DE3634496A1 - Glukosylmoranolinderivate und ihre herstellung - Google Patents
Glukosylmoranolinderivate und ihre herstellungInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen der folgenden
allgemeinen Formel (I)
wobei R eine Alkylgruppe mit einer oder mehreren Hydroxylgruppen
ist, welche eine inhibitorische Wirkung auf den
Anstieg des Blutzuckerspiegels haben.
Moranolin hat die folgende chemische Struktur
und hat sich als äußerst nützliches Arzneimittel mit
therapeutischer Wirkung gegen Diabetes mellitus erwiesen.
Moranolin wurde zuerst aus Catex Mori (einer orientalischen
Rohdroge) (vgl. Yagi et al., Nippon Nogei Kagaku Kaisha,
Band 50, Seite 571, 1976; japanische Patentveröffentlichung
52/83 951) isoliert, und später wurde herausgefunden, daß man
es durch Fermentierung unter Verwendung von dem Stamm Streptomyces
zugehörigen Mikroorganismen herstellen kann (vgl. japanische
Patentveröffentlichung 54/84 094).
Erfindungsgemäß wurden eine Reihe von Untersuchungen angestellt,
um noch leistungsfähigere Antidiabetesmittel zu finden, und es
wurden zahlreiche Derivate dieser Verbindungen synthetisiert.
Im Verlauf dieser Studien wurde eine Reihe von Verbindungen
hergestellt, bei denen R1 in der allgemeinen Formel (I) Wasserstoff
oder eine niedere Alkylgruppe ist, und die entsprechenden
Patentanmeldungen wurden getätigt (vgl. japanische geprüfte
Veröffentlichung 24 798/85 und andere).
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Herstellung von
Verbindungen mit stärkerer inhibitorischer Wirkung gegen den
Anstieg des Blutzuckerspiegels bei geringerer Toxizität durch
weitere Untersuchungen der Nützlichkeit von solchen Maronolinderivaten
als therapeutische Mittel gegen Diabetes mellitus.
Im Rahmen der Erfindung wurden gründliche Studien zwecks
Lösung der vorstehenden Aufgabe durchgeführt, wobei festgestellt
wurde, daß die Verbindungen gemäß der vorstehenden allgemeinen
Formel (I) den genannten Anforderungen genügen, was zu der
vorliegenden Erfindung geführt hat.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind neu und in der einschlägigen
Literatur bisher nicht erwähnt.
Das charakteristische Merkmal der erfindungsgemäßen Verbindungen
ist, daß die Alkylgruppe, die an das Stickstoffatom des
Ringes gebunden ist, einen oder mehrere Hydroxylgruppensubstituenten
enthält.
Es kann sich hierbei um einen oder mehrere Hydroxylgruppen
handeln, und obwohl hinsichtlich der Anzahl keine Beschränkung
besteht, sind 1 bis 4 Hydroxylgruppen zu bevorzugen.
Desgleich besteht keine besondere Einschränkung hinsichtlich
der Anzahl der Kohlenstoffatome der Alkylgruppe, jedoch sind
niedere Alkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen zu bevorzugen.
Die Alkylgruppe muß nicht geradkettig sein, sondern sie kann
auch verzweigt sein. Der Fall, daß die Alkylgruppe nicht durch
eine oder mehrere Hydroxylgruppen substituiert ist, fällt
nicht unter den Bereich der Erfindung.
Einige typische Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung
sind nachfolgend aufgeführt, obwohl dies keinerlei Einschränkung
des Erfindungbereiches bedeutet.
4-O-α-D-Glukopyranosyl-N-(2-hydroxyethyl)moranolin;
4-O-α-D-Glukopyranosyl-N-(2-hydroxypropyl)moranolin;
4-O-α-D-Glukopyranosyl-N-(3-hydroxypropyl)moranolin; und
4-O-α-D-Glukopyranosyl-N-(2,3-dihydroxypropyl)moranolin.
4-O-α-D-Glukopyranosyl-N-(2-hydroxypropyl)moranolin;
4-O-α-D-Glukopyranosyl-N-(3-hydroxypropyl)moranolin; und
4-O-α-D-Glukopyranosyl-N-(2,3-dihydroxypropyl)moranolin.
