DE3045781A1

DE3045781A1 - Verfahren zur herstellung eines antitumormittels

Info

Publication number: DE3045781A1
Application number: DE19803045781
Authority: DE
Inventors: Yoshiaki Osaka Ikeda; Shintaro Osaka Inoue; Seiichi Iwamoto; Teruo Sawada; Mikio Sotomura; Akira Tondabayashi Suzuki
Original assignee: Kanebo Ltd
Current assignee: Kanebo Ltd
Priority date: 1979-12-04
Filing date: 1980-12-04
Publication date: 1982-12-02
Also published as: IT1134561B; JPS5679622A; FR2471189B1; IT8026384A0; JPS6234729B2; GB2066069A; FR2471189A1; US4328218A; GB2066069B

Description

Die Erfindung betrifft ein neues und sehr gutes Verfahren zur Herstellung eines Antitumormittels, welches eine Zellkomponente von Streptococcus pyogenes (nachstehend als St. pyogenes abgekürzt) mit einer Antitumoraktivität enthält. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung eines sehr guten Antitumormittels, das eine Zellkomponente von St. pyogenes mit einer sehr guten Antitumoraktivität und weniger Nebeneffekten enthält und das eine sehr gute Lagerbeständigkeit hat.

In den letzten Jahren ist St. pyogenes kultiviert worden. Aus seinen Zellen (nachstehend als Kulturzellen oder lebende Bakterien bezeichnet) hergestellte Antitumormittel haben ihren Eingang in die Therapie gefunden. Präparate dieser Art müssen jedoch eine hohe Antitumoraktivität haben und zur gleichen Zeit ist es notwendig, daß sie keine lebenden Bakterien, die pathogene Bakterien sind, enthalten.

Es sind schon einige Verfahren vorgeschlagen worden, die diesen Anforderungen genügen sollen. Das repräsentativste Beispiel eines solchen Verfahrens ist ein Verfahren, bei dem die Kulturzellen in wäßrigen Lösungen von Salzen, die Penicillin enthalten, bei 30 bis 38⁰C gehalten werden und anschließend eine Lyophilisierung, wie das Penicillin enthalten ist, durchgeführt wird [Japanese Journal of Experimental Medicine, Band 36, Seiten 161 bis 174 (1966)]. Nach diesem Verfahren hergestellte Präparate haben jedoch solche Nachteile, wie die Nebenwirkungen des darin enthaltenen Penicillins (z.B. Schockzustände, Hautentzündungen, Schmerzen zur Injektionszeit und dergleichen), wozu noch kommt, daß kaum gesagt werden kann, daß ihre Antitumoraktivität zufriedenstellend ist.

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Obwohl Präparate dieser Art vorzugsweise kein Penicillin enthalten sollten, sind Penicillin enthaltende Präparate immer noch im praktischen Gebrauch. Der Grund hierfür ist, daß, wenn das Penicillin nach der Penicillinbehandlung der KuItürzellen entfernt wird, nur ein Präparat erhalten wird, dessen Antitumoraktivität erniedrigt ist (vgl. Vergleichsbeispiel 1 in der folgenden Tabelle I).

Es wurden nun verschiedene Wege zur Herstellung von verbesserten und sehr guten Antitumorpräparaten, d.h. Präparaten mit einer verbesserten Antitumoraktivität, die von Nebenwirkungen, die von lebenden Bakterien und Penicillin und dergleichen herrühren, frei sind, untersucht. Es wurde nun ein Verfahren aufgefunden, durch das nicht nur das obige Ziel erreicht tfird, sondern durch das auch überraschenderweise sehr gute Präparate mit einer hohen Lagerungsbeständigkeit erhalten werden können.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren geht man so vor, daß man die Kulturzellen einer Pasteurisierungsbehandlung (erste Stufe) und einer Penicillinbehandlung (zweite Stufe) unterwirft. Daran schließt sich eine primäre Lyophilisierung (dritte Stufe) an, wodurch zunächst Zwischenpräparate erhalten werden. Diese Zwischenpräparate werden hierauf einer Penicillinentfernungsbehandlung (vierte Stufe) und sodann einer sekundären Lyophilisierung (fünfte Stufe) unterworfen, wodurch die fertigen Präparate bzw. Arzneimittel erhalten werden.

Die als Ausgangsmaterial verwendeten Kulturzellen werden dadurch erhalten, daß man ot. pyogenes kultiviert. Diese Kultivierung erfolgt nach einem bekannten Verfahren (JA-PS 43-6690), bei dem ein Kulturmedium (z.B. eine Nährbrühe) verwendet wird, das keine fermentierbaren Kohlenstoffquellen

enthält, oder nach einen Verfahren (JA-OS 55-61792; vgl. das untenstehende Versuchsbeispiel), bei dem absichtlich fermentierbare Kohlenstoffquellen zu dem Kulturmedium gegeben werden und St. pyogenes durch Einstellung des pH-Werts des Kulturmediums auf 5,6 bis 7,5 kultiviert wird.

Als St. pyogenes können bei dem erfindungsgemäßen Verfahren Stämme verwendet werden, die zu den bekannten St. pyogenes gehören. Beispiele hierfür sind St. pyogenes ATCC Nr. 21060, St. pyogenes ATCC Nr. 21059 (hinsichtlich dieses Stammes wird auf den ATCC-Katalog der Stämme I (197S) verwiesen), St. pyogenes HD S-43, St. pyogenes HD T-3 (hinsichtlich dieses Stammes v.drd auf den JFCC-Katalog der Kulturen (1979) verwiesen) und dergleichen. Diese Stämme sind alle der Öffentlichkeit zugänglich.

