PL81998B1 - - Google Patents

Description

Sposób wytwarzania nowych hydrazonów 3-formyloryfamycyny SV Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych hydrazynów 3-formyloryfamycyny SV o wzorze ogólnym 1, w którym Rt i R2 oznaczaja atom wodoru, grupe alkilowa, alkenylowa, alkiny- lowa, arylowa, aryloalkilowa, heterocykliczna, lub cykloalkilowa, przy czym tylko jedna z grup Ri lub R2 moze oznaczac atom wodoru, lub nizsza grupe alkilowa o 1—4 atomach wegla i w tym przypadku druga z tych grup oznacza niepodsta- wiona grupe alkilowa, lub hydroksyalkilowa o co najmniej 5 atomach wegla, lub podstawiona grupe alkilowa rózna od grupy dwumetyloaminoetylowej, albo grupe alkenylowa, alkinylowa, arylowa, arylo¬ alkilowa, heterocykliczna lub cykloalkilowa, w któ¬ rych podstawnik arylowy oznacza grupe rózna od grupy fenylowej i p-karboksyfenylowej, a arylo- alkilowy nie jest grupa benzylowa, i w którym R3 oznacza —H lub CH3CO, ewentualnie w postaci pochodnej szesciowodorowej, lub 27-dwumetoksy- -27-hydroksy. Grupy alkilowa, alkenylowa i alki¬ nylowa zawieraja najwyzej 20 atomów wegla i mo¬ ga byc rozgalezione lub nie, jak równiez moga byc podstawione atomem chlorowca (F, Cl, Br, J), gru¬ pa nitrowa, aminowa, jedno- lub dwualkiloamino- wa, cyjanowa, hydroksylowa, alkoksylowa, karbo¬ ksylowa, karboalkoksylowa, karbamylowa, fluoro- sulfonylowa, sulfonowa lub podobna. Grupy alke¬ nylowa i alkinylowa moga zawierac jedno lub wie¬ cej wiazan wielokrotnych.Grupy arylowa i aryloalkilowa moga byc pod- Z stawione w pierscieniu jedna lub wiecej nastepuja¬ cymi grupami: nizsza grupa alkilowa o 1—4 ato¬ mach wegla, atomem chlorowca, nizsza grupa chlo¬ rowcoalkilowa, aminowa, jedno i dwualkiloamino- 5 wa, cyjanowa, karboksylowa, hydroksylowa, acylo- ksylowa, karboalkoksylowa, nitrowa, karbamylowa, sulfonowa, sulfamidowa, fluorosulfonylowa. Grupa cykloalkilowa zawiera zwykle 3—18 atomów weg¬ la. Grupy heterocykliczne moga zawierac w pier- 10 scieniu jeden lub wiecej heteroatomów, przy czym co najmniej jeden z nich musi oznaczac atom tle¬ nu, siarki lub azotu.Pewne hydrazony 3-formyloryfamycyny SV zo¬ staly opisane w opisie patentowym Stanów Zjed- 15 noczonych Ameryki nr 3 342 810, znane zwiazki wykazywaly wysoka aktywnosc antybakteryjna, nie dzialaja jednak na szczepy oporne na inne ryfamy- cyny, szczególnie na najbardziej znana i stosowa¬ na 3-(4-metylo-l-piperazynylo-iminometylo)-ryfa- 20 mycyne (ryfampicyna).Wiadomo, ze pewne szczepy bakteryjne wykazuja opornosc krzyzowa na antybiotyki z danej grupy wobec czego trudno jest znalezc antybiotyk z tej samej grupy hamujacy wzrost opornego szczepu. 25 Dotyczy to w pewnych przypadkach nawet anty¬ biotyków z innych grup.Nieoczekiwanie okazalo sie, ze wytworzone spo¬ sobem wedlug wynalazku nowe zwiazki, moga ha¬ mowac nawet przy niskich stezeniach wzrost szcze- 30 pów opornych na inne ryfamycyny. W szczególno- 8199881998 3 sci zwiazki z przykladów I. II, XI, XII, XIII, XIV, XV, XXIII, XXV hamuja wzrost szczepu Staphy- lococcu aureus Touropornego na ryfamycyne w ste¬ zeniach 10 Lig/ml lub nawet mniejszych.Zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wynalaz¬ ku wykazuja na ogól wysoka aktywnosc wobec bakterii „Gram-", a w szczególnosci wobec Staphy- lococcus aureus, Streptococcus free, Streptococcus hemoliticus, Diplococcus pneumoniae. W tych przy¬ padkach minimalne stezenia hamujace wahaja sie w granicach 0,001—0,5 [ig/ml.Wytwarzane sposobem wedlug wynalazku zwiaz¬ ki wywieraja wplyw hamujacy na DNA-polimera- zy, charakterystyczne dla ludzkich leukomocznych limifoblastów krwi oraz na typowe nukleotydylowe transferazy (polimerazy) wirusów nieuzytkowane przez normalne