DE2227173C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft 3-Formylrifamycin SV-Derivate gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, sowie ein Verfahren zu deren Herstellung.

Bestimmte Hydrazone des 3-Formylrifamycin-SV sind in der U.S.- PS 33 42 810 beschrieben. Diese Verbindungen besitzen eine gute antibakterielle Wirkung, sind jedoch praktisch wirkungslos gegen Bakterien, die gegen andere Rifamycine, insbesondere das bekannteste und therapeutisch nützliche 3-(4-Methyl-1- piperazinyl-iminomethyl)-rifamycin SV (Rifampicin) resistent geworden sind.

Bekanntlich ist es äußerst schwierig, wenn ein Mikroorganismenstamm gegen ein bestimmtes Antibiotikum resistent geworden ist, eine weitere Verbindung aus der gleichen Antibiotika-Familie aufzufinden, die das Wachstum der resistenten Mutante inhibieren kann. Manchmal ist es sogar überhaupt schwierig, auch unter anderen Antibiotika-Arten Verbindungen zu finden, die noch gegen einen solchen resistenten Stamm wirksam sind.

Überraschend wurde nun gefunden, daß repräsentative Verbindungen der vorliegenden Erfindung in niedriger Konzentration das Wachstum von Bakterienstämmen inhibieren, die gegen andere Rifamycine resistent sind, beispielsweise das Wachstum eines gegen Rifamycin resistenten Stammes von Staphylococcus aureus Tour.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind allgemein gegen die üblichen gram-positiven und gram-negativen Bakterien sehr aktiv. Insbesondere zeigen sie beträchtliche Wirkung bei Stämmen von Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Streptococcus hemolyticus und Diplococcus pneumoniae.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen lassen sich als topische Mittel gegen eine Reihe von Mikroorganismen anwenden. Zu den topischen Anwendungsgebieten gehören akute bakterielle Infektionen, wie beispielsweise Wund- und Brandinfektionen, infizierte Ekzeme und Bartflechte.

Es wurden Mindesthemmkonzentrationen der erfindungsgemäßen Verbindungen im Vergleich mit Rifampicin und Vancomycin, die ebenfalls für topische Zwecke anwendbar sind, gegenüber einigen Erregern ermittelt. Die dabei erzielten Ergebnisse werden in nachstehender Tabelle II wiedergegeben.

Tabelle II

Minimale Hemmkonzentration

Ein weiteres wichtiges Merkmal der erfindungsgemäßen Verbindungen ist ihre inhibierende Wirkung auf DNA-Polymerasen, die für Lymphoblasten in leukämischen menschlichem Blut charakteristisch sind, und auf typische Nukleotidyltransferasen (Polymerasen) von Viren, die von der normalen Zelle nicht verwendet werden. Aus Unteruschungen an repräsentativen Gliedern von Virusarten ist bekannt, daß die Viren in die Wirtszellen Polymerasen als wesentlichen Teil ihrer Replikationen tragen oder dort induzieren. Es gibt Viren, z. B. Picorna-Viren oder Polio-Viren, welche die RNA-abhängige RNA-Polymerase induzieren, während andere Arten wie z. B. Leukämie-Sarkom-Viren eine RNA-abhängige DNA-Polymerase tragen. Die Anwesenheit und die wichtige Rolle der RNA-abhängigen DNA-Polymerase Revers-Transcriptase in oncogenen RNA-Viren wurde durch D. Baltimore, Nature, 226 (1970), S. 1209 und H. M. Temin et al., Nature, 226 (1970), S. 1211 entdeckt. Die Entdeckung eines RNA- abhängigen DNA-Polymeraseenzyms in RNA-Tumorviren tierischer Herkunft wurde auch durch andere Autoren bestätigt, siehe z. B. Green et al.: Mechanism of carcinogenesis by RNA tumor viruses, I. An RNA-dependent DNA-polymerase in murine sarcoma viruses; Proc. Nat. Acad. Sci. USA 67 (1970), S. 385-393; Spiegelman et al.: Characterization of the products of RNA directed DNA-polymerase in oncogenic RNA viruses, Nature, London, 227, (1970), S. 563;

Hatanaka et al.: DNA polymerase activity associated with RNA tumor viruses. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 67 (1970), S. 143; Scolnick et al.: DNA synthesis by RNA containing tumor viruses, Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 67 (1970), S. 1034.