Zellen, die durch Kultivierung vervielfacht worden sind, werden durch herkömmliche Verfahrensweisen, z.B. durch Zentrifugierung, gesammelt und gegebenenfalls in einem geeigneten Lösungsmittel (wie t.'asser, physiologischer Kochsalzlösung und dergleichen) gereinigt. Unter Verwendung dieser Kulturzellen werden die erste Stufe bis zu der fünften Stufe wie folgt durchgeführt:

Zur Pasteurisierungsbehendlung (erste Stufe) sind alle Maßnahmen geeignet, solange die lebenden Bakterien im wesentlichen abgetötet werden, ohne daß die Antitumoraktivität beeinträchtigt wird. Im Hinblick auf den Effekt und die Einfachheit des Verfahrens wird jedoch ein Verfahren am meisten bevorzugt, bei dem die Kulturzellen mit Hydroperoxid oder einem einwertigen Alkohol behandelt werden.

Bei Verwendung von Hydroperoxid werden die Kulturzellen beispielsweise in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert.

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Nach Zugabe von wäßrigem Hydroperoxid in einer Menge von 1/20 bis 1/3, vorzugsweise 1/15 bis 1/5 (Volumen/ Volumen) der Suspension,

so daß beispielsweise die Suspension 10% Hydroperoxid enthält, wird die Suspension beispielsweise bei -5 bis 10⁰C, vorzugsweise 0 bis 5⁰C, 10 bis 120 min, vorzugsweise 20 bis 40 min gehalten. Die verwendete Konzentration des Hydroperoxids ist nicht auf 10%, wie oben genannt, begrenzt. Jede Konzentration ist geeignet, wenn die Hydroperoxidmenge in dem oben angegebenen Bereich bezüglich der Zeilsuspension bleibt.

Bei Verwendung eines einwertigen Alkohols wird diese Stufe so durchgeführt, daß man die Kulturzellen in innigen Kontakt mit dem einwertigen Alkohol bringt, was beispielsweise durch Zugabe des einwertigen Alkohols zu den Kulturzellen oder der physiologischen Kochsalzlösung zu der Suspension der Kulturzellen geschehen kann.

Geeignete Alkohole sind z.B. einwertige Alkohole, vorzugsweise C.-C.p-sliph^ischö Alkohole und Thioalkohole. Einzelbeispiele hierfür sind Methylalkohol, Äthylalkohol, n-Propylalkohol, Isopropylalkohol, η-Butylalkohol, sek.-Butylalkohol, tert.-Butylalkohol, n-Amylalkohol, sek.-Amylalkohol, tert.-Amylalkohol, Isoamylalkohol, n-Hexylalkohol, n-0ctylalkohol und Benzylalkohol, Hercaptoäthanol etc. Diese Alkohole können entweder für sich oder im Gemisch verwendet v/erden. Von diesen Alkoholen wird Äthylalkohol am meisten bevorzugt.

Wenn unter den genannten einwertigen Alkoholen Alkohole verwendet werden, die in Wasser ohne weiteres löslich sind, dann genügt es, die Kulturzellen in der wäßrigen Lösung zu suspendieren und die Komponenten miteinander zu vermischen. Wenn

jedoch Alkohole verwendet werden, die in Wasser kaum löslich sind, dann wird beispielsweise der Alkohol zu der Suspension der Kulturzellen bzw. der Zellkultur in physiologischer Kochsalzlösung gegeben und die so gebildeten zwei Flüssigkeitsschichten werden durch Rühren gründlich miteinander vermischt. Die Menge öler die Konzentration des Alkohols variiert entsprechend den Beziehungen zwischen der Art des Alkohols, der Behandlv^ngstemperatur und der Behandlungszeit, doch sollte der Alkohol vorzugsweise in der 2- bis 100-fachen Menge (Gewicht/Gewicht) wie diejenige der KuItürzellen und in einer Menge von etwa h% (Gewicht/Volumen) oder mehr, bezogen auf die gesamte Behandlungslösung, verwendet werden.

Bei der Alkoholbehandlung wird die Behandlungstemperatur auf 5O⁰C oder weniger, vorzugsweise -5 bis 45⁰C, am meisten bevorzugt 0 bis 5°C, eingestellt. Dagegen ist die Behandlungszeit keinen besonderen Beschränkungen unterworfen und sie wird gewöhnlich auf 10 bis 60 min eingestellt.

Durch diese Alkoholbehandlung können die lebenden Bakterien abgetötet werden. Außerdem ist es hierdurch möglich, Endpräparate zu erhalten, bei denen insbesondere die Antitumoraktivität erheblich er.iöht ist (vgl. Beispiel 2 bis Beispiel 5 der Tabelle I).

Die Penicillinbehandlung (zweite Stufe) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird dadurch vorgenommen, daß die Zellen, die die Pasteurisierungsbehandlung (erste Stufe) durchlaufen haben, in einem Penicillin enthaltenden wäßrigen Medium suspendiert und bei 10 bis 50°C 10 bis 60 min lang, vorzugsweise bei 35 bis 37°C 20 bis 30 min lang, und sodann bei 40 bis 45°C 20 bis 30 min lang gehalten werden.

