PL89269B1 - - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzainia nowych pochodnych ryfamycyny oraz jej 25-dezace- tylowej i 16, 17, 18, 19, 28, 29-szesciowodorowej pochodnej o ogólnym wzorze 1, w którym X ozna¬ cza grupe -CO-, -CS-, -C=NH- lub -S02-, R oznacza atom wodoru, Rt oznacza grupe alkilowa o 1—20 atomach wegla ewentualnie podstawiona grupe cy- janowa, hydroksyalkoksylowa, karboksylowa, ami¬ nowa lub podstawiona grupe aminowa, grupe alko- ksylowa o 1—6 atomach wegla, ewentualnie podsta¬ wiona grupe hydroksylowa, grupe fenylowa lub naftylowa, ewentualnie podstawiona co najmniej jednym podstawnikiem takim jak hydroksylowa, nizsza hydroksyaTkilowa, alkilowa, fenylowa, atom chlorowca, alkoksylowa o 1—3 atomach wegla, ami¬ nowa lub grupa -CH2-Ni(OOOEt)-OH, grupe aryloal- kiilowa, ewentualnie podstawiona w reszcie alkilo¬ wej grupa fenylowa, hydroksylowa, nizsza hydro- ksyalkilowa lufo aminowa albo grupe cyklopropy- lowa ailibo Ri oznacza grupe -NRjR,, w której R2 i Rj oznaczaja niezaleznie atom wodoru, nizsza grupe alkilowa o 1—6 atomach wegla, nizsza grupe altoenylowa o 3—fl atomach wegla, grupe nitrowa, grupe anilinowa, igrupe fenylowa ewentualnie pod¬ stawiona atomem chlorowca lufo nizsza grupa alki¬ lowa albo R! oznacza grupe -CONH-N-CHA lub -R4-CO-NH-N-CHA, w której R4 oznacza nizsza grupe alkilenowa lub fenylenowa, a A oznacza rodnik ryfamycyny SV albo R i Rx razem z sasiednia grupa -N-X- oznaczaja grupe czterowodoroizochinolinowa, dwuwodorokzoindolonowa i dwuwodoroindolidono- wa.Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze 3- -formyloryfamycyne SV lub jej 25-dezacetylowa albo 16, 17, 18, 19, 28, 29-szesciowodorowa pochodna poddaje sie reakcji ze zwiazkiem o wzorze 3, w którym R i X maja wyzej podane znaczenie, R5 ma znaczenie dla Rx lub oznacza grupe o wzorze -CO-NH-N=CH-A lub -R4/-CO-NH-N-CH-A, w których R4 ma wyzej podane znaczenie, zas A ozna¬ cza rodnik ryfamycyny SV o wzorze 2 albo R i Rs oznaczaja lancuch karboksylowy tworzacy wrae z sasiednia grupa -N-X- stanowia 5,6 lub 7-mioczlo- nowy pierscien heterocykliczny, skondensowany 18 z pierscieniem benzenowym. • Ponadto zwiazki wytworzone sposobem wedlug wynalazku charakteryzuja sie nastepujacymi ce¬ chami: gdy X oznacza grupe -CO- lub grupe -(C™NH)~, wówczas R1 nie moze stanowic rodnika o wzorze NR2R8, w którym rodniki R2 i R3 ozna¬ czaja atomy wodoru, a gdy X oznacza grupe -COi-, wówczas R1 nie moze byc rodnikiem p-toiilowym.Termin „grupa alkilowa" — równiez w odniesie¬ niu do czesci alkilowej innych wymienionych pod- ts stawników zawierajacych reszte alifatyczna, jak na przyklad grupa alkoksylowa — oznacza prosty lub rozgaleziony rodnik zawierajacy do 20 atomów wegla.Grupy alkilowe moga równiez zawierac jedna lub so wieksza liczbe podstawników, takich jak atomy 89 26989 269 chlorowca, grupy .nitrowe, cyjanowe, hydroksylowa alkoksyilowe, grupy keto, karboksy, karboalkoksy, grupy aminowe, acyloaminowe, hydroksyaminowe, grupy sulfonowe, sulfamidowe, tionowe.Termin „grupa arylowa" — równiez w odniesie¬ niu do czesci arylowej w innych podstawnikach zawierajacych ozesc aromatyczna — oznacza reszte benzenowa i naftalenowa, które równiez moga za¬ wierac jedna lub wieksza ilosc podstawników w pierscieniu. Podstawnikami tymi moga byc na przy¬ klad grupy alkilowe, artkenylowe, cykloaHkilowe, fenylowe, aminowe, acyloaminowe, hydroksyamino- we, mono- i dwua/lkiloaminowe, cyjanowe, atomy halogenów, grupy nitrowe, alkoksylowe, metyleno- dwuoksy, sulfo, karboksy, karbalkoksy, karbanylo, sulfonamido itp.Termin „grupa aryloatkilowa" obejmuje takze reszty alkilowe podstawione wiecej niz jedna grupa aryilowa.Jesli rodniki R i R1 razem wraz z sasiadujaca grupa -N-X- tworza skondensowany z pierscieniem benzenowym 5-, 6- lulb 7-azlonowy pierscien hetero¬ cykliczny, przy czym X jest grupa -CO-, wówczas czesc heterocykliczna moze zawierac jako podsta¬ wnik równiez inne grupy keto.Sposób wytwarzania nowych zwiazków wedlug wynalazku polega na 'dzialaniu na 3-formyloryfa- mycyne SV lub na jej pochodne 25-dezaoetylowa lub szesciowodoropochodna w przyibLizeniu równo- molowa iloscia zwiazku o wzorze 3. Reakcje prowa¬ dzi sie w odpowiednim rozpuszczalniku organicz¬ nym. "We wzorze 3, R i X maja podane wczesniej znaczenie, zas R5 moze miec te same znaczenie jak R1, a ponadto moze reprezentowac grupy o wzorze -CO-NH-NHa lub -(R4)-CO-NH-NHf, w których R4 ma podane Wczesniej znaczenie. R i R5 razem moga oznaczac lancuch karbocykliczny tworzacy