JPH01148196A - ポリヌクレオチド類の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はポリヌクレオチド類（ホモ−ポリヌクレオチド
類又はコーポリヌクレオチド類）及びそれらの複合体の
製造法に関する。また、本発明は前記の製造法によって
製造された新規な改良されたポリヌクレオチド類に関す
る。種々のポリヌクレオチド類が既存の方法で製造され
ているが、これ迄に製造されたポリヌクレオチド類の大
部分は所望のポリヌクレオチド類を調製する一連の工程
で出現する幾つかの不純物又は使用薬剤が混入するため
に、一般に発熱性であるか多少とも有毒性である。これ
らのポリヌクレオチド類は種々の治療分野において、特
に癌の治療において、ある種の細菌及びウィルス感染疾
患においてアジュバン）　（ａｄｊｕｖａｎｔ）であり
、またワクチンのアジュバントでもある０本発明はまた
、本発明の改良されたポリヌクレオチド類を有効成分と
して含有する治療剤組成物にも関する。

一般に、ポリヌクレオチド類は適当なヌクレオチド単量
体すなわちモノヌクレオチドに対してポリヌクレオチド
ホスホリラーゼを作用させて重合することによって得ら
れる。ＡＤＰ、　ＣＤＰ、　ＧＤＰ、　ＩＤＰ及びＩＪ
ＤＰのような種々のヌクレオチド単量体類は、従来周知
の方法で得られる。ポリヌクレオチドホスホリラーゼも
また、周知の方法によって収得され、例えば細菌の培養
物を原料として用い、その細菌培養物中に得られた細菌
菌体の溶解を行ない、続いて得られた菌体溶解液（この
中には種々の酵素例えばキナーゼ類、ホスファターゼ類
、ヌクレオターゼ類、ジェステラーゼ類等の酵素が含有
され、これら全ては前記のポリヌクレオチドホスホリラ
ーゼによるヌクレオチド単量体の重合を行なう次後の工
程における競合作用する酵素であって望ましくない成分
である）から前記の菌体溶解で得られたポリヌクレオチ
ドホスホリラーゼを抽出することによって得られる。前
記の種々の望ましくない酵素が存在すると所望しない副
反応が並行して起ることになり、また重合させるべきヌ
クレオチド単量体及び生成したヌクレオチド重合体の部
分的な分解が生起する。

このような理由で、前記の従来法で得られたポリヌクレ
オチド類の大部分はそれらの毒性及び（又は）それらの
発熱性特性のいずれかの点で欠点がある。分析化学用又
は限られた科学的な実験用では受容できる純度のポリヌ
クレオチドホスホリラーゼを小規模に製造することは可
能であるが、同じ純度のものを、許容できる費用で工業
的な技術で収得するのは容易ではない。

本発明によれば、前述した既存の種々の方法によって得
られるようなポリヌクレオチドホスホリラーゼ酵素剤の
代わりに、望ましくない反応をもたらす不純物のない高
度に精製された酵素をヌクレオチド重合剤として使用す
ることにより、ポリヌクレオチド類の実質的に純粋なホ
モ重合体もしくは共重合体又は純粋なポリヌクレオチド
の複合体（ｃｏｎ＋ｐｌｅｘ）　、あるいはヌクレオチ
ド類縁体の重合体を工業的に許容できる条件で製造でき
ることが見出された。そのヌクレオチド類類縁体として
は、例えば八〇Ｐの６−ヒドロキシアルキル誘導体又は
ＵＤＰの５−ハロもしくは５−ＯＨもしくは５−メチル
誘導体を挙げることができる。

特に、細菌菌株の培養と得られた細菌培養物の菌体溶解
を行なった後に、得られた菌体溶解液を３種のカラム、
すなわちイオン交換樹脂例えばＤＩ’ＡＩＥセファセル
（Ｓｅｐｈａｃｅｌ　：登録商標）又はその均等物を入
れた第１のカラムと、疎水性樹脂例えばフェニルセファ
ロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ：登録商標）又はその均等
物を入れた第２のカラムと、分子篩例えばセファクリル
（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　：登録商標）　Ｓ　３００もし
くはセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ：登録商標）２
００又はそれらの均等物を入れた第３のカラムとに次々
に通すことが必要であることが今回見出された。