Die Verbindungen gemäß der Erfindung sind basische Substanzen, die
folglich mit verschiedenen Säuren Salze bilden können. Wenn
diese Salze pharmakologisch verträglich sind, fallen sie natürlich
ebenfalls unter den Bereich der Erfindung.
Die Verbindungen nach der Erfindung können unter Anwendung von
in der organischen Chemie gut bekannten Methoden hergestellt
werden, beispielsweise durch Behandeln von 4-O-α-D-
Glukopyranosylmoranolin mit Amin oder Epoxid auf übliche Weise.
Beispielsweise können sie in hohen Ausbeuten durch Umsetzen
von 4-O-αD-Glukopyranosylmoranolin mit einem Epoxid in einem
inerten Lösungsmittel synthetisiert werden. Die Alkylierung
von 4-O-α-D-Glukopyranosylmoranolin mit β-Halogenhydrinen in
einem polaren Lösungmittel ergibt ebenfalls in vorteilhafter
Weise die angestrebten Verbindungen. Weiterhin ist es möglich,
ein Verfahren anzuwenden, bei dem α-Halogenketon alkyliert und
das erhaltene Keton anschließend reduziert wird, um die
Hydroxylgruppe zu erhalten.
Eine alternative Methode zur Herstellung der erfindungsgemäßen
Verbindungen ist in Anspruch 5 offenbart, bei der spezifische
Enzyme angewendet werden. Für die Durchführung dieser alternativen
Methode wird das als Ausgangsstoff verwendete N-substituierte
Moranolin in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst,
und unter Kontrolle des pH-Wertes werden α-Cyclodextrin oder
lösliche Stärke zugesetzt. Dazu wird dann das Enzym
Cyclodextringlukosyltransferase zugegeben, woraufhin die Glukosylierung
des N-substituierten Moranolins vollzogen wird. Das
Enzym kann ein durch Mikroorganismen erzeugtes sein. Nach der
Umsetzung kann das Produkt beispielsweise durch Säulenchromatographie
isoliert werden. Die Reaktionslösung kann bei der
anschließenden Umsetzung verwendet werden.
Zu der Lösung des erhaltenen oligoglukosyl-N-substituierten
Moranolins wird Glukoamylase zugesetzt unter Einstellung des
für die Durchführung der Umsetzung geeigneten pH-Wertes. Es
kann hierbei handelsübliche Glukoamylase eingesetzt werden.
Nach der Umsetzung kann das angestrebte Produkt beispielsweise
durch Säulenchromatographie isoliert werden. Die gewünschte
Verbindung kann durch gebräuchliche säulenchromatographische
Techniken, wie mit Sephadex G-15, gereinigt werden.
Die inhibitorische Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen
gegen den Anstieg des Blutzuckerspiegels wurde anhand der
nachfolgenden Tests gesichert.
An vier männlichen Beagle-Hunden (26 Monate alt; Körpergewicht
11-14 KG) wurde unter Verwendung einer Sonde peroral 2 g/kg Stärke
(lösliche Stärke; hergestellt von Kanto Kagaku K. K.) gegeben,
und die inhibitorische Wirkung der gleichzeitig gegebenen
erfindungsgemäßen Verbindung gegen den Anstieg des Blutzuckerspiegels
wurde getestet. 20 g Stärke wurden in 100 ml Wasser
durch Erhitzen gelöst, und 10 ml dieser Lösung pro 1 kg Körpergewicht
wurden verabreicht. Aus der Arterie des vorderen und
mittleren Teils der Vorderpfote wurde in bestimmten Zeitintervallen
Blut abgenommen, und zum Bestimmen des Blutzuckerspiegels
wurden 25 µl des Blutes in einem YS-1-Glukoanalysator
(Modell 23A, hergestellt von K. K. Nikkaki) gegeben. Die Gruppe,
an die lediglich Stärke verabreicht worden war, und die, an die
nur Wasser gegeben worden war (10 ml/kg Körpergewicht), wurden
als Vergleichs- bzw. Grundgruppe bezeichnet, und die Testverbindung
wurde an die Tiere in Dosen von 1, 3 und 10 mg/kg zusammen
mit Stärke gegeben. Während des Tests wurden vier Beagles bei konstanter
Temperatur 23 ± 2°C) und konstanter Feuchte 55 ± 5%)
bei einem Hell-Dunkel-Zyklus von jeweils 12 Stunden gehalten,
und am Abend wurden pro Tag 300 g Hundefutter (CD-1, hergestellt
von Nippon Kurea K. K.) gegeben. Die Ergebnisse von vier Beispielen
jeder Testgruppe sind in Tabelle 1 zusammengestellt.