wraz z sasiadujaca grupa -N-X 5-, 6- lub 7-czlonowy pier¬ scien heterocykliczny skondensowany z pierscieniem benzenowym. Reakcje prowadzi sie zwykle w tem¬ peraturze pokojowej, lecz w przypadkach, gdy szyb¬ kosc reakcji jest zbyt mala mozna mieszanine reakcyjna ogrzewac do temperatury wrzenia roz¬ puszczalnika.Jest oczywiste, ze jesli zwiazek o wzorze 2 po¬ siada dwie grupy 'funkcyjne hydrazynowe, to wów¬ czas produkt koncowy jest azyna 3-formyloryfamy- cyny SV o wzorze 1.Nowe zwiazki wytworzone sposobem wedlug wy¬ nalazku sa barwnymi cialami stalymi, które mozna krystalizowac ze zwyklych rozpuszczalników orga¬ nicznych, takich jak nizsze alkanole, octan etylu, dioksan, ozterowodorofuran, benzen oraz chlorowane weglowodory. Rozpuszczalnosc tych zwiazków w rozpuszczalnikach organicznych zailezy oczywiscie od charakteru i wieilkosci podstawników R, R1 i X.Jesli w zwiazku wystepuje kwasowa grupa fun¬ kcyjna to zwiazek ten jest rozpuszczalny równiez w wodzie, tworzac sole z odpowiednimi zasadami, taflami jak metale alkaliczne. Zwiazki wytworzone sposobem wedlug wynalazku wykazujac znaczna •lotywnosc bakteriobójcza przeciwko bakteriom grem-dodatnim i gram-ujemnym.W szczególnosci ta nowa klasa zwiazków chara¬ kteryzuje sie znaczna aktywnoscia przeciwko szcze¬ pom gronkowca zlocistego (Staphylococcus aureus).W tym przypadku minimalne stezenie inhibitujace wzrost bakterii wynosi okolo 0,001—0,05 jig/ml.Zwiazki te wykazuja równiez aktywnosc przeciwko innym drobnoustrojom odpornym na dzialanie in¬ nych znanych i szeroko stosowanych antybiotyków.W miarodajnych doswiadczeniach prowadzonych na myszach stwierdzono, ze ilosc od okolo 1 mg do io okolo 5 mg/kg ciala zwierzecia daje wysoce efekty¬ wne inhiibitowanie doswiadczalnego zakazenia za pomoca gronkowca zlocistego. W innych doswiad¬ czeniach reprezentatywne zwiazki wytwarzane spo¬ sobem wedlug wynalazku swoja aktywnosc w daw- kach 1—5 L*g/ml równiez przeciwko szczepom Staphylococcus aureus Tour odpornych na inne ryfamycyny, normalnie stosowane w praktyce te¬ rapeutycznej. Toksycznosc nowych zwiazków jest bardzo niska i wynosi okolo 250—1500 mg/kg.Inna istotna cecha zwiazków bedacch przedmio¬ tem wynalazku jest ich zdolnosc do inhibiitowania aktywnosci polimeraz DNA, które sa charaktery¬ styczne dla bialaczkowych limfoblastów krwi ludz¬ kiej. Zwiazki te dzialaja rówriez przeciwko trans- i5 ferazom nuikleotydylowym i(pc4Lmeraza) wirusa nie wykorzystywanego przez normalna komórke. Jest faktem znanym z badan na reprezentatywnych przed- stawicielach grup wirusów, ze moga one albo wnosic, albo powodowac powstawanie we wnetrzu komórki polimeraz jako zasadniczej czesci swojego dzialania.I tak istnieja wirusy takie jak wirus picorna lub wi¬ rus polyo, które powoduja powstawanie zaleznej od RNA polimerazy RNA, podczas gdy inne wirusy, takie jak wirusy bialaczkowo-miesakowe daja zale- zna od RNA polimeraze DNA. Obecnosc oraz wazna role zaleznej od RNA polimerazy w odwróconej transkryptazie w organicznych wirusach RNA wy¬ kryl D. Baltimore, Nature, 226, 1209 (1970) oraz H.M.Temini inni, Nature 226 1211 ,(1970). 40 Ostatnie odkrycie zaleznej od RNA polimerazy DNA w nowotworowych wirusach RNA u zwierzat zostalo potwierdzone równiez przez innych autorów w wyniku badan opisanych w nastepujacych pra¬ cach: Green i inni: Mechanism of carcinogenesis 4g by RNA tumor Yiruses. An RNA — dependent DNA — pollymerase in murine sarcoma viruses. Proc.Nat. Acad. Sci. USA 67, 385—393, 1970. Spiegelman i inni: Oharacterization of the products of RNA direct DNA — polymerases ;iin oncogenic RNA vi- ruses, Nature London, 227, 563, 1970.Hatanaka i inni: DNA — polymerase activity asso- ciated with RNA tumor viruses. Proc. Nat. Acad.Sci. USA, 67, 143, 1970.Scolnick i inni: DNA synthesis by RNA containing tumor viruses. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 67, 1034, 55 1970.Zwiazek miedzy wirusowym RNA a niektórymi nowotworami zostal potwierdzony równiez przez inne fakty, mianowicie stwierdzono odwrotna trans- 60 kryptaze w czastkach pochodzacych z mleka ludzkie¬ go pochodzacego od kobiet, w których rodzinie wy¬ stepowal rak sutki od populacji zblizonych (wsob¬ nych). Schottn i inni. Nature, 231, 97, 1971.¦Prori i inni: (Nature New Biology, 232, 16, 1971) 65 wyodrebnili wirusa o nazwie ESP-1 zawierajacego89 269 odwrotna transkryptaze, z komórek pochodzacych z wysieku oplucnowego dzieci dotknietych lifoma.Wirus ten udalo sie dalej hodowac ma pozywkach tkankowych.Obecnosc utworów RNA homologicznych do RNA wirusa mysiego nowotworu sutkowego w (Ludzkiej tkance nowotworowej sutka wykazano przez ekspe¬ rymenty polegajace na hydradacji czasteczkowej przeprowadzonych przez R. Axela i innych.