Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia pochodnych 3-alkenyloHryfamycyny SV o wzo¬ rze ogólnym 1, w którym R oznacza atom wodoru lub grupe alkilowa o wzorze ogólnym 1, w którym R oznacza latom wodoru lub grupe alkilowa ialbo gru-pe arylaniistooailikiiLowa, R1 atom wodoru lub gru¬ pe acetylawa, R2 atom wodoru lub nizsza grupe alkilowa, a X oznacza atom wodoru, grupe imi- nowa, podstawiona grupe iminowa ,grupe hydro- ksyimiinowa ^podstawiona grupe hydoroksyimiinowa, grupe hydraizonowa lub podstawiona grupe hydiro- zonowa, jak i ich 16, 17, 18, 19, 28, 29^szesaiowo- 'donopochodnych. sposób wedlug wynalazku polega mia (tym, ze 3- -alkenykwryfamycyne o podanym na ischemiaoie 1 wzorze 3, w którym R1, R2 ii R maja wyzej poda¬ ne znaczenie lub jej 16, 17, 18, 19, 28, 29-szesicio- wodoropochodna ialbo 25-/dezacetylopochadna pod¬ daje sie reakcji z pierwszorzedowa /amina, hydra¬ zyna lub hyidraksyloamina. Reakcje prowadzi sie nia logól w temperaturze pokojowej, w rozpusziczal- niku korzystnie tetohydrofurianie.Iminowe lub (podstawione limiiniowe pochodne, ry- famycyny SV o ogólnym wzorze 1 sa zasadami Schaffa wytwarzanymi (wedlug wyzej podanej re¬ akcji zwiazku o wzorze 3, z pieirwszorzedowymi aminami, natomiast pochodne dzonitrazowe otrzy¬ muje sie wówczas jesli jako isubstrat stasuje sie hydroksylamine lub O-podstawiona hydroksylo- amine. Pochodne ewentualnie podstawionych hy- drazonów — wytwarzane sa wtedy jesli isutostrat stanowi hydrazyna lub N-podstawione hydrazyny.W tym :przypaidku podstawniki azotu moga nazem z tym atomem, tworzyc hejterocykliiczny piersicien piperazyny, morfoliny, ipiperiadyny ,heptametyleno- iminy, oktametylenoimiiny lub 3,8-diwuazadwucy- klo [3,2,]-ototanu.Zwiazek wyjsciowy o wzorze 3 otrzymuje sie przez poddanie (reakcji 3-formyloryfamy/cyny SV, z odpowiednim alkillodeno- lub airaikiJitaeniofosfoira- nem. Reakcjia ta prowadzona jest w warunkach znanych dla reakcji Wittiniga i przebiega wedlug przedstawionego na rysunku schematu. Reakcje prowadzi sie korzystnie w obojetnym rozpuszczal¬ niku organicznym,takiim jak tetahydirofuran, oc¬ tan etylu ^dioksan, benzen lub chloroform. Od¬ czynnik alkilideniowy mozna wytworzyc z chlo- rowcoketanów i tirójfenylofasfiiny, sposobem opi¬ sanym przez Ramireza i wspólpracowników w J.Org. Chem. 22, 41 (1957) lub sposobem" opisanym przez Bestmana i wispc4prai(5ownik6w, Chem. Ber., 95, 1513 (1962).Inny sposób wytwarzania zwiazków o ogólnym wzorze 3 polega na kondensacji 3-formyloryfamy- cyny SV, jej pochodnej 25-desaicytylowBJ lub 16, 17, 18, 19, 28, 29-szesciowodorowej z aldehy¬ dem lub ketonem o ogólnym wzorze CH2R2COR.Reakcja ta przebiega wedlug ischematu: zwiazek o wzorze 2 + CH2R2 COR-* zwiazek o wzorze 3.Reakcje przeprowadza sie zwykle w obecnosci 8»0«1 *89 091 zasadowego katalizatona, np. wodorotlenku metalu alkalicznego ,aminy, lalkilanu metalu (alkalicznego lub lamidlku metalu lalkalicznego. Korzystne sa wa¬ runki przyjmowane w kondensacji Knovenagera (Qrg. Reactions 15, 204; John Wiley 1967). W tym przypadku jako zasadowy katalizator stosuje sie lamondiak lub lamine, (taka jak piperydyna lub dwu- etyloamaina. Stosowac moznia równiez /takie kata¬ lizatory Jak sole amoniowe lub sole metali alka¬ licznych z organicznymii kwasami, takie jak octan amonu, isodu lub potasu. Korzystne jest podstawia¬ nie 3-formyloryfamycyny SV odpowiednim aldehy- , dem 'lub ketonem iw ozterowiOdorofunamiie, w 'tempe¬ raturze 0 do 5°C ^stosujac jiako katalizator -mie¬ szanine 5 :1 piperydyny z kwasem oatoiwym.Wytworzony sposobem wedlug wynalazku zwia¬ zek o wzorze 1 otrzymuje sie w postaci stalej.Zwiazki te 'topnieja z rozkladem i sa substancja¬ mi latwo krystalizujacymi z octanu etylu i innych organicznych rozpuszczalników, takich