phenollösung zugegeben, die hergestellt worden war, indem man getrennt 27 1 flüssiges Phenol (90% Phenol und 10% Wasser), 610 ml einer 2 - molaren wässrigen Lösung von Tris-hydroxymethylaminomethan und 50()() ml Wasser gemischt hatte. Nach der Zugabe der Phenollösung wurde die Mischung eine Stunde gerührt und stehengelassen. Die Phenollösung wurde abgetrennt, die Extraktion wurde wiederholt und man ließ die Mischung über Nacht sich absetzen. Nach dem Absetzen wurde die Phenol lösung abgezogen.The remaining solution was mixed with 260 ml of a 10% aqueous solution Treated by sodium dodecyl sulfate and stirred for 15 minutes. Then 65 ml of a 4% bentonite suspension was added and the mixture was stirred for 19 minutes. To the mixture obtained a buffered phenol solution prepared by one separated 27 1 liquid phenol (90% phenol and 10% water), 610 ml of a 2 - molar aqueous solution of tris-hydroxymethylaminomethane and 50 () () ml of water had mixed. After the addition of the phenol solution, the mixture became one hour stirred and left to stand. The phenol solution was separated, the extraction was carried out repeated and the mixture was allowed to settle overnight. After weaning the phenol solution was drawn off.

Zu der restlichen Lösung wurden 1300 ml einer 10%igen wässrigen Lösung von Natriumdodecylsulfat zugegeben mit anschließendem Rühren für 15 Minuten und 35 ml einer 4 en Bentonitsuspension in Wasser mit anschließendem Rühren für 15 Minuten. In einem getrennten Behälter wurden 13,5 1 flüssiges Phenol (90% Phenol und 10f4' Wasser) mit 2500 ml Wasser und 305 ml einer 2 - molaren wässrigen Lösung von Tris-hydroxymethylaminomethan gemischt. Diese Phenol lösung wurde zu der Lösung, die das Poly C enthielt, zugegeben und die erhaltene Mischung wurde eine Stunde gerührt. Dann ließ man sie zur Trennung stehen und die Phenollösung wurde abgetrennt. Die gleiche Arheitsweise wurde wiederholt.1300 ml of a 10% strength aqueous solution were added to the remaining solution of sodium dodecyl sulfate added with subsequent stirring for 15 minutes and 35 ml of a 4 en bentonite suspension in water with subsequent stirring for 15 minutes. In a separate container, 13.5 liters of liquid phenol (90% phenol and 10f4 ' Water) with 2500 ml of water and 305 ml of a 2 molar aqueous solution of tris-hydroxymethylaminomethane mixed. This phenol solution was added to the solution containing the poly C and the resulting mixture was stirred for one hour. Then they were left for separation stand and the phenol solution was separated. The same procedure was repeated.

Dann wurde die gesamte wässrige Phase, die Poly C enthielt.Then all of the aqueous phase containing poly C.

zentrifugiert, wonach die überschüssige Flüssigkeit in einen kalten Raum von einer Temperatur von etwa 40 C gestellt wurde.centrifuged, after which the excess liquid in a cold Room at a temperature of about 40 C.

Zu dieser überschüssigen Flüssigkeit trurden dann 2700 ml einer gesättigten wässrigen Kaliumchloridlösung gegeben und anschließend 60 1 einer Mischung aus 95% Äthylalkohol und 5% Methylalkohol. Die erhaltene Mischung ließ man über Nacht zum-Absetzen stehen. Die iiberschüssige Flüssigkeit wurde abgesaugt und die Fällung wurde durch Zentrifugieren abgetrennt, gesammelt und in 18 1 destilliertem Wasser gelöst.2700 ml of a saturated liquid are then added to this excess liquid aqueous potassium chloride solution and then 60 1 of a mixture of 95% Ethyl alcohol and 5% methyl alcohol. The resulting mixture was allowed to settle overnight stand. The excess liquid was sucked off and the precipitation was carried out Separated by centrifugation, collected and dissolved in 18 l of distilled water.

