NL8802617A - Werkwijze voor de bereiding van polynucleotiden, daarmee verkregen produkt en farmaceutische preparaten die dit bevatten. - Google Patents
Werkwijze voor de bereiding van polynucleotiden, daarmee verkregen produkt en farmaceutische preparaten die dit bevatten. Download PDFInfo
- Publication number
- NL8802617A NL8802617A NL8802617A NL8802617A NL8802617A NL 8802617 A NL8802617 A NL 8802617A NL 8802617 A NL8802617 A NL 8802617A NL 8802617 A NL8802617 A NL 8802617A NL 8802617 A NL8802617 A NL 8802617A
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- poly
- polynucleotides
- polymerization
- column
- equivalent
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/30—Nucleotides
- C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/814—Enzyme separation or purification
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/814—Enzyme separation or purification
- Y10S435/815—Enzyme separation or purification by sorption
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
- Werkwijze voor de bereiding van polynucleotiden, daarmee verkregen produkt en farmaceutische preparaten die dit bevatten - &
De uitvinding heeft betrekking op een verbeterde werkwijze voor de verkrijging van polynucleotiden (homo- en copolynucleotiden) en complexen daarvan; ώ uitvinding heeft eveneens betrekking op de aldus verkregen nieuwe, 5 verbeterde produkten. Verschillende polynucleotiden zijn met be staande methoden bereid , maar tot dusverre zijn de meeste van de verkregen produkten in het algemeen pyrogeen of meer of minder toxisch door de aanwezigheid van enige verontreinigingen of reagentia die voorkomen in de opeenvolgende stappenweLke tot de tO gewenste produkten leiden. Deze verbindingen zijn adjuvantia op verschillende therapeutische gebieden en in het bijzonder bij de behandeling van kanker, bij cfe behandeling van bepaalde bacteriele en virusziekten en voor vaccins. De uitvinding heeft tenslotte betrekking op therapeutische preparaten die deze verbeterde 15 polynucleotiden als een werkzaam bestanddeel bevatten.
In het algemeen worden polynucleotiden verkregen door de werking van een polynueleotidefosforylase op het betreffende nucleotide monomeer. De verschillende mogelijke monomeren, zoals ADP, CDP, GDP, IDP en UDP worden verkregen met 20 algemeen bekende methoden. Polynucleotide fosforylase wordt eveneens met algemeen bekende methoden verkregen, waarbij men uitgaat van een bacteriele cultuur , en vervolgens de in de cultuur verkregen bacteriën lyseert, gevolgd door extractie van het bij de lyse verkregen polynueleotidefosforylase uit een complex 25 medium, waarin verschillende enzymen kunnen worden gevonden, zoals kinases, fosfatases, nucleases, diesterases, enz. die alle concurrerende reagentia zijn bij de volgende stap , de polymerisatie van het gekozen nucleotide monomeer door het polynueleotidefosforylase. De aanwezigheid van de verschillende niet gewensté 30 enzymen leidt tot gelijktijdig verlopende ongewenste reacties en gedeeltelijke afbraak van het te polymeriseren monomeer en van het gevormde polymeer.
Om deze redenen zijn de meeste van de aldus •8802617 ? \ - 2 - verkregen polynucleotiden onvolkomen wat betreft hun toxiciteit en/of hun pyrogene eigenschappen .Hoewel men een aanvaardbaar zuiver polynucleotidefosforylase kan bereiden op een kleine schaal voor analysedoeleinden of voor een beperkt wetenschappelijk ^ onderzoek, kan men een dergelijk zuiver produkt niet gemakkelijk bereiden op technische schaal tegen een aanvaardbare prijs.
Volgens de uitvinding is het mogelijk gebleken om onder industrieel aanvaardbare omstandigheden nagenoeg zuivere homopolymeren of copolymeren of complexen van poly-nucleotiden of van nauw verwante analoga daarvan te verkrijgen door als polymerisatiemiddel, in plaats van de polynucleotide-fosforylasepreparaten zoals verkregen volgens de verschillende eerder beschreven methoden, een zeer gezuiverd enzym te gebruiken dat geen verontreinigingen bevat, wélke tot ongewenste 15 reacties leiden. Nauw verwante analoga van nucleotiden kunnen bijvoorbeeld 6-hydroxyalkylderivaten van ADP of 5-halogeen- of 5-hydroxy-of 5-methylderivaten van UDP zijn.
