DE3837203A1

DE3837203A1 - Polynucleotide, verfahren zu ihrer herstellung und diese enthaltende arzneimittel

Info

Publication number: DE3837203A1
Application number: DE3837203A
Authority: DE
Inventors: Pierre-Etienne Cha Lassauniere; Acaye Soudhir Colote
Original assignee: Societe de Conseils de Recherches et dApplications Scientifiques SCRAS SAS
Current assignee: Ipsen Pharma SAS
Priority date: 1987-11-02
Filing date: 1988-11-02
Publication date: 1989-05-11
Also published as: GB8725606D0; BE1001938A4; GB2211847B; JPH0712316B2; NO884865L; MY103445A; KR0134624B1; FR2622451B1; FI95135B; AU2442988A; GB2211847A; FR2622586A1; TNSN88113A1; GR1000715B; AU610792B2; IE61610B1; DK607388A; FI885045A0; DK607388D0; ZA888180B

Description

Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Polynucleotiden (Homo- und Copolynucleotide) und deren Komplexen. Ferner betrifft die Erfindung die gemäß diesen Verfahren erhaltenen neuen Produkte.

Nach bekannten Verfahren ließen sich bisher verschiedene Polynucleotide herstellen, die jedoch im allgemeinen pyrogen oder mehr oder weniger toxisch sind, was auf die Anwesenheit von Verunreinigungen oder Stoffen, die bei den aufeinanderfolgenden Verfahrensstufen zur Herstellung der gewünschten Produkte auftreten, zurückzuführen ist. Derartige Polnucleotiode stellen Adjuvantien auf verschiedenen therapeutischen Gebieten und insbesondere bei der Behandlung von Krebs und bestimmten bakteriellen und viralen Erkrankungen sowie zur Herstellung von Impfstoffen dar. Somit betrifft die Erfindung auch Arzneimittel mit einem Gehalt an diesen verbesserten Polynucleotiden als Wirkstoffe.

Im allgemeinen werden Polynucleotide erhalten, indem man eine Polynucleotid-phosphorylase auf das geeignete monomere Nucleotid einwirken läßt. Die verschiedenen möglichen Monomeren, wie ADP, CDP, GDP, IDP und UDP, werden nach bekannten Verfahren erhalten. Polynucleotid-phosphorylase läßt sich ebenfalls nach bekannten Verfahren erhalten, wobei man von einer Bakterienkultur ausgeht, eine Lysis der in der Kultur enthaltenen Bakterien durchführt und anschließend die Polynucleotid-phosphorylase aus dem nach der Lysis erhaltenen komplexen Medium extrahiert. In diesem Medium finden sich verschiedene Enzyme, wie Kinasen, Phosphatasen, Nucleasen, Diesterasen und dgl., die alle bei der anschließenden Polymerisation des ausgewählten monomeren Nucleotids mit der Polynucleotid-phosphorylase konkurrieren können. Die Anwesenheit der verschiedenen nicht-erwünschten Enzyme führt zu parallelen unerwünschten Reaktionen und zu einem teilweisen Abbau des zu polymerisierenden Monomeren sowie des gebildeten Polymeren.

Aus diesen Gründen sind die meisten der auf diese Weise erhaltenen Polynucleotide in Bezug auf ihre Toxizität und/oder ihre pyrogenen Eigenschaften nachteilig. Obgleich es im Kleinmaßstab für Analysenzwecke oder für begrenzte wissenschaftliche Untersuchungen möglich ist, Polynucleotid-phosphorylase in annehmbar reinem Zustand herzustellen, ließ sich dies in großtechnischem Maßstab zu annehmbaren Kosten nicht durchführen.

Aufgabe der Erfindung ist es, Polymere von Nucleotiden herzustellen, die sich durch ihre hohe Reinheit auszeichnen und somit wegen ihrer geringen toxischen und pyrogenen Wirkung besonders gut als Arzneimittel geeignet sind.

Der Gegenstand der Erfindung ist in den Patentansprüchen definiert.

Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß es unter großtechnisch annehmbaren Bedingungen möglich ist, im wesentlichen reine Homopolymere oder Copolymere von Nucleotiden oder Komplexe von Polynucleotiden oder nahen Analogen dazu herzustellen, indem man als Polymerisationsmittel anstelle der gemäß verschiedenen herkömmlichen Verfahren erhaltenen Präparate von Polynucleotid-Phosphorylase ein hochgereinigtes Enzym verwendet, das frei von Verunreinigungen ist, die zu unerwünschten Reaktionen führen. Beispiele für nahe Analoge von Nucleotiden sind 6-Hydroxyalkylderivate von ADP oder 5-Halogen-, 5-OH-, oder 5-Methylderivate von UDP.

