PL89270B1 - - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jesit sposób wytwarza¬ nia nowych pochodnych pironoryfamycyny o wzo¬ rze ogólnym 1, w którym R oznacza nizszy rodnik alkilowy, grupe hydroksylowa lub nizsza grupe alkoksylowa oraz jej pochodnych: 25-dezacetylo- wej i 16, 17, 18, 19, 28, 29-szesciowodorowej.Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania no¬ wych zwiazków o dzialaniu bakteriobójczym.W ponizszym opisie i w PL

Claims (1)

1. zastrzezeniach czesc al¬ kilowa w rodnikach alkilowych i alkoksylowych .stanowi prosty lub rozgaleziony lancuch alifatycz¬ ny zawierajacy 1—4 atomów wegla. Sposobem wedlug wynalazku wytwarza sie nowe zwiazki na drodze reakcji 3-formyloryfamycyny SV lub jej 25-dezacetylowej badz szesciowodoro- pochodnej z równomolowa iloscia zwiazku o wzo¬ rze 2, w którylm R ma podane wyzej znaczenie, zas R1 oznacza grupe CN, COOH lub COOR2, przy czym R2 oznacza prosty lancuch alifatyczny zawierajacy od 1 do 4 atomów wegla. Reakcja cyklizacji przebiega poprzez kondensacje grupy metylenowej w zwiazku o wzorze 2 z grupa for- mylowa w polozeniu 3, w czasteczce ryfamycyny, a nastepnie przez kondensacje rodnika Rf i grupy OH w polozeniu 4 w ukladzie ryfamycynowym. Zaleznie od charakteru rodnika Rf nastepuje od- szczepienie wody, amoniaku lub nizszych alkoho¬ li. Reakcje prowadza sie w warunkach, jakie zwy¬ kle stosuje sie w syntezie kumaryn, wychodzac 25 30 2 z aromatycznych o-hydroksyaldehydów, która to reakcja nosi miano reakcji Knoevenagela (Org. Reactions, vol. 15, 204). W przypadku .tyim stosu¬ je sie zwykle zasadowy totalizator, którym mo¬ ze byc zasada aminowa, taka jak piperydyna, pi¬ rydyna lub dwuetyloamina. *W innych przypad¬ kach jako katalizator imoga byc wykorzystane so¬ le amonowe lub sole metali alkalicznych, jak octan amonu, potasu lub sodu. O ile zwiazek o wzorze 2 jest szczególnie reaktywny, wówczas reakcje mozna prowadzic bez udzialu kataliza¬ tora. Jako odpowiednie rozpuszczalniki stosuje sie nizsze alkanole, benzen, czterowodorofuran, chlo¬ roform, a w przypadku uzycia octanu amonu lub soli Imetali alkalicznych jako katalizatora, sto¬ suje sie kwas octowy. Reakcje przeprowadza sie w temperaturze od okolo 0°C do temperatury wrzenia rozpuszczalnika, w zaleznosci od szybkosci reagowania zwiazku o.wzorze 2. Nowe zwiazki sa barwnymi cialami stalymi, (które mozna wykry¬ stalizowac ze zwyklych rozpuszczalników organicz¬ nych, takich jak aceton, nizsze alkanole, octan etylu, czterowodorufan. Rozpuszczalnosc tych zwiazków w rozpuszczalnikach organicznych za¬ lezy oczywiscie od typu i wielkosci podstawoika- OOR. Jesli w zwiazku wystapuje kwasowa grupa funkcyjna, to wówczas zwiazki te sa równiez roz¬ puszczalne w wodzie jako sole metali alkalicznych. 