In het bijzonder is gevonden, dat , na de kweek van een bacteriestam en de lyse van de aldus verkregen 20 cultuur , het verkregen medium achtereenvolgens over drie kolommen moet worden géleid, waarbij de eerste een ionenuitwisse-lende hars zoals DEAE Sephacel of een equivalent daarvan bevat, de tweede kolom een hydrofobe hars zoals fenyl Sepharose of een equivalent daarvan bevat en de derde kolom een moleculaire 25 ^ zeef zoals Sephacryl^ S300 of Sephadex 200 of een equivalent daarvan bevat.
Het produkt dat uit de derde kolom komt, bestaat voornamelijk maar niet uitsluitend uit polynucleotidefosforylase tezamen met sporen van stoffen die niet actief zijn 30 bij het verdere polymensatieproces.
Als een homopolymeer wordt gewenst, wordt het verkregen polynucleotidefosforylase gebruikt voor de polymerisatie van het gekozen monomeer in aanwezigheid van gebruikelijke reagentia.
35
Als een copolymeer gewenst is, wordt het gekozen monomeer vervangen door een mengsel, in geschikte verhou- *8802617 9 4 - 3 - dingen, van de gekozen monomeren. Het copolymeer zal worden aangeduid als Poly A/Poly ü.
Als een complex gewenst is, wordt dezelfde polymerisatie uitgevoerd op elk van de betreffende monomeren, 5 en worden de verkregen homopolymeren in de juiste verhouding gemengd in aanwezigheid van NaCl en met ethanol geprecipiteerd.
Volgens een belangrijk kenmerk van de uitvinding wordt de polymerisatie van het gekozen monomeer of van het gekozen mengseL van monomeren uitgevoerd onder omstandig-10 heden die verschillen van wat gewoonlijk wordt gedaan.In het bijzonder zijn de gebruikte concentraties veel groter dan de gebruikelijke concentraties (ongeveer 30 tot ongeveer 100 keer en bij voorkeur 50 keer), wordt de polymerisatie uitgevoerd onder geregelde toevoeging van MgC^, onder een geregelde pH-waarde van 7,4 15 tot 8,6 en gedurende ongeveer 3 tot ongeveer 6 dagen.
De verkregen polymeren of copolymeren hebben een moleculair-gewichtstraject dat complexen geeft met moleculairgewichten van ongeveer 250.000 tot ongeveer 1.500.000 met een homogene polymerisatiesnelheid en een polymerisatieop-20 brengst van wel 90-95%.
De uitvinding zal beter worden begrepen uit de beschrijving van de volgende opeenvolging van vijf stappen, die leiden van een bacteriele startcultuur (hier E. coli maar andere bacteriën zijn eveneens geschikt) tot een complex van 25 Poly A/Poly U .
Stap 1: Kweek van E. coli B 1/5.
De cultuur wordt gehouden in steken bij omgevingstemperatuur.
30 Het cultuurmedium bevat per liter 10 g NaCl, 10 g trypticase en 5 g gistextract. Na sterilisatie gedurende 45 min bij 110°C wordt een afzonderlijk gesteriliseerde glucose-oplossing toegevoegd in een hoeveelheid van 2 g/1. Voorcultures worden bereid met 10 ml ,waarna 200 ml medium wordt bereid voor een 35 10 1 cultuur.
Er wordt geroerd bij 470 opm met 8 1 lucht per minuut.De verdubbelingstijd bij S 600 bedraagt 30 min en de bacteriën worden geoogst bij een optische dichtheid van 6 bij 600 nm.
.8802617 4
V
- 4 -
Ongeveer 8 g per liter cultuur wordt verkregen. De pH van de fermentatie wordt ingesteld op 6,5 tot 6,8 door toevoeging van 2N NH^OH. Als de cultuur, niet onmiddellijk wordt gebruikt, wordt deze bij -20°C bewaard.
5
Stap 2: Lyse van bacteriën
Buffer. A 5 x 10~2 M Tris-HCl pH 7,9 (bij 25°C) dat q 2 x 10 M EDTA , 0,233 M NaCl (13,63 g/l)en 5% glycerol ( 50 ml/1) bevat 10 -2 -4
Buffer B 10 M Tris-HCl pH 7,9 dat 10 M EDTA, 0,2 M NaCl en 5% glycerol bevat.