jak meta¬ nol czy etanol. Sa one dobrze rozpuszczalne w ace¬ tonie, tetrahydrofuranie, dioksanie i chloroformie.Wykazuja silna czynnosc przeoiwbakteryjna, szcze¬ gólnie w stosunku do Sitreptooocoujs hemolyticus i Diplococcus (pneumoniae. W tablicy I przedsta¬ wiono najnizsze stezenie hamujace in vitro wzrost wybranych mikroorganizmów. zalezna od RNS polimeraza DNS (przeciw-trans- kryptaza) w przypadku rakotwórczych wirusów RNS zostaly odkryte przez B. Baltimore^., Niatu- re 226 1209 (1970) i ,przez H.M. Teminia i wspól- pracowników, Nature, 226, 1211 (1970).Wystepowanie zaleznej .od RNS polimerazy DNS w zwierzecych rakotwórczych wirusach RNS zo- sitalo 'stwierdzone równiez iprzez innych badaczy.Zagadnienia to sa omówione w nastepujacych pu- bliikacjiach: Goneen i wispólpraoownicy „Mechanism of carcinogeneses by RNS tumor viruses. I. An RNA-dependent DNAnpolymerase in murine sar- coma viruses", Proc. Niat. Acad. Sci. USA, 67, 385—393, 1970, Spiegelman i wspólpracownicy, „Characterization of the iproduiots iof RNA direc- ted DNA-polymerase in onoogenic RNA wiruses", Nature, London, 227, 536, 1970, Hanaka i wspól¬ pracownicy, „DNA polymerase iactivity associeted with RNA itumor viruses", Proc. Nat. Acad. Sci.USA 67, 143, 1970, Scolnick i wspólpracownicy, „DNA synthesis by RNA comtainiing itumor vir- sues", Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 67, 1034, 1970.% Obecnosc wirusów RNS w pewnych inowotwo- irach potwierdzaja równiez dalsze fakty: w mleku kobiet, w rodzinach w których wystepowaly przy¬ padka raka piersi i malzensrtwaeh osób spokrew- Tablica I Zwiazek wytworzony wg przykladu Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus (z 20% surowica) S. aureus Tour.Streptococcus hemolyticus Streptococcus faecalis * Diplococcus pneumoniae Proteus E. coli Klebsiella pneumoniae Pseud. aereata Myc. Tub. H37Rv.I 04 0,2 0,1 0,005 0,5 0,005 100 100 100 100 0,5 II 04 0,05 0,1 0,2 1 0,05 50 100 100 0,5 III 0^02 0,2 0,05 0,05 0,1 0,002 50 50 100 100 0,5.IV 0^01 0,05 0,02 0,002 0,1 0,002 50 50 50 100 0,1 V 0^2 0,02 0,1 0,002 0,5 0,002. 100 100 100 100 1 VI 0^01 0,02 0,02 0,01 0,01 0,02 100 100 100 100 1 Czynnosci przeaiwbakteryjinej towarzyszy niska toksycznosc. Inna bardzo cenna wlasciwoscia zwiaz¬ ków wytwarzanych sposobem wedlug wynalazku jesit hamujace dzialanie przejawiane w stosunku do polinieraz DNS, ichiarakterys»tycznych dla lim- foblasitów z krwi ludzi chorych na bialaczke i w stosunku do (transferaz nukleotylowych (ipólirneraz) wirusów, które nie biora udzialu w metabolizmie komórek normalnych. Z badian nad reprezentatyw¬ nymi przedstawicielami grup wirusów wiadomo, ze w znacznej czesci cyklu reprodukcji w komór¬ kach zywiciela sa one nosicielami lub wytwarzaja polimery.Tak wiec np. wirusy Picorna, czy Polio wytwa¬ rzaja zalezna od RNS polimeraze RNS, podczas gdy wirusy innych grup, np. wirusy bialaczki sa nosicielami zaleznej od RNS polimerazy DNS.Obecnosc i niezwykle wazna rola jiaka spelnia 50 55 65 nionych znaleziono przeciwtranskryptazyne (Scholn i wspólpracownicy, Nature 231, 97, 1971), a Priori i wspólpracownicy, Nature New Biology, 232, 16, 1971 z komórek -plynu oplucnej dziecka z zapale¬ niem wezlów chlonnych wyodrebnili wirusa ESP-1, który zawiera przeciwtanskryptaze i który daje sie rozmnazac w hodowli tkankowej.Axel i wspólpracownicy, Nature 235, 32, 1972, w drodze hybrydyzacji molekularnej wykazali wy¬ stepowanie w iprzypadku raka piersi kobiet wirusa RNS homologicznego iz wirusem RNS nowotworu sutki piersi. Mozliwosc wirusiowego pochodzenia raka piersi wykazuja przeprowadzone technika mikroskopii elektronowej badania mleka kobie¬ cego (N.H. Sarkar i wspólpracownicy, Nature, 236, 104, 1972). Równiez z komórek ludzkiego miesaka miesni