Die darin genannten Werte sind
(Durchschnittswert) ± (Standardabweichung)
Aus den Ergebnissen wird ersichtlich, daß die erfindungsgemäßen
Verbindungen eine inhibitorische Wirkung gegen den Anstieg
des Blutzuckerspiegels aufweisen.
Als die erfindungsgemäßen Verbindungen (Beispiele 1 und 29
zum Ermitteln der Toxizität in einer Dosis 5 g/kg peroral
an Mäuse gegeben wurden, trat in keinem Fall der Tod ein. Als
die erfindungsgemäßen Verbindungen (Beispiele 1 und 2) in
einer Dosis von 400 mg/kg an fünf aufeinanderfolgenden Tagen
intraperitoneal an Ratten gegeben wurden, waren keine Anomalien
des klinischen Zustandes, der biochemischen Werte des Serums
und überhaupt der hämatologischen Werte zu beobachten. Somit
ist die Toxizität der erfindungsgemäßen Verbindungen äußerst
niedrig.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können als Arzneimittel
für Lebewesen einschließlich den Menschen ohne Zusätze oder
als eine pharmazeutische Zubereitung gegeben werden, die
beispielsweise 0,1 bis 99,5%, vorzugsweise 0,5 bis 90%,
der Verbindung in einem pharmazeutisch verträglichen nichttoxischen
und inerten Trägerstoff enthält.
Als Trägerstoff können ein oder mehrere feste, halbfeste oder
flüssige Verdünnungsmittel, Füllstoffe und Hilfsmittel für
pharmazeutische Zubereitungen verwendet werden. Die pharmazeutische
Zubereitung wird vorzugsweise in Form einer dosierbaren
Einheit verabreicht. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen
Zubereitungen können durch den Mund, durch das Gewebe, von
lokalen Bereichen aus (z. B. durch die Haut) oder durch das
Rektum verabreicht werden. Selbstverständlich werden jeweils
die für das Darreichungsverfahren geeigneten Formen gewählt.
Beispielsweise ist die orale Gabe besonders vorteilhaft.
Die Dosis als Heilmittel gegen Diabetes mellitus wird vorzugsweise
unter Berücksichtigung des Zustandes des Patienten (z. B.
Alter und Körpergewicht), des Verabreichungsweges, der Art und
des Ausmaßes der Erkrankung u. dgl. eingestellt. Üblicherweise
ist es angebracht, daß die tägliche Dosis im Bereich von 10 bis
2000 mg, vorzugsweise 100 bis 600 mg, liegt. In einigen Fällen
ist eine geringere Dosis ausreichend, während in anderen Fällen
eine höhere Dosis erforderlich sein kann. Es kann auch vorteilhaft
sein, die tägliche dem Patienten zu gebende Dosis auf
mehrere Gaben aufzuteilen.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen, die die
Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen betreffen,
näher erläutert.
4-O-α-D-Glukopyranosylmoranolin (10 g) wurden in 150 ml heißem
Dimethylsulfoxid gelöst und mit 16 g Kaliumcarbonat versetzt.
18 g Ethylenbromhydrin wurden unter Rühren zugesetzt, und das
Gemisch wurde 3 Stunden lang bei 100 bis 110°C umgesetzt.