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ϋ. S.ii_ri4 j.

Wasser reicht als wäßriges Medium für die zweite Stufe aus, doch können als wäßrige Medien auch Lösungen von Salzen, wie physiologische Kochsalzlösung oder Bernheimer's Basal-Medium (Medium, enthaltend 675 mg Maltose, 6 ml einer folgen wäßri- /ZO gen Kaliumdihydrogenphosphatlösung, mit Natriumhydroxid auf einen pH-^T.v^Tert von 7,0 eingestellt, und 12 ml einer 2£oigen wäßrigen I-iagnesiumsulfatheptahydratlösung und 66 ml destilliertes Wasser, nachstehend als BBH abgekürzt), genannt werden.

Beispiele für Penicilline, die in der zweiten Stufe verwendet werden können, sind Penicillin G, .Ampicillin, Amoxicillin, Phenäthicillin, Dicloxacillin, Hetacillin, Methicillin und die Salze davon.

Diese Penicilline werden in den genannten v/äßrigen Medien aufgelöst. Sie werden in Konzentrationen von 5 mg (Titer)/ml oder mehr, vorzugsweise 10 mg (Titer)/ml oder mehr, am meisten bevorzugt 15 bis 50 mg (Titer)/ml, verwendet.

Das in der zweiten Stufe verwendete Penicillin führt selbst dann, wenn es in einer großen Menge verwendet wird, nicht zu Nebenwirkungen, da das Penicillin in der nachstehend beschriebenen Penicillinentfernungsstufe (vierte Stufe) entfernt wird.

Bei der primären Lyophilisierung .(dritte Stufe) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Zellsuspension (die Penicillin enthält), die durch die Penicillinbehandlung (zweite Stufe) erhalten worden ist, als solche bei vermindertem Druck und im allgemeinen bei einer Temperatur von 2O°C oder weniger, vorzugsweise bei -10⁰C oder weniger, nach den folgenden herkömmlichen Verfahrensweisen lyophilisiert, wodurch ein Zwischenprodukt erhalten wird.

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Das so erhaltene Zwischenprodukt enthält keine lebenden Bakterien und es zeigt eine erhebliche Antitumoraktivität. Wegen seines großen Penicillingehalts hat es jedoch Nebenwirkungen, die dem Penicillin zuzuschreiben sind, und weiterhin fehlt ihm die notwendige Kon.5ervierungsstabilität bzw. Lagerungsstabilität (vgl. Vergl'jichsbeispiel 1 in Tabelle I).

Die Penicillinentfernung (vierte Stufe) des erfindungsgemäßen Verfahrens ist eine Stufe der Entfernung des Penicillins, das in dem Zwischenprodukt enthalten ist, welches in der primären Lyophilisierungsstufe (dritte Stufe) erhalten wird, ohne daß die Antitumoraktivität beeinträchtigt wird.

Es ist nicht notwendig, die Maßnahmen zur Entfernung des Penicillins speziell zu begrenzen, solange die Antitumoraktivität nicht verschlechtert wird. Es wird jedoch ein Verfahren besonders bevorzugt, bei dem das Zwischenprodukt in einem wäßrigen Medium (z.B. 'fässer, physiologischer Kochsalzlösung, BBM und dergleichen) bei einer Temperatur von 30⁰C oder weniger, vorzugsweise -5 bis 5 C, suspendiert wird. Wach Sammeln der Zellen durch Zentrifugieren und gegebenenfalls durch zweimalige oder mehrmalige Wiederholung dieses Vorgangs können Zellen erhalten werden, die kein Penicillin enthalten.

Wenn im Gegensatz zu der Erfindung die Kulturzellen nacheinander einer Pasteurisierungsbehandlung (erste Stufe) und einer Penicillinbehandlung (zweite Stufe) unterworfen werden und wenn dann die so behandelten Kulturzellen einer Penicillinentfernungsbehandlung unterworfen werden und wenn sie sodann lyophilisiert v/erden, d.h. wenn die Kulturzellen in Abwesenheit von Penicillin lyophilisiert werden, dann ist die Antitumoraktivität des so erhaltenen Präparats ausgeprägt verschlechtert (vgl. Vergleichsbeispiel 2 der Tabelle I).

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Λ ϊ

Schließlich wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die sekundäre Lyophilisierung (fünfte Stufe) dadurch durchgeführt, daß die penicillinfreien Zellen, die in der Penicillinentfernungsstufe (vierte Stufe) erhalten worden sind, in einem wäßrigen Medium (z.B. Wasser, physiologische Kochsalzlösung, BBH oder dergleichen), mehr bevorzugt unter gemeinsamer Verwendung eines Stabilisators und/oder eines Trägers, suspendiert werden und daß die resultierende Suspension bei den gleichen Bedingungen, wie sie für die primäre Lyophilisierung genannt wurden, lyophilisiert v/erden, beispielsweise nach den folgenden herkömmlichen Verfahrensweisen wie im Falle der primären Lyophilisierung (dritte Stufe), wodurch das Endprodukt des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten wird.