Zu der erhaltenen Lösung wurden 2810 ml einer gesättigten wässrigen Kaiiumchloridlösung und 4() 1 einer Mischung aus 95% Äthylalkohol und 5% Methylalkohol gegeben.To the resulting solution, 2810 ml of a saturated aqueous Potassium chloride solution and 4 () 1 of a mixture of 95% ethyl alcohol and 5% methyl alcohol given.

Die erhaltene Fällung wurde abgetrennt und in 18 1 Wasser gelöst und über Nacht bei einer Temperatur von 40 C stehengelassen. Zu diesem Zeitpunkt hatte die Lösung ein pH von 7,2. Diese Lösung wurde dann in eine Vielzahl von Dialysierrohren gegeben, die aus renenerierter Cellulose bestanden und einen Durchmesser von 47 mm und eine Kapazität von etwa 1 1 jeweils hatten. Die Rohre, von denen jedes etwa 1 1 der Lösung enthielt, wurden dann zehen 200 1 einer 0,01 - molaren wässrigen Lösung von Äthylendiamintetraessigsäure bei einem pH von 7,5 in einem kalten Raum mit einer Temperatur von etwa 40 C für 24 Stunden dialysiert. Dann wurden sie gegen die gleiche Menge einer 0, - molaren wässrigen Lösung von Kaliumacetat beim gleichen pH ind unter den gleichen Temperaturbedingungen für weitere 24 Stunden dialysiert und danach sukzessiv für Zeiträume von 6 bis 24 Stunden unter den gleichen Temperaturbedingungen gegen die gleiche Menge von destilliertem Wasser dialysiert.The resulting precipitate was separated off and dissolved in 18 l of water and Left to stand at a temperature of 40 ° C. overnight. At this point had the solution has a pH of 7.2. This solution was then transferred to a number of dialysis tubes which consisted of regenerated cellulose and a diameter of 47 mm and a capacity of about 1 liter each. The pipes, each of which is about 1 1 of the solution contained, then tens of 200 1 of a 0.01 molar aqueous Ethylenediaminetetraacetic acid solution at pH 7.5 in a cold room dialyzed at a temperature of about 40 C for 24 hours. Then they were against the same amount of a 0, - molar aqueous solution of potassium acetate for the same pH ind dialyzed under the same temperature conditions for a further 24 hours and then successively for periods of 6 to 24 hours under the same temperature conditions dialyzed against the same amount of distilled water.

Die Lösungen wurden dann aus den Dialysierrohren entfernt durch ein Membranfilter aus regenerierter Cellulose und ein 8 Mikron Papierfilter filtriert und gewaschen zu einem endgültigen Volumen der Lösung von 22 1. Danach wurde das erhaltene Produkt (Poly C) durch Lypholisieren isoliert, das heißt, die Lösung wurde in Schalen eeben und das Wasser wurde durch Gefriertrocknung entfernt.The solutions were then removed from the dialysis tubes by a Membrane filter made of regenerated cellulose and an 8 micron paper filter filtered and washed to a final volume of the solution of 22 1. Thereafter, the obtained product (poly C) isolated by Lypholization, that is, the solution was level in dishes and the water was removed by freeze drying.