Nach der Umsetzung wurden unlösliche Bestandteile von dem
Gemisch abgefiltert, dann wurden 150 ml Wasser zugesetzt, und
das Gemisch wurde sanft gerührt. Dann wurde es durch 300 ml
eines stark sauren Ionenaustauschharzes (Dowex 50W × 2 (H⁺))
geschickt, so daß die gewünschte Verbindung darin absorbiert
wurde. Die Säule wurde gründlich mit Wasser gewaschen, mit
0,5 n Ammoniakwasser eluiert, das Eluat im Vakuum eingeengt,
dann mit Aktivkohle behandelt und bis zur Trockne im Vakuum
eingeengt. Der Rückstand wurde mit Aceton aufgenommen, und die
in Aceton löslichen Bestandteile wurden verworfen. Die acetonunlöslichen
Bestandteile wurden in einer geeigneten Menge heißem
Wasser gelöst und aus Ethanol umkristallisiert. Die Kristalle
wurden abgefiltert und nochmals aus Ethanol umkristallisiert,
wobei 6,0 g des Endproduktes, d. h. 4-O-α-D-Glukopyranosyl-
N-(2-hydroxyethyl)moranolin erhalten wurden. Fp. 98-101°C.
[α]= +76,7°C (1%, Wasser)
Die Herstellung derselben Verbindung wie in Beispiel 1A
wird hier unter Verwendung von Enzymen beschrieben, d. h. durch
das alternative Verfahren gemäß Anspruch 5.
100 ml einer Kulturflüssigkeit (pH 7), die 1% Korneinweichflüssigkeit,
1% lösliche Stärke, 0,5% Ammoniumsulfat und
0,5% Calciumcarbonat enthielt, wurde in einem 500-ml-Erlenmeyerkolben
gegeben und zum Sterilisieren 15 Minuten lang auf
120°C erhitzt. Drei Platinschlingen voll Bacillus mascerans
vom IFO 3490-Stamm, das vollständig auf einem Schrägmedium
von 1% Pepton, 0,5% Hefe, 0,3% Glukose, 1,5% Glycerin,
0,3% Natriumchlorid, 2,5% Leberpulver (OXOID - Warenzeichen)
und 1,5% Agar gewachsen war, wurden darauf geimpft und 3 Tage
lang einer Schüttelkultur bei 37°C unterzogen. Die Kulturflüssigkeit
(600 ml) wurde in einem 30-Liter-Schüttelfermentierer
auf 18 solche Medien derselben Zusammensetzung geimpft und
3 Tage lang bei 37°C bei voller Belüftung und Rühren kultiviert,
wobei eine Enzymlösung von 130 bis 150 Einheiten als überstehende
Flüssigkeit nach dem Zentrifugieren erhalten wurde.
In 0,5 m Acetatpuffer (pH 5,5) wurden 0,7% lösliche Stärke
(für biochemische Untersuchungen; hergestellt von Nakarai
Chemical Co.) zur Gewinnung einer Substratlösung gelöst. Zu
950 µl dieser Substratlösung wurden 50µl Enzymlösung zugesetzt,
das Gemisch wurde 10 Minuten lang bei 40°C umgesetzt, und die
Reaktion wurde durch Zusatz von 0,5 ml 0,5 n Essigsäure abgestoppt.
Nach der Umsetzung wurden 100 µl der Reaktionslösung
entnommen, und 3 ml Wasser und 0,8 ml Jodlösung (in 0,25 m
Kaliumjodidlösung wurde bis zu einer Konzentration von 0,01 m
Jod zugesetzt) wurden zugegeben. Das Gemisch wurde gerührt und
die Extinktion bei 660 nm gemessen (ein AT-Wert). In gleicher
Weise wurden zu 950 µl der Substratlösung 50 µl Wasser und
0,5 ml 0,5 n Essigsäure zugegeben, und 100 µl des erhaltenen
Gemisches wurden mit der Jodlösung behandelt und die Extinktion
bei 660 nm gemessen (ein AR-Wert).
Diese Einheit bedeutet eine Aktivität, die eine Verminderung
von 1% Extinktion von Enzymlösung bei 40°C während 1 Minute
hervorruft.
Die Kulturflüssigkeit von B. mascerans IFO 3490 wird zentrifugiert,
wobei eine überstehende Flüssigkeit erhalten wird.
Diese wurde lyophilisiert, in einer kleinen Menge Wasser gelöst,
und eine konzentrierte Enzymlösung wurde erhalten. Diese
wurde gründlich bei 5°C in Wasser dialysiert, und die von
niedermolekularen Substanzen freie innere Lösung wurde als
Enzymlösung verwendet. Erforderlichenfalls wurde sie lyophilisiert
und das erhaltene Pulver verwendet.