(Nature, 235, 32 1072) Mozliwosc istnienia ludzkiego wirusa nowotworu sutka potwierdzona zostala w mikroskopii elektro¬ nowej mleka ludzkiego (N.H. Saiikar i inni, Nature, 236, 103, (1972).Równiez z komórek miesniaka — miesafca prazko- wano-komórkowego wydzielono wiroisopodobne cza¬ stki wykazujace kierowana przez RNA aktywnosc polimerazy DNIA. i(McAlliister i inni, Nature, New Biol. 235, 3, 1972). Dotychczas nie odkryto skutecz¬ nych srodków zwalczania chorób wirusowych, po¬ niewaz i wirusy posiadaja zblizony metabolizm.Najbardziej obiecujaca metoda chemoterapii chorób wirusowych jest oczywiscie wynalezienie odpowie¬ dnich substancji chemicznych, które specyficznie (swoiscie) laczylyby sie z polimerazami wirusowymi lub polimerazami komórek zaatakowanych przez wirusy, kontrolujac genetyczna informacje wirusów.Specyficzne inhibitory aktywnosci enzymów po¬ chodzacych od wirusów luib od zaatakowanych komórek, a zwlaszcza inhibitory polimeraz nowo¬ tworowych wirusów RNA sa szczegóOinie istotne przy opracowaniu leków przeciwko bialaczce i innym postaciom raka. Inhibitujaca aktywnosc zwiazków bedacych przedmiotem wynalazku ibadano za pomo¬ ca polimerazy DNA mysiego wirusa nowotworowego (endogenicznej) oraz zaleznej od DNA aktywne] polimerazy DNA z oczyszczonych enzymów (poli d A-Tas).Dzialanie inhibitujace badano zgodnie z me¬ toda opisana przez C. Gurgo i innych, Nature, New Bioiagy, 229, 111, 1971.Wplyw róznych stezen stosowanego srodka na aktywnosc polimerazy okreslono przez pózniejsze wprowadzenie HMTTP ((trytowany trójfosforan de- zoksyiybozyiotyminy) do czesci nierozpuszczalnej.Typowymi przykladami doswiadczalnych metod sa metody opisane ponizej.Izolowanie wirusa i oczyszczenie polimerazy wi¬ rusowej. Wyizolowano i oczyszczono wirus z my¬ siego wirusa miesalka (wyodrebniony przez Molo- neya) z przetworzonych (transformowanych) komó¬ rek szczurzych oraz mysiego wirusa miesakowego (wyodrebniony przez Jarveya) transformowanych komórek mysich w sposób uprzednio opisany (Green i dinni. Proc. Nat. USA, 67, 385^393, 1970. Rokutanda i inni, Nature, 227, 1026^1028, 1970). Polimeraze wirusowa oczyszczono na drodze 20-^40 krotnej in¬ kubacji oczyszczonego wirusa z 0,5% NP-40 (nie- identyczny z P-40) w 0,1 mola Nad 0,01 mola roz¬ tworu 'buforowego tris i(pH 7,6), 0,001 mola EDTA (kwasu wersenowego) w czasie 5 min w temperatu¬ rze pokojowej i nastepnie strefowe wirowainie w —30% roztworze sacharozy w 10 -molach roztworu buforowego fosforanu sodowego (pH-7,4), 2,5 mmola MgCl2, 10 mmola dwiutiotreitolu i 5% gliceryny w czasie 24 godz. przy szybkosci wirowania 38000 obr/ /min. w wirówce typu Spinco SW 41. Frakcje o naj¬ wiekszej aktywnosci enzymatycznej (13^17) sposród 22 frakcji zebrano, zmieszano i przechowywano w temperaturze —70°C w 30% roztworze gliceryny. 8 Próba polimerazy DNA. Inkubacje enzymu wyko¬ nywano przez okres 1 godz. w temperaturze 37°C w 100 ul mieszaniny reakcyjnej zawierajacej 40 m mola roztworu buforowego Tris (o pH-8,0), m moli dwutiotreitolu, 30 m moli Nad, 2,5 m mola MgCl* io 0,1 m mola dATP (trójfosforan dezoksyryhoryloade- niny), cGTP D,CTP (trójfosfloran dezoflcsyryibozylocjrtozyny) oraz jiCi 8H-dTTP (12—18 Ci/m mol) zgodnie z opisem Greena i innych (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 67, 385—393, 1970). Reakcje przerwano dodajac 150 pi 1 N roztworu kwasu nadchlorowego. Dodano 100 fil DNA pochodzacego z cielecej grasicy jako nosnik, radioaktywny produkt DNA przerabiano w sposób opisany we wspomnianych wczesniej dwóch pra- cach. Endogeniczna, zalezna od RNA aktywnosc polimerazy DNA mierzono po dodaniu 0,01% NP-40 do oczyszczonego wirusa w czasie próby. Aktywnosc enzymatyczna oczyszczonej wirusowej polimerazy DNA mierzono za pomoca 2 pi poly d(A-T) jako templatu oraz NP-40.Badanie dzialania inhibitujacego pochodnych ry- famycyny. Pochodne ryfamycyny rozpuszczono w dwumetylosulfotlenku (DMSO) w stezeniu 5 mg/ml i przechowywano w temperaturze 4°C. Inhibitowanie aktywnosci enzymatycznej endogenicznej, zaleznej od RNA polimerazy DNA badano w nastepujacy sposób: do mieszaniny próbki bezposrednio przed jej dodaniem do zniszczonego wirusa, który zawie¬ ral 15 do 30 \xl bialka wirusowego, dodawano 2 |xl odpowiednio rozcienczonej pochodnej w dwumetylo- sulfotlenku