Das Poly C hatte als sein neutrales Kaliumsalz die folgenden Pigenschaften: Extinktionswerte in Relation zum Phos hor ehait: 260 mu, pH 7 5,0-# ],0 x 103 Spektralverhältnisse bei pH 7 250/260 0,86+ 0,03 280/260 0,80+ 0,03 Phosphorgehalt: Mikromol / mg Prozent P 2,7 + 0,5 8,4+1,5 Sedimentationskoeffizient: S2O, w 8 - 13 Niedermolekulare Verunreinigungen: Ultrazentrifuge nicht-feststellbar Papierchromatographie nicht-feststs-l]bar Homogenität hinsichtlich der PLirin- oder Pyrimidin-Base: Abbau mit Ribonuclease und Prüfung durch Papierelektrophorese keine Verunreinigungen feststellbar Beispiel 2 Herstellung von Poly I F:s wurde die gleiche Arbeitsweise wie in Beispiel 1 verwendet, mit der Ausnahme, dass Inosin-5'-diphosphat anstelle von Cytidin-5'-diphosphat verwendet wurde, und dass bei dem Aufarbeitungsverfahren nach der letzten Alkohol-Salz-Fällung und unmittelbar vor dem Dialysieren das Poly T in Wasser gelöst wurde und eine Lösung von Kaliumacetat mit einem pH von 7,6 zugegeben wurde. Die Konzentration der Kaliumacetatlösung war derartig, dass zum Schluß eine Lösung entstand, die zu einem Viertel an Kaiiumacetat gesättigt war. Dadurch wurde Poly I ausgefällt, das dann wieder in destilliertem Wasser aufgelöst wurde und durch Dialysieren in der in Beispiel 1 angegehenen Weise weitergereinigt wurde.As its neutral potassium salt, poly C had the following properties: Extinction values in relation to the phosphorous: 260 mu, pH 7 5.0- #], 0 x 103 spectral ratios at pH 7 250/260 0.86+ 0.03 280/260 0.80+ 0.03 Phosphorus content: micromoles / mg percent P 2.7 + 0.5 8.4 + 1.5 Sedimentation coefficient: S2O, w 8 - 13 low molecular weight Impurities: Ultracentrifuge not detectable, paper chromatography not detectable Homogeneity with regard to the PLirine or pyrimidine base: degradation with ribonuclease and testing by paper electrophoresis, no impurities detectable. Example 2 Production of Poly I F: The same procedure was used as in Example 1, except that inosine 5'-diphosphate is used in place of cytidine 5'-diphosphate and that in the work-up process after the last alcohol-salt precipitation and immediately before dialysis, the poly T was dissolved in water and a solution of potassium acetate with a pH of 7.6 was added. The concentration of the potassium acetate solution was such that in the end a solution was created that contained a quarter of potassium acetate was saturated. As a result, Poly I was precipitated, which was then distilled again Water was dissolved and dialyzed in the manner approached in Example 1 was further cleaned.

Das Poly I hatte folgende Eigenschaften: fxtinktionswerte in Relationum Phosphorgehalt: 260 mu, pH 7 6,0 -# 1,0 x 103 Spektralverhältnisse bei pEl 7: 250 / 260 1,63 + 0,05 280 / 260 0,28 + 0,02 Phosphorgehalt: Mikromol / mg Prozent P 2,2 + 0,5 6,8 + 1,5% Sedimentationskoeffizient: S2O, w 10 - 15 Niedermolekulare Verunreinigimgen: Ultrazentrifuge nicht-feststellbar Papierchromatographie nicht-feststellbar Homogenität hinsichtlich der Purin- oder Pyrimidin-Base: Abbau mit Riborniclease und Prü- keine Verunreinigungen fung durch Papierelektrophorese feststellbar Das gemäß Beispiel 1 hergestellte Poly C und gemäß Beispiel 2 hergestellte Poly I können in äquimolaren Konzentrationen in 0,01 - molarer mit Phosphat gepufferter Salzlösung bei einem pH 7,2 gelöst werden, wobei diese Lösung 5 x 10-3 molar an Magnesiumchlorid ist. Dabei entsteht PI:C, das in der in Science, Band 162, Seiten 811 - 813 beschriebenen Weise verwendet werden kann.The poly I had the following properties: absorption values in relation to Phosphorus content: 260 mu, pH 7 6.0 - # 1.0 x 103 spectral ratios at pEl 7: 250 / 260 1.63 + 0.05 280/260 0.28 + 0.02 Phosphorus content: micromoles / mg percent P 2.2 + 0.5 6.8 + 1.5% sedimentation coefficient: S2O, w 10 - 15 low molecular weight Impurities: Ultracentrifuge not detectable, paper chromatography not detectable Homogeneity with regard to the purine or pyrimidine base: degradation with riborniclease and test no contamination detectable by paper electrophoresis Poly C produced according to Example 1 and Poly I produced according to Example 2 can in equimolar concentrations in 0.01 molar phosphate-buffered saline solution be dissolved at a pH 7.2, this solution being 5 x 10-3 molar of magnesium chloride is. This creates PI: C, which is described in Science, Volume 162, pages 811-813 Way can be used.