5 g N-(2-Hydroxyethyl)moranolin wurden in einer kleinen Menge
Wasser gelöst, der pH-Wert der Lösung wurde mit 3 n Salzsäure
auf 5,7 eingestellt, und mit Wasser wurde auf 25 ml verdünnt.
α-Cyclodextrin (80 g) wurden in 3975 ml Rohenzymlösung
(250 Einheiten/ml) gelöst, die N-(2-Hydroxyethyl)-moranolin-
Lösung wurde zugegeben, und das Gemisch wurde erneut auf pH 5,7
eingestellt. Es wurde dann 3 Tage lang bei 40°C geschüttelt,
um eine Reaktion hervorzurufen. Die Reaktionslösung wurde
zentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit durch eine Säule
(200 ml, Dowex 50W × 2 (H⁺)) geschickt, das ein stark saures
Ionenaustauschharz ist, so daß basische Substanzen absorbiert
wurden. Die Säule wurde gründlich mit Wasser gewaschen, mit
0,5 n Ammoniakwasser eluiert, das Eluat im Vakuum bis zur Trockne
eingeengt, und 14,8 g Gemisch von Oligoglukosyl-N-(2-hydroxyethyl)
moranolinen wurde erhalten.
Dieses wurde durch Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeitschromatographie
analysiert, wobei festgestellt wurde, daß es ein
Gemisch aus 15% N-(2-Hydroxyethyl)moranolin und 85% Oligoglukosyl-
N-(2-hydroxyethyl)moranolin war. Die Bedingungen für
die genannte Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeitschromatographie
waren wie folgt:
Sumipax R741 (Nucleosil 5NH2, 5 Mikrometer, 4 mm ID × 25 cm).
Entwickler: Acetonitril-Wasser (65/35). Strömungsgeschwindigkeit
der Flüssigkeit: 1 ml/min. RI-Bestimmung (Elmer Optical
Co., ERC-7510). Datenverarbeitungssystem: Hitachi Ltd.,
655-60.
10 g des auf vorstehende Weise erhaltenen Oligoglukosyl-N-
(2-hydroxyethyl)moranolin-Gemisches wurden in 50 ml Wasser
gelöst und die Lösung auf pH 5,1 eingestellt. Bei zu einem
Gesamtvolumen von 100 ml wurde Wasser zugegeben, und 250 ml
Glukoamylase (Glucozyme AF-6, hergestellt von Nagase Sangyo Co)
wurden zugesetzt. Das Gemisch wurde 24 Stunden lang bei 50°C
umgesetzt, die Reaktion wurde durch Erhitzen bis auf 80°C
beendet und das Gemisch auf Umgebungstemperatur abgekühlt.
Die Reaktionslösung wurde zentrifugiert, die überstehende
Flüssigkeit wurde durch eine Säule (200 ml Harzvolumen) von stark
saurem Ionenaustauschharz geschickt, und die Säule wurde gründlich
mit Wasser gewaschen. Die Säule wurde dann mit 0,5 n
Ammoniakwasser eluiert und das Eluat im Vakuum bis zur Trockne
eingeengt, wobei 5,6 g Pulver erhalten wurden.
Dieses wurde durch Hochgeschwindigkeits-Chromatographie, wie
vorstehend beschrieben, analysiert, wobei gefunden wurde, daß
es aus einem Gemisch aus 28,8% N-(2-Hydroxyethyl)moranolin,
71,0% 4-O-α-D-Glukopyranosyl-N-(2-hydroxyethyl)moranolin und
0,2% 4-O-α-D-Maltosyl-N-(2-hydroxyethyl)moranolin bestand.