luib tez 2 jil samego dwumetyflosulfo- tlenku jako próbe kontrolna. Inkubacje enzymu pro¬ wadzono w czasie 60 min. w temperaturze 37°C.Inhibitowanie oczyszczonego enzymu badano przez wstepne inkubowanie 2 ul pochodnej lub 2 jil DMSO z 30 pil enzymu i(l—2 fig bialka) przez okres 10 min w temperaturze 37°C. Nastepnie dodawano 70 fil mieszaniny sulbstratów i mieszanine reakcyjna inku- bowamo w dalszym ciagu, a nastepnie przerabiano w sposób opisany ponizej.W reprezentowanych badaniach zwiazków wy¬ tworzonych sposobem wedlug wynalazku przy ste¬ zeniach od 2-^100 g/ml lub mniej, stwierdzono zmniejszone wprowadzenie trytowanego dTTP do o wartosci ponizej 10% stwierdzonej w próbkach kon¬ trolnych. Wskazuje to w sposób oczywisty, zgodnie z najnowszymi pogladami biochemicznymi na inhi¬ bitowanie mechanizmu rakotwórczego wirusów no¬ wotworowych RNA.Inhitoitujacy wplyw odwrotnych transkryptaz zo¬ stal potwierdzony takze w badaniach na polimerazie pochodzacej z wirusa mysiej bialaczki. Zalezna od RNA polimeraza DNA wirusa mysiej bialaczki wy¬ tworzona zostala z wirusów zniszczonych za pomoca Tritonu X 100 w sposób opisany przez Galio i in¬ nych, Nature, New Biology, 232, 141 (1971).Wirusy typu zarówno Raiuschera jak i Moloney'a zostaly uprzednio oczyszczone przez rozdzielnie pas¬ mowe w 1,16 g/ml obszarze gradientu gestosci sa- 65 charczy po wstepnym wirowaniu z mala szybkoscia89 269 7 celem usuniecia resztek substancji komórkowych i stlumiono w 60% sacharozie poprzez 20% sacha¬ roze. Koncowe stezenie preparatu wirusowego wy¬ nosilo 1011 czastek/ml. Jako templat uzyto endogeni- cznego RNA wirusa 70 S. Stezenie 50 g/ml lub mniej okazalo sie dostatecznie efektywne do inhibi- towania aktywnosci enzymu. Podobne wyniki uzy¬ skano przy zastosowaniu polimeraz z komórek nowotworowych pochodzenia ludzkiego. W tym przypadku badano aktywnosc inhibitujaca takze na polimerazach pochodzacych z komórek normalnych, celem okreslenia selektywnosci dzialania. Reprezen¬ tatywne pochodne ryfamycyny o wzorze 1 oszacowa¬ no na podstawie ich wplywu na dwie oczyszczone polimerazy DNA wydzielone z: 1) ludzkich limfocytów normalnej krwi (stymulowa¬ nej za pomoca filochemoaglutyniny), 2) komórek limfóblastów (otrzymanych od normalnego dawcy), 3) ludzkich limfóblastów krwi bialaczkowej. Stoso¬ wano tu syntetyczne i/lub naturalne templaty.Typowe przyklady metod eksperymentalnych opi¬ sano ponizej.Limfoblasty krwi ludzkiej. Bialaczkowe limfobda- sty izolowano z obwodowej krwi pacjentów dotknie¬ tych ostra bialaczka limfocytowa, które wydzielono na drodze leukoforezy. Komórki przemywano, a ery¬ trocyty (krwinki czerwone) usuwano na drodze hy- potonolizy (niszczenie za pomoca roztworów hipoto- nicznych).Limfocyty normalne uzyskiwano z obwodowej krwi zdrowych dawców po usunieciu granulocytów na drodze chromatografii kolumnowej na nylonie.Limfocyty stymulowano za pomoca fitohemoagluty- niny przez okres 72 godz. w sposób opisany poprze¬ dnio (Galio i inni, Nature, 228, 927, 1970; Galio i inni, Scince, 165, 400, 1968) w celu zmaksymaibizo- wania aktywnosci polimerazy DNA. Z uwagi na pewne trudnosci w otrzymywaniu odpowiedniej ilosci tych komórek „normalna" ludzka kultura tkankowa (1788) uzywana byla do zaopatrywania mniej oczyszczonych polimeraz DNA w niektórych z poczatkowych eksperymentów. Omawiane zwiazki badano bardziej szczególowo za pomoca lepiej oczy¬ szczonych enzymów z limfocytów normalnej i bia- laczkowej krwi ludzkiej. Te komórki hodowli tkan¬ kowej otrzymywano z Associated Biomedic Systems, Inc.Wytwarzanie polimerazy DNA. Komórkowe poli¬ merazy DNA ekstrahowano i oczyszczono iz limfocy¬ tów krwi normalnej (stymulowano za pomoca fito- chemoaglutyniny) oraz limfocytów krwi bialaczko- wej oraz komórek limfoidowych (1788) na drodze homogenizacji w hipotonicznym roztworze buforo¬ wym. Nastepnie poddawano ekstrakcji za pomoca Tritonu X 100 lub/i roztworu soli o duzym stezeniu z plytek ekstralizosomalnych. Po rózniczkowym wi¬ rowaniu ekstraktów komórkowych poddawano je dalszemu oczyszczaniu na drodze 'Chromatografii kolumnowej na celulozie DEAE, fosfocelullozie oraz Sephadesie G 200.Próby polimerazy DNA. Próby polimerazy DNA prowadzono w objetosci koncowej 100 1. Mieszanina próbna izawiierala roztwór buforowy Tris-HGl p pH — 8,3 w ilosci 50 m moli, octan magnezu w ilosci 8 6 m moli, dwutitreitol w ilosci 8 m moli i NaCl w ilosci 6 m moli.Regulowanie pH wykonywano po dodaniu inhibi¬ torów, które poprzednio rozpuszczono w dwumetylo- sulfotlenku. Koncowe