Die Mitwirkung von RNA-Viren in einigen Tumoren wurde auch durch andere Tatsachen gestützt: Revers-Transcriptase wurde in Teilchen aus menschlicher Milch gefunden, die von Frauen mit Brustkrebs in der Familiengeschichte erhalten worden war (Scholn et al. Nature, 231 (1971), S. 97. Priori et al. (Nature, New Biology 232 (1971) S. 16 isolierten ein mit "ESP-1" bezeichnetes Virus, welches Revers-Transcriptase enthielt, aus Zellen der Rippenfell-Flüssigkeit eines Kindes mit Lymphom und das mit Erfolg in Gewebekulturen gezüchtet werden konnte. Bei menschlichem Brustkrebs konnte die Anwesenheit einer RNA durch Molekülhybridation nachgewiesen werden, die der Virus-RNA aus Brustkrebstumoren von Mäusen homolog ist, siehe R. Axel et al. in Nature, 235 (1972) S. 32. Bisher gibt es keine sehr wirksamen Medikamente zur Behandlung von Viruskrankheiten, da Viren und Zellen gemeinsame metabolische Anforderungen stellen. Der erfolgversprechendste Weg einer Chemotheraphie bei Viruskrankheiten ist eindeutig die Bereitstellung geeigneter Chemikalien, die sich spezifisch mit der Polymerase von Viruszellen oder durch Viren transformierten Zellen vereinigen, jedoch nicht mit den Polymerasen der Wirtszellen, die den Ausdruck der genetischen Information der Viren kontrollieren. Spezielle Inhibitoren der Enzyme von Viruszellen oder durch Viren transformierten Zellen, insbesondere Inhibitoren der Polymerasen von RNA-Tumorviren, können eine wichtige Rolle bei der Bereitstellung von Medikamenten gegen Leukämie und anderen Krebskrankheiten spielen.

Die inhibierende Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen wurde anhand der RNA-abhängigen DNA-Polymerase-Aktivität von endogenen Sarkom-Viren von Nagetieren und der DNA-abhängigen DNA-Polymerase-Aktivität von gereinigten Enzymen getestet. Die Inhibierung wurde nach den Methoden von C. Gurgo et al., Nature, New Biology, 229 (1971), S. 111, getestet.

Der Effekt der verschiedenen Wirkstoffkonzentrationen auf die Polymerase-Aktivität wurde bestimmt, indem man den ³H-dTTP (tritiiertes Thymin-deoxyribosid-triphophat)-Einbau in die unlösliche Fraktion verfolgte. Eine typische Versuchsanordnung ist folgende:

1) Isolierung der Viren und Reinigung der Virus-Polymerase.

Die Viren wurden aus durch Nagetier-Sarkom-Viren (Moloney-Typ) transformierten Rattenzellen (78A1-Zellen) und durch Nagetier- Sarkom-Viren (Harvey-Typ) transformierten Mäusezellen (MEH- Zellen) isoliert und gereinigt, siehe Green et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 67 (1970), S. 385-393, Rokutanda et al. Nature, 227, 1026-1028 (1970). Die Virus-Polymerase wurde 20- bis 40­ fach gereinigt durch Inkubation der gereinigten Viren mit 0,5% NP-40 (Nonidet P-40) in 0,1 M NaCl, 0,01 M Tris-Puffer (pH 7,6), 0,001 M Äthylendiamintetraessigsäure während 5 Minuten bei Raumtemperatur mit Zonenzentrifugierung in 15 bis 30% Sucrose-Gradienten in 10 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7,4), 2,5 mM MgCl₂, 10 mM Dithiothreit und 5% Glycerin während 24 Stunden bei 38 000 UpM in einem Spinco-SW41-Rotor. Die Fraktionen maximaler Enzymaktivität (13-17 von 22) wurden aufgefangen, vereinigt und bei -70°C in 30% Glycerin aufbewahrt.