前記の第３のカラムから溶出された酵素溶液は、ポリヌ
クレオチドホスホリラーゼを専ら含有するものであり、
次段のヌクレオチド重合工程に対する作用を失なった物
質の痕跡量を含む。

ヌクレオチド類のホモ重合体を製造しようと望む場合に
は、上記の得られたポリヌクレオチドホスホリラーゼを
、通常の使用薬剤の存在下で、原料として選択したヌク
レオチド単量体に作用させ重合するのに使用する。

ヌクレオチド類の共重合体を製造しようとする場合には
、原料として選択した複数のヌクレオチド単量体の適当
な割合の混合物を代わりに使用する。得られるヌクレオ
チド類の共重合体はポリＡ／ポリＵと呼ばれるものであ
る。

ポリヌクレオチド類同士の複合体を製造しようとする場
合には、適当なヌクレオチド単量体の２種又はそれ以上
の各々について同じ重合を行ない、そしてそれぞれ得ら
れた複数のヌクレオチドのホモ重合体を適当な割合でＮ
ａＣ１の存在下で水中で混合し、次いでエタノール添加
で沈澱させると、所望の複合体を収得できる。

本発明の重要な特徴としては原料として選択したヌクレ
オチド単量体又は選択した複数のヌクレオチド単量体の
重合を、通常慣用の条件とは異なる条件で実施すること
である。特に、ヌクレオチド単量体の使用濃度が通常の
慣用の濃度値をはるかに越えており（約３０〜約１００
倍好ましくは約５０倍）、重合はＭｇＣｆｆｉ、を加減
して添加しながら７．４〜８．６の調節されたｐｉ範囲
内で且つ約３日〜約６日の間実施させるのが本発明の特
徴である。

得られるヌクレオチド類のホモ重合体類又は共重合体類
は約２５０，０００〜約１．５００，０００の分子量を
有する複合体を与えるような分子量範囲を有するもので
あり、重合速度は均一で且つ重合収率は９０〜９５％に
達する。

本発明を次の実施例によって説明する０本例では酵素原
料として大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｔ）を用いるが他の細菌
もまた適当に使用できる。本例では、大腸菌の培養から
出発してポリＡ／ポリＵの複合体の製造に至る連続する
５段階について以下に説明する。

遺」１歿 使用する大腸菌Ｂ１１５は多くの菌保存機関から入手で
きる公知面であり、用いた大腸菌培養物は室温で穿刺培
養物として保存されたものである。

Ｉｎ当り１０ｇのＮａＣＩｔと１０ｇのトリブチケース
と５ｇの酵母エキスとを含有する培地を用いた。

この培地を１１０°Ｃで４５分間滅菌した後に、別に滅
菌したグルコース溶液を２ｇ／Ｉｔ加えた。このように
調製された培地の１０−を用いて前培養を行ない、次い
で２０Ｏｄずつの培地を用いて培養して計ＩＯＮの細菌
培養液を得た。

１分間当り８１の空気で通気下に４７Ｏｒｐｍで攪拌培
養したδ６００での菌体倍加時間は３０分であり、菌体
は６００ｎｍでの光学的濃度６で集菌した。培養液１２
当り約８ｇの菌体が得られた。培養ｐｉは２ＮのＮＨ，
ＯＨを添加して６．５〜６．８に調整した。すぐに使用
しない場合には大腸菌培養液は一２０℃で保存した。

最ｆｌ＝ｍＪＩ日１鰻 本段階は下記の２種の緩衝液を用いた。

緩衝液Ａ　：　２　Ｘｌ０−”Ｍ−ＢＤＴＡと０．２３
３Ｍ−Ｎａｃ　ｊ！（１３，６３ｇ　／　ｆ　）と５％
グリセロール（５０ａｅ／ｊりとを含有する５Ｘ１０−
”Ｍトリス−Ｈｃｍ！　（２５℃でｐＨ７，９）。