komórki.Wiadomo z badan nad przedstawicielami grup wirusów, Ze wnosza one lub indukuja w komórce gospodarza polimerazy jako czesc ich replikacji. Na przyklad wirusy picorna- i poliowirusy indukuja RNA-zalezna RNA-polimeraze, a inne grupy takie jak leukemia-sarcoma wirusy wnosza RNA-zalezna DNA-polimeraze. Obecnosc i wazna rola RNA-za- leznych DNA-polimeraz rewertowanych transkryp- taz w onkogennych RNA wirusach zostala odkryta przez D. Baltimere'a Nature 226, 1211, (1970). Od¬ krycie RNA-zaleznych DNA-polimeraz zostalo po¬ twierdzone przez innych autorów. Green i wspól¬ pracownicy — Mechanizm dzialania rakotwórczego RNA wirusów nowotworowych. RNA-zalezna DNA- -polimeraza w wirusach sacroma u myszy i szczu¬ rów. Proc. Not Acos. Sci. USA 67 385—393, 1970.Spiegelman i wspólpracownicy — „Charakterysty¬ ka wytwarzania RNA-kierowanego DNA-polimera- zy w nowotworowych wirusach RNA". Nature, London, 227, 563, 1970. Hatanka i wspólpracownicy — Aktywnosc DNA-polimerazy zwiazana z wiru¬ sami nowotworowymi RNA. Proc. Nat. Acad. Sci.USA 67, 143, 1970. Scolniek i wspólpracownicy — Synteza DNA przez RNA zawierajace wirusy no¬ wotworowe. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 67, 1034, 1970.Implikacje RNA wirusów w niektórych nowo¬ tworach zostaly równiez potwierdzone przez inne fakty: rewertowana transkryptaze znaleziono w czastkach ludzkiego mleka uzyskanego od kobiet ze znana historia raka piersi oraz z populacji ho¬ dowanych (Scholn i wspólpracownicy — Nature, 231, 97, 1971). Priori i wspólpracownicy (Nature, New Biology 232, 16, 1971) izolowali wirusa ESP-1 zawierajacego rewertowana transkrytaze z komó¬ rek plynu oplucnej dzieci z limforna, który z po¬ wodzeniem hodowali w hodowlach tkankowych.Obecnosc w ludzkim raku piersi RNA homologicz¬ nego z wirusem RNA sutkowego raka myszy wy¬ kazano na drodze hybrydacji molekularnej (R.Axel i wspólpracownicy — Nature 235, 32, 1972).Obecnie nie ma jeszcze efektywnych srodków prze¬ ciw wirusowych, poniewaz zarówno wirusy jak i komórki wykazuja taki sam metabolizm.Najkorzystniejszym w terapii przeciwwirusowej byloby sporzadzenie leku dzialajacego specyficznie na wiralnie lub wirusowo transformowane polime¬ razy, a nic dzialajacego na polimerazy komórek 4 gospodarza kontrolujace ekspresje informacji ge¬ netycznej wirusów. Specyficzne inhibitory wiralnie lub wirusowo transformowanych enzymów komór¬ kowych, a w szczególnosci inhibitory polimeraz 5 RNA wirusów nowotworowych moga odgrywac wielka role w poszukiwaniach leków przeciw leu¬ kemii oraz przeciw innym nowotworom.Dzialanie hamujace zwiazków wytwarzanych spo¬ sobem wedlug wynalazku testowano na zmiane 10 aktywnosci oczyszczonych enzymów: RNA zaleznej DNA-polimerazy endogennego wirusa mysiej sar- comy oraz RNA zaleznej DNA-polimerazie. Dziala¬ nie hamujace oznaczano wedlug metody podanej przez C. Gurgo i wspólpracowników w Nature, 15 New Biology 229, 111, 1971. Wyniki stosowania róz¬ nych stezen leków okreslano poprzez inkorporacje 3H-dTTP (trytowany trójfosforan dezoksyrybozydu tyminy) w nierozpuszczalna frakcje. Typowy sposób postepowania polega na tym, ze wirus izoluje sie 20 i oczyszcza z wirusa szczurowej sarcomy transfor¬ mowanych komórek szczurzych (komórki 78A1) oraz z transformowanych komórek mysich (komór¬ ki MEH) wirusa sarcomy mysiej, w sposób opisany przez Greena i wspólpracowników Proc. Nat. Acad. as Sci. USA 67, 385—393, 1970, i Rokutanda i wspól¬ pracowników Nature, 227, 1026—1028, 1970. Wirio- nowa polimeraze oczyszcza sie 20—40-krotnie na drodze inkubacji oczyszczonych wirusów o 0,5% NP-40 (nonidet P-40) w mieszaninie 0,1 m NaCl, 30 0,01 m Tris buforu o wartosci pH 7,6 i 0,001 m EDTA w ciagu 5 minut w temperaturze pokojowej i zonalnego wirowania w 15—30% gradiencie cu¬ krowym w roztworze 10 mM buforu fosforanowego o wartosci pH 7,4, 2,5 mM MgCl2, 10 mM dwutio- 35 treitolu oraz 5% gliceryny w ciagu 24 godzin na wirówce Spinco SW41 (38000 obrotów na minute).Sposród 22 zebranych frakcje 13—17 wykazujace aktywnosc enzymatyczna laczy sie i przechowuje w temperaturze —70°C w 3% glicerynie. 