PL89225B1 - - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia podstawionych w pozycji 3 ryfamycyn o wzo¬ rze ogólnym 1, w którym R oznacza atom wo¬ doru lub rodnik fenylowy, a R[ rodnik fenylowy lub karboksyfenylowy, lub tez R i Rj i atom 5 wegla, z którym te rodniki sa zwiazane stanowia lacznie rodnik cykloalkilidenowy, oraz odpowied¬ nich pochodnych 25-dezacetylo i 16, 17, 18, 19, 28, 29 — szesciowodorowo.Wyrazenie „rodnik cykloalkilidenowy" obejmuje 10 rodniki cykloalifatyczne o 5—10 atomach wegla w pierscieniu, w tym równiez rodniki alifatycz¬ nych zwiazków spiranowych. Rodniki te moga miec jedno lub wieksza liczbe podwójnych wia¬ zan i byc podstawione jednym lub wieksza licz¬ ba podstawników, takich jak grupa wodorotleno¬ wa, karboksylowa, aminowa, dwualkiloaminowa,. alkilohydroksyalkilowa, aminoalkilowa, alkiloami- noalkilowa lub dwuaikiloaminoalkilowa.Zwiazki o wzorze 1 otrzymuje sie, gdy na 3-fO'rmyloryfamycyne lub na jej pochodna 25-dez¬ acetylo lub na szesciowodorowo pochodna ryfamy- cyny dziala sie pochodna hydrazyny o gólnym wzorze 2, w którym R i R1 maja wyzej podane 25 znaczenie. Reakcje przeprowadza sie na ogól w temperaturze pokojowej, zadajac roztwór wyjscio¬ wej 3-formyloryfamycyny w obojetnym rozpusz¬ czalniku organicznym stechiometryczna iloscia po¬ chodnej hydrazyny o wzorze 2. Reakcja zachodzi 30 w ciagu 10 minut do 4—5 godzin. W niektórych przypadkach, gdy szybkosc reakcji jesit bardzo mala, mozna mieszanine reakcyjna ogrzewac. W celu wyodrebnienia surowego produktu koncowe¬ go odparowuje sie rozpuszczalnik, a pozostalosc przekrystalizowuje i/lub poddaje chromatografii kolumnowej.Stanowiace substrat reakcji hydrazyny otrzy¬ muje sie znanym sposobem, ogrzewajac zwiazek karbonylowy o wzorze 3, w którym R i Rj maja znaczenie wyzej podane, ze stechiometryczna ilos¬ cia hydrazyny w obojetnym rozpuszczalniku or¬ gan!oznym.Dobierajac odpowiednie zwiazki karbomylowe mozna otrzymac duza liczbe hydrazonów o wzorze 2, a tymi zwiazkami mozna z kolei podstawiac 3-formyloryfamycyny, otrzymujac odpowiednie zwiazki o wzorze 1.Jako przyklady zwiazków karbonylowych o wzo¬ rze 3, które mozna przeprowadzic w odpowiednie hydrazony, a nastepnie przy ich udziale otrzymac odpowiednie zwiazki o wzorze 1, mozna wymie¬ nic nastepujace: cyklopentanon, cykloheksanon (±) menton, (—) menton, (±) kamfora, (+) kamfora, karwon, pulegon, izopulegon, kwas cykloheksano- no-4-karbok.sylowy-l, 2-butylo-3-metylocyklopen- ten-l-on-2, 2-(2-dwumetyloaminoetylo) cykloheksa¬ nowi, kwas (cykloheksanono-3)octowy, cyklohepta- non, 4, 4-dwumetylocykloheiptanon, 3, 5, 5-trójme- 89 2253 89225 4 tylocykloheptanon, kwas l-(cyklocktanoino-2) pro- 'pionowy, cyklodekanon, spiro-[5,5]-undekanon-l, spiro-[6,7]-tetradekanon-8.Zwiazki otrzymywane sposobem wedlug wyna¬ lazku sa barwnymi cialami stalymi, krystalizuja- 5 cymi z rozpuszczalników