Eine weitere Ausführungsform verläuft wie folgt:
8 g lösliche Stärke wurden in 50 ml heißem Wasser gelöst, und in dieser Lösung wurde 1 g N-(2-Hydroxyethyl)moranolin gelöst. Die Lösung wurde auf 40°C abgekühlt, auf pH 5,7 eingestellt und mit 50 ml einer Rohenzymlösung (4000 Einheiten/ml) versetzt. Diese Mischung wurde erneut auf pH 5,7 eingestellt und 3 Tage lang unter Schütteln bei 40°C umgesetzt. Die Reaktion wurde durch 20 Minuten dauerndes Erhitzen auf 80°C beendet, es wurde auf 50°C abgekühlt, auf pH 5,1 eingestellt, 500 ml Glukoamylase (Glucozyme AF-6, hergestellt von Nagase Industry Co.) wurden zugegeben, und das Gemisch wurde 24 Stunden lang bei 50°C umgesetzt. Die Umsetzung wurde beendet, indem 20 Minuten lang auf 80°C erhitzt wurde, es wurde auf Umgebungstemperatur abgekühlt und zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde durch eine Säule (100 ml Harz) mit stark saurem Ionenaustauschharz Dowex 50W × 2 (H⁺) geschickt, wobei die basischen Substanzen adsorbiert wurden. Die Säule wurde gründlich mit Wasser gewaschen, mit 0,5 n Ammoniakwasser eluiert und das Eluat im Vakuum bis zur Trockne eingeengt, wobei 1,8 g Pulver erhalten wurden.
8 g lösliche Stärke wurden in 50 ml heißem Wasser gelöst, und in dieser Lösung wurde 1 g N-(2-Hydroxyethyl)moranolin gelöst. Die Lösung wurde auf 40°C abgekühlt, auf pH 5,7 eingestellt und mit 50 ml einer Rohenzymlösung (4000 Einheiten/ml) versetzt. Diese Mischung wurde erneut auf pH 5,7 eingestellt und 3 Tage lang unter Schütteln bei 40°C umgesetzt. Die Reaktion wurde durch 20 Minuten dauerndes Erhitzen auf 80°C beendet, es wurde auf 50°C abgekühlt, auf pH 5,1 eingestellt, 500 ml Glukoamylase (Glucozyme AF-6, hergestellt von Nagase Industry Co.) wurden zugegeben, und das Gemisch wurde 24 Stunden lang bei 50°C umgesetzt. Die Umsetzung wurde beendet, indem 20 Minuten lang auf 80°C erhitzt wurde, es wurde auf Umgebungstemperatur abgekühlt und zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde durch eine Säule (100 ml Harz) mit stark saurem Ionenaustauschharz Dowex 50W × 2 (H⁺) geschickt, wobei die basischen Substanzen adsorbiert wurden. Die Säule wurde gründlich mit Wasser gewaschen, mit 0,5 n Ammoniakwasser eluiert und das Eluat im Vakuum bis zur Trockne eingeengt, wobei 1,8 g Pulver erhalten wurden.
Dieses wurde durch Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeitschromatographie
analysiert, wobei gefunden wurde, daß es aus einem
Gemisch aus 29% N-(2-Hydroxyethyl)moranolin, 70% 4-O-α-D-
Glukopyranosyl-N-(2-hydroxyethyl)moranolin und 1% 4-O-α-D-
Maltosyl-N-(2-hydroxyethyl)moranolin bestand. Die Bedingungen
bei der Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeitschromatographie
waren wie vorstehend beschrieben, nur mit der Ausnahme, daß
als Entwickler ein Gemisch aus Acetonitril und Wasser (70/30)
verwendet wurde.
1,5 g des vorstehenden Gemisches wurden in einer kleinen Menge
Wasser gelöst, die Lösung wurde durch eine Säule geschickt
(48 mm Durchmesser × 850 mm, Sephadex G-15), und die Säule
wurde mit destilliertem Wasser entwickelt, wovon jeweils 5 ml-
Fraktionen gesammelt wurden.
Jede Fraktion wurde durch Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeitschromatographie
analysiert, geeignete gesammelte Fraktionen
wurden vereinigt und im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Das
erhaltene Pulver wurde aus wäßrigem Ethanol umkristallisiert,
wobei 550 mg 4-O-α-D-Glukopyranosyl-N-(2-hydroxyethyl)moranolin
vom Fp. 99-102°C erhalten wurden. [α] = +76,5° (1%, Wasser).
10 g 4-O-α-D-Glukopyranosylmoranolin wurden in 150 ml heißem
Dimethylsufoxid gelöst, und 16 g Kaliumcarbonat wurden zugesetzt.