Voor 165 g bacteriën ( 20 1 cultuur) 15 Net voor het gebruik wordt 0,4 ml dithio- threitol ( DTT) 0,1 M (15,4 mg/ml) toegevoegd aan 400 ml buffer A bij kamertemperatuur, gevolgd door 28 jil mercaptoethanol , 45 mg lysozym en 14 mg fenylmethylsulfonylfluoride ( PMSF) , opgelost in 4 ml ethanol. De bevroren bacteriën ( 165 g) worden gedisper-geerd in dit medium in een menger ( eindtemperatuur ongeveer 10°C), 20 waarna men de suspensie laat opwarmen tot 15°C onder af en toe mengen ( ongeveer 20 min) , waarna men 272 mg natriumdeoxycholaat onder mengen toevoegt, gevolgd door 4 mg deoxyribonuclease (DNAase). Men laat het lysemengsel 20 min staan onder af en toe mengen en houdt de temperatuur op 20°C. Aan dit mengsel wordt 400 ml 25 buffer B plus 0,4 ml 0,1 M DTT onder mengen toegevoegd, en de suspensie wordt 1 uur bij 5°C gecentrifugeerd bij 16000 g (10.000 opm in een Sorvall-centrifuge).
DNAase 50.679 Dornase-units/mg Lysozym 25.000 units/mg 30
Het door centrifugeren verkregen super- natans ( ongeveer 900 ml) werd verdund tot 1 1 met gedestilleerd water en proteïne werd geprecipiteerd door toevoeging van 280 g ammoniumsulfaat (45% verzadiging) bij 4°C onder roeren, waarna men het mengsel 2 uur bij 4°C liet staan. Proteïne werd gewonnen 35 door centrifugeren bij 16.000 g gedurende 30 min bij 5°C. Het pre-cipitaat ( supernatantia worden weggezet) werd opgelost in 150 ml # • 88026 17 - 5 - “ -2 10 M Iris HC1 pH 7,8 en de oplossing werd 20 min bij 16.000 g gecentrifugeerd ter verwijdering van onoplosbaar materiaal. De supematantia werden gedialyseerd tegen vier verse oplossingen van 2 1 5x10 ^ H Tris HC1 pH 7,8 bij 4°C in 18 uur , waarna de oplos-^ sing 1 uur werd gecentrifugeerd bij 16.000 g ter verwijdering van onoplosbaar materiaal.
300 ml , pH 7,8 , geleidbaarheid <7,0 mS.
Stap 3ï Zuivering van polynucleotide- 10 fosforylase coli B 1/5 (PNPase) 1. De boven verkregen supernatantia werden geleid over een kolom van 280 ml DEAE Sephacel ( 40 x 3 cm), die in evenwicht was gebracht in 0,1 M Tris HC1 pH 7,4 bij 4°C , 15 en de kolom werd geelueerd met een gradient van 1 1 0,1 M Tris HCl pH 7,4 tot 1 1 0,1 M Tris HCl in 0,4 M NaCl pH 7,4, waarbij fracties van 10 ml werden verzameld. Een piek met diesteraseacti-viteit werd geelueerd, gevolgd door een tweede piek met poly-nucleotidefosforylase-activiteit in de fracties 105 tot 125,ge-20 elueerd met 0,21 M NaCl, 0,1 M Tris HCl .
Volume 210 ml: 107 units/ml.Totaal 22.470.
2. Deze oplossing werd ingesteld op 0,5 M amraoniumsulfaat door toevoeging van 28 g daarvan onder roeren, en vervolgens geleid over een kolom van 60 ml fenylsq>harose ( 19 x 2 cm) , welke in evenwicht was gebracht in 0,5 M (NH^^SO^, 0,05 M Tris HCl pH 7,4 . De kolom werd gewassen met ongeveer 20 ml 0,5 M (NH^SO^ in 0,1 M Tris HCl pH 7,4 en daarna geelueerd met een omgekeerde gradient van 250 ml 0,4 M Tris HCl pH 7,8 in 0,1 M 30 —3 (NH4)2S04 tot 3 x 10 M Tris HCl pH 7,8 bij 4°C. Fracties van ongeveer 10 ml werden verzameld. De actieve fracties werden bij elkaar gevoegd.
Volume 55 ml : 355 units/ml.Totaal 19.525.
35 3. Ammoniumsulfaat ( 20 g) werd onder roeren toegevoegd ( 55Z verzadiging) om proteine te precipiteren en •8802617 m \ - 6 - menliet het mengsel daarna 1 uur bij 4°C staan , waarna men het 15 min bij 16.000 g centrifugeerde. Het residu werd opgelost in een minimale hoeveelheid 0,1 M NaCl, 0,05 M Tris-HCl pH 7,4 (ongeveer 10 ml) en de oplossing werd gebracht op een kolomvan 350ml 5 Sephacryl S300 (50 x 3 cm) welke in evenwicht was gebracht in 0,1 M. NaCl, 0,05 M Tris HC1 pH 7,4 ,waarna het enzym met dezelfde buffer werd geelueerd (fracties van ongeveer 10 ml). De actieve fracties (13-17) werden bij elkaar gevoegd.