Es wurde insbesondere festgestellt, daß nach Züchtung eines Bakterienstammes und nach Lysis der auf diese Weise erhaltenen Kultur das gebildete Medium anschließend über drei Säulen zu geben ist, wobei die erste ein Ionenaustauscherharz, wie DEAE-Sephacel oder ein äquivalentes Produkt dazu, die zweite Säule ein hydrophobes Harz, wie Phenyl-Sepharose oder ein äquivalentes Produkt dazu, und die dritte Säule ein Molekularsieb, wie Sephacryl S300, Sephadex 200 oder ein äquivalentes Produkt dazu, enthält.

Das aus der dritten Säule erhaltene Produkt enthält im wesentlichen, aber nicht ausschließlich Polynucleotid-phosphorylase mit anderen Spurensubstanzen die aber frei von einem Einfluß auf das weitere Polymerisationsverfahren sind.

Ist die Herstellung eines Homopolymeren beabsichtigt, so wird die erhaltene Polynucleotid-phosphorylase zur Polymerisation des ausgewählten Monomeren in Gegenwart üblicher Mittel verwendet.

Ist die Herstellung eines Copolymeren beabsichtigt, so wird das ausgewählte Monomer durch ein Gemisch ersetzt, das in geeigneten Mengenanteilen die ausgewählten Monomeren enthält. Diese Copolymeren werden als Poly A/Poly U bezeichnet.

Ist die Herstellung eines Komplexes beabsichtigt, so wird die gleiche Polymerisation mit den einzelnen geeigneten Monomeren durchgeführt, und die erhaltenen Homopolymeren werden in einem geeigneten Mischungsverhältnis in Gegenwart von NaCl vermischt und mit Äthanol gefällt.

Gemäß einem wesentlichen Merkmal der Erfindung wird die Polymerisation der gewählten Monomeren oder des gewählten Gemisches von Monomeren unter Bedingungen durchgeführt, die von der üblichen Verfahrensweise abweichen. Insbesondere werden Konzentrationen angewandt, die weit über den üblichen Werten (etwa 30- bis 100fach und vorzugsweise etwa 50fach) liegen. Ferner wird die Polymerisation unter kontrollierter Zugabe von MgCl₂, unter Kontrolle des pH-Werts von 7,4 bis 8,6 und während Reaktionszeiten von etwa 3 bis etwa 6 Tagen durchgeführt.

Die erhaltenen Polymeren oder Copolymeren weisen einen Molekulargewichtsbereich auf, der Komplexe mit Molekulargewichten von etwa 250 000 bis etwa 1 500 000 bei einer homogenen Polymerisationsrate und einer Polymerisationsausbeute bis zu 90 bis 95% ergibt.

Nachstehend wird die Erfindung anhand einer Beschreibung von fünf aufeinanderfolgenden Stufen näher erläutert. Diese Stufen führen von einer Ausgangsbakterienkultur (in diesem Fall E. coli, jedoch eignen sich auch andere Bakterien) zu einem Komplex von Poly A/Poly U.

Stufe 1 Züchtung von E. coli B 1/5

Die Kultur wird in "stabs" bei Umgebungstemperatur gehalten.

Das Kulturmedium enthält pro Liter 10 g NaCl, 10 g Trypticase und 5 g Hefeextrakt. Nach 45minütiger Sterilisation bei 110°C wird eine getrennt davon sterilisierte Glukoselösung mit einem Gehalt an 2 g/Liter zugesetzt. Vorkulturen werden mit 10 ml und anschließend mit 200 ml Medium zur Herstellung einer 10 Liter-Kultur hergestellt.

Das Kulturmedium wird unter Belüftung mit 8 Liter Luft/Minute mit einer Umdrehungsgeschwindigkeit von 470 U/min gerührt. Die Verdopplungszeit bei δ 600 beträgt 30 Minuten. Die Bakterien werden bei Erreichen einer optischen Dichte von 6 bei 600 nm geerntet. Man erhält etwa 8 g Bakterien pro Liter Kulturmedium. Der pH-Wert des Gärmediums wird durch Zugabe von 2n NH₄OH auf 6,5 bis 6,8 eingestellt. Sofern die Kultur nicht sofort verwendet wird, wird sie bei -20°C gelagert.