緩衝液Ｂ　：　１０−’）１−Ｅｌ）ＴＡと０．２Ｍ−
Ｎａｃ　Ｊ！と５％グリセロールとを含有する１０−”
Ｍ　）リス−Ｈｃｊ！　（ｐＨ７，９） 使用細菌量は１６５　ｇ　（２０Ｉｔ培養液）であった
。

使用直前に、前記の緩衝液Ａ　４００ａｄｌに室温で０
．１Ｍ　（１５，４■／Ｈ１）−ジチオトレイトール（
ＤＴＴ）０．４　ｍを加え、続いてメルカプトエタノー
ル２８μ！、リゾチーム４５■、及びエタノール４１１
ｄ！に溶解したフェニルメチルスルホニルフルオリド（
ＰＭＳＦ）１４■を加えた。得られた混合溶液に攪拌器
中で前記の大腸菌の凍結物（１６５ｇ　）を分散させ（
最終温度、約１０℃）、次いで、この得られた菌体懸濁
液を時折攪拌混合しながら（約２０分）１５℃迄昇温さ
せ、次いで攪拌下にデオキシコール酸ナトリウム２７２
■を加え、続いてデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮＡア
ーゼ）４■を加えた。得られた菌体溶解混合液を時折攪
拌混合しながら２０分間放置し、温度を２０℃に保持し
た。これに前記の緩衝液Ｂ４Ｏ０ａｄｔと０．１　Ｍ−
ＤＴＴ　０．４ｄを攪拌しながら加え、得られた懸濁液
を５℃で１時間（Ｓｏｒｖａｌｌ遠心分離機で１０．０
ＯＯｒｐｏ＋　）で遠心分離（１６，０００Ｇ）　した
。上記の使用したＤＮＡアーゼ、リゾチームは次の単位
を有する。

ＤＮＡアーゼ：　５０．６７９ドルナーゼ（Ｄｏｒｎａ
ｓｅ）単位／■ リゾチーム：　２５，０００単位／■ 遠心分離で得た上澄液（約９００１ｄ）を蒸留水で１２
に希釈し、攪拌しながら４℃で硫酸アンモニウム（４５
％飽和溶液）　　２８０ｇを加えて蛋白質を沈澱させ、
得られた混合物を４℃で２時間放置した。

蛋白質は５°Ｃで３０分間１６．０ＯＯＧで遠心分離し
て回収した。沈澱（上澄液を捨てる）をｐＨ７，８の１
０−２Ｍトリス−Ｈｃｌ　１５０ａｄに溶解し、得られ
た溶液を２０分間１６．０００Ｇで遠心分離し、不溶物
を除去した。

得られた上澄液を４℃で１８時間にわたって・ｐｔｔ７
．８　（７）　５　Ｘｌ０−”Ｍ　）　ＩＪ　ス−ＨＣ
ｌ１２　ｆ　ニ対して４回透析し、次いで透析後の溶液
を１時間１６．０００Ｇで遠心分離し不溶物を除去した
。得られた菌体溶解上澄液は液量３００ＩｄでＰＨ７，
８、導電率＜７．０　ｍｓを示した。

１、前記の上澄液を、４℃でｐＨ７，４の０．１Ｍ）リ
スーＨｃｌ中で平衡にさせたＤＩＥＡＥセファセル２８
０−〇カラム（４０Ｍ３ｃｍ）にかけ、カラムをｐＨ７
，４のＯ，１Ｍ）リスＨｃ１１　ｊ！〜ｐＨ７，４の０
．４　Ｍ　ＮａＣ１に溶解した０、１Ｍ）リスＨｃｌの
１１で勾配溶出法で溶離させ二１０ＩＩＩｌずつの両分
で溶出液を分画した。

ジェステラーゼ活性のピークをもつ両分が先ず出現し、
続いて０．２１Ｍ　ＮａＣ１−０，１Ｍ　トリスＨｃＩ
ｌで溶離させると、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ活
性のピークをもつ画分が画分阻１０５〜１２５として得
られた。これらの両分の総液量は２１０１ｄであり力価
が１０７単位／１１１であるから総単位２２．４７０の
ポリヌクレオチドホスホリラーゼが得られた。