40 Inkubowanie enzymu prowadzi sie w ciagu 1 go¬ dziny w 100 ul mieszaniny reakcyjnej zawierajacej 40 mM Tris buforu o wartosci pH 8,0, 5 mM dwu- tiotretiolu, 30 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1 mM dATP, dGTP, dCTP oraz 10 ^Ci 3H—dTTP (12—18 43 Ci/mmol) (Green i wspólpracownicy — Proc. Nat.Acad. Sci. USA 67, 385—393, 1970). Inkubacje prze¬ rywa sie przez dodanie 150 [ii 1 n kwasu nadchlo¬ rowego. Radioaktywny DNA przerabia sie w sposób opisany w powyzej cytowanych pracach stosujac 50 jako nosnik 100 |xg DNA z przysadek cielecych.Aktywnosc endogennej RNA zaleznej DNA-polime¬ razy oznacza sie po dodaniu w trakcie próby 0,01% NP-40. Aktywnosc DNA-polimerazy oczyszczonej wiralnej polimerazy mierzy sie wzgledem 2[xg poli 53 d(A-T) bez dodatku NP-40.Pochodne ryfamycyny rozpuszcza sie w dwume- tylosulfotlenku i przechowuje w temperaturze 4°C.Hamowanie aktywnosci endogennej DNA-polimera¬ zy RNA zaleznej oznacza sie dodajac do badanej 60 mieszaniny 2 \ii odpowiednio rozcienczonej w dwu- metylosulfotlenku pochodnej lub jako kontroli sa¬ mego dwumetylosulfotlenku przed dodaniem do rozbitego wirusa zawierajacego 15—30 \ig wiralnych protein. Inkubacje enzymu prowadzi sie w ciagu 05 60 minut w temperaturze 37°C Hamowanie oczysz-81*18 * f czonego enzymu oznacza sie na drodze preinkubacji 2 fil roztworu pochodnej lub dwumetylosulfotlenku z 30 fil enzymu (1—2 fig protein) w ciagu 10 minut w temperaturze 37°C, nastepnie dodaje sie 70 fil wyjsciowej mieszaniny i calosc inkubuje sie i prze¬ rabia w sposób opisany uprzednio.Na podstawie oznaczen opisanych w przykladach XI, XII, XIII, XIV, XV i XVI zwiazków, przy ste¬ zeniach %—100 fig/ml lub mniej rozcienczonych, in¬ korporacja H^ —dTTP mniejsza o 10% niz znale¬ ziona w testach kontrolnych jasno obrazuje hamo¬ wanie mechanizmu karcinogenezy przez nowotwo¬ rowe wirusy RNA zgodnie z ostatnimi wynikami badan biochemicznych.Efekt hamujacy rewertowanej transkryptazy po¬ twierdzono równiez przez test na polimerazie z wi¬ rusów szczurzej leukemii. RNA-polimeraze z wiru¬ sów szczurzej leukemii przygotowuje sie w sposób opisany przez Galio i wspólpracowników w Natu¬ re, New Biology 232, 141, 1971. Wirus typu zarów¬ no Rauschera jak Moloneya oczyszcza sie uprzed¬ nio na drodze wirowania i oddzielenia frakcji cu¬ krowej 1,16 g/ml gradientu stezen, po wstepnym niskoobrotowym wirowaniu w celu usuniecia szcza¬ tków komórkowych i przeprowadzenia 60% cukro- zy przez 20% cukroze. Koncowe stezenie prepara¬ tów wirusowych wynosi 1011 czasteczek/ml. Jako standard w czasie oznaczen stosuje sie endogenny 70 S RNA. Wykazano, ze stezenie 50 fig/ml lub mniejsze dziala w sposób hamujacy na aktywnosc enzymu. Na przyklad, okolo 50% hamowanie uzy¬ skano stosujac wybrane pochodne w stezeniach za¬ ledwie 5 fig/ml.Podobne rezultaty otrzymano stosujac polimera- zy komórek nowotworowych pochodzenia ludzkie¬ go. W tym przypadku, w celu wykazania dzialania selektywnego, wykonano oznaczenie dzialania ha¬ mujacego na polimerazach normalnych komórek.Niektóre sposród pochodnych ryfamycyny o wzo¬ rze ogólnym 1 opisano pod katem ich dzialania na dwie oczyszczone DNA-polimerazy wyodrebnione z: (1) normalnych ludzkich limfocytów krwi, (2) limfoblastów linii komórko¬ wej (otrzymanych z normalnych donorów) oraz (3) ludzkich