Volume 60 ml: 312,5 units/ml. Totaal 18.750.
10 540 units 6 280
Het enzym werd geprecipiteerd door toevoeging van 26 g (NH^^SO^ (65% verzadiging) en de suspensie werd bij -30°C bewaard.
15
Stap 4: Bereiding van polymeren 100 g ADP Na2 ( of 100 g UDP Na3) werd opgelost in ongeveer 600 ml water en toegevoegdaan: 200 ml M Tris HC1 pH 8,3 20 250 ml M ammoniumacetaat 20 ml 0,1 M EDTA pH 8,0 100 ml M MgCl2 in een 2 1 kolf. Het volume werd aangevuld tot 2 1 met water en de pH werd ingesteld op 8,6 bij kamertemperatuur met 5 N NH.OH.
25 . 4
Het oppervlak werd bedekt met een laag tolueen. De gebruikte nucleosidedifosfaten moeten geen verontreinigende metalen zoals 3+ 2+
Fe of Cu bevatten.
Aan een gedeelte van het mengsel (80 ml) werd 200 units enzym en 2 ml van een eerder bereid poly A
30 (of poly U ) als beginstuk ("primer") toegevoegd , waarna de oplossing 2 uur bij 37°C werd geincubeerd en daarna overgebracht naar de hoofdlading welke op 37°C werd gehouden. Na 4 uur werd nog eens 300 units enzym toegevoegd, waarna de incubatie werd voortgezet.
De pH daalde tot ongeveer 8,3 na 24 uur en de pH werd daarna ge-35 handhaafd op 8,0 tot 8,3 door toevoeging van 5 N NH^OH.
Het totale aantal units enzym bedraagt 500, •8802617 i - 7 - dat is 5 units per g . Als de polymerisatie verloopt met een snelheid van minder dan 25 % per 24 uur kan meer enzym worden toegevoegd op geschikte tijden om de snelheid te verhogen.
Extra hoeveelheden van 25 ml M MgC^ 5 worden onder krachtig roeren toegevoegd bij ongeveer 30%, 55% en 75% polymerisatie ( in totaal 175 mmol Mg voor 200 nmol ADP of ÜDP),waarbij de pH wordt gehandhaafd op 8,0 tot 8,3 (gemeten bij 37eC). De polymerisatie moet 80-90% bedragen na 3 tot 4 dagen.
De stapsgewijze toevoeging van MgC^ 10 handhaaft de verhouding van vrij ADP (UDP) tot Mg op ongeveer 2 bij de bovengenoemde polymerisatiepercentages.
Aan het eind van de incubatie wordt het mengsel gecentrifugeerd teneinde het geprecipiteerde ammonium-magnesiumfosfaat te verwijderen, waarna het precipitaat met een 15 weinig water wordt uitgewassen en de gecombineerde supernatantia worden gebruikt om het complex poly A - poly U te bereiden.
Optimale polymerisatieomstandigheden zijn een pH van 8,0 tot 8,3 , stapsgewijze toevoeging van MgC^ en voldoende enzym om een polymerisatiesnelheid van ongeveer 30% per 20 dag te verkrijgen . Een hogere incubatie pH (8,3 tot 8,6) geeft kleinere polymeren. Toevoeging van de totale hoeveelheid Mg aan het begin van de incubatie geeft eveneens kleinere polymeren.
Stap 5: Bereiding van complex Poly A - Poly U
25
Het totale nucleotidegehalte van de oplossingen wordt bepaald door hydrolyse van het incubatiémengsel in 0,1 N NaOH bij 10Ö°C gedurende 5 min onder toepassing van een verdunning van 1000 voor poly A en 500 voor poly ü (bijv. 10 jil poly A of 20 ul poly U in 10 ml 0,1 N NaOH of nauwkeuriger door tussen-30 . ; liggende verdunning van 100 jd. Aen.2QD jil U) . Absorptie bij 260 nm wordt gemeten en de molariteit wordt geschat met behulp van de volgende waarden.
•8802617
J
- 8 - \ -3 ^260 131111 x ^ voor molaire oplossingen pH 7,0 0,1 N NaOH (hydrolyse) 5 Ap 15,3 15,3
Poly A 9,8 15,3
Up 10,0 7,7
Poly U 9,5 7,7 10 De polymeerconcentraties worden bepaald uit de totale hoeveelheid nucleotide en het percentage polymerisatie. De volumina voor een stoechiometrische verhouding A/U = 1:1 worden vervolgens berekend. Aan het poly U in een 10 1 fles wordt 200 ml 25 % waterig NaCl toegevoegd, gevolgd door de poly A-oplos-15 sing, en de oplossingen worden grondig gemengd (eindconcentratie
NaCl ongeveer 0,18 M) , waarna men het mengsel minimaal 3 uur bij 4°C laat staan.