prazkowanych wyodrebniono czynna w sto¬ sunku do RNS polimeraze DNS i wiruisopodobne89 091 czastki. (McAllister i wspólpnaciawinicy, Nature New Biology, 235, 3, 1972).Dotychczas nie ma leków 'Skutecznie zwalczaja¬ cych schorzenia wirusowe, poniewaz warunki przemiany miaterii wirusów d komórek sa takie 5 same. Najbardziej obiecujaca droga chemioterapii chorób wirusowych jest opracowanie odpowiednich zwiazków wybiórczo laczacych isie z polimierazami wirusowymi, lub z .polimerazaimi 'komórkowymi transformowanymi przez wirusy, ia nie laczacymi io sie z polimeraziami normalnych komórek zywiciela, co daloby mozliwosc kontroli informiaoji genetycz¬ nej wirusów. Wybiórcze inhibitory enzymów wiru¬ sa lub enzymów komórkowych transformowanych przez wirusa, a w szczególnosci inhibitory poli- 15 meraz rakotwórczych wirusów RNS odgrywaja znaczna role w lekach do terapii bialaczki i innych schorzen nowotworowych.Zbadano hamujaca czynnosc zwiazków wytwa¬ rzanych sposobem wedlug wynalazku w stosunku 20 do oazyszczonej, zaleznej od RNS polimenazy DNS endogennego wirusa Muridae i w stosunku do oczyszczonej, zaleznej od DNS polimerazy Poly d-/A-T/ (jako „Template"). W badaniach posluzono isie sposobami opisanymi przez C. Gardo i wspól- 25 pracowników, Nature, New Biology, 229, 111, 1971.Dzialanie leków w róznych stezeniach ma czynnosc polimerazowa okreslano nastepnie w stosunku do 3H-dTTP (trytowany trójfosforan tyminodezoksy- rybozy) polaczonego z frakcja nierozpuszczalna. 30 Ponizej przedstawiono typowy przyklad poste¬ powania doswiadczalnego.Wyodrebnianie wirusa i oczyszczanie polimera¬ zy wirusowej.Sposobem opisanym przez Greenia i wspólpra¬ cowników, Proc. Niat. Acad. Soi. USA, 67, 385—393, 1970 i przez Rokutande i wspólpracowników, Na¬ ture, 227, 1026—1028, 1970, wyodrebnia sie wirusa Muridae z nowotworowych komórek szczura (szczap 40 M Moloney'a) oraz z nowotworowych komórek my¬ szy (szczep Harvey'ia), a nastepnie oczyszcza. Poli- meraze wirusowa .otrzymuje sie w wyniku inku¬ bacji 'Oczyszczonego wirusa 0,5°/o NP-40 (nonidet P-40) w 0,1 M NaCl, 0,01 M buforze Tnis (pH 7,6) 45 i 0,001 M EDTA, w ciagu 5 minut, w tempera¬ turze pokojowej, i 20^10-krotnie oczyszcza przez wirowianie strefowe w ciagu 24 godzin w roztwo¬ rze sacharozy o stezeniu wzrastajacym od 15 do %, 10 mM buforze Na-fosforanowym (pH 7,4), 50 2,5 mM MgCl2, 10 mM ditiotreioie i 5°/o glicerynie, z szybkoscia 38 000 obrotów na minute, w ultra- wirówce Spinoo SW41. Zebrano 22 frakcje, a wy¬ kazujace najwyzsza czynnosc enzymatyczna frak¬ cje 13—17 polaczono i przechowywano w tempe- 55 raturze —70°C w 30% glicerynie.Oznaczanie polimerazy DNS.Inkubacje enzymu prowadzi sie w ciagu godziny w 37°C, iw 100 fjil mieszaniny skladajacej sie z 60 40 mM buforu Tris (pH 8,0), 5 mM iditiotreicie, mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1 mM dATP, dCTP i 10 [ji Ci 3H-dTTP (12—18 Oi/mmoo), sposobem opisanym przez Greenia i Mitaro, Proc. Niat. Acad.Sci, USA, 67, 385^393, 1970. Reakcje przerywa sie 65 dodajac 150 jil 1 M kwasu nadchlorowego. W cha¬ rakterze nosnika 'dodaje sie DNS grasicy cielecia (100 \Lg), Radioaktywny produkt DNS przerabia sie w sposób opisany w obu powyzej cytowanych po¬ zycjach literaturowych. Endogenna czynnosc za¬ leznej od RNS polimerazy DNS okresla sie po do¬ daniu 0,01% NP-40 ido oczyszczonego wirusa w momencie przeprowadzania doswiadczenia. Czyn¬ nosc polimerazowa oczyszczonej polimerazy wiru¬ sowej oznacza sie 2 \ig Poly d (A-T) (jiako „Tem¬ plate") i bez NP-40.Oznaczanie hamujacego dzialania pochodnych ry- famycyny.Sporzadza sie roztwór pochodnej Tyfamycyny w dwumetylosulfotlenku (DMSO), o stezeniu 5 mg/mol i przechowuje go w temperaturze 4°C. Hamujacy /wplyw nia czynnosc endogenna polimerazy DNS