89 2703 89 270 4 Zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wynalazku wykazuja duza biologiczna aktywnosc przeciwko szczepom bakterii gram-dodatnich i gram-ujem- nyoh, oraz wykazuja niewielka toksycznosc. Re- prezentatywne eksperymenty wskazuja, ze zwiazki omówione w przykladach I i II w stezeniach od 0,1 do 5 Y/ml inhibituja wzrost bakterii Strepto- coccus hymolyticus, Staphylococcus aureus, Diplo- coccus pneumoniae i Mycobacterium tuberculosis H37Rv. Omówione zwiazki zastosowane w niewielkich stezeniach inhibituja równiez wzrost innych drob¬ noustrojów odpornych na dzialanie znanych i po¬ wszechnie stosowanych antybiotyków. Omawiane zwiazki charakteryzuja sie takze sta¬ bilnoscia chemiczna, poniewaz nie wystepuje juz w nich uklad hydrohinonowy, który móglby byc latwo naruszany pod wplywem czynników utlenia¬ jacych. Inna istotna cecha zwiazków wyitworzonych spo¬ sobem wediug wynalazku jest ich zdolnosc do in- hibitowania aktywnosci polimeraz DNA, które sa charakterystyczne dla bialaczikowyoh limfoblasitów kirwi ludzkiej. Zwiazki te dzialaja równiez prze¬ ciwko tranaferazom nukleotydylowyim (polimeraza) wirusa nie wykorzystywanego przez normalna ko¬ mórke. Jest faktem znanym z badan na repre¬ zentatywnych przedstawicielach grup wirusów, ze moga one albo wnosic, albo powódowiac we wne¬ trzu komórki powstawanie polimeraz jako zasad¬ niczej czesci swojego dzialania. I tak, istnieja wi¬ rusy, takie jak wirus picorna lub wirus polyo, które powoduja powstawanie zaleznej' od RNA pod¬ czas gdy inne wirusy, takie jak wirusy bialacz- kowo-imiesakowe daja zalezna od RNA polimeraze DNA. Obecnosc oraz wazna role zaleznej od RNA polimerazy DNA w odwróconej transkryptazie w organicznych wirusach RNA wykryl B. Baltimore, Nature, 226, 1209 (1970) oraz H. M. Temin i inni, Nature, 226, 1211 (1970). Ostatnie odkrycia zaleznej od RNA polimerazy DNA w nowotworowych wirusach RNA u zwie¬ rzat zostalo potwierdzone równiez przez innych autorów w wyniku badan opisanych w nastepu¬ jacych pracach: Green i inni: Mechanism of carcinogenesis by RNA tumor viruses. An RNA — dependent DNA — polymerase in morine sarcoma viruses. Proc. Nat. Acad. Siei. USA 67. 385—393, 1970. Spiegel- man i inni: Characterization of the products of RNA direct DNA — polymerases in oncogenie RNA viruses, Nature, London 227, 563, 1970. Hatsnaka i inni: DNA — polymerases activiity associated with RNA tumor vinuses^ Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 67, 143, 1970. Scolnick i inni: DNA synthesis by RNA containing tumor viruses. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 67, 1034, 1970. Zwiazek miedzy wirusowym. RNA i niektórymi nowotworami zostal potwierdzony równiez przez inne fakty, mianowicie stwierdzono odwrotna transkryptaze w czastkach pochodzacych z mle¬ ka ludzkiego pochodzacego od kobiet, w których rodzinie wystepowal rak sutki oraz od populacji zblizonych (wsobnych). (Scholn i inni, Nature, 231, 97, 1971). Prori i inni; (Nature New Biology, 232, 16, 1971) wyodrebnili wirusa o nazwie ESP-1 zawierajacego 5 odwrotna transkryptaze, z komórek pochodizacych z wysieku oplucnoiwego u dzieci dotknietych lifo- ma. Wirus ten udalo sie dalej hodowac na pozyw¬ kach tkankowych. Obecnoc utworów RNA homologicznych do RNA wirusa mysiego nowotworu sutkowego w ludzkiej nowotworowej