leukemicznych limfoblastów krwi. W ba¬ daniach stosowano syntetyczne i/albo naturalne wzorce. Typowy przyklad postepowania przedsta¬ wiono ponizej.Leukemiczne limfoblasty izoluje sie z krwi ob¬ wodowej pacjentów chorych na ostra leukemie limfót^czna myje sie i usuwa erytrocyty na drodze cofania hi- potonicznego. Normalne limfocyty otrzymane z krwi obwodowej zdrowych dawców stymuluje sie T po usunieciu geanulocytów na drodze chromatografii na kolumnach nylonowych fitochemagglutynina (PHA) w czasie 72 godzin w celu zwiekszenia ak¬ tywnosci DNA-polimerazy (Galio i wspólpracowni¬ cy — Science 165, 400, 1968). Jednakze ze wzgledu na logistyczne problemy w uzyskaniu wystarczaja¬ cych ilosci tych komórek, w próbach wstepnych uzywa sie „normalna" ludzka linie komórkowa ho¬ dowli tkankowych (1788) dostarczajaca gorzej oczy¬ szczonych polimeraz DNA. Zwiazki bardziej inte¬ resujace bada sie* dokladniej na lepiej oczyszczo¬ nych enzymach z normalnych i leukemicznych lim¬ focytów krwi. Hodowle tkankowe otrzymano od Assotiatet Bimedic System,Inc. ' KomórkoweDNA-polimerazy ekstrahowane, i oczy- 5 szczone uzyskuje sie z normalnych limfocytów (sty¬ mulowanych PHA) oraz leukemicznych limfocytów krwi i limfoidalnych komórek 1788 na drodze homo¬ genizacji w buforach hipotonicznych, a nastepnie w Tritonie X 100 i/albo na drodze solnej ekstrak¬ cji frakcji ekstralyzomalnej. Po róznicowym wiro¬ waniu ekstrakty komórkowe oczyszcza sie metoda chromatografii kolumnowej na DEAE celulozie, fosfocelulozie i sefadeksie G 200.Oznaczenie DNA-polimerazy prowadzi sie w kon¬ cowej objetosci 100 fil testowej mieszaniny zawie¬ rajacej bufor Tris-HCl o pH 8,3 (50 mM), MgAc (6 mM) i NaCl (60 mM). Po dodaniu inhibitorów rozpuszczonych uprzednio w dwumetylosulfotlenku przeprowadza sie korekte pH. Koncowe stezenie dwumetylosulfotlenku powinno wynosic we wszyst¬ kich próbkach kontrolnych 0,5%. W próbie tej sto¬ suje sie stezenie enzymu katalizujacego inkorpo¬ racje okolo 1,0 mola/godzine. W wiekszosci przy¬ padków enzym preinkubuje sie w ciagu 5 minut z dodatkiem inhibitora, a nastepnie zapoczatkowu¬ je sie reakcje dodajac wzorzec w postaci synr tetycznego DNA (poli d/AT) (Miles Lab. jak tez hybrydy DNA. RNA/olige dT. polirA), w stezeniu 5 figami lub tez wzorzec naturalny taki jak DNA z aktywowanego nasienia lososia w stezeniu 50 fig/ml i endogennego 70 S wiralnego, RNA, 10/Ciy^-metylo/-TTP/New England Nuclear, 18,6 mCi) (umol), liofilizowanego i ponownie rozpusz¬ czonego w 0,1 mHCl bezposrednio przed uzyciem) oraz dATP (QXID-* m z syntetycznym wzorem) lub wszystkich trzech trójfosforanów dezoksynukle- ozydów (8X10-^ m z RNA lub DNA reakcji wzor¬ cowej). W niektórych przypadkach nie prowadzi sie preinkubacji i w tych eksperymentach inicjuje sie reakcje dodajac enzym do mieszaniny zawierar jacej juz inhibitor. Próbki pobiera sie na poczatku procesu inkubacji i po czasie 30 minut, a nastepnie przerywa sie eksperyment dodajac 2 ml fr,08 roolar- nego pirofosforanu sodowego. Produkt poddaje sie procesowi krystalizacji w zimnym 12,5% kwasie trójchlórooctowym stosujac jako nosnik 400 ng slo¬ dowego RNA. Po odsaczeniu na miliporowatym fil¬ trze, produkt przemywa sie dokladnie 5% kwasem trójfluoróoctowym ii ml mieszaniny dwumetylor sulfotlenku, etanolu i 0,1 mNaCl (0,5 :70 :29,5) su^ szy i oznacza w 2 ml BPS^Beckman) i 10 ml cieklego fluoru (New England Nuclear) na scynty¬ lacyjnym liczniku cieczowym firmy Paskard.W wybranych eksperymentach stezenia zwiazków wynosily 5—10 fig/ml i powodowaly 50% hamo¬ wanie polimerazy leukemicznej wobec syntetyczne*- go DNAi\ Reakcje standaryzowane syntetycznym wzorcem'RNA byly jeszcze czulsze. Typowe ekspe^ rymenty