organicznych, takich jak nizsze alkanole, octan etylu, dioksan, czterowcdo- rofuran, benzen i chlorowcowane weglowodory.Rozpuszczalnosc jest zalezna od rodzaju i wielkosci podstawników R i Rj. Zwiazki posiadajace funk¬ cje kwasowa tworza z metalami alkalicznymi rozpuszczalne w wodzie sole.Zwiazki otrzymane sposobem wedlug wynalazku wykazuja silna czynnosc w stosunku do Gram- dodatnich i Gram-ujemnych bakterii, a szczegól¬ nie w stosunku do szczepów Staphylococous aureus.Najnizsza dawka hamujaca wynosi w tym przy¬ padku 0,001—0,05 |^g/ml. W stosunku do opornych na inne znane ryfamycyny szczepów Staphylococ- cus aureus zwiazki otrzymywane sposobem we¬ dlug wynalazku sa czynne w stezeniu 1—50 p,g/ml.Toksycznosc zwiazków jest bardzo niska.Inna bardzo cenna wlasciwoscia zwiazków wy¬ twarzanych sposobem wedlug wynalazku jest ha- 25 mujace dzialanie przejawiane w stosunku do poli¬ meraz DNS, charakterystycznych dla limfoblastów z krwi ludzi chorych ma bialaczke i w stosunku do transferaz nukleotylowych (polimeraz) wirusów, które nie biora udzialu w metabolizmie komórek 30 normalnych. Z badan nad reprezentatywnymi przedstawicielami grup wirusów wiadomo, ze w znacznej czesci cyklu reprodukcji w komórkach zywiciela sa one nosicielami lub wytwarzaja poli¬ merazy. Tak wiec na przyklad wirusy Picorna, 35 czy Polio wytwarzaja zalezna od RNS polimeraze RNS, podczas gdy wirusy innych grup, na przy¬ klad wirusy bialaczki sa nosicielami zaleznej od RNS polimerazy DNS. Obecnosc i niezwykle wazna rola, jaka spelnia zalezna od RNS polimeTaza DNS 40 (przeciw-transkryptaza) w przypadku rakotwór¬ czych wirusów RNS zostaly odkryte przez B. Bal¬ timore^, Nature 226, 1209 (1970) i przez H. M. Te- mina i wspólpracowników, Nature, 226, 1211 (1970).Wystepowanie zaleznej od RNS polimerazy DNS 45 w zwierzecych rakotwórczych wirusach RNS zo¬ stalo stwierdzone równiez przez innych badaczy.Zagadnienia te sa omówione w nastepujacych publikacjach: Green i wspólpracownicy, "Mechaniisni of car- 50 cinogenasis by RNS tumor vinises I. An RNA-de- pendent DNA-polymerase in murine sarcoma vi- ruses", Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 67, 385—393, 1970, Spiegelman i wspólpracownicy, "Characteri- zation of the products of RNA directed DNA-poly- 55 merase in oncogenic RNA viruses", Nature, Lon¬ don, 227, 536, 1970, Kanaka i wspólpracownicy, "DNA polymeraise activity associated with RNA tumor viruses", Proc. Nat. Acad. Soi, USA 67, 143, 1970, Scolnick i wspólpracownicy, "DNA synthesis 60 by RNA containing tumor viruses", Proc. Nat.Acad. Sci. USA. 67, 1034, 1970.Obecnosc wirusów RNS w pewnych nowotwo¬ rach potwierdzaja równiez dalsze fakty: w mleku 65 kobiet chorych na raka piersi i kobiet, w których rodzinie wystepowaly przypadki raka piersi zna¬ leziono przeciwtranskryptaze (Scholn i wspólpra¬ cownicy, Nature 231, 97, 1971), a Priori i wspól¬ pracownicy, Nature New Biology, 232, 16, 1971 z komórek plynu oplucnej dziecka z zapaleniem wezlów chlonnych wyodrebnili wirusa ESP, który zawiera przeciwtranskryptaze i który daje sie rozmnazac w hodowli tkankowej.Axel i wspólpracownicy, Nature 235, 32, 1972, w drodze hybrydyzacji molekularnej wykazali wy¬ stepowanie w przypadku raka piersi kobiet wirusa RNS homologicznego z wirusem RNS nowotworu sutki myszy. Mozliwosc wirusowego pochodzenia raka piersi wykazuja przeprowadzone technika mikroskopii elektronowej badania mleka kobie¬ cego (N. H. Sarkar i wspólpracownicy, Nature, 236, 104, 1972). Równiez z komórek ludzkiego miesaka miesni prazkowanych wyodrebniono czynna w sto¬ sunku do RNS polimeraze DNS i wirusopodobne czastki. (McAllister i wspólpracownicy Nature New Biology, 235, 3 1972). Dotychczas nie ma v leków skutecznie zwalczajacych schorzenia wirusowe, po¬ niewaz warunki przemiany materii wirusów i ko¬ mórek sa takie same. Najbardziej obiecujaca droga chemioterapii chorób wirusowych jest opracowa¬ nie odpowiednich zwiazków wybiórczo laczacych - sie z polimerazami wirusowymi, lub z polimera- zami komórkowymi transformowanymi przez wi¬ rusy, a nie laczacymi sie z polimerazami normal¬ nych komórek zywiciela, co daloby mozliwosc kontroli informacji genetycznej wirusów. Wybiór¬ cze inhibitory enzymów wirusa lub enzymów ko¬ mórkowych transformowanych przez wirusa, a w szczególnosci inhibitory polimeraz rakotwórczych wirusów RNS odgrywaja znaczna role w lekach do terapii bialaczki i innych schorzen nowotworo¬ wych.Zbadano hamujaca czynnosc zwiazków wytwa¬ rzanych sposobem wedlug wynalazku w stosunku do oczyszczonej, zaleznej od RNS polimerazy DNS endogennego wirusa Muridae i w stosunku do oczyszczonej zaleznej od DNS polimerazy wirusa Poly d(A—T). W badaniach posluzono sie sposo¬ bami opisanymi przez C. Gargo i wspólpracow¬ ników, Nature, New Biology, 229, 111, 1971. Dzia¬ lanie leków w róznych stezeniach na czynnosc polimerazowa okreslano nastepnie w stosunku do 3H-dTTP (trytowany trójfosforan tyminodezoksy- rybozy) polaczonego z frakcja nierozpuszczalna.Ponizej przedstawiono typowy przyklad poste¬ powania doswiadczalnego.Sposobem opisanym pnzez Greena i wspólpra¬ cowników, Proc. Nat. Acad. Soi, USA, 67, 385—393, 1970 i przez Rokutande i wspólpracowników, Na¬ ture, 227, 1026—1028, 1970, wyodrebnia sie wirusa Muridae z nowotworowych komórek szczura (ko¬ mórki 78 Al (szczep Moloney'a) oraz z nowotwo¬ rowych komórek myszy (komórki MEEH) (szczep Harvey'a), a nastepnie oczyszcza. Polimeraze wiru¬ sowa otrzymuje sie w wyniku inkubacji oczyszczo- negjo wirusa 0,5% NP-40 (monidet P-40) w 0,1 -M NaCl, 0,01 M buforze Tris (pH 7,6) i 0,001 M EDTA,89 2 w ciagu 5 minut, w temperaturze pokojowej i 20— 40 krotnie oczyszcza przez wirowanie strefowe w ciagu 24 godzin w roztworze sacharozy o steze¬ niu wzrastajacym od 15 do 30%, 