２、この酵素溶液に攪拌しながら硫安２８ｇを加えるこ
とによって硫酸アンモニウム濃度０．５Ｍに調整し、次
いで、０．５　Ｍ（ＮＨａ）ｚｓＯｎ　−０，５Ｍ　）
リスＨｃｌ　（ｐＨ７，４）中で平衡にさせたフェニル
セファロース６０ｄカラム（１９Ｍ２ｃｍ）に通した。

このカラムを０．５　Ｍ（ＮＨ４）！ＳＯ４−０，１Ｍ
　）リスＨＣｆ（ｐＨ７，４）の約２０１ｄで洗滌し、
次いで４℃で０．１Ｍ（ＮＨｎ）ｚｓ（１ｍ　−０，４
Ｍ　）リスＨｃＩｌ（ｐＨ７，８）　〜３　Ｘｌ０−３
ＭトリスＨｃｊ！　（ｐＨ７，８）２５０　ｒｍで逆勾
配溶出法で溶離させた。溶出液を約１０ｄずつの両分で
分画し、活性な画分を集めた。活性画分の総液量は５５
ｍであり、酵素力価３５５単位／ｄであり、総単位１９
．５２５の酵素量である。

３、硫酸アンモニウム（２０ｇ）を攪拌しながら上記の
活性画分に加え（５５％飽和）、蛋白質を沈澱させ、こ
の沈澱を４℃で１時間放置し、次いで１６、０００　Ｇ
で１５分遠心分離した。得られた残渣を０．ＩＭ　Ｎａ
Ｃｌ　−０，０５Ｍ　）リスＨｃｌ　（ｐＨ７，４）の
最小量（約１０ｍ）に溶解し、得られた溶液を０．１　
Ｍ　ＨａＣｊ！−０，０５Ｍ　トリスＨｃｊ！　（ｐＨ
７，４）中で平衡させたセファクリル３３００　３５０
ｄカラム（５０Ｘ３Ｃ１）にかけ、次いで同じ緩衝液で
酵素を溶出させた（約１０ｄずつ分画）。活性な両分（
画分１１ｋＬ１３〜Ｎａ１７）を集めた。得られた活性
画分の総液量は６０ｄであり、酵素力価は３１２．５単
位／ｄであり、総単位１８．７５０の酵素量である。５
４０単位、６２８０活性画分へ（ＮＨａ）　ｚｓＯａ　
２６　ｇを加えて（６５％飽和）、酵素を沈澱させ、得
られた酵素懸濁液を一３０℃で保存した。

没ｌ土：ヌ　レオチ゛　ム　の１１゛ ヌクレオチドＡＤＰ　Ｎａｇ　１００ｇ　（又はヌクレ
オチドＵＤＰ　Ｎａｓ　１００ｇ）を約６００ａｄの水
に溶解し、その溶液を２２のビンに入れた下記の４種の
溶液ＩＭのトリスＨｃ　ｌ　（ｐＨ８，３）２００ＩＩ
１１１Ｍの酢酸アンモニウム２５０　ａｆ Ｏ，Ｉ　ＭのＥＤＴ＾（ｐＨ８，０）２０　ａｄ！１Ｍ
のＨｇＣ１ｔ　１００　ＩＩｌ の混液に加えた。このようにして得られた混合溶液の液
量を水で２２に希釈し、５Ｎ　　ＮＨａＯＨで室温ｐＨ
８，６に調整した。その溶液の表面をトルエン層で覆っ
た。使用したヌクレオシドジホスフェートはＦｅ”°又
は（、ｕ４＋のような金属が混入していないものである
。

前記の希釈混合溶液の一部（８０ｍｌりを取出し、これ
に２００単位の酵素と、予め別に調製したポリＡ（又は
ポリＵ）２−をブライマーとして加え、得られた溶液を
３７℃で２時間酵素反応させ、その反応液を次いで３７
°Ｃに保持した前記の希釈混合溶液の主要残部（ｍａｉ
ｎ　ｂａｔｃｈ）に加えた。４時間後に、更に３００単
位の酵素を追加し、反応を続けた。２４時間後に、ｐＨ
は約８．３に下がり、その後５Ｎ−ＮＨ，ＯＨを加えて
ｐＨを８．０〜８．３に維持した。