zaleznej od RNS zostalo zbadane przez dodanie 2 \il 'antybiotyku w DMSO lub 2 fil DMSO (próbka kontrolna) do badanej próby, zawierajacej 15—30 fig bialka wirusowego, a nastepnie wprowadzanie wirusa. Inkubacje enzymu prowadzi sie w ciagu 70 minut w 37°C. Nastepnie dodaje sie 70 yl mie¬ szaniny substratów i mieszanine dinkubuje i prze¬ rabia w wyzej opisany sposób.W reprezentatywnych badaniach zwiazki wytwa¬ rzane sposobem wedlug wynalazku w stezeniu 2— 100 fig/ml ograniczaly przylaczanie 8H-dTTP do ponizej 10% wartosci oznaczonej w badaniach kontrolnych. W ten sposób w oczywisty sposób •wykazano, ze wplywaja one hamujaco na mecha¬ nizm nowotworotwórczy nowotworowych wirusów RNS, zgodnie z najnowszymi pogladami bioche¬ micznymi.Hamujace idzialanie w stosunku do przeciwtrans- kryptaz okresla sie równiez w badaniach na wi¬ rusach Muridae. Zalezna od RNS polimeraze DNS wirusa Muridae otrzymuje sie w sposób opisany przez Galio i wspólpracowników, Nature New Biology, 232, 141, 1971 z wirusa oslabionego Tri- toneim X100. Wirusy szczepów Rauschera i Molo- ney'a oczyszcza sie wiazac je w zakresie 1,16 g/ml gradientu gestosci sacharozy, po wstepnym wiro¬ waniu przy ograniczonej szybkosci w roztworze sacharozy o stezeniu mialejacym od 60 ido 20%, dla oddzielenia fragmentów komórek. Koncowe stezenie preparatu wirusowego wynosi 1011 iczastek w ml.. Jako „Template" stosuje sie 70 SR.N.S.Stwierdzono, ze stezenie 50 fig/ml i nizsze sku¬ tecznie hamuje czynnosc enzymatyczna. Podobne wyniki otrzymuje sie stosujac polimerazy z komó¬ rek nowotworowych pochodzenia ludzkiego. W tym przypadku dla scharakteryzowania selektywnego wplywu bada sie dzialanie hamujace równiez w stosunku do polimenaz komórek normalnych. Ba¬ dano czynnosc reprezentatywnych pochodnych ryfamycyny w wzorze ogólnym 1 w stosunku do 2 oczyszczonych polimeraz DNS, wyodrebionych z normalnych ludzkich limfocytów krwi (stymulo¬ wanych PHA), z komórek limfoblastów krwi zdro¬ wego dawcy i z limfoblastów krwi bialaczkowej.Stosowano syntetyczne i/lub naturalne „Temp^te".Ponizej opisano typowy przyklad przeprowadze¬ nia oznaczenia.89001 8 Limfoblasty krwi ludzkiej.Baaleozfcowe limfoblasty wyodrebnia sie z obwo¬ dowej ikirwi pacjentów z ostra bialaczka. Komórki przemywa sie, a erytrocyt usuwa przez podcis¬ nieniowe rozpuszczenie. Normalne limfocyty otrzy¬ muje siie z obwodowej krwi zdrowych dawców po oddzieleniu graoulocytów w drodze 'Chromatografii kolumnowej ina itworzywie poliamidowym. Poddaje sie je obróbce opisanej iprzez Galio i wspólpracow¬ ników, Niature 228, 927, 1970 i Science 165, 400, 1968, dzialajac w ciagu 72 godzin filohemagluty- ndina (PHA), w celu (mozliwie jak (najwiekszego wzmocnienia ich iczyninosci DNS-polimerazowej.W niektórych orientacyjinych badaniach wstep¬ nych stosowano slabiej oczyszczona polimenaze DNS, otrzymana z hodowli „oormallnych,, itkainek ludzkich. Interesujace zwiazki zbadano nastepnie ma lepiej oczyszczonych enzymach z /normalnych i bialaczkowych limfocytów. Kultury tkanek otrzy¬ mano z Associaflted Biomedic Systems, linie.Preparaty poliimerazy DNS.Polimerazy DNS otrzymuje sie z inormialnych (stymulowanych PHA) i bialaczkowych limfocytów oraz z komórek limfoidalnych 1788, w drodze ho¬ mogenizowania w Mpotonijcanyoh noztworach bufo¬ rowych i inastepnego traktowania Tritonem X 100 iAub ekstrakcji roztworami isoli zewnetrznych lizozomalnych blon komórkowych. Po róznicuja- cym iwiriowaniu w roztworach isoli ekstrakty ko¬ mórkowe oczyszcza sie dalej w drodze chromato¬ grafii kolumnowej ina icelulozie DEAE, fosfocelu- lozie i dekstranie Sephadex G 200.Badanie polimerazy DNS.Badanie polimerazy DNS przeprowadza sie w koncowej objetosci 100 [ii. Badana mieszanina za¬ wiera 50 mM buforu Tris-HCl o pH 9,3, 