Beispiele für geeignete Stabilisatoren sind anorganische Antioxidantien, wie Na tr iumthio sulfat, Ilatriumpyrosulfit, Natriumhydrogensulfit und dergleichen, inerte Proteine, wie Gelatine, Albumin und dergleichen, Aminosäuren, wie Methionin, Arginin, Cystin und dergleichen, Polysaccharide, wie Dextran, Dextransulfat, Stärke und dergleichen, sowie Natriumhydrogencarbonat und dergleichen. Diese Stoffe können entweder allein oder miteinander im Gemisch verwendet werden.

Beispiele für geeignete Träger sind disaccharide, wie Haitose und Lactose. Die Erfindung ist jedoch nicht auf die Verwendung dieser Stoffe begrenzt.

Das erfindungsgemäß erhaltene Endpräparat hat eine gute Antitumoraktivität und es ist im Hinblick auf Nebenwirkungen erheblich verbessert, da es keine lebenden Bakterien und kein Penicillin enthält, und da selbst bei langzeitiger Lagerung die Antitumoraktivität nicht verschlechtert wird.

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Das charakteristische Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht, wie oben erwähnt, darin, daß verbesserte und sehr gute Antitumorzubereitungen erhalten werden, indem die Kulturzellen der Reihe nach einer Pasteurisierungsbehandlung (erste Stufe), eir^er Penicillinbehandlung (zweite Stufe), einer primären Lyophilisierung (dritte Stufe), einer Penicillinentfernungsbehandlung (vierte Stufe) und einer sekundären Lyophilisierung (fünfte Stufe) unterworfen werden.

Im Gegensatz dazu haben Produkte, die unter Weglassung der Penicillinentfernungsstufe (vierte Stufe) erhalten worden sind, wie es beispielsweise beim Vergleichsbeispiel 1 der Fall ist, die Webenwirkungen des Penicillins. Dazu kommt noch, daß sie keine Lagerbeständigkeit haben. Weiterhin sind Präparate, die durch Lyophilisierung in Abwesenheit von Penicillin erhalten worden sind, wie es beispielsweise beim Vergleichsbeispiel 2 der Fall ist, sowohl hinsichtlich der Antitumoraktivität als auch der Lagerbeständigkeit schlechter.

Die erfindungsgemäßen Präparate bzw. Zubereitungen können für die Therapie nach den gleichen Verfahrensweisen wie bei herkömmlichen bekannten Zubereitungen verwendet werden. So wird beispielsweise das erfindungsgemäße Präparat in einer physiologischen Kochsalzlösung oder in einer wäßrigen Glucoselösung suspendiert und es kann durch hypodermische, intramuskuläre oder intravenöse Injektion in einer Menge von 0,02 bis 1,0 mg als Zellkomponente über aufeinanderfolgende Tage oder 2- bis 3-mal wöchentlich verabreicht werden.

Die Erfindung wird anhand der Beispiele und Vergleichsbeispiele wie folgt erläutert:

Die Kulturzellen und ihre Suspensionen sowie die Ausgangsmaterialien, die bei den jeweiligen Versuchen verwendet wurden, wurden gemäß dem folgenden Versuchsbeispiel hergestellt.

BAD ORIGINAL

Die akute Toxizitat (LDcq) und die Antitumoraktivität (in vitro und in vivo) der einzelnen in Tabelle I angegebenen Präparate wurden wie folgt gemessen.

Versuchsbeispiel

Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung der Kulturzellen, die als Ausgangsmaterial für die Erfindung eingesetzt werden. 150 ml einer Kulturlösung von Streptococcus pyogenes ATCC 2IO6O, im voraus unter Verwendung einer Nährbrühe (Kyokuto Seiyaku) kultiviert, wurden in ein Kulturmedium (pH-Wert 7,2 bis 7,A-) inokuliert, das dadurch erhalten worden war, daß 60 g Sojapolypeptonbrühe [Ehytone (BBL)] in 2000 ml destilliertem Wasser aufgelöst wurden und daß die Lösung 20 min lang bei 121⁰C dampfsterilisiert wurde.

Sodann wurde eine wäßrige Glucoselösung in einer solchen Weise eingemischt, daß die Glucosekonzentration 0,4% (Gewicht/ Gewicht), bezogen auf die Gesamtkulturlösung, erreichte, und die Zellen wurden 20 h bei 37°C kultiviert, wobei der pH-Wert mit einer 5K-NaOH-Losung auf 6,5 eingestellt wurde. Die Kulturlösung wurde mit Eis abgekütü.t und hierauf wurden die Zellen durch Zentrifugierung in der Kälte gesammelt. Die so erhaltenen Zellen wurden in 80 ml physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. 80 ml der so erhaltenen Suspension enthielten 1400 bis 1600 mg, im Durch .-schnitt 1500 mg (durchschnittliche Zellkonzentration 18,75 mg/ml) Zellen.

Akute Toxizitat

Eine Gruppe von fünf 4 Wochen alten Mäusen (DDY-Stamm, weiblich) wurde getestet.

Die jeweiligen Proben (Präparate) wurden in physiologische Kochsalzlösung eingegeben, um Zellsuspensionen mit den jeweiligen Konzentratioren herzustellen. Die Zellsuspensionen mit den jeweiligen Konzentrationen wurden intravenös in die Schwänze der Mäuse in einer Menge von 0,01 ml pro g Körpergewicht der Maus injiziert. Die LD^Q-Werte wurden nach der Weil-Hethode auf der Fasis der Beobachtungsergebnisse für 7 Tage errechnet.