力価５単位／ｇの酵素を総計５００単位使用した。

重合が２４時間当り２５％未満しか進まないならば酵素
を追加して適当な時間で進むように重合速度を増加させ
る。

重合率がそれぞれ約３０％、５５％及び７５％の時に、
激しく攪拌しながらＩＭ　　ＭｇＣ１，ｚを２５ｄずつ
追加しくＡＤＰ又はＵＤＰの２００ナノモルに対しＭ、
の全量は１７５ミリモルであった）　、ｐｉを８．０〜
８．３　（３７°Ｃで測定）に維持する。重合率は反応
３〜４日目には８０〜９０％であるべきである、 ＭｇＣＩｌ　ｚを段階的に分けて添加することにより前
述の種々の重合率の時に遊離ＡＤＰ（又はＵＤＰ）をＭ
ｇとの比が約２であるように維持する。

反応終了時に、得られた反応混合物を遠心分離し、沈澱
したリン酸マグネシウムアンモニウムを除去し、得られ
た沈澱を少量の水で洗滌した。得られた上澄液は、原料
としてＡＤＰ　（又はＵＤＰ）を用いた時にポリＡ（又
はポリＵ）を含有する。複合体ポリＡ−ポリＵを製造す
るためには、ポリＡを含む上澄液とポリＵを含む上澄液
とを合併して使用する。

最適重合条件はｐＨを８．０〜８．３に維持し、しかも
１日当り約３０％の重合率を得るように十分な酵素とＭ
ｇＣｌ２とを段階的に分けて添加することである。反応
時のｐＨ（８，３〜８．６）を高くすると得られる重合
体の量が少なくなる。反応開始時にＭｇ全部を一辺に添
加すると得られる重合体の量が減少する。

１１貝Ｅ５−：ポＩＡ−パＩＵ　ム　の　゛告使用する
ポリＡ又はポリＵの溶液の全ヌクレオチド含量は、ポリ
Ａについては１０００倍の希釈度及びポリＵについては
５００倍の希釈度（例えば０．ＩＮ　ＮａＯＨＩＱａｄ
！当りにポリＡ１０ＩＩｎ又はポリＵ２０μ２の量にな
るように希釈し、またより正確にはポリＡ１００μｌ及
びポリＵ２００μｌになるように中間希釈を行なう）を
使用して、０．Ｉ　Ｎ　ＮａＯＨ中で反応混合物を１０
０℃で５分間加水分解することによって定量する。２６
０ｎｍでの吸光度を測定し、且つ次の値を用いてモル濃
度を求めた。

モル溶液についての値δ２６０　ｎｍ　Ｘ　１０−’重
合体濃度は、全ヌクレオチド量と重合率（％）とから決
定した。次いで、化学量論比ポリＡ／ボリＵ＝１：１の
容量を算出した。１ＯＮビン中のポリＵに２５％ＮａＣ
Ｉｔ水溶液２００ｄを加え、続いてポＩＪ　Ａの溶液を
加え、次いでこの溶液を十分に混合しくＮａＣ１の最終
濃度、約０．１８Ｍ）　、４°Ｃで最小３時間放置した
。

次いで攪拌しながら等容量のエタノールを加えポリＡ−
ポリＵの複合体を沈澱させ、得られた混合物を４°Ｃで
１時間放置した。複合体ポリＡ−ポリＵを５ｏｒｖａ１
１３　Ｂ遠心分離機（複数の１２ポツト）中５．ＯＯＯ
ｒｐｍで３分間遠心分離することによって集め、次いで
５５％エタノール２Ｉｌで洗滌した。

残渣として得られた前記の複合体は４１の純水に溶解し
、次いで遠心分離し微量のリン酸マグネシウムアンモニ
ウムを除去した。清澄な上澄液に２５％ＮａＣＩｌ　２
００ａｌ！を加え、得られた溶液を４°Ｃで最小３時間
放置した。

前記の複合体を、攪拌しながら等容量のエタノールを加
えることによって再び沈澱させ、遠心分離によって集め
、５５％エタノール（約２１）で１回、７５％エタノー
ルで１回及び９６％エタノールで２回洗滌し、次いで減
圧下で乾燥した。収量的１１０〜１２０ｇ。