6,0 mM octanu magnezu, 8,0 mM diitiotreitu i 60 mM NaCl.Wartosc pH inastawia sie po dodaniu rozpuszczo¬ nych w DMSO inhibitorów. Koncowe stezenie DMSÓ wynosi 0,5°/o i taka ilosc zawieraja wszyst¬ kie próby kontrolne. W badaniach stosuje sie en¬ zymy w stezeniu katalizujacym przylaczanie okolo 1 pM w ciagu godziny. W wiekszosci przypadków enzym inkubuje sie wstepnie inhibitorem w ciagu minut. Nastepnie przeprowadza :sie podstawienie dodatkiem syntetycznego DNS (Poly d/AT/ Miles Lab.) i hybrydy DNS. RNS (Oligo dtjpoly rA) w ilosci 5 ^g/ml lub maturalnego, laktywowanego DNS nasienia lososia, w ilosci 50 ^ig/ml i RNS endogen¬ nego wirusa 70S, 10 \i Oi/3H-metylo/-TTP. (New England Nuclear, 18,6 mCi/jiM, liofilizowany i po¬ nownie rozpuszczony w 0,01 M HC1 bezposrednio przed uzyciem) i ATP (8X10~5M, z substancja syntetyczna) lub dodatkiem wszysitkich trzech trój- fosforanów dezoksynukleozydów (8X10~5M z RNS lub DNS). W pewnych przypadkach nie przepro¬ wadza sie wstepnej inkubacji enzymu inhibitorem, lecz przeprowadza sie reakcje wprowadzajac do gotowej mieszaniny enzym lacznie z inhibitorem, Na poczatku inkubacji i po 30 minutach pobiera sie-próby, przerywa w mich reakcje dodatkiem 2 ml 0,08 M pirofosforanu sodu i przeprowadza, 40 45 50 55 wytracenie dodatkiem 12,5% zimnego kwasu trój- chlorooctowego (TCS) z 400 fig RNS drozdzy jako nosnikiem. Produkty odsacza sie na mikroporowa- tym filtrze, dokladnie pmzemywa 5°/o kwasem trój- chloroocftowym i 1 ml mieszaniny DMSO-etanol-0,1 M NaCl (05:70:29:5), suszy, rozpuszcza w 2 ml BBS3 (Beckrman) i 10 ml liauifluoru (New England Nudear) i liczy za pomoca cieczowego liczoika scyntylacyjnego produkcji Packard.Stwierdzono, ze stezenie 5—20 |xg/ml powoduje przy syntetycznym „DNS-Template" 50% zahamo¬ wanie polimerazy bialaczkowej. Przy syntetycznym „RNS-Template" (Poly rArU) reakcja byla jesz¬ cze czulsza.Reprezentatywne badania, przeprowadzone z naturalnym „Template" ma polimerazach komórek inormalnych i nowotworowych wykazaly, ze enzy¬ my nowotworowe sa czulsze ma dzialanie testowa¬ nych zwiazków.Sposród innych wlasciwosci biologicznych no¬ wych pochodnych ryfiamycyn nalezy wymienic ha¬ mowanie powstawaniu logniisk 'nowotworowych w komórkach myszy, szczurów i ludzi zakazanych szczepem Molaney'a i Kiirstena wirusa Muridae, selektywne hamowanie 'wytwarzania wirusów przez zmienione komórki mysie i ludzkie, odtwa¬ rzalnie komórek normalnych przez zmienione przez wirusa Muridae komórki mysie i iszczurze.Ponadto, pochodne hydrazonowe sa selektywnie toksyczne w stosunku do zmienionych przez wi¬ rusy komórek mysich, szczurzych i ludzkich, co wynika z badan ich zdolnosci do tworzenia kolonii.Badania czynnosci hamujacej wywolywanie ognisk nowotworowych przez .szczep Moloney'a w hodowli tkankowej przeprowadza sie w nastepu¬ jacy sposób: Komórki BALB/3T3 hoduje sie w 250 ml pojem- inikach z tworzywa sztucznego na pozywce Eagle'a zawierajacej surowice krowiego plodu. Liczenie komórek przeprowadza sie za pomoca licznika Soultera po zawieszeniu ich w nosniku trypsyno- wym i rozcienczeniu pozywka. Jako homogenat inowotworowy stosuje :sie ,szczep Moloiney'a. Pod¬ daje sie go czterokrotnemu pasazowaniu komór¬ kowemu ma wielokrotnie pasazowanym zarodku myszy rasy szwajcarskiej i bada wlasciwosci ognisk 'nowotworowych w komórkach BALB/3T3.Stosuje isie zmodyfikowany sposób opracowany przez Hatley'a i Rowe'a, Proc. Nat. Acad. Sci:, 55, 780, 1966. Zawarta w"pojemnikach pozywke szczepi sie komórkami w ilosci 1—2 X 106 na 25 ml i in¬ kubuje w ciagu 24 godzin w 37°C? Po oddzieleniu plynu wprowadza isie wirusa w okreslonej liczbie jednostek nowotworotwórozych.Nastepnie w ciagu 30 minut, w 37°C przepro¬ wadza sie adsorpcje na pojedynczej warstwie komórek, po czym