Een gelijk volume ethanol wordt vervolgens onder roeren toegevoegd teneinde poly A- poly U te precipiteren, 20 waarna men het mengsel 1 uur bij 4°C laat staan. Het complex wordt verzameld door centrifugeren in een Sorvall 3B ( 1 1 vaten) bij 5000 opm gedurende 3 min en vervolgens gewassen met 2 1 55% ethanol. Het residu wordt opgelost in ongeveer 4 1 zuiver water en gecentrifugeerd teneinde eventuele sporen ammoniummagnesiumfosfaat 25 te verwijderen. Aan de heldere supernatantia wordt 200 ml 25 % NaCl toegevoegd, waarna men de oplossing minimaal 3 uur bij 4°C laat staan.
Het complex wordt opnieuw geprecipiteerd door toevoeging van een gelijk volume ethanol onder roeren, ver-30 zameld door centrifugeren, uitgewassen met 55 % ethanol ( ongeveer 2 1), 75% ethanol en 2 maal met 96% ethanol, en vervolgens, onder vacuum gedroogd.
Opbrengst ongeveer 110-120 g.
In de regel moet voor de precipitatie van 35 het complex met 50% ethanol NaCl (0,15 tot 0,02 M ) aanwezig zijn'.
Voor de wassing moet niet minder dan 55% waterige ethanol worden gebruikt ( het geprecipiteerde complex wordt opgelost door 50% ethanol).
•8802617 2 4 - 9 -
Toxiciteit
De LD50 is onderzocht bij muizen en ratten via de IP- en IV-routes.
Geen lethaal effect werd waargenomen bij 5 de maximaal toegediende doses via de IV-route, noch. bij muizen noch bij ratten.
Een lethaal effect werd evenmin waargenomen bij IP toediening bij ratten, maar een LD^q van ongeveer 3 g/kg werd gevonden bij IP toediening aan muizen.
10 De gebruikelijke proeven ter bepaling van een pyrogeen effect waren volledig negatief.
Farmacologie
Aangezien de polymeren en copolymeren 15 volgens de uitvinding in het algemeen bekend zijn, maar tot nu toe nooit op industriële schaal in een voldoende zuivere toestand waren verkregen , zijn in de afgelopen jaren verschillende farmacologische onderzoekingen uitgevoerd op monsters van speciaal gezuiverde produkten welke niet verkrijgbaar waren op redelijke 20 commerciële voorwaarden.
Het belang van de uitvinding kan worden onderkend uit de bestaande bibliografie, zoals bijvoorbeeld de volgende artikelen: . Modulation of the immune system by synthetic polynucleotides -25 A.G. Johnson - Springer Semin. Immunopathol., 2, p. 149-168 (1979) , . Regulation of the immune system by synthetic polynucleotides -I. Characteristics of adjuvant action on antibody synthesis -30 J*R. Schidtke en A.G. Johnson - J. Immunol., 106, p. 1191— 1200 ( 1971), . Changes in lymphocyte subpopulations in mice receiving a single injection of poly A - poly Ü - M. Donner, D. Vallier en 35 F. Lacour - Ann. Immunol. ( Inst. Pasteur ) 128C, p.1039-1052 (1977), . Spectrum and mode of action of poly A - poly Ü in the stimulation •8802617 - 10 - τ of immune responses - V. Braun, M. Ishizuka, Ü. Yajima, D. Webb eiR.Winchurch in : Beers R. F., Braun W., "Biological effects of polynucleotides" New-York : Springle-Verlag, p. 139-156(1971), 5 . Reduced incidence of spontaneous mammary tumors in C3H/He mice after treatment with polyadenylate-polyridylate - F.Lacour, G. Delage en C. Chianale - Science , 187 , p. 256-257 (1975), . Poly A - poly U as an adjunct tot surgery in the treatment of 10 spontaneous murine mammary adenocarcinoma - F. Lacour, J.Lacour en A. Spira - Recent results in cancer research, vol. 47, p . 352-356, . Polyadenylic-polyuridylic acid: Biological response-modifying 15 activities in mice, in vivo organ distribution and pharmacokinetics in rabbits - F. Lacour : J. Biol. Resp. Modif., 4 , p. 490 - 494 (1985), . A phase I clinical tolerance study of polyadenylic-’polyuridylic 20 acid in cancer patients - J.P. Ducret , P. Caille, H. Sancho-Garnier, J.L. Ainiel, M. Michelson, R.G. Hovanessian, J.K. Youn en F. Lacour - J. Biol. Resp. Modif. , 4, p. 129-133 (1985).