10 mM buforze Na-fosforanowym (pH 7,4), 2,5 mM MgCl2, 10 mM 5 ditiotreicie i 5% glicerynie, z szybkoscia 38 000 obrotów na minute, w ultrawiirówce Spinco SW 41.Zebrano 22 frakcje, a wykazujace najwyzsza czyn¬ nosc enzymatyczna frakcje 13—17 polaczono i przechowywano w temperaturze —70° w 30% gli- 10 cerynie.Oznaczanie polimerazy DNS.Inkubacje enzymy prowadzi sie w ciagu godziny w 37^C, w 100 fil mieszaniny skladajacej sie z 40 mM buforu Tris (pH 8,0), 5 - mM ditiotreitu, mM Nad, 2,5 mM Mg Cl2, 0,1 mM dATP dGTP, dCTP i 10 [t Ci 3H-dTTP (12—18 Ci/mmol), sposo¬ bem opisanym przez Greena i Mitaro, Proc. Nat.Acad. Sci, USA, 67, 385—393, 1970. Reakcje przej- 2Q rywa sie dodajac 150 1 IM kwasu rradchlorowego.W charakterze nosnika dodaje sie DNS grasicy cie¬ lecia (100 (Ag). Radioaktywny produkt DNS przera¬ bia sie w sposób opisany w obu powyzej cytowa¬ nych pozycjach literaturowych. Endogenna czyn- 25 nosc zaleznej od RNS polimerazy DNS okresla sie po dodaniu 0,01% NP-40 do oczyszczonego wirusa w momencie przeprowadzania doswiadczenia.Czynnosc polimerazowa oczyszczonej polimerazy wirusowej oznacza sie stosujac jako matryce 2 pg 30 Poly d(A—T) i bez NP^O.Oznaczanie hamujacego dzialania pochodnych ryfamycyny.Sporzadza sie roztwór pochodnej ryfamycyny w dwumetylosulfotlenku (DMSO), o stezeniu 5 mg/mol *5 i przechowuje go w temperaturze 4°C. Hamujacy wplyw na czynnosc endogennej zaleznej od RNS polimerazy DNS okresla sie w ten sposób, ze 2 (0,1 roztworu antybiotyku w DMSO lub 2^1 DMSO (kontrola) dodaje sie do badanej próby, zawiera- 40 jacej 15—30 jxg bialka wirusowego a nastepnie do próby wprowadza sie oslabionego wirusa. Inkuba¬ cje enzymu prowadzi sie w ciagu^ 70 minut w 37°C.Nastepnie dodaje sie 70 uA mieszaniny substratów i mieszanine inkubuje i przerabia w wyzej opisany 45 sposób.W reprezentacyjnych badaniach zwiazki wytwa¬ rzane sposobem wedlug wynalazku w stezeniu 2— - 100 (Lig/ml ograniczaly przylaczanie 3H-dTTP do ponizej 10% wartosci oznaczonej w badaniach kontrolnych. W ten sposób wykazano, ze wplywaja one hamujaco na mechanizm nowotworotwórczy nowotworowych wirusów RNS, zgodnie z najnow¬ szymi pogjladami biochemicznymi. 55 Hamujace dzialanie w stosunku do przeciw- transkryptaz okresla sie równiez w badaniach na wirusach Muridae. Zalezna od RNS polimeraze DNS wirusa Muridae otrzymuje sie w sposób opi¬ sany przez Galio i wspólpracowników, Nature eo New Biology, 232, 141, 1971 z wirusa oslabionego Ttaiitonem X 100. Winusy szczepów Rauschera i Moloney'a oczyszcza sie przez wirowanie strefowe w zakresie 1,16 g/ml gradientu gestosci sacharozy, po wstepnym wirowaniu przy ograniczonej szyb- 65 6 kosci w roztworze sacharozy malejacym od 60 do %, dla oddzielenia fragmentów komórek. Konco¬ we stezenie preparatu wirusowego wynosi 10*1 czastek w ml. Jako matryce stosuje sie endogenny 7OS RNS. Stwierdzono, ze stezenie 50 