Stufe 2 Lysis der Bakterien

Puffer A:
5×10^-2 m Tris-HCl, pH-Wert 7,9 (bei 25°C) mit einem Gehalt an 2×10^-3 m EDTA, 0,233 m NaCl (13,63 g/Liter) und 5% Glycerin (50 ml/Liter)
Puffer B:
10^-2 m Tris-HCl, pH-Wert 7,9, mit einem Gehalt an 10^-4 m EDTA, 0,2 m NaCl und 5% Glycerin.
165 g Bakterien (20 Liter Kulturmedium)

Unmittelbar vor der Verwendung werden 0,4 ml Dithiothreit (DTT; 0,1 m (15,4 mg/ml)) zu 400 ml Puffer A bei Raumtemperatur gegeben. Anschließend werden 28 µl Mercaptoethanol, 45 mg Lysozyme und 14 mg Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), gelöst in 4 ml Äthanol, zugesetzt. Die eingefrorenen Bakterien (165 g) werden in einem Mischer in diesem Medium (Endtemperatur ca. 10°C) dispergiert. Man läßt die Suspension unter gelegentlichem Mischen auf 15°C erwärmen (etwa 20 Minuten), setzt dann 272 mg Natriumdesoxycholat unter Mischen und hierauf 4 mg Desoxyribonuclease (DNAase) zu. Das Lysisgemisch wird 20 Minuten unter gelegentlichem Mischen und bei Einstellen der Temperatur auf 20°C stehengelassen. Sodann wird das Gemisch mit 400 ml Puffer B und 0,4 ml 0,1 m DTT unter Mischen versetzt. Die Suspension wird 1 Stunde bei 5°C und 16 000 g (10 000 U/min in einer Sorvall-Zentrifuge) zentrifugiert.

DNAase: 50 679 Dornase-Einheiten/mg
Lysozyme: 25 000 Einheiten/mg.

Der Überstand (ca. 900 ml) der Zentrifugation wird mit destilliertem Wasser auf 1 Liter verdünnt und durch Zugabe von 280 g Ammoniumsulfat (45% Sättigung) bei 4°C unter Rühren ausgefällt. Das Gemisch wird 2 Stunden bei 4°C belassen. Protein wird durch 30minütige Zentrifugation bei 16 000 g und 5°C gewonnen. Der Niederschlag (die Überstände werden verworfen) wird in 150 ml 10^-2 m Tris-HCl vom pH-Wert 7,8 gelöst. Die Lösung wird 20 Minuten bei 16 000 g zur Abtrennung von unlöslichem Material zentrifugiert. Der Überstand wird gegen 2 Liter 4×10^-2 n Tris-HCl vom pH-Wert 7,8 unter viermaligem Wechseln der Dialyseflüssigkeit 18 Stunden bei 4°C dialysiert. Anschließend wird die Lösung 1 Stunde bei 16 000 g zur Abtrennung von unlöslichem Material zentrifugiert. Man erhält 300 ml Produkt vom pH-Wert 7,8, Leitfähigkeit <7,0 mS.

Stufe 3 Reinigung von Polynucleotid-phosphorylase aus E. coli B 1/5 (PNPase)

1. Die vorstehenden Überstände werden auf eine Säule der Abmessungen 40×3 cm mit einem Gehalt an 280 ml DEAE-Sephacel, die mit 0,1 m Tris-HCl vom pH-Wert 7,4 bei 4°C äquilibriert ist, aufgesetzt. Die Elution der Säule erfolgt mit einem Gradienten von 1 Liter 0,1 m Tris-HCl vom pH-Wert 7,4 bis zu 1 Liter 0,1 m Tris-HCl in 0,4 m NaCl vom pH-Wert 7,4. Man sammelt Fraktionen von 10 ml Volumen. Ein Maximum an Diesterase-Aktivität wird eluiert, wonach sich ein zweites Maximum an Polynucleotid- phosphorlyase-Aktivität anschließt, die in den Fraktionen 105 bis 125 (eluiert bei 0,21 m NaCl und 0,1 m Tris- HCl) lokalisiert ist. Das Volumen beträgt 210 ml bei 107 Einheiten/ml, was insgesamt 22 470 Enzymeinheiten ergibt.