DNA-Polymerase-Test

Die Enzym-Inkubation erfolgte 1 Stunde lang bei 37°C in 100 µl eines Reaktionsgemischs, welches 40 mM Tris-Puffer (pH 8,0), 5 mM Dithiothreit, 30 mM NaCl, 2,5 mM MgCl₂, 0,1 mM dATP, dGTP, dCTP und 10 µCi ³H-dTTP (12-18 Ci/mMol) enthielt, siehe Green et al., in Proc. Nat. Acad. Sci. US 67 (1970), S.385-393. Die Reaktion wurde durch Zusatz von 150 µl 1n-Perchlorsäure beendet. Als Träger wurden 100 µg DNA aus Kalbsthymus zugesetzt. Das radioaktive DNA-Produkt wurde nach der Vorschrift der beiden genannten Veröffentlichungen aufgearbeitet. Die Aktivität der endogenen RNA-abhängigen DNA-Polymerase wurde nach Zusatz von 0,01% PN-40 zu den gereinigten Viren zum Probezeitpunkt bestimmt. Die DNA-Polymerase-Aktivität der gereinigten Virus-Polymerase wurde unter Verwendung von 2 µg Poly d(A-T) ("Template") und ohne NP-40 gemessen.

Test auf die Inhibierung durch Rifamycin-derivate

Rifamycin-derivate wurden in Dimethylsulfoxid in einer Konzentration von 5 mg/ml gelöst und bei 4°C gelagert. Die Inhibierung der endogenen RNA-abhängigen DNA-Polymerase- Aktivität wurde getestet durch Zusatz von 2 µl der Derivatlösung in Dimethylsulfoxid oder von 2 µl Dimethylsulfoxid (Vergleich) zum Testgemisch vor Zugabe der zerkleinerten Viren, die 15-30 µg Virus-Protein enthielten. Die Enzym- Inkubation erfolgte während 60 Minuten bei 37°C. Die Inhibierung des gereinigten Enzyms wurde getestet unter Vorinkubierung von 2 µl der Derivatlösung oder von 2 µl Dimethylsulfoxid mit 30 µl Enzym (1-2 µg Protein) während 10 Minuten bei 37°C; dann wurden 70 µl Substratgemisch zugegeben und das Gemisch wurde wie oben beschrieben inkubiert und aufgearbeitet.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen der Beispiele 8, 9, 10, 11 und 12 verminderten bei Konzentrationen von 2-100 µg/ml oder weniger den Einbau von H³-dTTP auf weniger als 10% der Vergleichswerte. Dadurch wird die Inhibierung des Mechanismus der Carcinogenese durch RNA-Tumorviren klar erwiesen.

Die inhibierende Wirkung von Revers-Transcriptasen wurde ebenfalls durch Versuche mit Polymerase aus Nagetier-Leukämie- Viren bestätigt. Die RNA-Polymerase der Leukämie-Viren wurde nach der Vorschrift von Gallo et al., Nature, New Biology, 232 (1971), S. 141 aus zerkleinerten Viren in Triton X 100 hergestellt. Viren vom Rauscher- und vom Moloney-Typ wurden zunächst gereinigt durch Bandenbildung in der 1,16 g/ml-Region eines Sucrose-Dichte-Gradienten (60% Sucrose bis 20% Sucrose) nach erfolgter Zentrifugierung bei niedriger Geschwindigkeit zwecks Entfernung von Zellrückständen. Die Endkonzentration des Virus-Präparats betrug 10¹¹ Teilchen/ml. Als Vorlage (Template) wurde endogene 70S-RNA verwendet. Konzentrationen von 50 µg/ml oder weniger erwiesen sich als wirksam zur Inhibierung des Enzyms. Beispielsweise wurden Inhibierungen von ca. 50% mit Konzentrationen von nur etwa 5 µg/ml der repräsentativen Verbindungen erzielt.