stezenie DMSO wynosilo 0,5% i wszystkie próbki kontrolne (porównawcze) zawie¬ raly te 'ilosc dwumetylosulfotlenku. Enzym stosowa¬ no w stezeniu powodujacym katalizowanie powsta¬ wania substancji z szybkoscia 1,0 piko mola/godz.Enzym w wiekszosci przypadków inkubowano wste¬ pnie przez Okres 5 min z inhibitorem. Nastepnie reakcje inicjowano przez dodanie templatu zarówno syntetycznego DNA i(poli d/AT/ z Miles Lab.) i hy- dryd DNA-RNA (oligo dT-pdlii rA) w ilosci 5 \d/ml lub tez templaty naturalne: endogeniczne RNA wi¬ rusa 70 S, 10 fjiCi ;(3H-metylo)-TTP (z New England Nuclear — 18,6 mli/mol, liofilizowany i powtórnie rozcienczony bezposrednio przed uzyciem za pomoca 0,01 m HC1) oraz dATlP (8-10"5 mola, z syntetycznym templatem). Ostatnio trzy zwiazki byly w postaci dezoksynukleozydów trójfosforanowych .(8*10"5 mola, templowane DNA lub RNA). W niektórych doswiad¬ czeniach nie stosowano wstepnej inkubacji enzymu z inhibitorem. W przypadkach tych reakcji inicjo- wano przez dodanie enzymu do pelnej mieszaniny reakcyjnej, która zawierala inhibitor. Z mieszaniny pobierano próbki na poczatku okresu inkubacji i po min, a reakcje przerywano przez dodanie 2 ml 0,08 m roztworu pirofosforanu sodu, po czym wy- tracano produkt za pomoca 12,6% zimnego roztwo¬ ru kwasu trójchllorooctowego przy zastosowaniu drozdzowego RNA (400 g) jako nosnika. Produkty zbierano za pomoca filtra Millipore, przemywano intensywnie 5% roztworem kwasu trójdiiloroocto- wego i 1 ml mieszaniny DMSO-etanol- 0,1 molowy roztwór NaCl (w stosunku 0,5 :70 :29,5), suszono i zliczano w 2 ml BBS3 (Beckman) i 10 ml liauifluoru (New England Nuclear) za pomoca licznika scynty¬ lacyjnego dla cieczy typu Packard. 40 Stwierdzono, ze stezenie w granicach 5—20 g/ml powoduje 50% inhibitowanie aktywnosci polimerazy bialaczkowej z syntetycznym templatem DNA.Reakcje z udzialem syntetycznego templatu RNA (pali rA.rU) byly nawet jeszcze bardziej czule.Miarodajne doswiadczenia przeprowadzane z natu¬ ralnymi templatami polimeraz komórek normalnych i nowotworowych wykazaly wyzsza czulosc enzy¬ mów nowotworowych na badane zwiazki.Innymi cechami 'biologicznymi przejawianymi 50 przez nowe pochodne ryfamycyny sa: inhibitowanie tworzenia sie ognisk zapalnych w komórkach my¬ sich, szczurzych i ludzkich pod wplywem szczepu Moloneya i Kirstena wirusa miesaka mysiego oraz selektywne iinhibitowanie wytwarzania wirusów przez juz przeksztalcone komórki mysie i ludzkie.Zwiazki ryfamycynowe bedace przedmiotem wyna¬ lazku potwierdzily w badaniach nad zdolnoscia tworzenia kolonii swoja selektywna toksycznosc wzgledem komórek zaatakowanych przez wirusy 60 pochodzace od myszy, szczurów i ludzi.W badaniach nad okresleniem wplywu zwiazków bedacych przedmiotem wynalazku na inhibitowanie tworzenia sie ognisk zapalnych pod wplywem wiru¬ sa mdesakowego Moloney^a w hodowlach tkanko- 65 wych BALB/3T3 stosowano nastepujacy sposób po-9 stepowania. Kulture komórkowa BALB/3T3 hodo¬ wano w 250 ml kolibach z tworzyw sztucznych w srodowisku hodowlanym zawierajacym srodowisko Eacle'a wraz z 10% bydlecej surowicy plodowej.Zliczanie komórek prowadzono za pomoca licznika Coulter po wytworzeniu zawiesiny komórek w mie¬ szaninie trypsyny z solami kwasu etylenodwuamino- czterooctowego i rozcienczajac w .pozywce hodowla¬ nej. Wirus mysiego miesaka Molonej^a stosowano w postaci homogenatu tkanki nowotworowej. Byl on pasazowany_ czterokrotnie w linii komórkowej embriona mysiego wielokrotnie pasazowanego (po¬ chodzacego ze Szwajcarii) i próbowany na wytwa¬ rzanie zapalnych ognisk w komórkach BALB/3T3.W badaniach tych zastosowano modyfikacje meto¬ dy opisanej przez Har£le'a i Rowe, Proc. Naft. Acad.Sci. 55, 780 (1966). Zawartosc kolb zaszczepiono ko¬ mórkami w ilosci 1—2X106 'komórek w 25 ml po¬ zywki i inkubowano w temperaturze 37°C przez okres 24 godz. Po usunieciu plynów wirus w okre¬ slonej uprzednio ilosci •jednostek tworzacych ogni¬ ska wprowadzono do 0,5 ml pozywki hodowlanej rumozliwiono absorpcje jednowarstewkowa komó¬ rek przez okres 90 min w temperaturze 37°C. Po tym okresie absorpcji okreslona ilosc, zwykle jako dawke od okolo 5 do okolo 10 ng/ml zwiazku piro- noryifiamycynowego (rozpuszczonego uprzednio w dwumetylosulfotlenku w stezeniu 1 mg/ml), wpro¬ wadzono do 25 ml pozywki hodowlanej, a naste¬ pnie hodowle powtórnie umieszczono w inkubatorze.Jako próbke porównawcza dodawano w odrebnej hodowli do pozywki hodowlanej sam dwumetylosul- iotlenek. Po trzech dniach inkubacji w