do 25 ml pozywki wprowadza sie 'Okreslona ilosc, zwykle 5^10 \ig/ml, alkenylo- wej pochodnej ryfamycyny, w postaci roztworu w dwumetylosulfotlenku o stezeniu 1 mg/ml i ho¬ dowle ponownie umieszcza w inkubatorze. Kon¬ trole stanowi dodany do odrebnej hodowli dwu- metyloisulfotlenek w pozywce. Po trzydniowej in¬ kubacji 'obserwuje sie zmiany w plynie hodowla-9 89 091 E 1 cm 181,9 379,9 lem 138,5 339,4 349,5 Analiza elementarna: dla C49H60N2O13.Obliczono: C 66,50, H 6,83, N 3,16.Znaleziono: C 65,23, H 6,81, N 3,28. nym, a nowotworowo izrnienione komórki liczy sie po 7 dniach prowadzenia hodowli.W podobny sposób przeprowadza sie badania wirusa pecherzykówatego zapalenia jamy ustnej.Sposoby mnozenia i badania 'tego wirusa opisali 5 Hackett i wspólpracownicy, Viinology, 34, 114, 1967.Powyzsze wlasciwosci wykazuja, ze zwiazki otrzymywane sposobem wedlug wynalazku dzialaja hamujaco ma (rozwój wirusowych nowotworów zwierzat.Sposób wedlug wynalazku objasniaja nizej po¬ dane przyklady, z których przyklad I, VI ii VII ilustruja sposoby wytwarzania zwiazków wyjscio¬ wych.Przyklad I. 3-/3-keto-l-butenylo/-ryfamycyna 15 SV. Do roztworu 10 g fosforanu lacetanylideno- trójfenylowego w 600 ml tetrahydrofuranu dodaje sie 7,2 g 3-formyloryfamycyny SV i w ciagu 3 go¬ dzin ogrzewa mieszanine pod chlodnica zwrotna. v Zatezony od malej objetosci roztwór izadaje sie 300 ml octanu etylu i przemywa wpierw zakwa¬ szona (pH = 2), a nastepnie obojetna woda. Osu¬ szony roztwór odparowuje sie, ia pozostalosc dwu¬ krotnie przekrystalizowuje z octanu etylu. Wydaj¬ nosc 60%. Otrzymuje sie substancje stala nie wy¬ kazujaca Okreslonej temperatury topnienia. Zwia¬ zek ten rozklada sie w (temperaturze 200—290°C i wykazuje nastepujace widmo absorpcji w nad¬ fiolecie 485 340 262 160,5 291,5 386,5 Przyklad IV. 3-/3-benzyloksyimino-l-buiteny- lo/ryfamycyna SV. Do roztworu 800 mg zwiazku otrzymanego wedlug przykladu I w 40 ml tetra- hydrofuranu dodaje sie 160 mg chlorowodorku O-benzynohydirdksyloaminy i 2 ml pirydyny.Po 60 minutach roztwór, odparowuje sie do su¬ cha, a pozostalosc rozpuszcza w octanie etylu.Roztwór organiczny przemywa sie wioda i odparo¬ wuje pod zmniejiszonym cisnieniem, a pozostalosc przekrystalizowuje z octanu etylu. Otrzymuje sie produkt o temperaturze topnienia 183—190°C. Wy¬ dajmosc 60%. Widmo absorpcji w nadfiolecie przedstawia sie nastepujaco: X max (nm) 470 336 258 przygiecie przy tt1% 30 l max W F l0/o E lem Analiza elementarna: dla C41H51NO13; Obliczono: C 64,30; H 6,71, N 1,83; Znaleziono: C 63,62; H 6,61; N 1,30. 35 Przyklad II. 3-/3-fenylohydrazono-l-butenylo/ /ryfiamycyna SV. Do roztworu 1,5 g zwiazku otrzy¬ manego 'W przykladzie I w 50 nil itetrahydroro- furanu, mieszanego w temperaturze pokojiowej, dodaje sie 220 mg fenylohydrazy. 40 Po dwóch godzinach wytracony osad odsacza sie i przekrystalizowuje z octanu etylu. Produkt roz¬ klada sie powyzej 210°C i wykazuje, nastepujace widmo absorpcji w nadfiolecie: Xmax(nm) 475 360 1% 50 Analiza elementarna: dla C47H57N3O12.Obliczono: C 65,95, H6,71, N 4,91; Znaleziono: C 65,40, H 6,58, N 4,35.Przyklad III. 3-/3-fenyloksyimino-l-buitenylo/ /ryfamycyma SV. Postepuje sie wedlug sposobu Opisanego w przykladzie II, z tym, ze fenylohy- drazyne nastepuje sie O-fenetylohydroksyloamAna. 