jxg/ml i nizsze skutecznie hamuje czynnosc enzymatyczna. Podob¬ ne wynika otrzymuje sie stosujac polimerazy z ko¬ mórek nowotworowych pochodzenia ludzkiego.W tym przypadku dla scharakteryzowainia selek¬ tywnego wplywu bada sie dzialanie hamujace równiez w stosunku do polimeraz komórek nor¬ malnych. Badano czynnosc reprezentatywnych po¬ chodnych ryfamycyny o wzorze ogólnym 1 w sto¬ sunku do 2 oczyszczonych polimeraz DNS, wy¬ odrebnionych z normalnych ludzkich limfocytów krwi (stymulowanych PHA), z komórek limfobla- stów krwi zdrowego dawcy i z limfoblastów krwi bialaczkowej. Stosowano matryce syntetyczne i/lub naturalne.Ponizej opisano typowy przyklad przeprowadze¬ nia oznaczenia.Limfoblasty krwi ludzkiej.Bialaczkowe limfoblasty wyodrebnia sie z obwo¬ dowej krwi pacjentów z ostra bialaczka w drodze leukoforezy. Komórki przemywa sie, a erytrocyty usuwa przez podcisnieniowe rozpuszczenie. Nor¬ malne limfocyty otrzymuje sie z obwodowej krwi zdrowych dawców po oddzieleniu granulocytów w drodze chromatografii na tworzywie poliamido¬ wym. Poddaje sie je obróbce opisanej przez Gal¬ io i wspólpracowników, Nature 228, 927, 1970 i Science 165, 400, 1968, dzialajac w ciagu 72 godzin fitohemaglutynina (PHA), w celu mozliwie jak najwieks"zego wzmocnienia ich czynnosci DNS — polimerazowej. W niektórych orientacyjnych bada¬ niach wstepnych stosowano slabiej oczyszczona poli¬ meraze DNS, otrzymana z hodowli „normalnych" tkanek ludzkich (1788). Interesujace zwiazki zba¬ dano nastepnie na lepiej oczyszczonych enzymach z normalnych i bialaczkowyeh limfocytów. Kultu¬ ry tkanek otrzymano z Associated Biomedic Sys¬ tems, Inc.Preparaty polimerazy DNS.Polimerazy DNS otrzymuje sie z normalnych (stymulowanych PHA) i bialaczikowych limfo¬ cytów oraz z komórek lirnfoidainych 1788, w dro¬ dze homogenizowania w hipotonicznych roztwo¬ rach buforowych i nastepnego traktowania Trito- nem X 100 i/lub ekstrakcji roztworami soli zew¬ netrznych lizozomalnych blon komórkowych. Po róznicujacym wirowaniu w roztworach soli etos- . trakty komórkowe oczyszcza sie dalej w drodze chromatografii kolumnowej na celulozie DEAE, fosfocelulozie i dekstranie Sephadex G 200.Badanie polimerazy DNS.Badanie polimerazy DNS przeprowadza sie w koncowej objetosci 100 1. Badana mieszanina za¬ wiera 50 mM buforu Tris — HC1 o pH 8,3, 6,0 mM octanu "magnezu, 8,0 mM ditiotreitu i 60 mM NaCl. Wartosc pH nastawia sie ipo dodaniu roz¬ puszczonych w DMSO inhibitorów. Koncowe ste-\ 7 zenie DMSO wynosi 0,5% i taka ilosc zawieraja wszystkie próby kontrolne. W badaniach stosuje sie enzymy w stezeniu katalizujacym przylaczanie okolo 1 pM w ciagu godziny. W wiekszosci przy¬ padków enzym inkubuje sie wstepnie inhibitorem 5 w ciagu 5 minut. Nastepnie przeprowadza sie pod¬ stawienie dodatkiem syntetycznego DNS (Poly d/AT/ Miles Dab.) i hybrydy DNS.RNS (Oligo dT. poly rA) w ilosci 5 u,g/ml lub