hodowlach tych wymieniono plyny i ogniska lub znieksztalcone komórki zliczono po uplywie 7 dni.Ta sama metoda badano wirus pecherzykowego zapalenia jamy ustnej (typu serologicznego New Yersey). Zastosowana metoda hodowla i badania tego wirusa opisana zostala przez Hacketta i innych, Yirology, 31, Iil4, (1967).Omówione wyniki wskazuja, ze zwiazki otrzymy¬ wane sposobem wedlug .wynalazku charakteryzuja sie znaczna aktywnoscia inhibitowania zwierzecych nowotworów wywolanych przez wirusy.Ponizej podano przyklad ilustrujacy wytwarzanie reprezentatywnych zwiazków sposobem wedlug wy¬ nalazku.Przyklad. Do roztworu w czterowodorofuranie, zawierajacego 0,01 mola 3-fonnylorylamycyny SV lub jej pochodnych: 25-dezacetylowej i 16, 17, 18, 19, 28, 29-szesciowodorowej dodano w temperaturze po¬ kojowej 0,01 mola zwiazku o wzorze HgH-NROC-Rs.Reakcje przeprowadzono w czasie 2—i godzin. W przypadku, gdy po tym okresie czasu badania chro¬ matograficzne na plytce zelu krzemionkowego wska*- za, ze reakcja nie zaszla calkowicie, nalezy miesza¬ nine reakcyjna ogrzewac do wrzenia pod chlodnica zwrotna w czasie 15—45 min. Nastepnie mieszanine reakcyjna odparowano do sucha, a otrzymany su- irowy produkt krystalizowaino z rozpuszczalników organicznych, na przyklad metanolu, octanu etylu lub Chloroformu, badz itez oczyszczono na drodze chromatograficznej.W tablicy I podano dane fizykochemiczne zwiaz¬ ków o wzorze 1. wytworzonych z 3-formyloryfamy- 269 cyny SV i pochodnej hydrazynowej o wzorze 2 oraz rozpuszczalniki stosowane w krystalizacji.Podano (równiez, jakie moga wystepowac rodniki oznaczone we wzorach symbolami R, Rj i X. PL

Claims (3)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowych pochodnych ryfa- mycyny o ogólnym wzorze 1, w którym X oznacza grupe -CO-, -CS-, -C=NH- lub -S02-, R oznacza io atom wodoru, Rt oznacza grupe alkilowa o 1—20 atomach wegla ewentualnie podstawiona grupa cy¬ janowa, hydroksyalkoksylowa, karboksylowa, ami¬ nowa lub podstawiona grupe aminowa, grupe alko- ksylowa o 1—6 atomach wegla ewentualnie pod- 15 stawiona grupa hydroksylowa, grupe fenylowa lub naftylowa ewentualnie podstawiona co najmniej jednym podstawnikiem takim jak hydroksylowa, nizsza hydroksyalkilowa, alkilowa, fenylowa, atom chlorowca, alkoksylowa o 1—3 atomach wegla, ami- 20 nowa lub grupa -CH2-N(COOEt)-OH, grupe aryloal- kilowa ewentualnie podstawiona w reszcie alkilo¬ wej grupa fenylowa, hydroksylowa, nizsza hydro- ksylalkilowa lub aminowa albo grupe cyklopropylo- wa albo Rx oznacza grupe -NR2R8, w której R2 i Rs 25 oznaczaja niezaleznie atom wodoru, nizsza grupe alkilowa o 1—6 atomach wegla, nizsza grupe alke- nylowa o 3—6 atomach wegla, grupe nitrowa, gru¬ pe anilinowa, grupe fenylowa ewentualnie podsta¬ wiona atomem chlorowca lub nizsza grupa alkilowa 30 albo Ri oznacza grupe -CO-NH-N-CHA lub R4-CO-NH-N-CHA, w której R4 oznacza nizsza gru¬ pe alkilenowa, lub fenylowa, a A oznacza rodnik ryfamycyny SV albo R i Rx razem z sasiednia grupa -N-X oznaczaja grupe czterowodoroizochinolinowa, 35 dwuwodoroizoindolonowa i dwuwodoroindolodiono- wa, znamienny tym, ze 3-formyloryfamycyne SV poddaje sie reakcji ze zwiazkiem o wzorze 3, w którym R i X maja wyzej podane znaczenie, R5 ma znaczenie podane dla Ri lub oznacza grupe 40 -CO-NH-NH2 lub -(R4)-CO-NH-NH2 albo R i R6 oznaczaja lancuch karboksylowy tworzacy wraz z sasiednia grupa -N-X piecio lub szescio albo sie- dmioczlonowy pierscien heterocykliczny skondenso¬ wany z pierscieniem benzenowym. 45 2. Sposób wytwarzania nowych 25-dezacetylowych pochodnych ryfamycyny o ogólnym wzorze 1, w którym X oznacza grupe -CO-, -CS-, -C=NH- lub -S02-, R oznacza atom wodoru, Rt oznacza grupe ~ -NRjRj, w której R2 i R8 oznaczaja niezaleznie atom 50 wodoru, nizsza grupe alkilowa o 1—6 atomach wegla, nizsza grupe alkenylowa o 3—6 atomach wegla, grupe nitrowa, grupe anilinowa, grupe fenylowa ewentual¬ nie podstawiona atomem chlorowca lub nizsza grupa alkilowa albo RA oznacza grupe -CO-NH-NCHA lub 5B R4-CO-NH-N-CHA, w której R4 oznacza nizsza gru¬ pe alkilenowa lub fenylowa, a A oznacza rodnik lyfamycyny SV albo R i Rx razem z sasiednia grupa -N-X oznaczaja grupe czterowodoroizochinolinowa, dwuwodoroizoinolonowa i dwuwodoroindolodionowa, 60 znamienny tym, ze 25-dezacetylowa pochodna 3- -formyloryfamycyny SV poddaje sie reakcji ze zwia¬ zkiem o wzorze 3, w którym R i X maja wyzej podane znaczenie, R5 ma znaczenie podane dla Ri lub oznacza grupe -CO-NH-NH2 lub -(R4)-CO-NH- 65 -NH2 albo R i R5 oznaczaja