In-vitro-Antitumoraktivität

Yoshida-Sarkomzellen v.-urden intraperitoneal in Ratten eingeführt. 5 Tage später v.urden die Aszites genommen und 7 min lang bei etwa 120 G zentrifugiert, wodurch Yoshida-Sarkomzellen gesammelt wurden. Diese wurden in einem Eagle-MEM-Kulturmedium, das mit 20% Pferdeserum versetzt worden war, in einer solchen Weise suspendiert, daß die Zellkonzentration 5 x 10 Zellen/ml erreichte, wodurch eine Zelllösung für den Test hergestellt wurde.

Die Probe wurde mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt, wodurch Probelösungen mit verschiedenen Konzentrationen hergestellt wurden. 0,1 ml der jeweiligen Probelösung und 0,9 ml der Zelllösung, die getestet werden sollte, wurden in Reagenzgläschen eingegeben. Diese wurden dicht zugestöpselt und es wurde 43 h bei 37°C kultiviert, worauf die Anzahl der lebenden Zellen in jeder Probelösung bei den jeweiligen Konzentrationen gezählt wurde.

Andererseits wurde als Kontrolle nur 0,1 ml einer physiologischen Kochsalzlösung zu 0,9 ml der zu testenden Zelllösung gegeben. Es wurde in ähnlicher Weise kultiviert und die Anzahl der lebenden Zellen wurde gezahlt.

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Ab

Danach λ/urde die prozentuale Hemmung der Zellmultiplikation (?o) jeder Probelösung nach folgender Gleichung bestimmt.

prozentuale Hemmung der ^J P^nL^ f™^ * Zellmultiplikation (JS) = (1- ^¹⁰⁰ jeder Probelösung S Kntroiltest

Durch Austragung der Konzentrationen der Probelösungen auf einem semilogarithmischen Papier als Abszisse (logarithmische Skala) und der prozentualen Hemmung der Zellmultiplikation jeder Probelösung als Ordinate wurde eine Konzentration (ICj-Q, mg/ml), die eine 50%ige Hemmung der Zellmultiplikation anzeigte, bestimmt und als in-vitro-Antitumoraktivität der betreffenden Probe genommen.

Die Kessung der in-vitro-Antitumore.ktivität erfolgte nicht nur sofort nach der Herstellung des Präparats, sondern auch nach 6-monatiger Lagerung des Präparats bei 6O⁰C in einem dicht zugestöpselten Gläschen.

In-viyo-Antitumoraktivität

1 χ 10 Ehrlich-Aszites-Karzinomzelilen pro Haus wurden in eine Gruppe von 10 Mäusen (ddy-Stanm, weiblich, etwa 5 Wochen alt) überführt und die Hause vurden intraperitoneal mit 0,2 ml einer Suspension der Probe in physiologischer Kochsalzlösung (die in einer solchen Weise hergestellt worden war, daß eine Trockenzellkonzentration von 1 mg/ml erreicht wurde) 5 aufeinanderfolgende Tage inokuliert, um die Anzahl der nach 30 Tagen überlebenden Mäuse zu bestimmen.

Als Kontrolle wurden nur 0,2 ml einer physiologischen Kochsalzlösung intraperitoneal 5 aufeinanderfolgende Tage verab-

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-gereicht. In diesem Fall war die Anzahl der nach 30 Tagen über lebenden Mäuse null (O).

Beispiel χ

(1) Erste Stufe (Pasteurisierungsbehandlunff mit Hydroperoxid)

8 ml 10%ige wäßrige Hydroperoxidlösung wurden zu 80 ml einer Kulturzellsuspension gegeben, die nach dem Versuchsbeispiel hergestellt worden war. Es wurde 30 min bei 0⁰C stehen gelassen und sodann zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln. Die Zellen wurden zweimal mit 240 ml kalter physiologischer Kochsalzlösung gereinigt.

Sodann wurden die Zellen in etwa 250 ml kaltem BBM suspendiert und die Suspension wurde so eingestellt, daß die Absorption bei 660 mn 10 betrug (Zellkonzentration 6 mg/ml).

(2) Zweite Stufe (Penicillinbehandlung mit Penicillin

200 ml der BBM-Suspension (die etwa 1200 mg Zellen enthielt), erhalten in der ersten Stufe, wurden mit 200 ml einer wäßrigen Lösung von Penicillin G-Kaliumsalz [enthaltend 54000 Einheiten Penicillin G-Ivaliumsalz pro ml (etwa 34 mg (Titer)/ml)] versetzt. Das Gemisch wurde 20 min bei 37⁰C und hierauf 30 min lang bei 45°C gehalten. Auf diese Weise wurden 400 ml einer mit Penicillin behandelten Suspension erhalten (davon wurden 200 ml in der dritten Stufe dieses Beispiels und 100 ml im Vergleichsbeispiel 2 verwendet).

(3) Dritte Stufe (primäre Lvophilisierung)

Jeweils 20 ml der 200 ml mit Penicillin behandelten Suspen-

sion, die in der zweiten Stufe erhalten worden war (enthaltend etwa 600 mg Zellen), wurden in 10 Gläschen (mit einer Innenkapazität von 100 ml) eingegossen. Die Proben wurden bei -30⁰C 4 h lang (unter normalem Druck) vorlyophilisiert und sodann unter Unterdruck (etwa 0,05 mm Hg) bei einer Temperatur von nicht mehr als 20⁰C 4 h lang gesetzt, v/o durch Zwischenpräparate erhalten wurden. (Von diesen Zwischenpräparaten wurden 5 Gläschen in der vierten Stufe dieses Beispiels und die restlichen 5 Gläschen im Vergleichsbeispiel 1 verwendet) .