tkance sutka wykazano przez eks¬ perymenty polegajace na hydratacji czasteczko¬ wej, przeprowadzonych przez R. Axeila i innych, (Nature, 235, 32, 1972). Mozliwosc istnienia ludzkiego wirusa nowotworu sutka potwierdzona zostala w mikroskopii elek¬ tronowej mleka ludzkiego (N. H. Sarkar i inni, Nature, 236, 103, 1972). Równiez z komórek miesniako-miesaka prazko- wano-komórkowego wydzielono wirusopodobne czastki wykazujace kierowana przez RNA aktyw¬ nosc polimerazy DNA. (McAllister i inni, Nature, New Biol. 235, 3, 1972). Dotychczas nie odkryto skutecznych srodków zwalczania chorób wiruso¬ wych, poniewaz i wirusy i komórki posiadaja zbli¬ zony metabolizm. Najbardziej obiecujaca metoda chemoterapii cho¬ rób wirusowych jest wynalezienie odpowiednich substancji chemicznych, które specyficznie laczylyby sie z polimerazami wirusowymi lufo polimerazami komórek zaatakowanych przez wirusy, kontrolujac genetyczna informacje wirusów. Specyficzne inhi¬ bitory aktywnosci enzymów pochodzacych od wi¬ rusów lub od zaatakowanych komórek, a zwlaszcza inhibitory polimeraz nowotworowych wirusów RNA sa szczególnie istotne przy opracowaniu leków przeciwko bialaczce i innym postaciolm raka. Inhi- bitujaca aktywnosc zwiazków bedacych przedmio¬ tem wynalazku badano za pomoca polimerazy DNA mysiego wirusa nowotworowego (endoge- nicznej) oraz zaleznosci od DNA aktywnej poli¬ merazy DNA z oczyszczonych enzymów (poli d A — Tas). Dzialanie inhibituijace badano zgodnie z metoda opisana przez C. Gurgo i innych, Na¬ ture, New Biology, 229, 111, 1971. Wplyw róznych stezen stosowanego srodka na aktywnosc polime¬ razy okreslono przez pózniejsze wprowadzenie H3 dTTP (trytowany trójfosforan dezoksyrybazydoty- miny) do czesci nierozpuszczalnej. Typowymi przy¬ kladami doswiadczalnych metod sa metody opi¬ sane ponizej. Izolowanie wirusa i oczyszczanie polimerazy wi¬ rusowej. Wyizolowano i oczyszczono wirus z mysiego wi¬ rusa miesaka (wyodrebniony przez Molonyea) z przetworzonych (transformowanych) komórek szczu¬ rzych oraz mysiego wirusa miesakowego (wyod¬ rebniony przez Jarveya) transformowanych ko-, morek mysich w sposób uprzednio opisany (Green i inni, Proc. Nat. USA, 67, 385—393, 1970; Roku- tanda i inni, Nature, 227, 1026—1028, 1970). Poli- meraze wirusowa oczyszczono na drodze 20—50- krotnej inkubacji oczyszczonego wirusa z 0,5% 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6089 270 NP-40 (nieidentyczny z P-40) w 0,1 mola NaCl, 0,01 mola roztworu buforowego tris (pH 7,6), 0,001 mola BDTA (kwasu wersenowego) przez okres 5 min. w temperaturze pokojowej i nastepnie stre¬ fowe wirowanie w 15—30% roztworze sacharozy 5 w 10 mimolach roztworu buforowego fosforanu so¬ dowego (pH = 7,4), 2,5 mlmola MgCl2, 10 mmoli dwutioitreitolu i 5% gliceryny przez okres 24 godz. przy szybkosci wirowania 38000 ofor./min. w wi¬ rówce typu Spin co SW41. Frakcje o najwiekszej 10 aktywnosci enzymatycznej (13—17) sposród 22 frakcji zebrano, zmieszano i przechowywano w temperaturze —70°C w 30% roztworze gliceryny. Próba polimerazy DNA. 