20 g Epibromhydrin wurden unter Rühren zugegeben, und
das Gemisch wurde 3 Stunden lang bei 100 bis 110°C umgesetzt.
Nach dem Umsetzen wurden unlösliche Bestandteile von dem Gemisch
abfiltriert. Es wurden 150 ml Wasser zugesetzt und das
Gemisch sanft gerührt. Dieses wurde dann durch eine 300-ml-
Säule mit stark saurem Ionenaustauschharz (Dowex 50W x 2 (H⁺))
geschickt und die gewünschte Verbindung wurde darin absorbiert.
Die Säule wurde gründlich mit Wasser gewaschen, mit 0,5 n
Ammoniakwasser eluiert, das Eluat unter Rühren am Rückfluß
3 Stunden lang bei 80°C erhitzt, im Vakuum eingeengt, mit
Aktivkohle behandelt, durch eine 200-ml-Säule mit Diaion HP-200
geschickt und mit Wasser gewaschen. Durch Durchlauflösung und die
Waschlösung wurden vereinigt, das Gemisch im Vakuum eingeengt,
der Rückstand mit Methanol aufgenommen, die methanolische Lösung
mit 3 l Sephadex LH-20 behandelt, die Säule mit Methanol entwickelt.
Die Fraktionen, die die gewünschte Verbindung enthielten,
wurden gesammelt, dann wurde das Methanol verdampft, der
Rückstand in einer geeigneten Menge heißem Wasser gelöst und
aus Ethanol umkristallisiert. Die Kristalle wurden abfiltriert
und nochmals umkristallisiert, wobei 5,0 g des Endproduktes,
d. h. 4-O-α-D-Glukopyranosyl-N-2,3-dihydroxypropyl)moranolin
vom Fp. 83-85°C erhalten wurden. [α] = +73,7° (1% Wasser).
Hier wird die Herstellung derselben Verbindung, wie sie gemäß
Beispiel 2A erzeugt wurde, unter Anwendung von Enzymen beschrieben,
d. h. gemäß der alternativen Methode nach Anspruch 5.
8 g lösliche Stärke wurden in 50 ml heißem Wasser gelöst, und
1 g N-(2,3-Dihydroxypropyl)moranolin wurden darin gelöst. Die
Lösung wurde auf 40°C abgekühlt, auf pH 5,7 eingestellt und
mit 50 ml Rohenzymlösung (4000 Einheiten/ml) versetzt. Die
Lösung wurde erneut auf pH 5,7 eingestellt und 3 Tage lang bei
40°C unter Schütteln umgesetzt. Dann wurde sie auf die in
Beispiel 2A beschriebene Weise behandelt, wobei 1,6 g einer
Mischung aus 31% N-(2,3-Dihydroxypropyl)moranolin, 68%
4-O-α-D-Glukopyranosyl-N-(2,3-dihydroxypropyl)moranolin und
1% 4-O-α-D-Maltosyl-N-(2,3-dihydroxypropyl)moranolin erhalten
wurden.
Dieses Pulvergemisch (1,5 g) wurde in einer kleinen Menge
Wasser gelöst, die Lösung wurde durch eine Sephadex-G-15-Säule
(48 mm Durchmesser × 850 mm) geschickt, mit destilliertem Wasser
entwickelt, und jeweils 5-ml-Fraktionen wurden gesammelt. Jede
Fraktion wurde durch Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeitschromatographie
analysiert, um geeignete Fraktionen sammeln zu können,
und diese wurden im Vakuum zur Trockne eingeengt. Das erhaltene
Pulver wurde aus wäßrigem Ethanol umkristallisiert, wobei 505 mg
4-O-α-D-Glukopyranosyl-N-(2,3-dihydroxypropyl)moranolin vom
Fp. 83-86°C erhalten wurden. [α] = +72,3° (1%, Wasser).