naturalnego, akty¬ wowanego DNS nasienia lososia, w ilosci 50 u,g/iml 10 i RNS endogennego wirusa 70S, 10 jjtCi (3H-metylo)- -TTP (New England Nuclear, 18,6 mCi) j^M, liofi¬ lizowany i ponownie rozpuszczony w 0,01 M HOl bezposrednio przed uzyciem) i ATP (8 X 10~5M, z matryca syntetyczna) lub dodatkiem wszystkich 15 trzech trójfosforanów dezoksynukleozydów (8 X "5 M z RNS lub DNS jako matryca). W pewnych przypadkach nie przeprowadza sie wstepnej inku¬ bacji enzymu inhibitorem,, lecz przeprowadza sie reakcje wprowadzajac do gotowej mieszaniny en¬ zym lacznie z inhibitorem. Na poczatku inkubacji i po 30 minutach pobiera .sie próby, przerywa w nich reakcje dodatkiem 2 ml 0,08 M pirofosforanu sodu i przeprowadza sie wytracenie dodatkiem 12,5% zimnego kwasu ifrójchlorooctowego (TCS) z 25 400 jmg RNS drozdzy jako nosnikiem. Produkty odsacza sie na imikroporowatym filtrze dokladnie przemywa 5% kwasem trójchlorooctowym i 1 ml mieszaniny DMSO-etanol-0,1 M NaCl (0,5 : 70 : 29 : : 5), siuszy, rozpuszcza w 2 ml BBS3 (Beckman) i ml liquifluoru (New England Nuclear) i liczy za pomoca cieczowego licznika scyntylacyjnego pro¬ dukcji Packard.Stwierdzono, ze stezenie 5—20 jLig/ml powoduje 35 przy syntetycznej matrycy DNS 50% zahamowa¬ nie aktywnosci polimerazy bialaczkowej. Przy syn¬ tetycznej matrycy RNS (Poly rA .rU) reakcja byla jeszcze czulsza. 40 Reprezentatywne badania przeprowadzone z na¬ turalna matryca na polimerazach komórek nor¬ malnych i nowotworowych wykazaly, ze enzymy nowotworowe sa czulsze na dzialanie testowanych zwiazków. 45 Sposród innych wlasciwosci biologicznych no¬ wych pochodnych ryfamycyn nalezy wymienic ha¬ mowanie powstawanie ognisk nowotworowych w komórkach myszy, szczurów i ludzi zakazonych szczepem Moloney^ i Kirstena wirusa Muridae, selektywne hamowanie wytwarzania wirusów przez zmienione komóriki mysie i ludzkie, odtwa¬ rzanie komórek normalnyeh przez zmienione wi¬ rusy Muridae komóriki mysie i szczurze.Ponadto, pochodne hydrazowane sa selektywnie toksyczne w stosunku do zmienionych przez wi¬ rusy komórek mysich, szczurzych i ludzkich, co wynika z badan ich zdolnosci do tworzenia ko¬ lonii. w Badania czynnosci hamujacej wywolywanie ognisk nowotworowych przez szczep Moloney'a w hodowli tkankowej przeprowadza sie w nastepujacy spo¬ sób: 8 Komórki BALB/3T3 hoduje sie w 250 ml pojem¬ nikach z tworzywa sztucznego na pozywce Eagle'a zawierajacej surowice krowiego plodu* Liczenie komórek przeprowadza sie za pomoca licznika Soultera po zawieszeniu ich w nosniku trypsyno- wym i rozcienczeniu pozywka. Jako homogenat nowotworowy stosuje sie szczep Moioney^a. Pod¬ daje sie go czterokrotnemu pasazowaniu komór¬ kowemu na wielokrotnie pasazowanym zarodku myszy rasy szwajcarskiej i bada wlasciwosci two¬ rzenia ognisk nowotworowych w komórkach BALB/3T3. Stosuje sie zmodyfikowany sposób opracowany przez Hatley'a i