25 Presentatie en posologie
Bij voorkeur wordt IV een isotonische oplossing met 0,01 tot 0,1 g werkzaam bestanddeel toegediend.
Een wekelijkse injectie zal gedufende 6 weken worden herhaald.
• 86026 17
Claims (8)
- 2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de eerste kolom een ionenuitwisselende hars zoals •fS) DEAE Sephacel^ of een equivalent daarvan bevat.
- 3. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de tweede kolom een hydrofobe hars zoals fenyl (gv
- 30 Sepharose^of een equivalent daarvan bevat.
- 4. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de derde kolom een moleculaire zeef zoals Sephacryl® S300 , Sephadex^ 200 of een equivalent daarvan bevat.
- 5. Nucleotide-polymeer of -copolymeer, 35 verkregen volgens de werkwijze van één van de conclusies 1 tot 4.
- 6. Copolymeer volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat de als uitgangsstof gebruikte nucleotiden adenylzuur en uridylzuur zijn. • 88026 17 4 ί - 12 -
- 7. Copolymeer volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat de molverhouding van polyadenylzuur en polyuridylzuur ongeveer 50/50 bedraagt.
- 8. Therapeutisch preparaat, met het ken- 5 merk, dat het als werkzaam bestanddeel een doeltreffende hoeveel heid van eén..polymeer of copolymeer volgens één van de conclusies 5 tot 7 bevat. -o-o-o-o- • 88026 17
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB878725606A GB8725606D0 (en) | 1987-11-02 | 1987-11-02 | Preparation polynucleotides |
| GB8725606 | 1987-11-02 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NL8802617A true NL8802617A (nl) | 1989-06-01 |
| NL194949B NL194949B (nl) | 2003-04-01 |
| NL194949C NL194949C (nl) | 2003-08-04 |
Family
ID=10626275
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NL8802617A NL194949C (nl) | 1987-11-02 | 1988-10-25 | Werkwijze voor de bereiding van polynucleotiden en therapeutisch preparaat dat een dergelijk polynucleotide bevat. |
Country Status (29)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4927755A (nl) |
| JP (1) | JPH0712316B2 (nl) |
| KR (1) | KR0134624B1 (nl) |
| AR (1) | AR244342A1 (nl) |
| AT (1) | AT396251B (nl) |
| AU (1) | AU610792B2 (nl) |
| BE (1) | BE1001938A4 (nl) |
| CA (1) | CA1339911C (nl) |
| CH (1) | CH676248A5 (nl) |
| DE (1) | DE3837203A1 (nl) |
| DK (1) | DK607388A (nl) |
| ES (1) | ES2009099A6 (nl) |
| FI (1) | FI95135C (nl) |
| FR (2) | FR2622451B1 (nl) |
| GB (2) | GB8725606D0 (nl) |
| GR (1) | GR1000715B (nl) |
| HK (1) | HK47692A (nl) |
| IE (1) | IE61610B1 (nl) |
| IT (1) | IT1227447B (nl) |
| MY (1) | MY103445A (nl) |
| NL (1) | NL194949C (nl) |
| NO (1) | NO172902C (nl) |
| NZ (1) | NZ226643A (nl) |
| OA (1) | OA10206A (nl) |
| PT (1) | PT88903B (nl) |
| SE (1) | SE503401C2 (nl) |
| SG (1) | SG40792G (nl) |
| TN (1) | TNSN88113A1 (nl) |
| ZA (1) | ZA888180B (nl) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9108085D0 (en) * | 1991-04-16 | 1991-06-05 | Scras | Complexes of polyadenylic acid with polyuridylic acid |
| AR013269A1 (es) * | 1997-08-04 | 2000-12-13 | Scras | Producto que contiene por lo menos un rna de doble filamento combinado con por lo menos un agente anti-viral, para la utilizacion terapeutica en eltratamiento de una enfermedad viral, en especial de la hepatitis viral |
| EP2258712A3 (en) * | 2002-03-15 | 2011-05-04 | Multicell Immunotherapeutics, Inc. | Compositions and Methods to Initiate or Enhance Antibody and Major-histocompatibility Class I or Class II-restricted T Cell Responses by Using Immunomodulatory, Non-coding RNA Motifs |
| EP1582584A4 (en) * | 2002-12-26 | 2006-05-31 | Nippon Shinyaku Co Ltd | PROCESS FOR PRODUCING PNPASE |
| WO2005068662A1 (en) * | 2003-12-30 | 2005-07-28 | Sigma-Aldrich Co. | Rapid preparation of nucleic acids by enzymatic digestion |
| CA2722589A1 (en) | 2008-04-25 | 2009-10-29 | Innate Pharma | Improved tlr3 agonist compositions |