(4) Vierte Stufe (Penicillinentfernunff)

Jeweils 40 ml kaltes physiologische Kochsalzlösung wurden in 5 Gläschen mit dem Zwischenpräparat der dritten Stufe eingegossen und es wurde gründlich durchgemischt, wonach die Zellen (etwa 300 mg) durch Zentrifugieren gesammelt wurden. Die Zellen wurden zusammengegeben, in 200 ml kalter physiologischer Kochsalzlösung suspendiert und sodann zentrifugiert, wodurch Zellen erhalten wurden, die kein Penicillin G-Kaliumsalz enthielten.

(5) Fünfte Stufe (sekundäre Lyophilisierung)

240 mg der penicillinfreien Zellen, die in der vierten Stufe erhalten worden waren, wurden in etwa 80 ml einer Mischlösung aus 2,5/^iger wäßriger Maltoselösung und 3%iger wäßriger Natriumthiosulfatlösung [4 : 1 (Volumen/Volumen)] suspendiert, wobei das Mengenverhältnis so gewählt wurde, daß die Konzentration der Zellen 3 nig pro ml betrug.

Sodann wurden jeweils 1 ml der resultierenden Suspension (enthaltend 3 mg Zellen) in Gläschen (mit einer Innenkapa-

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zität von 15 ml) eingegossen und bei den gleichen Bedingungen wie in der primären Lyophilisierungsstufe (dritte Stufe) lyophilisiert, wodurch die Endzubereitungen des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten wurden.

Die Endzubereitung (enthaltend 3 mg Zellen in einem Gläschen), erhalten im Beispiel 1, hat, wie die Tabelle I zeigt, eine niedrige Toxizität, eine gute Antitumoraktivität und eine gute Lagerungsstabilität.

Beispiele 2 bis 5

In den folgenden Beispielen wurde die Pasteurisierungsbehandlung mit Äthylalkohol (Beispiel 2), Isopropylalkohol (Beispiel 3), tert.-Butylalkohol (Beispiel 4) und Benzylalkohol (Beispiel 5) anstelle von Hydroperoxid wie im Beispiel 1 durchgeführt.

(1) Erste Stufe (Pasteurisierungsbehandlung mit einwertigem Alkohol}

Bei den jeweiligen Beispielen wurden 20 ml der Kulturzellsuspension (enthaltend etwa 375 mg Zellen), kultiviert und hergestellt gemäß dem Versuchsbeispiel, eingesetzt und zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln. Die gesammelten Zellen wurden als Ausgangsmaterial verwendet.

Im Falle der gut wasserlöslichen Alkohole Äthylalkohol, Isopropylalkohol und tert.-Butylalkohol wurden die Zellen in 20 ml der jeweiligen 8O?6igen wäßrigen Lösung des jeweiligen Alkohols suspendiert und 30 min lang bei 0 bis 5⁰C gehalten.

4*

Bei Verwendung des in V/asser schlecht löslichen Benzylalkohols wurden 10 ml Benzylalkohol und 10 ml Wasser auf die Zellen aufgegossen und die gebildeten zwei Flüssigkeitsschichten wurden 30 min lang bei 0 bis 5 C gehalten und gründlich mittels eines Hagnetrührers durchgerührt.

Sodann v/urde in den jeweiligen Beispielen die alkoholbehandelte Lösung zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln. Die Zellen wurden zweimal mit 60 ml kauter physiologischer Kochsalzlösung gereinigt und in etwa 50 ml kaltem BBM suspendiert und so eingestellt, daß die -bsorption bei 660 nm 10 betrug (Zellkonzentration 6 mg/ml).

(2) Zweite Stufe (Penicillinbehandlung), dritte Stufe (primäre Lyophilisierung), vierte Stufe (Penicillinentfernung) und fünfte Stufe (sekundäre Lyophilisierung)

Kit 50 ml BBK-Suspension (enthaltend etwa 300 mg Zellen), die in der ersten Stufe dieser Beispiele erhalten worden war, wurden die zweite Stufe bis die fünfte Stufe der Reihe nach wie im Beispiel 1 durchgeführt. Auf diese Weise wurden die jeweiligen Endprodukte der Beispiele 2 bis 5 erhalten.

Die Endprodukte (enthaltend 3 mg Zöllen in einem Gläschen) haben, wie die Tabelle I zeigt, ei:ie niedrige Toxizität, insbesondere eine sehr gute Antitirioraktivität und eine gute Lagerungsstabilität.

Beispiel 6

Die Penicillinbehandlung wurde mit Ampicillin anstelle von Penicillin G wie im Beispiel 1 durchgeführt.

(1) Erste Stufe (PasteurisierunKsbehandlung mit Hydroperoxid)

Mit 20 ml der Kulturzeilsuspension (enthaltend etwa 375 mg Zellen), die im Versuchsbeispiel kultiviert und hergestellt worden war, wurde die Behandlung mit Hydroperoxid wie im Beispiel 1 durchgeführt, wodurch die BBM-Suspension erhalten wurde.