Rowe'a, Proc. Nat.Actad. Soi., 55, 780, 1966. Zawarta w pojemnikach pozywke szczepi sie komórkami w ilosci 1—2 X 106 na 25 ml i inkubuje w ciagu 24 godzin w 37°C.Po oddzieleniu plynu wprowadza sie wirusa w okreslonej liczbie jednostek nowotworotwórczych.Nastepnie w ciagu 30 minut w 37°C przeprowadza sie adsorpcje na pojedynczej warstwie komórek, po czym do 25 ml pozywki wprowadza sie okreslo¬ na ilosc, zwykle 5—10 u.g/mi hydrazynowej pochod¬ nej ryfamycyny, w poistaci roztworu w dwume- tyloisulfotlenku o stezeniu limg^ml i hodowle po¬ nownie umieszcza w inkubatorze. Kontrole stanowi dodany do odrebnej hodowli dwumetylosulfotle- nek w pozywce. Po trzydniowej inkubacji obser¬ wuje sie zmiany w plynie hodowlanym, a nowo- tworowo zmienione komórki liczy sie po 7 dniach prowadzenia hodowli.W podobny sposób przeprowadza sie badania wirusa pecherzykowatego zapalenia jamy ustnej, serotyp New Jersey. Sposoby mnozenia i badania tego wirusa opisali Hackett i wspólpracownicy, Virology, 34, 114, 1967.Powyzsze wlasciwosci wykazuja, ze zwiazki otrzymywane sposobem wedlug wynalazku dzia¬ laja hamujaco na rozwój wirusowych nowotwo¬ rów zwierzat. Wynalazek ilustruja nizej podane przyklady.Przyklad I. 3-(2Hcykloalkilidenohydrazono) metyloryfamycyna SV.Do roztworu 1,3 g eyiklooktanonu w 10 ml cztero- wodorofuranu dodaje sie 0,5 g 98% wodzianu hy¬ drazyny. Mieszanine w ciagu godziny ogrzewa sie pod chlodnica zwrotna w temperaturze wrzenia, a nastepnie pod zmniejszonym cisnieniem odpa¬ rowuje z niej , rozpuszczainik, otrzymujac w po¬ zostalosci 0,90 g oleistej cyklooktylidenohydra- zyny. Surowy produkt dodaje sie do roztworu 4,5 g 3-formyloryfamycyny w 300 ml czterowodo- rofuranu. Po 15 minutach roztwór odparowuje sie do sucha, a otrzymane w pozostalosci cialo stale poddaje chromatografii kolumnowej na zelu krze¬ mionkowym ,eluujac chloroformem z wzrastajaca od 0 do 1,5% zawartoscia metanolu.Oczyszczony chromatograficznie produkt dwu¬ krotnie iprzekrystalizowuje sie z metanolu. Wy¬ dajnosc: 1,5 g zwiazku o temperaturze topnienia 252—256°C (z rozkladem). Analiza elementarna: wartosci obliczone dla C46H61N3012 : C 65,15 H 7,2589 225 N 44,95, wartosci znalezione: C 64,95 H 7,22 N 5,10.Widmo absorpcji w nadfiolecie przedstawia sie na¬ stepujaco: Amax(nm 480 333 260 przegiecie przy 505 5 1% E 166 280 326 1 cm Przykl a d II. 3-(2-benzylidenohydrazono)me- tyloryfamycyna SV.Do utrzymywanego w temperaturze pokojowej roztworu 750 mg 3-formyloryfamycyiny SV w 10 ml czterowodorofuranu dodaje sie, mieszajac, 150 mg benzylidenohydrazyny. Reakcje prowadzi sie w cia¬ gu 20 minut, nastepnie roztwór odparowuje do sucha, a stala pozostalosc przekrystalizowuje z metanolu. Wydajnosc: 500 mg zwiazku o tempe¬ raturze topnienia 203—214°C (z rozkladem). Analiza elementarna: wartosci obliczone dla C/^H^NsO^ : :C 65,28 H 6,45 N 5,08, wartosci znalezione: C 64,98 H 6,69 N5,ll. Widmo albsorpcji w nadfiolecie przed¬ stawia sie nastepujaco: A (nm) /lmax 1% 500 345 310 1 om 170,9 346 341 Przyklad III. 3-(2-beinihyd,ryliidenohydrazono) metyloryfamycyna SV.Postepujac w sposób opisany w przykladzie II, 6,1 g zwiazku tytulowego o temperaturze topnienia 260°C (iz rozkladem otrzymuje sie z 7,5 g 3-fonmylo- ryfamycyny SV i 2 g benhydrylidenohydrazyny w . 