15 Inkubacje enzymu wykonywano przez 1 godz. w temperaturze 37°C w 100 ml mieszaniny reak¬ cyjnej zawierajacej 40 mlmoli roztworu buforowego Tras (o = pH = 8,0), 5 mmoli dwutioitreitolu, 30 m moli NaCl, 2,5 m mola MgCl2, 0,1 m mola dATP - (trójfosforan dezoksyryboryloadeniny), dGTP (trój- fosforan dezoksyryibozyloguaniny), d, CTP (itrój- fosforan dezoksyrybozylocytozyny) oraz 10 Ci 3H-dTTP <12—18 Ci/m mol) zgodnie z opiiselm Gree- na i innych (Proc. Nat. Acad. Sci, USA, 67, 385, 25 1970). Reakcje przerwano dodajac 150 1 i N roz¬ tworu kwasu nadchlorowego. Dodano 100 g DNA pochodzacego z cielecej grasicy jako nosnik. Radio¬ aktywny produkt DNA przerabiano w sposób opi¬ sany w wyzej wymienionych dwóch pracach. Endo- 30 geniozna — zalezna od RNA aktywnosc polimerazy DNA mierzono po dodaniu 0,01% NP-40 do oczy¬ szczonego wirusa w czasie próby. Aktywnosc enzy¬ matyczna oczyszczonej wirusowej polimerazy DNA mierzono za pomoca 2 ^g poly d(A—T) jako tein- 35 platu oraz NP-40. Badacie dzialania inhibitujacego pochodnych ryfamycyny. Pochodne ryfalmycyny rozpuszczono w dwume- tylosulfotlenku (DMSO) w stezeniu 5 mg/ml i prze¬ chowywano w temperaturze 4°C. Inhibitowanie aktywnosci enzymatycznej endogenicznej, zaleznej od RNA polimerazy DNA badano w nastepujacy sposób: do mieszaniny próbki bezposrednio przed jej dodaniem do zniszczonego wirusa, który zawie¬ ral 15 do 30 jxg bialka wirusowego, dodawano 2 ^,1 odpowiednio rozcienczonej pochodnej w dwurne- tyloisulfotleinku lub tez 2 jxl samego dwumetylo- sulfotlenku jako próbe kontrolna. Inkubacje enzy- 50 mu prowadzono przez 60 min w temperaturze 37°C. Inhibitowanie oczyszczonego enzymu badano przez wstepne inkubowanie 2 u.1 pochodnej lub 2 u.1 DMSO z 30 |tl enzymu (1—2 jug bialka w czasie 10 min. w temperaturze 37°C. Nasitejpnie dodawano 55 70 ^1 mieszaniny substratów i mieszanine reak¬ cyjni inkubowano w dalszym ciagu, a nastepnie przerabiano w sposób opisany powyzej. W reprezentatywnych badaniach zwiazków wy¬ tworzonych sposobem wedlug wynalazku przy ste¬ zeniach od 2—100 g/ml lub 'mniej stwierdzono zmniejisizone wprowadzenie trytowanego dTTP do .wartosci ponizej 10% stwierdzonej w próbkach kontrolnych. Wskazuje to w sposób oczywisty, 65 40 zgodnie z najnowszymi pogladami biochemicznymi na inhibitowanie mechanizmu rakotwórczego wiru¬ sów nowotworowych RNA. Inhibitiujacy wplyw .odwrotnych transkryptaz zostal potwierdzony takze w badaniach na polime- razie pochodzacej z wirusa mysiej bialaczki. Za¬ lezna od RNA polilmieraza DNA wirusa mysiej bia¬ laczki wytworzona zoistala z wirusów zniszczonych za pomoca Tritonu X 100 w sposób cpisany przez Galio i innych, Nature, New Biology, 232, 141, (1971). Wirusy typu zarówno Rausichera jak i Molo- ney'a zostaly uprzednio oczyszczone przez roz¬ dzielanie pasowe w 1,16 g/ml obszarze gradientu gestosci sacharozy po wstepnym wirowaniu z 'mala szybkoscia celem usuniecia resztek substancji ko¬ mórkowych i stlumiono w 60%i sacharozie poprzez 20% sacharoze. Koncowe stezenie preparatu wiru¬ sowego wynosilo 10*1 