prowadzone z naturalnymi standardami na normalnych lub nowotworowych polimerazach ko¬ mórkowych charakteryzuja sie wyzsza wrazliwo¬ scia enzymatyczna wobec testowanych zwiazków.Na przyklad stezenie okolo 5 fig/ml zwiazku wy* tworzonego w przykladzie XI i powoduje 50% ha-^ mowanie polimeraz nowotworowych podczas gd# 15 20 *5 40 35 40 45 W 55 6081998 8 wobec zwyklej polimerazy nie wykazuje praktycz¬ nie zadnej aktywnosci. Nowe pochodne ryfamycyn hamuja tworzenie ognisk na mysich, szczurzych i ludzjdch komórkach przez szczepy Moloneya i Kirstena wirusa mysiej sarcomy, hamuja selek- 5 tywnie produkcje wirusów przez juz transformo¬ wane mysie i ludzkie komórki jak równiez sluza do wykrywania rewertowanych komórek przy po¬ mocy nieproduktywnego, transformowanego mysie¬ go i szczurzego systemu komórkowego wirusa my- io siej sarcomy. Zwiazki hydrazonowe wytworzone sposobem wedlug wynalazku wykazuja selektywna toksycznosc wobec transformowanych komórek po¬ chodzacych od myszy, szczurów i ludzi w testach na zdolnosc tworzeniakolonii. 15 Badania nad okresleniem efektywnosci zwiazków w hamowaniu tworzenia sie ognisk przez wirusa sarcomy Moloneya na kulturach tkankowych BALB/3T3 przeprowadza sie w nastepujacy spo¬ sób: kultury komórkowe BALB/3T3 hoduje sie 20 w 250 ml plastykowych naczyniach w pozywce wzrostowej skladajacej sie z pozywki Eaglesa i 10% bydlecej surowicy plodowej. Zliczanie ko¬ mórek wykonuje sie przy uzyciu licznika Coultera po zawieszeniu ich w trypsynie — EDTA i roz- 25 cienczeniu medium wzrostowym. Jako homogenat nowotworowy uzywa sie wirusa Moloneya mysiej sarcomy. Po czterokrotnym pasazowaniu w szwaj- carskiej wysoko pasazowej linii mysich komórek embrionalnych; oznacza sie ilosc jednostek tworza- 30 cych ogniska w komórkach BALB/3T3.W dalszych badaniach stosowano metode zmo¬ dyfikowana przez Hartleya i Bowea (Proc. Nat.Acad. Sci. 55, 780, 1966). W pracy tej naczynia szczepi sie komórkami w ilosci 1—2Xl(fi w 25 ml 35 medium wzrostowego i inkubuje w temperaturze 37°C w ciagu 24 godzin. Po usunieciu plynów por¬ cje wirusa z przewidziana uprzednio iloscia jedno¬ stek tworzacych ogniska wprowadza sie do 0,5 ml pozywki wzrostowej absorbuje jednowarstwowo 40 komórki w ciagu 90 minut w temperaturze 37°C.Nastepnie do badanej kultury dodaje sie zwykle okolo 5—10 iig/ml pochodnej ryfamycyny (rozpusz¬ czonej w dwumetylosulfotlenku w stezeniu 1 mg/ ml) w 25 ml medium wzrostowego i prowadzi sie 45 dalsza inkubacje. Jako próbe kontrolna dodaje sie do separowanej kultury sam dwumetylosulfotlenek w medium wzrostowym. Po trzech dniach inoku- lacji zmienia sie plyn, a ogniska transformowa¬ nych komórek zlicza sie w 7 dniu. 50 Ta sama metoda bada sie wirusa serotypu New Jersey Vesicular stomatitis. Metody stosowane w hodowli i testowaniu tego wirusa zostaly opi¬ sane przez Hacketta i wspólpracowników w Viro- logy 31, 114, (1967). Na podstawie przeprowadzo¬ nych badan wykazano, ze zwiazki wytwarzane spo¬ sobem wedlug wynalazku wykazuja dzialanie ha*- mujace na wirusy wywolujace nowotwory u zwie¬ rzat.Sposób wytwarzania nowych 3-formyloryfamy- cyn wedlug wynalazku charakteryzuje sie tym, ze 3-formyloryfamycyne SV, lub jej pochodna 25-de- zacetylowa, albo odpowiednia pochodna szesciowo- dorowa poddaje sie reakcji w rozpuszczalniku or¬ ganicznym ze stechiometryczna iloscia dowolnej hydrazyny o wzorze ogólnym H2N-NR1R2, w któ¬ rym Ri i R2 maja uprzednio podane znaczenie.Mieszanine reakcyjna pozostawia sie w tempe¬ raturze pokojowej przez okres od 10 minut do kilku godzin i po odparowaniu rozpuszczalnika otrzymuje sie surowy produkt, który oczyszcza sie na drodze krystalizacji z rozpuszczalników orga¬ nicznych takich jak