2. Die erhaltene Lösung wird durch Zugabe von 28 g Ammoniumsulfat unter Rühren auf eine Ammoniumsulfatkonzentration von 0,5 m eingestellt und anschließend über eine mit 60 ml Phenyl- Sepharose beschickte Säule der Abmessungen 19×2 cm, die mit einem Puffer mit einem Gehalt an 0,05 m (NH₄)₂SO₄ und 0,05 m Tris-HCl vom pH-Wert 7,4 equilibriert worden ist, aufgesetzt. Die Säule wird mit etwa 20 ml 0,5 m (NH₄)₂SO₄ in 0,1 ml Tris- HCl vom pH-Wert 7,4 gewaschen und sodann mit einem umgekehrten Gradienten von 250 ml 0,4 m Tris-HCl vom pH-Wert 7,8 in 0,1 m (NH₄)₂SO₄ bis 3×10^-3 m Tris-HCl vom pH-Wert 7,8 bei 4°C eluiert. Fraktionen von etwa 10 ml werden gewonnen. Die aktiven Fraktionen werden gruppenweise eingeteilt. Man erhält 55 ml Produkt mit 355 Einheiten pro ml. Die Gesamtmenge beträgt 19 525 Enzymeinheiten.

3. 20 g Ammoniumsulfat werden zur Ausfällung von Protein (55% Sättigung) unter Rühren zugesetzt. Der Niederschlag wird 1 Stunde bei 4°C stehengelassen und sodann 15 Minuten bei 16 000 g zentrifugiert. Der Rückstand wird in einer möglichst geringen Menge eines Puffers mit einem Gehalt an 0,1 m NaCl und 0,05 m Tris-HCl vom pH-Wert 7,4 (etwa 10 ml) gelöst. Die Lösung wird auf eine mit 350 ml Sephacryl S300 gepackte Säule der Abmessungen 50×3 cm, die mit einem Puffer mit einem Gehalt an 0,1 m NaCl und 0,05 m Tris-HCl vom pH-Wert 7,4 äquilibriert worden ist, aufgesetzt. Das Enzym wird mit dem gleichen Puffer eluiert. Fraktionen von etwa 10 ml Volumen werden gewonnen. Die aktiven Fraktionen (13 bis 17) werden vereinigt. Man erhält 60 ml Produkt mit einem Gehalt an 312,5 Einheiten/ml. Die Gesamteinheitenzahl beträgt 18 750. 540 Einheiten. δ 280.

Das Enzym wird durch Zugabe von 26 g (NH₄)₂SO₄ (65% Sättigung) gefällt. Die Suspension wird bei -30°C gelagert.

Stufe 4 Herstellung von Polymeren

100 g ADP-Na₂ (oder 100 g UDP-Na₃) werden in etwa 600 ml Wasser gelöst und in einen 2 Liter fassenden Kolben gegeben, der folgende Bestandteile enthält:

200 ml 1 m Tris-HCl vom pH-Wert 8,3
250 ml 1 m Ammoniumacetat
20 ml 0,1 m EDTA vom pH-Wert 8,0
100 ml 1 m MgCl₂

Das Volumen wird mit Wasser auf 2 Liter aufgefüllt. Der pH- Wert wird bei Raumtemperatur mit 5 n NH₄OH auf 8,6 eingestellt.

Die Oberfläche wird mit einer Schicht Toluol abgedeckt. Die verwendeten Nucleosid-diphosphate sollen frei von verunreinigenden Metallen, wie Fe³⁺ oder Cu²⁺n, sein.

Eine Aliquotmenge des vorstehenden Gemisches (80 ml) wird mit 200 Enzymeinheiten und 2 ml eines vorstehenden Präparats von poly A (oder poly U) als Primer versetzt. Die Lösung wird 2 Stunden bei 37°C inkubiert und sodann in den Hauptansatz, der bei 37°C gehalten wird, übertragen. Nach 4 Stunden werden weitere 300 Enzymeinheiten zugesetzt und die Inkubation wird fortgesetzt. Der pH-Wert fällt nach 24 Stunden auf etwa 8,3 und wird durch anschließende Zugabe von 5 n NH₄OH auf 8 bis 8,3 gehalten. Es ergeben sich insgesamt 500 Enzymeinheiten, d. h. 5 Einheiten pro 1 g. Ergibt sich ein Polymerisationsgrad von weniger als 25% pro 24 Stunden so kann weiteres Enzym zu geeigneten Zeitpunkten zugesetzt werden, um die Geschwindigkeit zu erhöhen.