czastek/ml. Jako templat uzy¬ to endogenicznego RNA 70 S. Stezenie 50 g/ml lub mniej okazalo sie dostatecznie efektywne do inhi- bitowania aktywnosci enzymu. Podobne wyniki uzyskano przy zastosowaniu polimeraz z komórek nowotworowych pochodzenia ludzkiego. W tyrn przypadku badano aktywnosc inhibiitujaca takze na polimerazach pochodzacych z komórek nor¬ malnych' celem okreslenia selektywnosci dziala¬ nia. Reprezentatywne pochodne ryfamycyny o wzorze 1 oszacowano na podstawie ich wplywu na dwie oczyszczone polimerazy DNA wydzielone z: 1) ludzkich limfocytów normalnej krwi (stymulo¬ wanej za pomoca filohemoaglutyniny), 2) komórek limfoblastów (otrzymanych od normalnego dawcy), 3) ludzkich limfoblastów krwi bialaczkowej. Sto¬ sowano tu syntetyczne i/loib naturalne templaty. Typowe przyklady metod eksperymentalnych opisano ponizej. Limfoblasty krwi ludzkiej. Bialaczkowe limfoblasty izolowano z obwodo- -wej krwi pacjentów dotknietych ostra bialaczka limfocytowa, które wydzielano na drodze leu- -koforezy. Komórki przemywano, a erytrocyty (krwinki czerwone) usuwano na drodze hyptonoli- -zy (niszczenie za pomoca roztworów hipotoni- -cznych). Limfocyty normalne uzyskiwano z obwodowej krwi zdrowych dawców po usunieciu granulo- -cytów na drodze chromatografii kolumnowej na nylonie. Limfocyty stymulowano za pomoca fi- -tohemoaglutyniny przez 72 godz. w sposób opi¬ sany poprzednio (Galio i inni, Nature, 22I& 927, 1970; Galio i inni, Science, 165,400,1968) w celu zmaksymalizowania aktywnosci polimerazy DNA Z uwagi na trudnosci w otrzymywaniu odpowie¬ dniej ilosci tych komórek, „normalna" ludzka kultura tkankowa (1788) uzywana byla do zao¬ patrywania mniej oczyszczonych polimeraz DNA w niektórych z poczatkowych eksperymentów. Omawiane zwiazki badano bardziej szczególowo za pomoca lepiej oczyszczonych enzymów z limfocytów normalnej i bialaczkowej krwi lu¬ dzkiej. Te komórki hodowli tkankowej otrzymano z Associated Biomedio Systems, Inc.7 89 270 8 Wytwarzanie polirnerazy DNA. Komórkowe polimerazy DNA ekstrachowano i oczyszczano z limfocytów krwi normalnej' (stymu¬ lowanej za pomoca fitohemoaglutyniny) oraz li¬ mfocytów krwi bialaczkowej oraz komórek li- mfoidowyoh (1788) na drodze homogenizacji w hipotonicznym roztworze buforowym. Nastepnie poddawano ekstrakcji za pomoca Tritonu X 100 i/lub roztworu soli o duzym stezeniu z plytek estralizosomalnych. Po rózniczkowym wirowaniu ekstraktów komórkowych poddawano je dalszemu oczyszczaniu na drodze chromatografii kolumno¬ wej na celulozie DEAE, fosfocelulozie oraz Sepha- dexie G 200. Próby polimerazy DNA. Próby polimerazy DNA prowadzono w objetosci koncowej 100 1. Mieszanina próbna zawierala roz¬ twór buforowy Triis-HCl o pH = 8,3 w ilosci 50 m moli, octan magnezu w ilosci 6 m moli, dwutiotreitol w ilosci 8 m moli i NaCl w ilosci 6 m moli. Regulowanie wartosci pH wykonywano przez poddanie inhibitorów, które poprzednio rozpusz¬ czano w dwuimetylosrulfotlenku. Koncowe stezenie DMSO wynosilo 0,5% i wszystkie próbki kontrolne (porównawcze) zawieraly te