一般に、５０％エタノールで複合体を沈澱させるには、
ＮａＣｌ　（０，１５Ｍ〜０．０２Ｍ）を存在させねば
ならない。洗滌には５５％以上の濃度の水性エタノール
を使用しなければならない（沈澱した複合体も５０％濃
度のエタノールを用いると再溶解する）。

皇性 前記の実施例で得たポリＡ−ポリＵ複合体のＬＤｓ。

をＩＰ（腹腔内）及びＩＶ（静脈内）投与によりマウス
とラットについて調査した。

ＩＶ投与の場合には最大投与量でマウス又はラットのい
ずれについても死亡例は認められなかった。

ＩＰ投与の場合にはラットに対しては死亡例は認められ
なかったが、マウスに対してはＬＤｓ。が約３ｇ／ｋｇ
であった。

通常の発熱性試験は完全に陰性であった。

ｌ且立里 本発明によるヌクレオチドの重合体及び共重合体は一般
に知られているが、これ迄は十分に純粋な状態で工業的
製法で得られたことがなかった。

適当に工業的な条件では実際には入手できない特別に精
製されたポリヌクレオチド生成物の試料を用いて種々の
薬理試験はすでに数年間行なわれている。

本発明のポリヌクレオチド生成物の利点は下記の既存の
参考文献及び例えば以下の論説から認め得る。

・ＭＯＤＵＬＡＴＩＯＮ　ＯＦ　ＴＨＥ　ＩＭＭＵＮＥ
　ＳＹＳＴＥＭ　ＢＹ　５ＹＮＴＨＥＴＩＣＰＯＬＹＮ
ＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ　−Ａ、Ｇ、　ＪＯＨＮＳＯＮ　
−ｒＳｐｒｉｎｇｅｒＳｅｍｉｎ、　Ｉｎｎ＋ｕｎｏｐ
ａｔｈｏ１．　Ｊ　、第２巻第１４９−１６８頁（１９
７９年）。

・ＲＥＧＵＬＡＴＩＯＮ　ＯＦ　ＴＨＥＩＭＭＵＮＥ　
ＳＹＳＴＥＭ　ＢＹ　５ＹＮＴＨＥＴＩＣＰＯＬＹＮＵ
ＣＬＥＯＴＩＤＥＳ　−１，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔ
ｉｃｓ　ｏｆＡｄｊｕｖａｎｔ　Ａｃｔｉｏｎ　ｏｎ　
Ａｎｔｉｂｏｄｙ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　−Ｊ、Ｒ。

５ＣＨＩＤＴＫＥ及びＡ、Ｇ、　ＪＯＨＮＳＯＮ　−ｒ
Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｊ　。

第１０６巻第１１９’ｌ−１２００頁（１９７１年）。

・ＣＨＡＮＧＥＳ　ＩＮ　ＬＹＭＰＨＯＣＹＴＥ　５Ｕ
ＢＰＯＰＵＬＡＴＩＯＮＳ　ＩＮ　ＭＩＣＥＲＥＣＥＩ
ＶＩＮＧ　Ａ　５ＩＮＧＬＥ　ＩＮＪＥＣＴＩＯＮ　Ｏ
Ｆ　ＰＯＬＹ　Ａ−ＰＯＬＹＵ　−Ｍ、　ＤＯＮＮＥＲ
、Ｄ、　ＶＡＬＬＩＨＲ及びＦ、　ＬＡＣＯＵＲ−’Ａ
ｎｎ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　　Ｊ　（１１１ｓｔ、　
　Ｐａ５ｔｅｕｒ）　　１２８Ｃ。