55 Wymieniony izwiazek otrzymuje sie iz wydajnoscia 87%. Zwiazek ten topnieje z rozkladem w tempe¬ raturze 168—173°C i wykazuje nastepujace widmo absorpcji w nadfiolecie: Xmax(nni) 478 337 262 60 ^ l°/o 1 om 154,8 338 391 Analiza elementarna dla: C48H58N2O13.Obliczono: C 66,19, H 6,71, N 3,22.Znaleziono: C 65,08, H 6,61, N 2,67.Przyklad V. 3-/3-/4-metylo-l-!piperazynylo/- -imino- wedlug sposobu opisanego w przykladzie II, z tym, ze fenylohydrazyne zastepuje sie l-aimino-4-imetylo- piperazyna. Zadany zwiazek otrzymuje sie z wydaj¬ noscia 65%. Zwiazek ten topnieje z rozkladem w temperaturze 160°C. Widmo absorpcji w nadfiolecie przedstawia sie nastepujaco: A max(mm) 480 338 261 271 E 1% 1 cm 351,6 369,1 295,8 136,8 Analiza elementarna: dla C46H62N4O12.Obliczono: C 64,92, H 7,24, N 6,49; Znaleziono: C 64,12, H 7,24, N 5,78; Przyklad VI. 3-/|3-formylowinylo/Hryfamycyna SV. Do utrzymywanej w temperaturze 0—5°C za¬ wiesiny 1 g 3-formyloryfamycyny SV w 70 ml te- trahydrofuranie dodaje sie mieszanine 1 ml pipe- rydymy i 0,2 ml kwasu octowego, a nastepnie 0,2 ml aoetaldehydu. Calosc miesza sie w ciagu 2 godzin, a nastepnie pod zmniejszonym cisnie¬ niem zateza do mialej objetosci. Pozostalosc roz¬ ciencza sie octanem etyki i przemywa zakwaszona woda. Pozostalosc po odparowaniu fazy organicz¬ nej poddiaje sie chromatografii na 100 g zelu krze¬ mionkowego zbuforowanego do pH 6, stosujac jiako uklad rozwijajacy mieszanine 1:1 chloroformu z acetonem. Otrzymuje sie 250 mg 3-/(3-formylowi- nylo/-ryfamycyny. Zwiazek ten rozklada sie w temperaturze powyzej 200°C i wykazuje nastepu¬ jace widmo absorpcji w nadfiolecie: l max (rum) 500 385 1% E 1 cm 176 410 65 Analiza elementarna: dla C40H49NO13.Obliczono: C 63,90, H 6,37, N 1,86.Znaleziono: C 63,46, H 6,68, N 1,77.Przyklad VII. 3-/3-/4-me.tylo-l-piperaizynylo/- imino-1-propenylo/Hryfamycyna SV. Powyzszy zwiazek otrzymuje sie iz 3/p-formylowinylo/ryfia- mycyny SV i l-amino-4-metylopiperazyny sposo¬ bem opisanym w przykladzie II. Zwiazek 'topnieje z rozkladem powyzej 200°C i wykazuje nastepu¬ jace widmo absorpcji w nadfiolecie: *89 m 11 12 485 164 385 426 260 177 X max (ram) e r7- lem Analiza elemeratarima: dla C40H62N4O12.Obliczono: C 63,66, N 7,12, N 6,60.Znaleziono: C 64,60, N 6,64, N 5,91.Przyklad VIII. 3-/3-keto-2-/IIIrz.bu!tok;sykar- bonylo/-l-buitenylo-/-ryfamycyraa-SV. Powyzszy awiazek otrzymuje sie z 3-formyloryfiamycyiny SV i ootiairuu Illtrz.butyloaicetokisylu, sposobem opisa¬ nym w pirzykladzie IV. Zwiazek topnieje w tempe- ratuirze 140—<145°C d wykazuje nastepujace widmo absorpcji w nadfiolecie: X max (ram) 475 370 E -1-'0 90,4 101,5 1 cm Anializa elementarna: dla C46H59NOi5.Obliczono: C 63,80, H 6,87, N 1,12.Znaleziono: C 63,91, H 6,80, N 1,72." W podobny isfposób otrzymuje siie ryfiamycyny o ogólnym wzorze 1 i ikh pochodne 25-desacetylo i Bzescdioiwodioiro z niaistepujacyimi podstawnikami R, Re i X, wymienionymi iw itabiicy II. tablicy c.d. 280 511,3 - MM 0 9 1 • 2 3 4 6 7 8 9 11 12 13 14 16 17 18 19 21 22 23 24 26 27 28 29 1 31 Ta H H H H H 1 H H H H CH3 CH& CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 C2H5 C2H5 C2H5 C2H5 C2H5 C2HC C2H5 C2H5 C2H6 C2H5 C2H5 1 C2H5 b 1 i c a R2 H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H 1 H II [ X =N-C6H5 wzór 4 wzór 5 wzór 6 =N-NH-/CH2/3-C6H5 =N-N/C3H7/2 wzór 7 =N-/CH2/7-CH3 =N-NHCH3 =N-NH-CH2-CH2OH wzór 8 wzór 9 =N-N/CH3/2 wzór 10 wzór 11 wzór 12 wzór 13 =N-0-CH/3H7/2 =N-0-CH/C6H5/2 =0 /wzór 14 =N-NH2 wzór 4 =N-N/C2H5/2 =N-N/C6H5/2 wzór 15 =N-NH-CH2-CH = =CH2 =N-NH-CH2-CH= =CH-C6H5 =N-NH-CH2-CH2- -N/C2H5/2 wzór 5 | wzór 16 40 45 50 55 60 | 65 & 3 Il 32 33 34 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 ' 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 1 75 1 76 77 78 79 80 81 82 83 84 1 85 H C2H6 C2H5 —/CH2/4—CH3 —/CH2/4^CH3 —/CH2/4—CH3 —/CH2/4—CH3 —/CH2/4—CH3 —/CH2/4—CH3 —/CH2/4—CH3 —/CH2/4—CH3 —/CH2/6-^CH3 —/CH2/6—CH3 —/CH2/6—CH3 —/CH2/c—CH3 —/CH2/6—CH3 —/CH2/6—CH3 —/CH2/6—CH3 C2H5 -C3U7 C3H7 C3H7 C3H7 C3H7 C3H7 C3H7 wzór 28 wzór 28 wzór 28 wzór 28 wzór 28 -CH2/2-C6H5 -CH2/2-C6H5 -CH2/2-C6H5 -CH2/2-C6H5 -CH2/2-C6H5 -CH2/2-C6H5 -CH2/2-C6H5 -CH2/2-C6H5 -CH2/2-C6H5 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 