Ähnliche Ergebnisse wurden bei Verwendung von Tumorzellen-Polymerase menschlichen Ursprungs erhalten. In diesem Fall wurde die inhibierende Wirkung auch an Polymerasen aus normalen Zellen untersucht, um einen selektiven Effekt festzustellen. Repräsentative Derivate der Formel I wurden hinsichtlich ihrer Wirkung auf zwei gereinigte DNA-Polymerasen bewertet, die (1) aus normalen menschlichen (PHA-stimulierten) Blutlymphozyten, (2) einer Lymphoblast-Zell-Familie (von einem normalen Spender) und (3) leukämischen menschlichen Blut-Lymphoblasten erhalten worden waren. Es wurden synthetische oder native Vorlagen (Templates) verwendet.
Ein typisches Beispiel der Versuchsausführung wird nachstehend geschildert:

Lymphoblasten aus menschlichem Blut

Leukämische Lymphoblasten wurden aus dem peripheren Blut von Patienten mit akuter lympholytischer Leukämie (ALL) durch Leukophorese isoliert. Die Zellen wurden gewaschen und die Erythrozyten wurden durch hypotonische Lysis entfernt. Ferner werden normale Lymphozyten aus dem peripheren Blut aus gesunden Spendern nach Entfernung der Granulozyten durch Nylon- Säulenchromatographie erhalten, sie wurden mit Phytohämagglutinin (PHA) 72 Stunden wie oben beschrieben (Gallo et al., Nature, 228 (1970), S. 927; Gallo et al. Science, 165 (1968), S. 400 stimuliert, um die DNA-Polymerase-Aktivität zu erhöhen.

Wegen der rechnerischen Probleme bei der Bereitstellung ausreichender Mengen dieser Zellen wurden eine "normale" Gewebskultur (1788) verwendet, die weniger hochgereinigte DNA-Polymerasen für die ersten Orientierungsversuche lieferte. Die interessanten Verbindungen wurden dann mit den stärker gereinigten Enzymen aus den normalen und leukämischen Blutlymphozyten näher untersucht. Die Zellen aus Gewebskulturen waren von Associated Biomedic System, Inc. erhalten worden.

DNA-Polymerase-Präparate

Zell-DNA-Polymerase wurde aus normalen Blutlymphozyten (PHA- stimuliert), leukämischen Blutlymphozyten sowie 1788-Lymphoidzellen durch Homogenisierung in hypotonischer Pufferlösung mit anschließender Extraktion der extralysosomalen Pellets mit Triton X 100 und/oder Lösungen mit hohem Salzgehalt gewonnen und gereinigt. Nach der Differential-Zentrifugierung wurden die Zellextrakte durch Säulenchromatographie an DEAE- Cellulose, Phosphocellulose und Sephadex G 200 weitergereinigt.

DNA-Polymerase-Tests

Die Tests auf DNA-Polymerase wurden in einem Endvolumen von 100 µl durchgeführt. Das Testgemisch enthielt 50 mM Tris- HCl-Puffer (pH 8,3), 6,0 mM MgAc, 8,0 mM Dithiothreit und 60 mM NaCl. Die Einstellung des pH-Werts erfolgte nach Zugabe der Inhibitoren, die zuvor in Dimethylsulfoxid gelöst worden waren. Die Endkonzentration an Dimethylsulfoxid betrug 0,5%, und alle Vergleichsproben enthielten diese Menge Dimethylsulfoxid. Eine Enzymkonzentration, die einen Einbau von ca. 1,0 pMol/Std. katalysierte, wurde verwendet. Das Enzym wurde in den meisten Fällen mit dem Inhibitor 5 Minuten vorinkubiert. Die Reaktion wurde dann durch Zugabe von 5 µg/ml synthetischer DNA (Poly d(AT), Miles Lab.) oder DNA.RNA-Hygrid (oligo-dT-Poly rA) oder nativen Stoffen, nämlich aktivierter Salmsperm-DNA in einer Menge von 50 µg/ml und endogener 70S Virus-RNA, 10 µCi (³H-Methyl)-TTP (New England Nuclear, 18,6 mCi/µMol, lyophilisiert und direkt vor Verwendung in 0,01 m-Salzsäure wieder gelöst) und dATP (8 × 10^-5 M, zusammen mit synthetischem Material) oder sämtlichen drei Deoxynucleosid-triphosphaten (8 × 10^-5 M bei RNA- oder DNA-basierenden Reaktionen) initiiert. Bei einigen Versuchen erfolgte keine Vorinkubation des Enzyms mit dem Inhibitor. In diesen Fällen wurden die Reaktionen beim Zusatz des Enzyms zum gesamten Reaktionsgemisch, welches den Inhibitor enthielt, initiiert. Proben wurden zu Beginn der Inkubation und nach 30 Minuten abgezogen, ihre Reaktion wurde durch Zugabe von 2 ml 0,08 m-Natriumpyrophosphatlösung beendet, und die Ausfällung erfolgte in 12,5%iger kalter Trichloressigsäure mit Hefe-RNA-(400 µg) als Träger. Die Produkte wurden auf einem Milliporen-Filter gesammelt, sorgfältig mit 5%iger Trichloressigsäure und 1 ml eines Gemisches aus Dimethylsulfoxid, Äthanol, 0,1 m-Natriumchlorid (0,5 : 70 : 29,5) gewaschen und getrocknet, dann erfolgte Zählung in 2 ml BBS₃ (Beckman) und 10 ml Liquifluor (New England Nuclear) in einem Packard- Scintillationszähler.