ilosc dwumetylosulfo- tlenku. Enzytai stosowano w stezeniu powodujacym katalizowanie powstawania substancji z szybkos¬ cia 1,0 piko mola/godz. Enzym w wiekszosci przy¬ padków inkubowano wstepnie przez 5 min z in¬ hibitorem. Nastepnie reakcje inicjowaino przez dodanie templatu zarówno syntetycznego DNA (poli d/AT/ z Miles Lab) i hybryd DNA-RNA (oligo dT-poli rA) w ilosci 5 g/ml lub tez templaty naturalne: aktywowana DNA z nasienia lososia w ilosci 5 juig/ml, endogeniczne RNA wirusa 70 S, lO^Ci^H-met^lo-TTP/ (z New England Nuclear- -18,6 mCi/jujmol, liofilizowany i .powtórnie rozcien¬ czony bezposrednio przed uzyciem za pomoca 0,01 m HC1 oraz dATM (8.10-5 mola, z syntetycz¬ nym templatem). Ostatnie trzy zwiazki byly w po¬ staci dezoksynukleozydów trójfosforanowych (8.10-5 mola, templowane DNA lub RNA). W niektórych doswiadczeniach nie stosowano wstepnej inkubacji enzymu z inhibitorem. W przypadkach tych reakcje inicjowano przez dodanie enzymu do pelnej miesza¬ niny reakcyjnej, która zawierala inhibitor. Z mie¬ szaniny pobierano próbki na poczatku okresu inku¬ bacji i po 30 min, a reakcje przerywano przez do¬ danie 2 ml 0,08 m roztworu pirofosforanu sodu, po czym wytracono produkt za pomoca 12,5% zimnego roztworu kwasu trój chlorooctowego przy zastoso¬ waniu drozdzowego RNA (400 jutg) jako nosnika. Produkty zbierano za pomoca filtra Millipore, prze¬ mywano intensywnie 5% roztworem kwasu trój- chlorooctowego i 1 ml mieszaniny DMSO- etanol-0,1 molowy roztwór NaOl (w stosunku 0,5:70:29,5), suszono i zliczano w 2 ml BBS3 (Beckman) i 10 ml liauifluoru (New England Nuclear) za pomoca li¬ cznika scyntylacyjnego dla cieczy typu Packard. Stwierdzono, ze stezenia w granicach 5—20 jxg/ml powoduja 50% inhibitowanie aktywnosci polime¬ razy bialaczkowej z syntetycznym templatem DNA. Reakcje z udzialem syntetycznego templatu RNA (poli rA.rU) byly nawet jeszcze bardziej czule. * Miarodajne doswiadczenia przeprowadzone z na¬ turalnymi templatami polimeraz komórek normal¬ nych i nowotworowych wykazaly wyzsza czulosc 5 enzymów nowotworowych na badane zwiazki. Innymi cechami biologicznymi przejawianymi przez nowe pochodne rytaimycyny sa: inhibitowa¬ nie tworzenia sie ognisk zapalnych w komórkach mysich, szczurzych i ludzkich pod wplywem 10 szczepu Moloneya i Kristena wirusa miesaJka my¬ siego oraz selektywne inhibitowanie wytwarzania wirusów przez juz przeksztalcone komórki mysie i ludzkie. Zwiazki ryfamycynowe wytworzone sposobem wedlug wynalazku potwierdzily w ba- 15 daniach nad zdolnoscia tworzenia kolonii swoja ' selektywna toksycznosc wzgledem komórek za¬ atakowanych przez wirusy pochodzace od myszy, szczurów i ludzi. W badaniach nad okresleniem wplywu zwiaz- 20 ków wytworzonych sposobem wedlug wynalazku na inhibitowanie tworzenia sie ognisk zapalnych pod wplywem wirusa miesakowego Moloney'a w hodowlach tkankowych BALB/3T3 stosowano nastepujacy sposób postepowania. Kulture komór- 25 kowa BALB/3T3 hodowano w 250 ml kolbach z tworzyw sztucznych w srodowisku hodowlanym zawierajacym srodowisko Eaigle'a