(²) Zweite Stufe (Penicillinbehandlung mit Ampicillin)

50 ml wäßrige Lösung von Ampicillin (Aminobenzylpenicillinnatriumsalz) [enthaltend 60 mg (Titer) Ampicillin pro ml] wurden zu 50 ml der BBH-Suspension (enthaltend etwa 375 mg Zellen), die in der ersten Stufe erhalten worden war, gegeben. Das Gemisch wurde bei 37°C 30 min lang und sodann bei 45°C 30 min lang gehalten, wodurch 100 ml mit Penicillin behandelte Suspension erhalten wurden.

(3) Dritte Stufe (primäre Lyophilisierung), vierte Stufe (PenicilTinentfernung) und fünfte Stufe (sekundäre Lyophilisierung)

Mit der mit Penicillin behandelten Suspension (enthaltend etwa 300 mg Zellen), die in der zweiten Stufe erhalten worden war, wurden die dritte bis die fünfte Stufe wie im Beispiel 1 durchgeführt, wodurch das Endprodukt erhalten wurde.

Dieses Endprodukt (enthaltend 3 mg Zellen in einem Gläschen) hat, wie die Tabelle 1 zeigt, eine niedrige Toxizität und eine sehr gute Antitumoraktivität sowie eine sehr gute Lagerungsbeständigkeit.

Vergleichsbeispiel 1

In diesem Beispiel wird ein Präparat unter Weglassung der Penicillinentfernung (vierte Stufe) hergestellt.

5 Gläschen des Zwischenpräparats (enthaltend etwa 300 mg Zellen und eine große Menge Penicillin G), das in der dritten Stufe (primäre Lyophilisierung) des Beispiels 1 erhalten worden war, wurden als solche ohne Durchführung der Penicillinentfernung in etwa 100 ml Ilischlösung aus 2,5^iger wäßriger Haltoselösung und 3&Lger väßriger Natriumthiosulfatlösung (4 : 1 (Volumen/Volumen)) in ähnlicher Tieise wie in der fünften Stufe des Beispiels 1 suspendiert. Es wurde so eingestellt, daß der Zellgehalt 3 mg/ml "betrug und die so erhaltene Suspension Λ-.-urde bei den gleichen Bedingungen lyophilisiert.

Die Zubereitung (enthaltend 3 mg Zellen in einem Gläschen), die in diesem Vergleichsbeispiel 1 erhalten worden war, hat, wie die Tabelle 1 zeigt, eine auf Penicillin zurückzuführende Toxizität und ihre Lagerbeständigkeit ist schlecht.

Verfileichsbeispiel 2

Das Vergleichsbeispiel 2 entspricht dem Versuch, bei dem die Penicillinentfernung vor der dritten Stufe (primäre Lyophilisierung) des Beispiels 1 durchgeführt wird. Es wurde wie folgt durchgeführt:

Von AOO ml der penicillinbehandelten Lösung, die in der zweiten Stufe (Penicillinbehandlung mit Penicillin G) des Beispiels 1 erhalten worden war, wurden 100 ml (enthaltend etwa 300 ml Zellen) abgenommen und zentrifugiert, um die

Zellen zu sammeln. Die Zellen wurden zweimal mit 200 ml kalter physiologischer Kochsalzlösung gewaschen, wodurch Zellen erhalten wurden, die Kein'Penicillin G enthielten.

Sodann wurden die so erhaltenen Zellen (etwa 240 mg) in 80 ml kaltem BBM suspendiert und die resultierende Suspension wurde bei den gleichen Bedingungen wie bei der dritten Stufe (primäre Lyophilisierung) des Beispiels 1 lyophilisiert. Das Produkt wurde in 80 ml einer Mischlösung aus 2,5%iger wäßriger Ilaltoselösung und 3°oiger wäßriger Natriumthiosulfatlösung [4 : 1 (Volumen/Volumen)] wie in der fünften Stufe (sekundäre Lyophilisierung) des Beispiels 1 suspendiert und in ähnlicher Weise lyophilisiert.

Die Zubereitung (enthaltend 3 mg Zellen in einem Gläschen), die in diesem Vergleichsbeispiel 2 erhalten wurde, hat, wie Tabelle I zeigt, eine erheblich niedrigere Antitumoraktivität.

	Penicillingehalt (Penicillinein heiten/Gläschen)	^LD50 (mg/kg)	Tabelle I	0,012	Antitumoraktivität nach 6-monatiger La gerung bei 60⁰C in vitro (IC₅₀)	304E	I
Zubereitungen	O	>50		0,003	0,018
Beispiel 1	O	>50	Heßergebnisse Antitumoraktivität unmittelbar nach der Herstellung in vivo* in vitro (IC₅₀)	0,004	0,004		I e < t t
Beispiel 2	O	>50	10/10	0,003	0,006
Beispiel 3	O	>50	10/10	0,002	0,004
Beispiel 4	O	>50	10/10	0,018	0,003
Beispiel 5	O	>50	10/10	0,015	0,023
Beispiel 6	27000	15	10/10	>0,3	>0,3
Vergleichs beispiel 1	0	>50	10/10		>0,3
Vergleichs beispiel 2		10/10
	2/10

* Anzahl der überlebenden Mäuse/Anzahl der Testmäuse

««ti ««· t

Fußnoten:

(1) Beispiel 1 ... Die Pasteurisierungsbehandlung mit Hydroperoxid (erste Stufe), die Penicillinbehandlung mit Penicillin G-Kaliumsalz (zweite Stufe), die primäre Lyophilisierung (dritte Stufe), die Penicillin-G-Entfernung (vierte Stufe) und die sekundäre Lyophilisierung (fünfte Stufe) wurden der Reihe nach durchgeführt.