Es wurde gefunden, daß Konzentrationen von 5-10 µg/ml der Verbindungen der Beispiele 3 und 4 eine 5%ige Inhibierung der leukämischen Polymerase bei einer synthetischen DNA- Vorlage (Template) bewirkten. Bei synthetischer RNA (Poly rA.rU) war die Reaktion noch stärker.

Versuche mit Polymerase aus normalen und Tumorzellen bei nativer Vorlage (Template) zeigten eine höhere Empfindlichkeit der Tumorenzyme auf die getesteten Verbindungen.

Beispielsweise ergibt eine Konzentration von etwa 5 µg/ml der Verbindung 4 eine 50%ige Inhibierung der Tumorpolymerase, während sie auf normale Polymerase praktisch unwirksam bleibt. Weitere biologische Eigenschaften der neuen Rifamycinderivate sind die Inhibierung der Focus-Bildung durch Nagetier- Sarkom-Viren der Moloney- und Kirsten-Stämme in Mäuse-, Ratten- und menschlichen Zellen; die selektive Inhibierung der Virusproduktion durch bereits transformierte Mäuse oder menschliche Zellen; und die Auffindung revertierender Zellen unter Verwendung von durch das Sarkom-Virus-transformierten, keine Viren produzierenden Mäuse- und Rattenzellen. Die selektive Toxizität der erfindungsgemäßen Verbindungen für durch Viren transformierte Zellen von Mäusen oder Ratten oder Zellen menschlichen Ursprungs wurde ferner beim Test auf die Fähigkeit zur Koloniebildung bestätigt.

Bei Versuchen zur Ermittlung der inhibierenden Wirkung auf die Focus-Bildung durch Moloney-Starkom-Viren-BALB/3T3-Gewebekulturen wurde folgende Methode angewandt:
BALB/3T3-Zellkulturen wurden in 250 ml Kunststoffkolben in einem Wachstumsmedium aus Eagle's Mindestnährstoff-Medium mit 10% Fötus-Rinderserum gezüchtet. Die Zählung der Zellen erfolgte mit einem Coulter-Zähler, nachdem die Zellen mit Trypsin-Äthylendiamintetraessigsäure suspendiert und im Wachstumsmedium verdünnt worden waren. Moloney-Sarkom-Virus wurde als Tumorhomogenat verwendet. Es wurde 4 Passagen einer Mäuseembryo- Zellreihe unterworfen, dann auf Focus-bildende Einheiten in BALB/3T3-Zellen untersucht. Bei den Versuchen wurde nach einer Abwandlung der Methode von Hartley und Rowe, Proc. Nat. Acad. Scj. 55 (1966), S. 780 gearbeitet. Die Kolben wurden mit 1-2 × 10⁶-Zellen in 25 ml Wachstumsmedium geimpft und bei 37°C 24 Stunden inkubiert. Nach Entfernung des flüssigen Anteils werden Viren mit einer vorher ermittelten Anzahl Focus-bildender Einheiten in 0,5 ml des Wachstumsmediums eingeführt und an der Schicht aus einer Zellage 90 Minuten bei 37°C adsorbiert. Nach dieser Adsorptionszeit wird eine vorbestimmte Menge, gewöhnlich eine Dosis von etwa 5-10 µg/ml einer Rifamycin-Verbindung (in Dimethylsulfoxid in einer Konzentration von 1 mg/ml gelöst) in 25 ml Wachstumsmedium zugegeben und die Kulturen werden in die Inkubationsvorrichtung zurückgesetzt. Zum Vergleich wird Dimethylsulfoxid allein im Wachstumsmedium einer weiteren Kultur zugegeben. Nach 3-tägiger Inokulierung erfolgt Flüssigkeitsaustausch, und die Kerne transformierter Zellen werden am Tag 7 gezählt.