wraz ze 10% bydlecej surowicy plodowej. Zliczanie komórek prowadzono za pomoca licznika Coulter po wytwo- 30 rzeniu zawiesiny komórek w mieszaninie trypsyny z kwasem etylenodwuaiminoctziteróoicftowym i roz¬ cienczajac w pozywce hodowlanej. Wirus mysiego miesaka Moloney'ia stosowano w postaci homoge- , natu tkanki nowotworowej. Byl on pasazowany 35 czterokrotnie w linii komórkowej embriona mysie¬ go wielokrotnie pasiazowaniego (pochodzacego ze Szwajcarii) i próbowany na wytwarzanie ognisk zapalnych w komórkach BALB/ST3. W badaniach tych zastosowano modyfikacje metody opisanej 40 przez Hartley?a i Rowe'a, Proc. Nat. Acad. Sci. 55, 780 (1966). Zawartosc kolb zaszczepiano komórka¬ mi w ilosci 1—2X106 komórek w 25 ml pozywki i inkubowano w temperaturze 37 °C przez okres 24 godz. Po usunieciu plynów wirus w okreslonej 45 uprzednio ilosci jednostek tworzacych ogniska wprowadzano do 0,5 ml pozywki hodowlanej i umozliwiano absorpcje jednowarstewkowa komó¬ rek przez 90 min. w temperaturze 37°C. Po tylm okresie absorpcji okreslona ilosc, zwykle jako dawc- 50 ke od okolo 5 do okolo 10 ^g/ml zwiazku pirono- ryfamycynowego (rozpuszczonego uprzednio w dwumetylosiulfotlemku w stezeniu 1 mg/ml, wpro¬ wadzano do 25 ml pozywki hodowlanej, a nastep¬ nie hodowle powtórnie umieszczono w inkubatorze, jako próbke porównawcza dodawano w odrebnej hodowli do pozywki hodowlanej sam dwumetylo- sulfotlenek. Po trzech dniach inkubacji w hodow¬ lach tych wymieniono plyny i ogniska, i znie¬ ksztalcone komórki zliczano po uplywie 7 dni. Ta sama metoda badano wirus pecherzykowego zapalenia jamy ustnej (typu serologicznego New Yersey). Zastosowana metoda hodowli i badania tego wirusa opisana zostala przez Hacketta i in- 65 nych, Yirology, 31, 114, (1967).89 270 9 10 Omówione wyniki wskazuja, ze zwiazki wytwo¬ rzone sposobem wedlug wynalazku charakteryzuja sie znaczna aktywnoscia inihibitowania zwierzecych nowotworów wywolywanych przez wirusy. W iceki zilustrowania sposobu wedlug wynalazku 5 wtwarzania nowych zwiazków przedstawiono me¬ tode syntezy zwiazków stanowiacych polaczenie ukladu 2-pironowego w polozeniu 4,3 z 4-dezoksy- ryfalmycyna SV. Przy nazwach zwiazków cyfry z dodatkowym 10 oznaczeniem „prim" odnosza sie do ukladu piro- nowego, natomiast cyfry bez indeksów — do uk¬ ladu ryfamycyny. Przyklad 1. 3'acetylo-2'pirono[4',3'-c]4-dezo- ksyryfamycynaSV. 15 Do roztworu zawierajacego 2 mmole 3-formylory- famycyny SV w 70 ml czterohydrofuranu dodano 1 ml piperydyny i 2 mmole acetooctanu etylu. Po ogrzaniu mieszaniny reakcyjnej do wrzenia przez 30 min reakcja zachodzi calkowicie. Mieszanine reakcyjna odparowano do sucha, a nastepnie za¬ dano' octanem etylu i zakwaszono do wartosci pH 2 za pomoca kwasu mineralnego. Warstwe orga¬ niczna ekstrahowano trzykrotna objetoscia wody. 25 Warstwe wodna ekstrahowano nastepnie octanem etylu i roztwór organiczny po wysuszeniu odpa¬ rowano do sucha. Otrzymana surowa pozostalosc rekrystalizowano z acetonu, otrzymujac z wydaj¬ noscia 50% produkt o temperaturze topnienia 175 30 —183°C. Ten sam zwiazek koncowy mozna wytworzyc zastepujac acetooctan etylu acetooctanem metylu. Wyniki analizy otrzymanego zwiazku wykazaly nastepujace zawartosci: C-60, 72%; H-6, 32; N-l, 35 36%i (wartosci obliczone dla C42H49NOJ/, wynosza C-63, 71%. H-6, 24%.; N-l, 77%). Widmo w nadfiolecie: E i% tnax525 82,7 346 295,1 311 233,1 Przyklad II. S^karbokisy^-pironolzl^-n] 4- -dezoksyryfamycynaSV. 