| WO2012092540A1 (en) * | 2010-12-30 | 2012-07-05 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for the synthesis of polyadenylic acid |
| US20220389050A1 (en) * | 2020-01-24 | 2022-12-08 | Aim Immunotech Inc. | Therapeutic double stranded rna and methods for producing the same |
Family Cites Families (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU6012A1 (ru) * | 1927-04-04 | 1928-07-31 | Л.С. Кравцов | Горизонтальный вод ной двигатель с поворотными лопаст ми |
| JPS4940954B1 (nl) * | 1970-02-16 | 1974-11-06 | ||
| DE2056081A1 (en) * | 1970-11-14 | 1972-06-22 | Pabst Brewing Company, Milwaukee, Wis. (V.StA.) | Poly nucleotides prepn |
| IL37076A (en) * | 1971-06-16 | 1974-05-16 | Littauer U | A method for stepwise synthesis of oligoribonucleotides of defined sequence using 2'(3')-o-acyl-nucleoside diphosphates and polynucleotide phosphorylase |
| JPS524633B2 (nl) * | 1972-07-21 | 1977-02-05 | ||
| GB1435571A (en) * | 1973-04-02 | 1976-05-12 | Searle & Co | Polynucleotides |
| DE2319495C2 (de) * | 1973-04-17 | 1985-01-10 | Yeda Research And Development Co., Ltd., Rehovot | Verfahren zum selektiven, reversiblen Binden von Biomolekülen an ein Adsorbens in einer chromatographischen Säule |
| FR2252350A1 (en) * | 1973-11-22 | 1975-06-20 | Choay Sa | Polynucleotide phosphorylase - extraction from E coli, fixation on sepharose, and use in preparing polynucleotides |
| JPS50107187A (nl) * | 1974-02-08 | 1975-08-23 | ||
| US4006059A (en) * | 1974-07-29 | 1977-02-01 | Purdue Research Foundation | Hydrophobic noncovalent binding of proteins to support materials |
| US4000098A (en) * | 1974-08-16 | 1976-12-28 | Palo Alto Medical Research Foundation | Separation of proteins by hydrophobic adsorption |
| SU601287A1 (ru) * | 1976-05-12 | 1978-04-05 | Предприятие П/Я М-5043 | Способ получени полирибонуклеотидов |
| US4075195A (en) * | 1976-08-31 | 1978-02-21 | Kraft, Inc. | Debittered protein product and method for manufacture |
| SU619508A1 (ru) * | 1976-12-07 | 1978-08-15 | Предприятие П/Я Г-4740 | Способ получени полинуклеотидов, обладающих полирибонуклеотидфосфорилазной активностью |
| JPS5922518B2 (ja) * | 1977-03-09 | 1984-05-26 | 三菱化学株式会社 | ポリグアニル酸の製造方法 |
| JPS5618597A (en) * | 1979-07-23 | 1981-02-21 | Mitsubishi Chem Ind Ltd | Production of oligonucleotide |
| US4379843A (en) * | 1981-01-26 | 1983-04-12 | Peter Cashion | Immobilization of polynucleotides and polypeptides with tritylated polysaccharides |
| US4617376A (en) * | 1985-07-01 | 1986-10-14 | Eli Lilly And Company | Process for recovering glucagon from pancreas glands |
| US4771128A (en) * | 1986-10-10 | 1988-09-13 | Cetus Corporation | Method of purifying toxin conjugates using hydrophobic interaction chromatography |
-
1987
- 1987-11-02 GB GB878725606A patent/GB8725606D0/en active Pending
-
1988
- 1988-10-20 NZ NZ226643A patent/NZ226643A/en unknown
- 1988-10-24 AR AR88312284A patent/AR244342A1/es active
- 1988-10-24 CH CH3951/88A patent/CH676248A5/fr not_active IP Right Cessation
- 1988-10-25 NL NL8802617A patent/NL194949C/nl not_active IP Right Cessation
- 1988-10-26 GR GR880100728A patent/GR1000715B/el not_active IP Right Cessation
- 1988-10-28 BE BE8801243A patent/BE1001938A4/fr not_active IP Right Cessation
- 1988-10-28 MY MYPI88001231A patent/MY103445A/en unknown
- 1988-10-28 AU AU24429/88A patent/AU610792B2/en not_active Ceased
- 1988-10-31 PT PT88903A patent/PT88903B/pt not_active IP Right Cessation
- 1988-10-31 AT AT0267788A patent/AT396251B/de not_active IP Right Cessation
- 1988-10-31 ES ES8803317A patent/ES2009099A6/es not_active Expired
- 1988-10-31 IT IT8822471A patent/IT1227447B/it active
- 1988-10-31 GB GB8825399A patent/GB2211847B/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-10-31 SE SE8803930A patent/SE503401C2/sv not_active IP Right Cessation
- 1988-11-01 NO NO884865A patent/NO172902C/no unknown