Auf die gleiche Weise werden Stomatitis-Viren (New Jersey Serotyp) untersucht; Methoden zur Züchtung und Testung dieser Viren wurden von Hackett et al., Virology, 31 (1967), S. 114 beschrieben.

Die Ergebnisse zeigen, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen eine inhibierende Wirkung auf durch Viren induzierte Tumore bei Tieren besitzen.

Ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen besteht darin, daß man 3-Formylrifamycin-SV in einem organischen Lösungsmittel mit der stöchiometrischen Menge eines Hydrazins der allgemeinen Formeln

wobei R₂ die in Anspruch 1 und R₂′ die in Anspruch 2 angegebene Bedeutung besitzt, behandelt. Nachdem man das Reaktionsgemisch einige Zeit, beispielsweise 10 Minuten bis einige Stunden, beim Raumtemperatur stehengelassen hat, wird das Rohprodukt durch Einengen oder Abdampfen des Lösungsmittels gewonnen. Die Reinigung bereitet keine besonderen Schwierigkeiten, sie erfolgt im allgemeinen durch Kristallisieren aus einem geeigneten Lösungsmittel, beispielsweise einem niedrigen Alkanol, niedrigen Acylestern niedriger Alkanole oder Benzol.

Allgemein erfolgt die Herstellung der Hydrazone, indem man zu einer Lösung von 0,01 Mol 3-Formylrifamycin-SV in Tetrahydrofuran 0,01 Mol des Hydrazons unter Rühren bei Raumtemperatur zusetzt. Nach 10-minütigem bis 3-stündigem Rühren wird ein Tropfen der Lösung durch Dünnschichtchromatographie an Kieselgel getestet, wobei das Verschwinden des Ausgangsmaterials und die Bildung des Endprodukts festgestellt werden können.

Sobald keine Carbonylverbindung mehr vorhanden ist, wird die Lösung zur Trockne eingeengt, wobei man das Rohprodukt erhält, das durch Kristallisieren aus einem Lösungsmittel oder durch Säulenchromatographie gereinigt wird.

In Tabelle 1 sind die chemischen und physikalischen Daten der erfindungsgemäßen Verbindungen aufgeführt.

Tabelle I

Claims (4)

1. 3-Formylrifamycin-SV-Derivate der allgemeinen Formel I worin R₂ einen Cycloalkylrest mit 5-8 Kohlenstoffatomen, einen 2- oder 3-Nitrophenylrest, einen 2,4-Dinitrophenylrest, einen 2- oder 3-Methylphenylrest, einen 4-Fluorphenylrest, einen 2,4,6-Trichlorphenylrest, einen 2-Phenyl-7-(trifluormethyl)-4-chinolinylrest, einen 8-(Trifluormethyl)-4-chinolinylrest, einen 4,8- Dimethyl-2-chinolinylrest oder einen 2-(4-Amino-2,6- dichlorphenoxy)-äthylrest bedeutet.

2. 3-Formylrifamycin-SV-Derivate der allgemeinen Formel II worin R₂′ den Phenyl- oder Benzylrest bedeutet.

3. 3-Formylrifamycin-SV-Derivat der Formel

4. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man 3-Formylrifamycin-SV der Formel mit einem Hydrazin der allgemeinen Formeln umsetzt, wobei R₂ die in Anspruch 1 und R₂′ die in Anspruch 2 angegebene Bedeutung besitzt.