Weitere Mengen von 25 ml 1 m MgCl₂ werden unter heftigem Rühren bei einem Polymerisationsstadium von 30%, 55% und 75% zugesetzt (insgesamt 125 mMol Mg pro 200 nMol ADP oder UDP), wobei der pH-Wert auf 8,0 bis 8,3 gehalten wird (gemessen bei 37°C). Nach 3 bis 4 Tagen soll der Polymerisationsgrad 80 bis 90% betragen.

Durch stufenweise Zugabe des MgCl₂ wird das Verhältnis von freiem ADP (UDP) zu Mg bei den vorerwähnten Polymerisationsgraden auf etwa 2 gehalten.

Am Ende der Inkubationsdauer wird das Gemisch zentrifugiert, um ausgefälltes Ammoniummagnesiumphosphat zu entfernen. Der Niederschlag wird mit wenig Wasser gewaschen. Die vereinigten Überstände werden zur Herstellung des poly A-poly U-Komplexes verwendet.

Die optimalen Polymerisationsbedingungen betragen 8,0 bis 8,3 bei stufenweiser Zugabe von MgCl₂ und einer ausreichenden Enzymmenge, um eine Polymerisationsgeschwindigkeit von etwa 30% pro Tag zu gewährleisten. Höhere Inkubations-pH-Werte (8,3-8,6) ergeben kleinere Polymere. Die Zugabe des gesamten Mg zu Beginn der Inkubation ergibt ebenfalls kleinere Polymere.

Stufe 5 Herstellung von poly A-poly U-Komplex

Der gesamte Gehalt an Nucleotid in den Lösungen wird durch 5minütige Hydrolyse des Inkubationsgemisches in 0,1 n NaOH bei 100°C unter Anwendung einer 1000fachen Verdünnung für poly A und einer 500fachen Verdünnung für poly U bestimmt (z. B. 10 µl poly A oder 20 µl poly U in 10 ml 0,1 n NaOH oder genauer durch Zwischenverdünnung von 100 µl A und 200 µl U). Die Absorption bei 260 nm wird gemessen. Die Molarität wird unter Verwendung folgender Werte bestimmt.

Die Polymerkonzentrationen werden aus dem gesamten Nucleotidgehalt und der prozentualen Polymerisation berechnet. Anschließend werden die Volumina für ein stöchiometrisches Verhältnis A/U=1 : 1 berechnet. poly U in einem 10 Liter fassenden Kolben wird mit 200 ml 25% wäßrigem NaCl und anschließend mit der Lösung von poly A versetzt. Die Lösungen werden gründlich vermischt (Endkonzentration an NaCl ca. 0,18 m) und anschließend miindestens 3 Stunden bei 4°C stehengelassen.

Sodann wird ein gleiches Volumen an Äthanol unter Rühren zugesetzt, um poly A-poly U- auszufällen. Das Gemisch wird 1 Stunde bei 4°C stehengelassen. Der Komplex wird durch Zentrifugation in einer Sorvall 3 B-Zentrifuge (1 Liter fassende Zentrifugengefäße; 3 Minuten bei 5000 U/min) gewonnen und sodann mit 2 Liter 55% Äthanol gewaschen. Der Rückstand wird in etwa 4 Liter reines Wasser gelöst und zur Entfernung von Spurenmengen an Ammoniummagnesiumphosphat zentrifugiert. Der klare Überstand wird mit 200 ml 25% NaCl versetzt. Die Lösung wird mindestens 3 Stunden bei 4°C stehengelassen.

Der Komplex wird sodann nochmals durch Zugabe eines gleichen Volumens an Ethanol unter Rühren ausgefällt, durch Zentrifugieren gewonnen, mit 55% Ethanol (etwa 2 Liter), mit 75% Ethanol und zweimal mit 96% Ethanol gewaschen und sodann unter vermindertem Druck getrocknet. Die Ausbeute beträgt etwa 110 bis 120 g.

In der Regel muß bei der Fällung des Komplexes mit 50% Ethanol NaCl (0,15 m bis 0,02 m) vorhanden sein. Zum Waschen muß mindestens 55% wäßriges Ethanol verwendet werden, da der ausgefällte Komplex durch 50% Ethanol gelöst wird.

Toxizität

LD₅₀-Werte werden an Mäusen und Ratten bei intraperitonealer und intravenöser Verabreichung bestimmt. Weder bei Mäusen noch bei Ratten ergeben sich bei der maximalen intravenösen Verabreichung Todesfälle. Auch bei intraperitonealer Verabreichung kommt es bei den Ratten zu keinen Todesfällen, während der LD₅₀-Wert bei intraperitonealer Verabreichung bei Mäusen etwa 3 g/kg beträgt.