L-Arabinosetetraacetat (Wolfram et al., J. Am. Chem. Soc. 63,
201, 1941) wurde zu 2,3,4,5-Tetra-O-acetylpentyl-1-bromid
reduziert und bromiert. 11,8 g dieser Substanz und 5 g 4-O-α-D-
Glukopyranosylmoranolin wurden in 50 ml Dimethylformamid gelöst,
die Lösung wurde mit 6,4 g wasserfreiem Kaliumcarbonat versetzt,
und das Gemisch wurde 5 Stunden lang bei 100°C umgesetzt. Die
Reaktionslösung wurde filtriert und das Lösungsmittel daraus
verdampft. Der Rückstand wurde in Wasser gelöst und durch eine
100-ml-Säule mit stark saurem Ionenaustauschharz (Dowex 50W × 2 (H⁺))
geschickt. Die Säule wurde gründlich mit Wasser
gewaschen und mit 1 n Ammoniakwasser eluiert. Das Eluat wurde
zum Entacetylieren eine Stunde lang auf 70°C erhitzt, und das
Lösungsmittel wurde im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde
mit Wasser aufgenommen und die Lösung durch eine 100-ml-Säule
mit stark saurem Ionenaustauschharz (Dowex 50W × 2 (H⁺))
geschickt. Die Säule wurde gründlich mit Wasser gewaschen
und mit 0,5 n Ammoniakwasser eluiert. Das Lösungsmittel wurde
daraus entfernt. Der Rückstand wurde getrocknet, in Methanol
gelöst, mit 4,5 g p-Toluolsulfonsäure-Monohydrat versetzt, um
auszukristallisieren. Nach dem Filtrieren wurden die Kristalle
getrocknet, wobei 3,4 g 4-O-α-D-Glukopyranosol-N-(2,3,4,5-
tetrahydroxy-n-pentyl)moranolin-p-Toluolsulfonat erhalten
wurden. Fp. 195-198°C, [α] = +139,2° (c = 1%, Wasser).
5 g 4-O-α-D-Glukopyranosylmoranolin wurden in 50 ml Dimethylformamid gelöst. Es wurden 10 ml Cyclohexenoxid zugegeben und
das Gemisch 20 Stunden lang unter Erhitzen auf 110°C gerührt.
Dann wurde das Gemisch mit Wasser verdünnt und mit n-Hexan
gewaschen. Dann wurde es durch eine 100-ml-Säule mit stark saurem
Ionenaustauscherharz (Dowex 50W × 2 (H⁺)) geschickt, um die
gewünschte Verbindung zu adsorbieren, und gründlich mit Wasser
gewaschen. Die Säule wurde mit 05, n Ammoniakwasser eluiert,
das Lösungsmittel wurde verdampft, es wurde getrocknet, dann
mit Methanol aufgenommen, und zum Umkristallisieren wurden 4,5 g
p-Toluolsulfonsäure-Monohydrat zugesetzt. Das Gemisch wurde
filtriert und getrocknet, wobei 5,8 g 4-O-α-D-Glukopyranosyl-
N-(2-hydroxycyclohexyl)moranolin vom Fp. 105-108°C erhalten
wurden. [α] = +85,0° (c = 1%, Wasser).
Claims (5)
1. Glukosylmoranolinderivate der folgenden allgemeinen
Formel (I),
in der R eine Alkylgruppe mit einer oder mehreren Hydroxylgruppen
ist.
2. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
R eine niedere Alkylgruppe mit einer oder mehreren Hydroxylgruppen
ist.
3. Verbindungen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß
eine oder zwei Hydroxylgruppen vorhanden sind.
4. Verfahren zur Herstellung der Verbindung (I) gemäß
Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß 4-O-α-D-
Glukopyranosylmoranolin auf an sich bekannte Weise alkyliert
wird.
5. Verfahren zur Herstellung von Moranolinderivaten der
folgenden allgemeinen Formel (I)
dadurch gekennzeichnet, daß eine wäßrige Lösung eines
Moranolinderivats der folgenden allgemeinen Formel (III)
(in der R eine niedere Alkylgruppe mit einer oder mehreren
Hydroxylgruppen ist) und Cyclodextrin oder lösliche Stärke
mit Cyclodextringlukosyltransferase zu 5-Oligoglukosylmoranolinderivat
der allgemeinen Formel (II) umgesetzt werden,
wobei R die vorstehend angegebene Bedeutung hat und n eine
ganze Zahl von 0 bis 15 ist, wonach mit Glukoamylase behandelt
wiid.
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