nizsze alkanole, nizsze estry acylowe nizszych alkanoli lub benzen. W przypad¬ kach gdy hydrazyna zawiera w czasteczce silnie kwasne grupy, takie jak na przyklad sulfonowa otrzymuje sie zhydrolizowana w pozycji 27 po¬ chodna ryfamycyny otrzymujac zwiazek 27-dwu- metoksy-27-hydroksylowy.Podany powyzej sposób wytwarzania zwiazków wedlug wynalazku wskazuje dogodna metode ich wytwarzania nie zawezajac jednak zakresu stoso¬ walnosci wynalazku.Ogólny sposób wytwarzania hydrazynów polega na tym, ze do roztworu czterohydrofuranowego 0,01 mola 3-formyloryfamycyny SV, jej pochodnej 25-dezacetylowej, lub odpowiedniej pochodnej sze- sciowodorowej dodaje sie podczas mieszania w temperaturze pokojowej 0,01 mola hydrazyny.Po czasie 10 minut do 3 godzin przeprowadza sie analize chromatograficzna na plytce pokrytej ze¬ lem krzemionkowym. Po stwierdzeniu calkowitego zaniku zwiazku wyjsciowego z mieszaniny reak¬ cyjnej uzyskuje sie na drodze odparowania do su¬ cha rozpuszczalnika surowy produkt. Surowy pro¬ dukt oczyszcza sie na drodze krystalizacji lub me¬ toda chromatografii kolumnowej.W tablicy I podano wielkosci fizykochemiczne charakterystyczne dla zwiazków wytwarzanych sposobem wedlug wynalazku. W tablicy tej uwzgledniono zwiazki, w których grupa R3 ozna¬ cza grupe acetylowa, a nie podano wlasnosci po¬ chodnych uwodornionych.Tablica I Grupa Ri 1 x l/H. . 2/H Grupa R2 2 wzór 2 wzór 3 Rozpuszczalnik krysta¬ lizacji lub chromato¬ grafii 3 kolumna CHCyMeOH kolumna CHCyMeOH Wy¬ daj¬ nosc % 4 48 47 Temperatura topnienia °C 5 157—9 157—9 Charakterystyczne pasma w nadfiolecie i pasmie widzialnym 6 ' 475 170,6 331 281,9 475 178,5 330 290,0 |Sld9S d 10 1 1 f 3/CH3 4/H 5/H 6/H 7/H - 8/H 9/H 10/H 1l/wzór 11 12i/H 13/H 14/H 15/wzór 17 16/H 17/H 18/H 19/H 20/H 21/H 22/H 23/H 24/H 25/H 26/H 27/CH3 28/H 29/H 30/CH2 31/H 32/H 33/CH2 34/H 35/H 36/H 37/H 2 CH2COOH wzór 4 wzór 5 wzór 6 wzór 7 wzór 8 wzór 9 wzór 10 wzór 12 wzór 13 wzór? 14 wzór 15 wzór 16 wzór 18 wzór 19 wzór 20 wzór 21 wzór 22 wzór 23 wzór 24 wzór 25 wzór 26 wzór 27 wzór 28 wzór 29 -CH2-CH = CH2 wzór 30 -CH2OH wzór 31 wzór 32 16,17,18,19,28,29 szescio-wodoro wzór 33 27-demetoksy-27- -hydroksy -CH2-N(C2H5)2 CH2-CH2N (C2H5)2 wzór 34 wzór 35 wzór 36 wzór 37 3 ligoryna benzen benzen metanol benzen octan etylu metanol MeOH kolumna CHCl3/MeOH kolumna CHCl3/MeOH kolumna CHCl3/MeOH kolumna CHCl3/MeOH kolumna CHCl3/MeOH octan etylu metanol octan etylu octan etylu metanol benzen benzen octan etylu metanol czterochlorek wegla metanol metanol octan etylu czterochlorek wegla kolumna chloro¬ form: metanol 96:4 , octan etylu eter naftowy octan etylu acetor. czterochlorek wegla octan etylu czterochlorek wegla metanol 4 66 50 56 35 68 81 60 60 48 42 52 46 60 40 75 75 75 65 55 45 40 50 50 90 90 40 75 75 55 • 50 60 95 85 70 BO 5 280 280 200 z rozkladem 210 z rozkladem 200 z rozkladem 188—90 180 z rozkladem 208—10 168—72 205—15 z rozkladem 157—9 152=-6 150—1 140 206 z rozkladem 193 z rozkladem 212 z rozkladem 208 z rozkladem 215 z rozkladem 185 z rozkladem 185 z rozkladem 200 z rozkladem 193^4 178—80 22 170—5 145—8 164—6 120—4 z rozkladem 25G z rozkladem 280 160—3 244—6 200—3 190—3 6 478 340 480 335 491 356 485 352 483 343 485 348 473 480 345 486 360 500 390 475 330 476 335 490 363 483 343 510 504 364 512 382 325 512 383 487 irtO 500 384 508 389 502 384 502 368 485 358 525 425 340 475 332 470 331 485 355 502 401 475 358 475 330 474 333 348 490 357 485 358 200,9 328,9 150 320 180,5 291 165,9 258,3 191,6 341,3 164,3 326,8 166 191,4 344,0 185,8 238,9 200,5 279,3 173,0 274,0 175,0 282,3 173,2 231,2 135,4 240,9 166 194 246 170 283 178 167 304 191,6 382,8 149,1 249,5 134,2 190 161,2 259,2 157,8 248,7 237,5 243,8 210 235 228 160,5 272,1 135 233 196 230,8 143,3 215,9 179,4 268,1 155 322 154,5 244,4 187,7 225,5 204 284 222 23381998 n n t — 1 38/H 39/H 40/H 41/CH3 42/H 43/H 44/H 45/H 46/CH3 47/H 48/h 49/nC8Hi7 50/nCeHi3 51/H 52/H . 