lancuch karboksylowy89 269 11 12 y—i cd o " Xi cd tH pcy; etle ze pasma absor fiolecie i w swi widzialnym c/2 "73 sg = £ o- O w X fi i T3 23 £§ ^ cd 3 Tempera' topnien lub rozkJ °C k prz i lub rafii :zalni izacj Latog] N CC g w -+- O ozpu krys chr X X tó « cd pocho wana cd n £2 .2-3 o * •w j^ '£ ^ Ci 00 t co LO Th 00 CM rH ° o ~ lo cm c oo co cm N oo cm n in Oi tF #rv T3 LO . „ Ti H cocgr-ooLn£coooLO..,co . „ . ^ CM 00 00 CM £ . ~ 00 00 CM < cq CN D-HCOH©C5 &COHC005 0(^)0 COOiLOLOCOLOCDCOLOCDLOCDCOLO i—li—li—li—li—li-HNi—li—li—li—iNi—li—1 2 '2 2 c 1:0 - OT r- v^ *G M^mmt-Mr2comtco«cot ^ooco^oo^yco^oo^^oooo ooooooooooooj^ooooooooj^cooo ^COOOOLO O O O LO Ó ** CO t- CO OS 00 CO CO Ol CO OD COCO 1 ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ^** ^^ ^^ olooooloolooolooloo C-^LOCOCOCiCOCDCOCOOCOCOCO O LO O O LO O O 1 [ C5 LO I t C5 in OtC^)I 1 1 1 co 1 1 1 1 oo 1 1 1 1 co^com2coHCOin^coHcoco r-ii-Hi-lcM^CMcMi-IcM^cMcMi-li-H c cd fi O d 3 p fi D p T3 »»» £* t ,—i -+J -4- +J , | ,_( -M -4-J -l-J ,_( , 1 ^ O CUdJC^ooCJCJCDoOfH 2 § o c a a g g c a £ g g s (D+J^ratoro-M+JCOdtli-p+jH +j -^ -^ CD 'CD c NriOOOOri^cjocjriescD OGcdOOOfifiOOOfifi^ ttOOOOOOOOOOOOO oouuouoooouuuo O (N ^ |7 O CM ^ br CD COCOi-li-li-ip^COi-li-li-lp^i-l « w v0 sO ^O ^O ^O £ ^O ^O -O -O ffi ^O 00 CM 00 co CM 00 1—1 I ^ o Ci o CO 1 CO c- 1—1 fi CD N fi 0) o o CO 1-1 u -o N "tf o 05 CM CD 1—1 ^ 00 co co c- ^ lo t co 1 lo C~ 1—1 fi CD N fi CD Xi o u o CM J-l -o N LOH^hCOCOCOCO I^OOcMTFOl^Ot^ CM000O0O0OCMCMCM CO O CO £- 00 LO i—l LO inocoahmhin i—ii—ii—ii—ii—ii—ii—ii—i 'tcoMinmw^io oooooooooooooooo oooooooooooooooo CDOOOOOOO D-COCOCOCOCOCOCO LO LO LO O LO LO O O LO[LOLOLOCOCDCO o 00 Ci L^ D- Ci LO CO MMIII,. i-HtLOLOt-00C0.o COCOCOCOL^C-LOZ: i—li—li—li—li—li—li—1 " cd cd cd cd cd cd cd 'Eb fi fi fi fi fi 'tuo $* 'o 'o 'o 'o 'o s? Sh U U U f-i ** CUD tUO tUO CUD CJO ^ 8 3 3 33 3 S £ ^ ,;,, ^ /-< -l^ -M -M -4- -4-» C j-jCjCDCDCDCDCD'^ picDcdcdcdcdcdcD cDncjcjcjoon ^uoooooo oooooooo ouuuooou u hH CO hH ^ ri ffi ^ ri ® M ° CNCJr^CNUCMCMOO 1 ^ 1 t-l __« f ^( ,_N ^( ^ U vO ffi ffi vO ffi vO ^O ^O N m m N m N N N I 00 00< CO CM i-H 00 CO* i-H 00 i-H CM* C3i -O^COLOOCOOOCO ggcMCM^OO^OOCM ., ,, h CD h H it CO in Q^COt05HCOCi3c6 w^m^oo^coco i—li—li—li—li—iCMi—ii—ii—1 OOLDi-HLOTPf-'^!—Ii-H ^OO^OO^^TJH'^'^ 000000000000000000 OOOOCMOCMOLO O2C0O5C0C0OSC0O5C0 ^^ ^^ ^^ ^* ^^ ^* ^^ ^^ ^^ 1 cMLOOLOOLOLOOLO oit-ol^mcocoffico 188 168 192—5 190 190—4 185 250 260 190 2 tl CD- 3 2 B^ ^ s^^^^ h UOOuOOOO g^fifiofifififi N^jcdcd^cdcdcdcd j ci3+j4j<1)-p+j+j+j Jrj+JCDCD+^CDCDCDCD ^SESSEGE w OOOOtt^OOO uuououooo CM^COCO1^, Oi-HOOLO fOMCOMn^^^^ ^^^^uu^^^ NNNN^i^-NNN w W ffi KKpHpHKwWWKKKffiwKKKwKWhMffi £ W o u X W ffi o o o 1 1 1 o o o u o o X H « ffi H M K 1« ^^m005»Hi-l^tC3ii—li-H^rH -o tz vo -o -o *o ^o £; -o *o -o -o *z vo £ffi£££££K££££K£ [ 1-1 5-i o N £ C5 i—1 U o N £ ko o MW n ¦ ffi W W o o u 1 1 1 o o o u u u HM^MMlfi^ffl CMg^CM^CMCMCM o £ z ^o *z vo -o ^o ^M^.^^ in 1 X u ffi ^ c/b u hmioiE®ow^ 00000000^00^^-^ o ^o -o ^o z ^o -o ^o ^o NNNNc^iNNNN zzzzxzzzz89269 13 14 OS co t co LO "* 00 CSJ »H LO §8 . ~ CSJ °* .~ 00 00 OS LO tr- lo Tf< CO 00 00 LO O co co Tt< ^ LO O OS TJH CSI l 1 CM g D w—i -*-» o cu -*-» cd fi u c o O O U U i Cl X ^ « o *° ffi J? n n x M W 1 X u 1 o X u 1 o u 2 E M ^O £ iJ? £ K U LO L"" CSI t 00 CSI ^H CO Ci LO L CO oo oo 00 OO O LO co r- «* -tf LO LO CS CO O O csi 1 CSJ 2 3 •—1 -^ o cu C r* « S -m co 6 8 0 O u u X o o £ £ o M W w o, w o 04 w u o o o u C2 X * z I-I I £ W LO TJH CS LO CSI CO LO CT LO L O LO ^ Th 00 00 LO LO 00 CO TJH T*H LO LO LO LO o k OS 1 1 1 1 LO L O CO CSI i-H g o o .Sec O cd cd O W U U »H LO 1—1 CD i—i 00 TJH O CO esj Tt< 00 TJH CO Tt< o 00 co 1 1 o CM o c cd +J CU s 0 u 00 LO u N "^ LO* 00 t 1—1 co co "tf co LO CO T*H o CD o 1—1 1 1 CO o CSI c o -4- CU o cd o o LO LO I-I N i-l L <* © TJH | 00 CS! TJH LO CO i-H t CD "^ LO TlH 00 00 00 CSJ O co co T}H TF LO CO t- [ 1-1 LO 1 S ci N 3 cd UO CU1 £ JA 2 p s * .c -^ o « 2 £ cu cd N O o o w O u u t- H H W S H H »o O 1 o u X o fc m i u X £ CSJ LO t-l N £ TJH LO u £ u ? 04 u 1 o u co ii ^ £ u ¦ N 04 & w to t csi oi -* 00 CSI CSJ CO Ci CO LO CSJ LO OS CO 00 CO 00 00 co" o co co TJH ^ LO LO co co co 00 LO 1 1 O 00 00 CSJ i-t CSJ 3 g cu o .5 - G 0 3^