第１０３９−１０５２頁（１９７７）　。

・ＳＰＥＣＴＲＵＭ　ＡＮＤ　ＭＯＤＨＯＦ　ＡＣＴＩ
ＯＮ　ＯＦ　ＰＯＬＹ　Ａ　　−ＰＯＬＹ　Ｕ　ＩＮ　
ＴＨＥ　ＳＴＩＭＵＬＡＴＩＯＮ　ＯＦ　ＩＭＭＵＮＥ
　Ｒ１１！５ＰＯＮＳＩＩ！Ｓ−Ｖ、　　ＢＲＡＵＮ、
　　Ｍ、　　ｌ５ＨＩＺＵＫＡ　　、　　Ｕ、　　ＹＡ
ＪＩＭＡ　　、　　Ｄ、　　ＷＥＢＢ及びＲ，ＷＩＮＣ
ＨＵＲＣＨｉｎ　：　ＢＥＥＲ５Ｒ，Ｆ、　、　ＢＲＡ
ＵＮ　Ｗ、。

ｒＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｐｏ
ｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　　Ｊ　Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ
　：　Ｓｐｒｉｎｇｌｅ−Ｖｅｒｌａｇ、第１３９−１
５６頁（１９７１年）。

・　ＲＥＤＵＣＥＤ　　ＩＭＣＩＤＩ！ＮＣＥ　　ＯＦ
　　５ＰＯＮＴＡＮＥＯＵＳ　　ＭＡＭＭ八ＲＹへＵＭ
ＯＲ３ＩＮ　Ｃ３Ｈ／Ｈｅ　ＭＩＣＩＩ！　ＡＦＴＥＲ
ＴＲＥＡＴＭＥＮＴ　ＷＩＴＩＩＰＯＬＹＡＤＥＮＹＬ
ＡＴＥ−ＰＯＩＪＲＩＤＹＬＡＴＥ−Ｆ、ＬＡＣＯＵＲ
、Ｇ。

ＤＥＬＡＧＥ及びＣ，ＣＨＩＡＮＡＬＥ　−ｒｓｃｉｅ
ｎｃｅ　Ｊ第１８７巻第２５６−２５７頁（１９７５年
）。

・ＰＯＬＹ　Ａ−ＰＯＬＹ　Ｕ　ＡＳ　ＡＮ　ＡＤＪＵ
ＮＣＴ　Ｔｏ　５ＵＲＧＥＲＹ　　ＩＮＴＨＥ　ＴＲＥ
ＡＴＭｔ！ＩＴ　ＯＦ　５ＰＯＮＴＡＮＩＩ！Ｏ３ＭＵ
ＲＩＮＨＭＡＭＭＲＹＡＤＥＮＯＣＡＲＣＩＮＯＭＡ−
Ｆ、　ＬＡＣＯ［ＩＲ、Ｊ、　ＬＡＣＯＵＲ及びＡ。

５ＰＩＲＡ　　−ｒＲｅｃｅｎｔ　Ｒｅ５ｕｌｔｓ　　
ｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　」第４７巻
第３５２−３５６頁。

・ＰＯＬＹＡＤＥＮＹＬＩＣ−ＰＯＬＹＵＲＩＤＹＬＩ
ＣＡＣＩＤ　　：　　ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬＲＨＳＰＯ
ＮＳＲ−ＭＯＤＩＦＹＩＮＧ　ＡＣＴＩＶＩＴＩＥＳ　
　ＩＮ　ＭＩＣＥ、ＩＮＶＩＶＯ０ＲＧＡＮ　ＤＩＳＴ
ＲＩＢＵＴＩＯＮ　ＡＮＤ　ＰＨＡＲＭＡＣＯＫＩＮＥ
ＴＩＣＳＩＮ　ＲＡＢＢＩＴＳ−Ｆ、　　ＬＡＣＯＵＲ
−ｒＪ、　　Ｂｉｏｌ、　　Ｒｅ５ｐ。

Ｍｏｄｉｒ、　」、第４巻第４９０−４９４頁（１９８
５年）・　Ａ　　ＰＨＡＳＥ　　Ｉ　　ＣＬＩＮＩＣＡ
Ｌ　　ＴＯＬＥＲＡＮＣＨ５ＴＵＤＹ　　ＯＦ　　ＰＯ
ＬＹＡＤＥＮＹＬＩＣ−ＰＯＬＹＵＲＩＤＹＬＩＣＡＣ
ＩＤ　　ＩＮ　ＣＡＮＣｔ！ＲＰＡＴＩＥＮＴＳ−Ｊ、
Ｐ、　　ＤＵＣＲＨＴ　　、　　Ｐ、　　ＣＡＩＬＬｔ
！　　、　　Ｈ，５ＡＮＣＩＩＯ−ＧＡＲＮＩＥＲ。