- 1988-11-01 DK DK607388A patent/DK607388A/da not_active Application Discontinuation
- 1988-11-01 CA CA000581851A patent/CA1339911C/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-11-01 US US07/265,561 patent/US4927755A/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-11-01 ZA ZA888180A patent/ZA888180B/xx unknown
- 1988-11-01 IE IE329088A patent/IE61610B1/en not_active IP Right Cessation
- 1988-11-01 KR KR1019880014332A patent/KR0134624B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1988-11-02 FR FR888814251A patent/FR2622451B1/fr not_active Expired - Fee Related
- 1988-11-02 FR FR888814252A patent/FR2622586B1/fr not_active Expired - Fee Related
- 1988-11-02 TN TNTNSN88113A patent/TNSN88113A1/fr unknown
- 1988-11-02 DE DE3837203A patent/DE3837203A1/de active Granted
- 1988-11-02 FI FI885045A patent/FI95135C/fi not_active IP Right Cessation
- 1988-11-02 JP JP63276359A patent/JPH0712316B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1988-11-18 OA OA59474A patent/OA10206A/fr unknown
-
1992
- 1992-04-14 SG SG407/92A patent/SG40792G/en unknown
- 1992-07-02 HK HK476/92A patent/HK47692A/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA1073387A (en) | Induction of interferon production by modified nucleic acid complexes | |
| Dahmus et al. | Increased template activity of liver chromatin, a result of hydrocortisone administration. | |
| Daly et al. | Purine and pyrimidine contents of some desoxypentose nucleic acids | |
| NL194949C (nl) | Werkwijze voor de bereiding van polynucleotiden en therapeutisch preparaat dat een dergelijk polynucleotide bevat. | |
| Villani et al. | Sites of termination of in vitro DNA synthesis on cis-diamminedichloroplatinum (II) treated single-stranded DNA: a comparison between E. coli DNA polymerase I and eucaryotic DNA polymerases α | |
| Sporn et al. | Nuclear exoribonucleases. III. Isolation and properties of the enzyme from normal and malignant tissues of the mouse | |
| US4210746A (en) | Nucleotide inhibitor of protein synthesis | |
| SU933001A3 (ru) | Способ получени синтетической двунитчатой РНК, обладающей интерферониндуцирующей активностью | |
| Hoffman et al. | Polynucleotide phosphorylase covalently bound to cellulose and its use in the preparation of homopolynucleotides | |
| Wang et al. | NATURE OF MONOESTER PHOSPHATE GROUP IN COENZYME A1 | |
| Brown et al. | The release of chromatin template restrictions by natural polyribonucleotides | |
| NO145540B (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av terapeutisk aktive polyribonukleotider. | |
| Karkas et al. | Template functions in the enzymic formation of polyribonucleotides. 3. Apurinic acid as template. | |
| Pitha et al. | Polynucleotide analogs as inhibitors of DNA and RNA polymerases | |
| Soldo et al. | The Kinetic and Analytical Complexities of the DNA Genomes of Certain Marine and Fresh‐Water Ciliates 1 | |
| US3438865A (en) | Preparation of bacterial lipopolysaccharides | |
| Ip et al. | Two deoxyribonucleases from Novikoff ascites hepatoma cells | |
| EP0320807A2 (en) | Novel polynucleotide analogs, methods for inhibiting nucleic acid polymerases and methods for inducing synthesis of interferon | |
| SU1081171A1 (ru) | Способ выделени дезоксирибонуклеиновой кислоты | |
| JPH06511265A (ja) | レトロウィルス複製抑制剤としてのアシル化ヘパリン | |
| 阿部辰一 | Nucleic Acids | |
| Marcante | Properties of hyaluronic acid from a human myxosarcoma | |
| Walker | Nucleic acids | |
| Okamoto | Partial Purification of RNA-polymerase from Bacillus stearothermophilus | |
| IL36707A (en) | Process for the preparation of polynucleotide phosphorylase |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BA | A request for search or an international-type search has been filed | ||
| BB | A search report has been drawn up | ||
| BC | A request for examination has been filed | ||
| V1 | Lapsed because of non-payment of the annual fee |
Effective date: 20050501 |