2. 2. Cd +j o o u o II a ffi V u li X X w ffi ^ WW W J5 u o d 04 X X u u 1 1 o o o o X X z z 1 1 C4 04 ffi W i-l CO 00 Tl< D' CD CSJ CSI Oi OS csi tjh TlH 00 LO 00 Tt< Tt< 00 00 lo" Tin" o Oi LO Tf o co 00 CD o o 00 00 CSJ CSI 3 % o cu g C rn .S rt S O -m cd tr g?3 o o u u < ffi u -CONHN- wzór 59 X X X X o u o o X co z w J_ ** oi N X £ I ^H CSJ CSJ co ^H 00 o T}H co o co TJH co Cl Tf 1 o co cd tJD cu- z M CU S-i ^o 5 o o t-l CU N ó w i-H CD I-I -o N CO LO LO LO "^ i-H CO [ rr * CSJ CSJ ^° CSJ . ^ . ^ CSJ Oi CSJ . ^ LO csi lo co ^h LO LO i—1 LO LO O O CO co ^ ^ oo 00 00 00 00 O 00 CD O co oo oi co ^ ^H ^ ^ o co o lo os Ci co Oi o u u co v £ ^ i i3 *a | co o o o L l CSJ CO i-l i-H CSJ i-t 3 ^H ^ o o oj^j cd cd J5 o 5 CU CU CU Cl -^ EEG5g OOO O u u u o X z o o < CO LO I . hrH l CO CO J? {H CD 04 QJ t-l t-l M II t-l »o ^o w -o N N U h. N jrj K W M X o co t-l -o £ 04 ¦ 2 X Zf u y O oiO u x u CSJ ^ ffi ^ ffi 50 • a ffi a t-l t-l 1 (7 1 vo ^o n § &; N N oi O e^ ^ £ W U ffi L CSJ "^ Tl^ CSJ LO "tf 00 LO 00 Tt< I CO LO CD CSJ o z cd ¦*J CU s tyj o II X u oo ^ co T^H oó t- 1—1 oo ^ 00 LO co "^ CD Oi tj cu •o ° 00 csi o c cd ¦4-J CU w u 1 m x * u u a u a w 04 X o II o II X u 1 Sz; có u co ii 50 ^ ^ J. N 04 ^ ffi B co co t-l -o N £89 269 15 tworzacy wraz z sasiednia grupa -N-X piecio lub szescio albo siedmioczlonowy pierscien heterocykli¬ czny skondensowany z pierscieniem benzenowym.
3. 3. Sposób wytwarzania nowych 16, 17, 18, 19, 28, 29-szesciowodorowych pochodnych ryfamycyny o ogólnym wzorze 1, w którym X oznacza grupe -CO-, -CS-, -C=NH- lub -S02-, R oznacza atom wodoru, R± oznacza grupe -NR2R3, w której R2 i R8 ozna¬ czaja niezaleznie atom wodoru, nizsza grupe alkilo¬ wa o 1—6 atomach wegla, nizsza grupe alkenylowa o 3—6 atomach wegla, grupe nitrowa, grupe anili¬ nowa, grupe fenylowa ewentualnie podstawiona atomem chlorowca lub nizsza grupa alkilowa albo Rx oznacza grupe -CO-NH-N-CHA lub R4-CO-NH- 10 16 -N-CHA, w której R4 oznacza nizsza grupe alkile- nowa lub fenylowa, a A oznacza rodnik ryfamycy¬ ny SV albo R i Rj. razem z sasiednia grupa -N-H oznaczaja grupe czterowodoroindolidionowa, zna¬ mienny tym, ze 16, 17, 18, 19, 28, 29-szesciowodorowa pochodna 3-formyloryfamycyny SV poddaje sie rea¬ kcji ze zwiazkiem o wzorze 3, w którym R i X maja wyzej podane znaczenie, R5 ma znaczenie podane dla Ri lub oznacza grupe -CO-NH-NH2 lub -(R4)-CO-NH-NH2 albo R i R5 oznaczaja lancuch karboksylowy tworzacy wraz z sasiednia grupa -N-X- piecio lub szescio albo siedmioczlonowy pierscien heterocykliczny skondensowany z pierscie¬ niem benzenowym. Me Me Wzór 489 269 Wzór 5 Wzór 7 Wzór 6 Wzór 8 CH2-CH2OH H-N-NH-OC Wzór 9 CH2-CH2OH Wzór 10 'UH2L/H2, "^1 Wzór 12 O II /O Wzór 14 W- V H2N-N Wzór 13 h2n-nh-coy^ H-OOOC-N-ClC^ n5o2v. I OH Wzór 15 HO-N-CH I Y^j H2N-NH-C0-C=(C6Hs) COOC2H5 Wzór 16 CH2OH Wzór 17 \ /C=(C6H5)C0 H2N-NH-CON^v HOCH2 Wzór IB HOCK Wzór 19 AJ89 269 H2N-NH-CO-C .C6H5 \ H0CH2 Wzór 20 CH, ÓHjOH" H-C CH, HOCH2 Wzór 22 Wzór 21 H2N-NH-O0-CH Wzór 23 -CH, CH, CH ,CH2 XCH2 Wzór 24 HgN-NH-CO- CH, '7 VlH2-CH CH, Wzór 25 CH, (^\ CH, Wzór 26 Wzór 27 -(CH2)S-^) HjN-NH-CO-Cr^/ Wzór 28 ui-i. * \ 4 Wzór 29 -CH o Wzór 30 H^l-NH-CO- Wzór 3{ -CH,-^ Wzór 34 hzn-nh-co-ch5-^^ Wzór 33 0CH3 HgN-NH-CO^^J 0CH3 Wzór 3589 269 PCH3 7 ^ H2N-NH-CO-CH-CH2-/ VOH OCH3 Wzór 36 NH2 Wzór 37 NH -ch-chz-^QMh h2n-nh-c-nh-.no2 Wzór 38 Wzór 39 •h2n-nh-coY~Vnh, Wzór 40 ^NH2 Wzór 4\ H2N-NH-C0H^Var Wzór Al o-* Wzór 43 NH, ^N-NH-CO-f VCL Wzór 44 NH, // V-Cl Wzór 45 h2n-nh-cs-nh^JMh3 nh^^chs Wzór 46 Wzór 4? CL / H2N-NH-D0-NH^Q Wzór 49 CH3 H2N-NH-CS-NH^3 Jl m-^J Wzór 49 OH, // ^\ Wzór 50 Wzór 5189 269 Wzór 52 OCH, H2N-NH-CO- OH ^ Wzór 53 OCH, Wzór 54 Wzór 55 Wzór 55 h,n-nh-cs-nh-nh/~^ hn-nh^ Wzór 57 H^NH-CA^C-NH-NH2 0 ° f\ Wzór 5B -^^-CONHN=CHA Wzdr 59 CL l^-HN-SO^^CL CL Wzdr 60 a Wzór 61 a H^N-NH-CO-CCH^-CH-COOH OgHgCHjOCONH Wzór 62 CL CsHeCr^OCONH , vX -(CH^-CH H*N NH CU \=I COOH iin2 Wzór 63 Wzór 64 NH?CL CL NH2 CL Wzór 65 H,N-NH-00-C=(C6H5)2 HO Wzór 6689 269 -C=(<*H5) KN-NH-CS-NH^^ HO Wzór 67 ~{=ym* Wzór 69 _JOt "0 NHZ Wzór 71 OH OCH, 1 / -b Wzór 73 Wzór 68 -O-Br : 1 OH Wzór 70 OH l -^-NHCOCH3 Wzór 72 N02 ^N02 Wzór 74 N02 /0C2H5 /00H5 N02 0C2H5 Wzór 75 Wzór 76 N02 .OH * N02 HO CH5 Wzór 78 Wzór 79- OH J—%— OCH, Wzór 7? -O-S03H Wzór 60 ^ ^ COOH Wzór 82 Ct -<&s -O -sOnO* Cl Wzór 83 Wzór 84 Wzór B5Wzór 86 89 269 HO Wzór 88 Wzór 67 CH*<^-0 -CH2-0 Wzór 89 0-CH2 Wzór 90 Wzór 91 X"X$) lV) -CHZ Wzór 92 Wzór 93 Wzór. 94 -O Wzór 95 C=-S0fcNH Wzór 97 OCH, Br Wzór 99 Wzór 96 N02 Wzór 9& Wzór -fOO NH^^^N02 -NH^O-CL Wzór 101 Wzór 40289 269 ,Cl CH, NH^(_ \x Wzór i03 NH^ Wzór fl5 CL NH^O^Cl Wzór l07 NH-^^-CL Wzór IM NH^O Wzór i06 NH-^3 CHS Wzór 1D8 NH-t^V^ Wzór 103 H COMHNH, Wzór UD PL