Ｊ、Ｌ、　ＡＭＩＥＬ、　Ｍ、　ＭＩＣＨＥＬＳＯＮ、
　　Ｒ，Ｇ、　ＨＯＶＡＮＥＳＳＩＡＮ。

Ｊ、に、　ＹＯＵＮ及びＦ、　ＬＡＣＯＵＲ−ｒＪ、　
Ｂｉｏｌ、　Ｒｅ５ｐ。

Ｍｏｄｉｆ、　Ｊ　、第４巻第１２９−１３３頁（１９
８５年）。

ＭｊＬＵ創ｌυＬ友汰 好ましい投与方法は有効成分０．０１〜０．１ｇを含有
する等張性溶液のＩＶ　（静脈内）投与によるものであ
る。毎週の投与は６週間繰り返される。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヌクレオチドの重合体又は共重合体又はそれらの複
   合体の製造法において、下記の諸工程；すなわち、 （ａ）細菌菌株培養物の菌体溶解を行ない、得られた菌
   体溶解液を３種のカラム、すなわ ちイオン交換樹脂を入れた第１のカラムと 疎水性樹脂を入れた第２のカラムと、分子 篩を入れた第３のカラムとに次々に通し、 これらのカラム処理によって、次後の重合 工程に影響を及ぼす物質を含有しないよう に実質的に純粋にしたポリヌクレオチドホ スホリラーゼの溶液を収得する工程を行な い、 （ｂ）前記の工程（ａ）で得られたポリヌクレオチドホ
   スホリラーゼを原料として選択したモ ノヌクレオチドに作用させて重合させる工 程であって、ヌクレオチドの重合の程度を 調節するために段階的に分けて加えられる ＭｇＣｌ＿２の存在下で、通常の緩衝液と０．０６〜０
   ．２ミリモル／ｌの濃度の前記の原料モノヌクレオチド
   とを含有する溶液に対して 約２００〜約７５０単位の前記ホスホリラーゼをｐＨ７
   ．４〜８．６の範囲で約３〜約６日間反応させることか
   らなるヌクレオチド重合体の生 成工程を行ない、 （ｃ）前記の工程（ｂ）で得られたヌクレオチドの重合
   体を分離し且つ洗滌してヌクレオチド の重合体を収得する工程を行ない、更に所 望ならば、 （ｄ）原料として選択した第２のヌクレオチドの重合を
   前記と同じ条件で行なって第２の ヌクレオチド重合体を生成させ、第１及び 第２の生成されたヌクレオチド重合体を選 択してそれらの各々の適当量を水中でＮａＣｌの存在下
   に混合し、得られた２種のヌクレ オチド重合体同士の複合体をエタノール添 加によって最後に沈澱させる工程を行なう ことを特徴とするヌクレオチドの重合体又 は共重合体又はそれらの複合体の製造法。 ２、前記の第１のカラムがＤＥＡＥセファセル又はその
   均等物のようなイオン交換樹脂を収容するカラムである
   請求項１記載の製造法。 ３、前記の第２のカラムがフェニルセファロース又はそ
   の均等物のような疎水性樹脂を収容するカラムである請
   求項１記載の製造法。 ４、前記の第３のカラムがセファクリルＳ３００、セフ
   ァデックス２００又はそれらの均等物のような分子篩を
   収容するカラムである請求項１記載の製造法。 ５、請求項１〜４記載の製造法によって製造されたヌク
   レオチドの重合体又は共重合体又はそれらの複合体。 ６、原料ヌクレオチド類がアデニル酸（ＡＤＰ）及びウ
   リジル酸（ＵＤＰ）である請求項５記載の共重合体。 ７、ポリアデニル酸とポリウリジル酸との比がモル比で
   約５０：５０である請求項６記載の共重合体。 ８、有効成分として請求項５〜７記載の重合体又は共重
   合体又はそれらの複合体を含有する治療剤組成物。