Übliche Tests auf pyrogenes Verhalten verlaufen vollkommen negativ.

Pharmakologie

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Polymeren und Copolymeren sind im Prinzip bekannt, wurden jedoch bisher auf großtechnischem Wege nie in ausreichend reinem Zustand erhalten. Die bisherigen pharmakologischen Untersuchungen wurdne an Proben von speziell gereinigten Produkten durchgeführt, die nicht unter vernünftigen wirtschaftlichen Bedingungen zur Verfügung standen.

Darreichungsformen und Posologie

Bevorzugt wird eine intravenöse Verabreichung einer isotonen Lösung mit einem Gehalt an 0,01 bis 0,1 g Wirkstoff. Eine Injektion in einwöchigem Abstand wird vorzugsweise 6 Wochen lang wiederholt.

Bibliographie

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"Reduced Incidence of Spontaneous Mammary Tumors in C3H/He Mice after Treatment with Polyadenylate-Polyuridylate", F. Lacour, G. Delage und C. Chianale, Science, (1975) Bd. 187, S. 256-257;

"Poly A - Poly U as an Adjunct to Surgery in the Treatment of Spontaneous Murine Mammary Adenocarcinoma", F. Lacour, J. Lacour und A. Spira - Recent Results in Cancer Research, Bd. 47, S. 352-356;

"Polyadenylic-Polyuridylic Acid : Biological Response- Modifying Activities in Mice. In Vivo Organ Distribution and Pharmacokinetics in Rabbits" - F. Lacour - J. Biol. Resp. Modif., Bd. 4 (1985), S. 490-494; "A Phase I Clinical Tolerance Study of Polyadenylic- Polyuridylic Acid in Cancer Patients", J. P. Ducret, P. Caille, H. Sancho-Garnier, J. L. Amiel, M. Michelson, R. G. Hovanessian, J. K. Youn und F. Lacour - J. Biol. Resp. Modif. (1985), Bd. 4 S. 129-133.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Polymeren von Nucleotiden, gekennzeichnet durch folgende Stufen:

- Induzieren der Lysis einer Bakterienstammkultur und aufeinanderfolgendes Durchleiten des erhaltenen Mediums durch folgende drei Säulen:
eine erste Säule mit einem Ionenaustauscherharz,
eine zweite Säule mit einem hydrophoben Harz und
eine dritte Säule mit einem Molekularsieb,
wobei die Behandlung zu einer Polynucleotidphosphorylase- Lösung führt, die im Hinblick auf Substanzen, die ein anschließendes Polymerisationsverfahren beeinflussen können, im wesentlichen rein ist,
- Behandeln des gewählten Nucleotids mit der erhaltenen Phosphorylase, indem man etwa 200 bis etwa 700 Phosphorylase- Einheiten mit einer Lösung, die übliche Puffer und das gewählte Mononucleotid in einer Konzentration von 0,06 bis 0,2 mMol/ml enthält, in Gegenwart von MgCl₂, das zur Steuerung des Polymerisationsgrads stufenweise zugesetzt wird, etwa 3 bis etwa 6 Tage umsetzt, wobei man den pH-Wert auf 7,4 bis 8,6 hält,
- Abtrennen und Waschen des erhaltenen Polymeren, gegebenenfalls Durchführung der Polymerisation eines weiteren ausgewählten Nucleotids unter den vorstehenden Bedingungen und in diesem Fall Vermischen geeigneter Mengen der einzelnen ausgewählten Polymeren in Wasser in Gegenwart von NaCl vermischt und schließlich Ausfällung des erhaltenen Komplexes durch Zugabe von Ethanol.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Säule als Ionenaustauscherharz DEAE-Sephacel oder ein äquivalentes Produkt enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Säule als hydrophobes Harz Phenyl-Sepharose oder ein äquivalentes Produkt enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die dritte Säule als Molekularsieb Sephacryl S300, Sephadex 200 oder ein äquivalentes Produkt enthält.

5. Polymer oder Copolymer von Nucleotiden, erhältlich nach einem Verfahren der Ansprüche 1 bis 4.

6. Copolymer nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Ausgangsnucleotiden um Adenylsäure und Uridylsäure handelt.

7. Copolymer nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Molanteile von Polyadenylsäure und Polyuridylsäure etwa 50/50 betragen.

8. Arzneimittel, enthaltend als Wirkstoff ein Polymer oder Copolymer nach einem der Ansprüche 5 bis 7.