C3H7 C3H7 * C3H7 C3H7 -/CH2/2-C6Hi -/CH2/2-C6H= | -/CH2/2-C6HE R2 H H H H H H H •H H H H H H H H H U H H H H H H H H H.H H H H H H H H H H H H H C3H7 C3H7 C3H7 C3H7 C3H7 C3H7 C3H7 C3H7 CH3 1 CH3 1 CH3 CH3 C3H7 C3H7 |C3H7 X =NO-.gteranil =N-0/CH2/3-CH3 =0 =N-NH-C2H5 =N-N/CH2-CH2OH/2 wzór 4 wzór 17 =N^OH =N-Q-C2H5 wzór 18 wzór 5 = 0 wzór 19 wzór 20 wzór 2il wzór 22 wzór 23 wzór 24 =Q wzór 25 wzór 26 wzór 27 =N-0-CH2-C6H5 =N-0-CH2-CH= = CH2 =N-0-CH2-CH2- -CH2-C6H5 = 0 wzór 5 1 wzór 29 =N-0-C3H7 wzór 30 =0 =N-NH2 wzór 31 wzór 32 =N-N/C2H5/2 =N-0-C2H5 wzór 33 =N-OH =N-0-CH2-CH2- -COOH =0 wzór 34 wzór 5 iwzór 36 wzór 36 wzór 37 =N-0-CH2-C=CH wzór 38 =0 wzór 39 wzór 40 wzór 23 =0 wzór 41 | wzór 589 091 13 14 tablicy cd. li ¦8 g ii 86 87 88 89 90 91 92 93 | 94 H -/CH2/2-CH3 —/CH2/4^CH3 —/CH2/4^CH3 —/CH2/4^CH3 —/CH2/4^CH3 —/CH2/4—CH3 —/CH2/4—CH3 —/CH2/4—CH3 —/CH2A—CH3 R2 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 x 1 =0 wzór 42 wzór 43 =N-0-CH2-CH2- -COOH wzór 44 wzór 45 wzór 46 wzór 47 wzór 48 Z ia strzezeni a patentowe 1. Sposób wytwarzania pochodnych 3-iaikenylo- ryfamycyny SV o ogólnym wzorze 1, w którym R oznacza atom wodoru lub grupe alkilowa albo grupe laryioniiskoalkilowa, Ri oznacza iatom wodo¬ ru lub gru,pe acetylowa, R2 oznacza atom wodoru lub nizszy alkil, X oznacza grupe iminowa, pod¬ stawiona grupe iminowa, grupe hydroksyiminowa, podstawiona grupe hydirotosyiminowa, girupe hy- drazonu lub podstawionego hydirazonu, znamienny tym, ze ryfamycyne SV o podanym w schemacie 1 ogólnym wzorze 3, w którym R, Ri i R2 maja wyzej podane znaczenie poddaje sie reakcji z pierwszorzedowa amina, hydrazyna lub hydroksy¬ loamina. 2. Sposób wytwarzania pochodnych 3-alkenylo- ryfacycyny SV o wzorze 1, w którym R oznacza atom wodoru lub grupe alkilowa albo grupe ary- loniisikoalkilowa, Ri oznacza atom wodoru lub gru¬ pe acetylowa, R2 oznacza atom wodoru lub nizszy alkil, X oznacza grupe iminowa, grupe hydroksy¬ iminowa, podstawiona grupe hydroksyiminowa, grupe hydirazonu lub podstawionego hydrazonu, znamienny tym, ze 16, 17, 18 19, 28, 29-szesciowo- doropochodna SV-ryfiamycyny o podanym schema¬ cie 1 wzorze 3, w iktórymR, Ri i R2 maja wyzej podane znaczenie poddaje sie reakcji z pierwsizo- rzedowa amina, hydrazyna lub hydroksyloamina. 3. Sposób wytwarzania pochodnych 3-alkanylo- ryfamycyny SV o wzorze 1, w którym R oznacza atom wodoru lub grupe alkilowa albo grupe airy- lciniskioalkilowa, Ri oznacza atom wodoru lub giru¬ pe acetylowa, R2 oznacza atom wodoru lub nizszy alkil, X oznacza grupe iminowa, grupe hydroksy¬ iminowa, podstawiona grupe hydroksyiminowa, grupe hydraizoinu lub podstawionego hydrazonu, znamienny tym, ze 25-dezacetylopochodna SV-ry- fiamycyny o podanym w 'schemacie 1 wzorze 3, w którym R, Ri i R2 maja wyzej podane znaczenie poddaje sie reakcji z pierwsizorzedowa amina lub hydroksyloamina.Me Me R10^ OH o MeO^Me°'H QH Me 0 Wzór 1 N02 N-NH^3^N02 lVzór 4 -N-NC -H-K - o I Ol X o I to o o N in -r^ ^ X (d o o V 0H- £3 1— N O o o 1 A 0 (NJ KI o u, o N lO U_ O ! A i i V X r— M lO K X X O O \X -ZL i 1 »0 * oT X "~T X o o" -o N O -o N J_ O i x -o N " C N -a NI89 091 o CM x o 'cm X o o CM nr o 'cm X o o o o o o I o x o -o N co OJ to ro X o I ro 'cm X o I CO i- -o N ^ •*.U V i CM ^~OJ X ^ ! O o ICM X o o I -o X o (O O l CM X -o N89 091 ?3H7 =N-N-C6H5 izór $ =N"'V-CH9--G:H. 2 ^6n5 Wzór 40 CH3 ,Cr!3 =N-NH^f C-CH~ CH m 3 zór 45 C,H 2n5 =n-nh-ch,-ch,-n: Wzór 41 CK 2"5 CH, 'N-NHCHg-CHa^J Wzór 42 -u-K :nh CH3 Wzór 43 CH3 CH / \ CH3 CH3 Wzór 46 CH5 =N- Wzór 4/ N-NH S02F S02F Jzo zr 44 =N-NHA H Vvzdr -fd HO R40 Ma Me MeO ^le Me Me Me CH0+(C6H5),P = CR2-C-R O Me Me MeO CH = CR-C-R + (CB'H5),P0 6 "5/3 Me O V\izor j O Schemat WZGaraf. Z-d Nr 2, tzam. 397/77, A4, 110 Cena 10 zl PL PL