45 Do roztworu zawierajacego 2 mmole 3-formylo- ryfamycyny SV w 70 ml chloroformiu dodano 2 ml piperydyny i 2 mmole Ikwasu malonowego. W wy¬ niku ogrzewania pod chlodnica zwrotna do wrze¬ nia przez 4 godz. reakcja zachodzi calkowicie. 50 Mieszanine reakcyjna odparowano do sucha, a nastepnie zadano octanem etylu i zakwaszono do wartosci pH = 2 przy uzyciu kwasu mineralnego. Warstwe organiczna ekstrahowano nastepnie trzykrotna objetoscia wody. Warstwe wodna eks- 55 trahowano octanem etylu i roztwór organiczny po wysuszeniu odparowano do suflha. Otrzymany surowy produkt rekrystalizowano z acetonu otrzy¬ mujac z wydajnoscia 40%. produkt o temperaturze topnienia 191—202°C. Wyniki analizy otrzymanego zwiazku wykazaly nastepujace wartosci: C-61, 69%; H-5, 68%; N-l, 41% (wartosci obliczone dla C4iH47N015 wynosza: C-62, 03%; H-5, 97%; N-l, 76%). Widmo w nadfiolecie: max J 1 cm 475 116,7 333 328 307 269,2 Wedlug 'metody opisanej w przykladach mozli¬ we jest wytworzenie pochodnych pironowych ry- famycyny o wzorze 1, w którym rodnik oznaczony jako -COR stanowi nastepujace grupy: -COOCH3, -COOC2H5, -COOC3H7, -CO-C3H7, -CO-CH(CH3)2. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowych pochodnych pi- ronoryfamycyny o wzorze 1, w którym R oznacza nizsza grupe alkilowa, nizsza grupe alkoksylowa lub grupe hydroksylowa, znamienny tym, ze 3-for- myloryfamycyne SV poddaje sie reakcji z w przy¬ blizeniu równoimolowa iloscia zwiazku o wzorze 2, w którym R ma podane wyzej znaczenie, zas R* oznacza grupe COOH, CN lub COOR2, w której R2 oznacza prosty lancuch alifatyczny zawiera¬ jacy 1—4 atomów^wegla. v 2. Siposób wytwarzania nowych pochodnych pi- ronoryfamycyny o wzorze 1, w którym R oznacza nizsza grupe alkilowa lub grupe hydroksylowa, znamienny tym, ze 25-dezacetylowa pochodna 3- -formyloryfamycyny SV ipOddaje sie reakcji z w przyblizeniu równomolowa iloscia zwiazku o wzorze 2, w którym R ma wyzej podane znacze¬ nie, zas R* oznacza grupe COOH, CN, lub COOR2, w której R2 oznacza prosty lancuch alifatyczny zawierajacy 1—4 atomów wegla. 3. Sposób wytwarzania nowych pochodnych pi- ronoryfamycyny o wzorze 1, w którym R. oznacza nizsza grupe alkilowa, nizsza grupe alkoksylowa lub grupe hydroksylowa, znamienny tym, ze 16, 17, 18, 19, 28 i 29-szesiciowodorowa pochodna 3- -formyloryfamycyny SV poddaje sie reakcji z w przyblizeniu równomolowa iloscia zwiazku o wzorze 2, w któryim R ma wyzej podane znacze¬ nie, zas Rl oznacza grupe COOH, CN lufo COOR2, w której R2 oznacza prosty lancuch alifatyczny zawierajacy 1—4 atomów wegla.89 270 Me Me Me 0 Wzór 1 COR CH, j ^R Wzór 2 Druk WZKart. Zam. D-5035. Cena 10 zl PL