Die Erfindung hat den Vorzug, dass sie ein verbessertes Verfahren zur Herstellung, Aufarbeitung und Reinigung von Polynucleotiden, z.B. Poly I und Poly C schafft. Durch dieses Verfahren gelingt es, die Zusammensetzung des erhaltenen Produktes innerhalb gut definierter Grenzen zu halten und Nebenprodukte zu eliminieren, die giftig sind oder in anderer Weise stören könnten.The invention has the merit of being an improved method for the production, processing and purification of polynucleotides, e.g. Poly I and Poly C creates. This method makes it possible to determine the composition of the Keep product within well-defined limits and eliminate by-products, that are poisonous or that could interfere in any other way.

Claims

Patent claims:

1. Process for processing and purifying a polynucleotide, that by enzymatic polymerization of a nucleotide in the presence of water was obtained under alkaline conditions, characterized in that (a) the aqueous enzyme reaction mixture comprising an obese surfactant and an finely divided solid adsorbent for ending the enzyme reaction and for Removal of the nucleases is mixed; (b) Repeatedly use the remaining solution in liquid Phenol buffered to the pH of the enzyme reaction mixture for removal it protein is extracted; (c) by adding an aqueous salt solution tn.1 from ethyl alcohol to the liquid of (b) the polynucleotide is precipitated: (d) the precipitate of (c) is separated and redissolved in water; (e) the aqueous Solution of (d) against a solution of a chelating agent capable of metal ions to bind, is dialyzed: (f) the solution of (e) those a saline solution that is in the situation is to remove unreacted nucleotides, is dialyzed; (g) the Solution of (f) repeatedly standing distilled water is dialyzed and (h) that obtained polynucleotide is isolated.

2. The method according to claim 1, characterized in that the stage (c) is repeated.

3. The method according to claim 1, characterized in that nucleoside 5'-diphosphate is used as a nucleotide.

4. The method according to claim 1, characterized in that Cytidi.n-5'-diphosphate is used as the nucleotide and the polynucleotide is poly C.

5. The method according to claim 1, characterized in that inosine-5 '-diphosphate is used as the nucleotide and the polynucleotide is poly J.

6 The method according to claim 5, characterized in that between the steps (d) and (e) the solution from step (d) with a solution of potassium acetate in water with a pH of about 7.6 and a concentration high enough to to give a final solution one-fourth saturated in potassium acetate is deposited, the thereby precipitated polynucleotide and immersed in water before the step (e) is dissolved.

7 The method according to claim 1, characterized in that as aqueous Enzyme reaction mixture is used a mixture obtained by using cytidine-5'-diphosphate dissolves in water and buffers to about pH 9 and the enzymatic polymerisation with Polynucleotide phosphorylase from Micrococctis Lysodeikticus, which Solution also includes urea, the sodium salt of ethylenediaminetetraacetic acid, and magnesium chloride contains and the enzymatic polymerization continues until the niaximal Viscosity is reached, after which the work-up and purification according to the stages (a) to (h) takes place.

8. The method according to claim 7, characterized in that one Enzyme reaction mixture used, which is obtained by using inosine-5'-diphosphate Dissolves in water and buffers to a ptl of about 9 for enzymatic polymerization with polynucleotide phosphorylase from Micrococcus Lysodeikticus, these Solution also urea, the disodium salt of ethylenediaminetetraacetic acid and magnesium chloride contained, with the enzymatic polymerization to the limit of the maximum Viscosity is carried out, after which the product is isolated and according to the in Claim 6 specified stages is worked up and purified.