53/H ; 2 wzór 38 wzór* 39 -(CH2)ii-CH3 -(CH2)4~CH3 wzór 40 wzór (41 wzór 42 wzór 43 wzór 44 wzór 46? wzór 47 ^ nC8Hi7 nCeHia CH2CF3 ^(CHJ^it-CHa wzór 48 3 czterochlorek wegla metanol ligroina metanol metanol czterochlorek wegla czterochlorek wegla/ ligoryna heksan heksan metanol octan etylu/ligoryna metanol 4 85 90 70 60 85 75 63 65 58 69 80 60 5 160—4 174—6 118—20 150—3 214—16 194—197 z rozkladem 196—198 z rozkladem 178—181 z rozkladem 180 z rozkladem 182—187 136—147 88—94 89—95 178—183 122—123 170 6 484 357 485 342 478 340 480 343 501 440 348 365 500 336 475 350 486 350 486 475 333 480 340 490 360 203 226 156,8 250,8 127,8 231,3 130 235 lii 265 151 232 138 203 123 222 130 183 312,4 139 252 238 228 Zwiazki wyjsciowe do wytwarzania pochodnej ryfamycyny SV wytwarza sie w nastepujacy spo¬ sób: 20 g ryfamycyny S zawiesza sie w 600 ml suchego etanolu i poddaje procesowi uwodornienia w autoklawie Parra w obecnosci 2 g dwutlenku platyny Pt02 w ciagu 3 godzin w temperaturze pokojowej pod cisnieniem okolo 5 atmosfer. Po odsaczeniu katalizatora i odparowaniu rozpuszczal¬ nika do sucha surowy produkt rozpuszcza sie w czterohydrofuranie i miesza z 18 g Mn02 w tem¬ peraturze pokojowej. Osad nieorganiczny odsacza sie i po zatezeniu przesaczu do malej objetosci do¬ daje sie 300 ml octanu etylu i przemywa woda.Warstwe organiczna suszy sie siarczanem sodu i po odparowaniu otrzymuje sie 8 g produktu. Po kry¬ stalizacji w metanolu zwiazek wykazuje tempera¬ ture topnienia 158—160°C. Produkt przeprowadza sie w odpowiednia 3-formylopochodna wedlug me¬ tody opisanej w opisie patentowym Wielkiej Bry¬ tanii nr 1219 360 (przyklad V). Surowy produkt oczyszcza sie na drodze chromatografii kolumnowej z roztworu chloroformowego na zelu krzemion¬ kowym eluujac go 1% mieszanina metanolu w chlo¬ roformie. Otrzymuje sie 16, 17, 18, 19, 28, 29-sze- sci«wodorowo-3-formyloryfamycyne SV o tempera¬ turze topnienia 126—133°C.Zwiazki zestawione w tablicy II podano jedynie aby lepiej zilustrowac wynalazek. Inne hydrazony mieszczace sie w ogólnym wzorze 1, sa uzyteczne do wymienionych uprzednio celów leczniczych.Hydrazony te wytworzono sposobem wedlug wy¬ nalazku z 3-formyloryfamycyny, jej 25-dezacetylo- wych pochodnych, lub odpowiednich pochodnych szesciowodorowych przez poddanie ich reakcji z hydrazynami o ogólnym wzorze NH2-NRiR2, 35 w których podstawniki te maja znaczenie podane w ponizszej tablicy 2f. 40 45 50 55 60 Przyklad nr I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII ;XIV XV )XVI XVII JXVIII | XIX Tablica II Grupa Ri C4H9 H CH3 H C2H5 H CH3 H CH3 CH3 H C4Hg H C2H5 H H H H C5H9 Grupa R2 3 C5HH 6-dwuhydroksymetylo- amino 3-pirydazynylowa lH-2,3-benzoksazymi- lowa-4 lH-2,3-benzoksazynylo 6-chloro-lH-2,3-benzo- ksazymylowa-4 6-chloro-lH-2,3-benzo- ksazymylowa-4 6-amino-lH-2,3-benzo- ksazymylowa-4 6-fluoroftalazynylowa-l -(CH2)5-OH -(CH2)4-CeH5 -COOH-4 cykloheksylowa 2-fenylo-6-metoksy-4- -chinolinowa -i(CH2)ii-CH3 -C6H4-S02CH3-4 -C6H4-S02F-4 -C6H3(N02-2) (S02F-4) 9-aksydycylowa CsH17 |ftlftM 13 14 1 1 XIX XJXI XjXII XiXIII xxiv x*xv X[XVI xpcvn XiXVIII XXIX XXX X£jXI xpcxn XXXIII xpcxiv XXXV xxptvi X1XXVII XXXVIII XXXIX X}L XLI XLII XLIII XLIV XLV JXLVI XLVII XLVIII XLIX L ' LI LII LIII LIV Lv - JJVI LVII LVIII x LIX LX LXI LXII UXIII LXIV LXV LXVI LXVII LXVIII LXIX LXjX LXXII 2 (CaHy) 2NC2H4 CH3CL- -CHC1 CH2CH2 COOH CHaCH : CHOH2OHa C=»C-CH3 C4H9 1 CH3 H H H H H H H H H H H CH3 