(2) Beispiel 2 bis Beispiel 5 .... Die Versuche wurden in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß Äthylalkohol (Beispiel 2), Isopropylalkohol (Beispiel 3), tert.-Butylalkohol (Beispiel 4) und Benzylalkohol (Beispiel 5) anstelle von Hydroperoxid bei der Pasteurisierungsbehandlung (erste Stufe) verwendet wurden.

(3) Beispiel 6 ... Der Versuch wurde wie im Beispiel 1 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß Ampicillin anstelle von Penicillin G-Kaliumsalz bei der Penicillinbehandlung (zweite Stufe) verwendet wurde.

(4) Vergleichsbeispiel 1 ... Der Versuch wurde wie im Beispiel 1 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die Penicillinentfernung (vierte Stufe) weggelassen wurde.

(5) Vergleichsbeispiel 2 ... Die Penicillinentfernung wurde unmittelbar nach der Penicillinbehandlung (zweite Stufe) durchgeführt und hierauf wurden die primäre Lyophilisierung und die sekundäre Lyophilisierung durchgeführt.

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung eines Antituraormittels, dadurch gekennzeichnet , daß man Kulturzellen von zu Streptococcus pyogenes gehörenden Stämmen der Reihe nach einer Pasteurisierungsbehandlung (erste Stufe) und einer Penicillinbehandlung (zweite Stufe) und darauf einer primären Lyophilisierung (dritte Stufe) unterwirft, um ein Zvischenpräparat zu erhalten, und daß man sodann das Zwischenpräparat einer Penicillinentfernung sbehandlung (vierte Stufe), gefolgt von einer sekundären Lyophilisierung (fünfte Stufe) unterwirft.

* PATENTANWÄLTE

UND ZUGELASSENE VERTRETER VOR DEM EUROPÄISCHEN PATENTAMT

DR. WALTER KRAUS D 1 PLO M C H EM I K ER · D R.-l N G. AN N EKÄTE WT.ISERT DIPL-ING. FACHRICHTUNG CHEMIE IRMGARDSTRASSE 15 · D-BOOO MÜNCHEN 71 · TELEFON O8 9/79 7O 77-7Θ 7O 78 . TELEX O5-212156 kpatd

TELEGRAMM KRAUSPATENT , -»

P 30 45 781.9 29. Januar 1981

Patentanspruc h

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e η η zeichnet, daß man als zu Streptococcus pyogenes gehörendem Stamm mindestens einen Stamm aus der Gruppe St. pyogenes ATCC Nr. 21060, St. pyogenes ATCC Nr. 21059, St. pyogenes HD S-43 (JFCC Catalogue of Cultures (1979) ) und St. pyogenes HD T-3 (JFCC Catalogue of Cultures (1979)) verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch ge kennzeichnet, daß man die Kulturzellen mit Hydroperoxid oder einwertigen Alkoholen als Pasteurisierungsbehandlung (erste Stufe) behandelt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch g e k e η η

•-Ο zeichnet, daß man die Hydroperoxidbehandlung bei

_o Temperaturen im Bereich von -5 bis 1O⁰C vornimmt. ο

5. Verfahren nach Anspruch 3> dadurch gekennzeichnet, daß man die KuItürzellen bei einer Temperatur von 50⁰C oder weniger behandelt, indem man als einwertige Alkohole aliphatische Alkohole und Thioalkohole

mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen verwendet.

6. Verfahren nach Anspruch 3» dadurch g e k e η η zeichnet , daß man die Kulturzellen bei einer Temperatur von 5O⁰C oder weniger unter Verwendung von Äthanol als einwertigern Alkohol behandelt.

7. Verfahren ηε ch Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Penicillinbehandlung (zweite Stufe) der Zellen, die die Pasteurisierungsbehandlung durchlaufen haben, dadurch vornimmt, daß man die Zellen in einem Penicillin enthaltenden wäßrigen Medium, insbesondere wäßrigen Lösungen von Salzen oder Bernheimer's Basal-Medium, suspendiert.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die Konzentration des Penicillins in dem Penicillin enthaltenden wäßrigen Medium bei 5 bis 50 mg (Titer)/ml einstellt.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Penicillinentfernungsbehandlung (vierte Stufe) in der Weise vornimmt, daß man das durch primäre Lyophilisierung (dritte Stufe) der die Pasteurisierung sbehandlung (erste Stufe) und Penicillinbehandlung (zweite Stufe) durchlaufenen Zellen erhaltene Zwischenpräparat nach herkömmlichen Verfahrensweisen in einem wäßrigen Medium, insbesondere wäßrigen Lösungen von Salzen oder Bemheimer's Basal-Medium, suspendiert.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die sekundäre Lyophilisierung (fünfte Stufe) nach herkömmlichen Verfahrensweisen nach Durchführung der Penicillinentfer^ongsbehandlung (vierte Stufe) vornimmt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die sekundäre Lyophilisierung (fünfte Stufe) nach Zumischung eines Stabilisators und/oder eines Trägers zu den Zellen, die die Penicillinentfernungsbehandlung (vierte Stufe) durchlaufen haben, vornimmt.