100 ml czterowodorofuranu. Reakcje prowadzi sie w ciagu 1 godziny. Analiza elementarna: obli¬ czone dla C51H57N3012 : C 67,75 H 6,35 N4,65, war¬ tosci znalezione: C 66,82 H 6,39 N4,85. Widmo ab¬ sorpcji w nadfiolecie przedstawia sie nastepujaco: Wnm) 510 350 1% 1 cm 140,1 278,7 ' Przyklad IV. 3-[2-(p-karboksybenzylideno) hydrazono]metyloryfamycyny SV.-Postepujac w sposób opisany w przykladzie III, z tym, ze benzyhydrylidenohydrazyne zastepuje 40 45 sie ekwimolarna iloscia (p-karboksybenzylideno) hydrazyny otrzymuje .sie z wydajnoscia 55% zwia¬ zek tytulowy o temperaturze topnienia 205—215°C (z rozkladem). Analiza elementarna: wartosci obli¬ czone dla C/l6H5^N3014 : C 63,36 H 6,13 N 4,82, war¬ tosci znalezione: C 62,04 H 6,25 N 5,00. Widmo ab¬ sorpcji w nadfiolecie przedstawia sie nastepujaco: *max(nm) 313 5°0 1% E 1 cm 402,3 154,4 PL

Claims (3)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania podstawionych w pozycji 3 ryfamycyn o wzorze ogólnym 1 w którym R oznacza atom wodoru lub rodnik fenyIowy, a Rt oznacza rodnik fenylowy lub karboksyfenylowy lub tez R i A razem z atomem wegla, z którym te rodniki sa zwiazane, istanowia lacznie rodnik cykloalkilidenowy, znamienny tym, ze 3-formylo- ryfamycyne poddaje sie reakcji z pochodna hydra¬ zyny o ogólnym wzorze 2, w którym R i RA maja wyzej podane znaczenie.
2. 2. Sposób wytwarzania podstawionych w pozycji 3 ryfamycyn stanowiacych 25-dezacetylo pochodna ryfamycyny o wzorze ogólnym 1, w którym R oznacza atom wodoru lub rodnik fenylowy a Ri oznacza rodnik fenylowy lub karboksyfenylowy lub tez R i Ri razem z- atomem wegla, z którym te rodniki sa zwiazane, .stanowia lacznie rodnik cykloalkilidenowy, znamienny tym, ze 25-dezace¬ tylo-3-formyloryfamycyne poddaje sie reakcji z hydrazyna o wzorze 2, w którym R i Rx maja wy¬ zej podane znaczenie.
3. 3. Sposób wytwarzania podstawionych w pozycji 3 ryfamycyn stanowiacych 16, 17, 18, 19, 28, 29-sizesiciowodoropoichodna ryfamycyny o wzorze 1, w którym R oznacza atom wodoru lub rodnik fenylowy, a 1^ oznacza rodnik fenylowy lub kar¬ boksyfenylowy lub tez R i Ri razem z atomem wejgla, z którym te rodniki sa zwiazane stanowia lacznie rodnik cykloalkilidenowy, znamienny tym, ze 3-forimylopochodna 16, 17, 18, 19, 28, 29-szescio- wodororyfamycyny poddaje sie reakcji z odpowied¬ nie pochodna hydrazyny o wzorze 2, którym R i RA maja wyzej podane znaczenie.89 225 HO Me MeCOOJ Me Me Me O :6r { h9n-n=c; zdr 2 o=c; ^ zór 3 Druk WZKart. Zam. D-5035. Cena 10 zl PL