H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H amyl H H H H CH* ch:3 CHg H H ¦ H | 3 r CgHieOH m-nitrofenylowa 3-fenylopropylowa izoamylowa CH3 p-nitrofenylowa m-nitrofenylowa p-chlorofenylowa p-bromofenylowa m-fluorofenylowa 2,5-dwufluorofenylowa CeH^SCbFfe^^ o-metoksyfenylowa p-tolilowa 4-karboksymetoksy- fenylowa C4H4-As03H2^4 OjH^AsOaHj-* 2,6-dwumetylo-4- -izobutylofenylowa C12H25 2-fenetylowsfr CH2CH(OH)(CH2)9-CH3 4^dwufenylowa CHaCOOCa^s CH(CH3)COOC2H5 pentafluorofenylowa o-chlorobenzylowa 3,4-dwumetoksybenzy- lowa o-trójffluorometylo- fenylowa 2-(2,6-dwubromo-4- -aminofenoksy)etylowa 2-(2,6-dwubromo-4^ -acetamidofenoksy)- -etylowa 3-fenylopropylowa -fenylobutylowa 2-fenylopropylowa 4-fenylobenzylowa 2-pirydylowa 3-izobutenylowa CH2-C=iCH cyklopropylowa cyklobutylowa 2-naftylowa 2-(l,2,3,4-tetrahydro- nafitylowa) amylowa CgH4SCi8H37-2 C6H4S02CF3-4 (CF2)8CH3 2,4,6-trójnitrofenylowa CH2CH/OHC6H5 CH2CH(SH)CH3 CH2C(CH3)2SCH2C (CH3)2SH 5-cyjano-6-chloro-2- pirydylowa CH2CH2CH2S03H 1 2-tiazolylowa | 10 II 39 40 49 90 99 1 1 LXIXII LX|XIII LXXIV LXJXV LXjXVI LXXVII LXXVIII LXXIX I£GXjX LXXXI LXXJXII LXIXXIII LXXXIV LXXJCV LXXXVI LXXXVII LXXXVIII LXXXIX XC XCI XCII XCIII XCIV 1 xcv 2 H H H CH& H H H H H benzyl H H H H H " H H 1 H H H H H H CH^ 3 3,4-metylenodwuoksy- benzylowa cykloheksylometylowa CH2CH2CH2CH(CH3) CeHg CHaCHaNHCHaC^CeHs 4-pirydylo-N-tlenek 4-amino-6-chloro-3- -pirydazynylowa 5-nitro-2-pirymidylowa l,3,4-tiadiazolylowa-2 l,2,5-tiadiazolilowa-3 benzylowa 3-metylo-5-nitro-2- ISrymidylowa 2-metylosulfonylo-3,5- -dwuchioropirydylowa-4 2-benzimidazolilowa Sipurynylowa 3^(4-pirydyio)-propy- lowa * 6-pursnyloW& ^ 1-adafhantanylowa szesciochlorochinoliny- lowa-4["; CH2CE = CHC6H6 3-plrydylora^tylo lHiieJjrto-8-purynylowa 3Mnetyto-8-purynylowa 7-me1ylo-8-purynylowa ^CHaZ-OCOCHa | PL PL PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patent^e Sposób wytwarzania nowych hydwoonów 3-for- myloryfam^cyny SV o wzorze ogólnym. |, w któ¬ rym Ri i^ oznaczaja atom wodoru, grupe alkilo¬ wa, alkenylowa, alkinylowa, arytowft, aryloalkilowa, heterocykliczna lub *eykloalkilbwsi pr^E psyni^-gdy Jedna z grup Ri lub R2 oznacza a^om wodoru lub nizsza grupe altóflowa o 1—4 Atomach wegla, druga z grup Ri lub R2 oznacza nie podstawiona grupe alkilowa^ lub^hydroksyalkilowa zawierajaca co naj¬ mniej 5 atomów wegla, lub podstawiona grupe al¬ kilowa rózna od grupy dwumetyloaminoetylowej, lub tez grupy alkenylowa, alkinylowa, a^ówa, aryloalkilowa, heterocykliczna lub cykloalkilowa, w których. podstawnik arylowy jest rózny 04'gru- py fenylowej i p-karboksyfenylowej, a podstawnik aryloalkilowa jest rózny od grupy benzylowej, a R3 oznacza H^ lub CH3CO— ewentualnie w postaci 16, 17, 18, 19, 28, 29-szesciowodorowych i 27-metok- sy-27-hydroksylowych pochodnych hydrazonów 3- -formyloryfamycyny, znamienny tym, ze na 3-for- myloryfamycyny o wzorze ogólnym 45, w którym R3 ma znaczenie podane powyzej, lub na odpowied¬ nia pochodna szesciowodorowa dziala sie hydrazy¬ na o wzorze ogólnym H2N—NR1R2, W którym Rt i R2 maja znaczenie podane powyzej.81998 HO- Me, Me Me R,0™ OH 0. Me T OH ?H CH=N-NR1R2 Me O Utort Wzór 2 ® Wzór 3 CH2CH,N /C2H5 C2H5 Wiór 4 Wzór 6 O-1 CH, Wzór 5 M VCH, OH Wzór ? N.N0C6H5 Wzór 8 N Wzór 10 O Wzór 12 Wzór # N-CH, Ato/-.? Wzór 11 NO, ^NOj Ma*-a Wzór 1581998 CH3^C3 A A Wzór 16 Wzór 1? Wzór ff Wzór 20 Wzór 21 '3-^Kj Wzór 2381998 V CFc Mór 26 Uzór 28 C6H5^N Uar 25 Mór 2? \Jzor 23 N0< -CHp-CH2-0-^3 Mór 30 Mór 31.81998 UW 32 ^-S03H UW 35 Cl N02 CH2-CH2-0^ZNH2 J3 Cl — h/W % UW 35 N05 UW 36 h/W 37 CH3 UW 38 Cl ^3-ci Cl h/W 33 -81998 30/ Me 6 Wzór 46 S02F v\ 0C2H5 ior k/zor tf PZG Bydg., zam. 424/76, nakl. 110+20 Cena 10 zl PL PL PL