CN114621310A - 基于雷公藤红素的靶向Prdx2降解剂及其制备方法与医药用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了结构如式I所示的雷公藤红素PROTAC化合物或其药学上可接受的盐，L选自

m为2～10的整数，n为1～3的整数；D结构如下：

本发明还公开了所述的雷公藤红素PROTAC化合物或其药学上可接受的盐在制备靶向Prdx2降解剂的用途。本发明雷公藤红素PROTAC化合物或其药学上可接受的盐对肿瘤细胞具有显著的细胞增殖抑制作用，同时能够显著的靶向降解靶蛋白Prdx2，能够通过泛素‑蛋白酶体途径降解Prdx2，调节凋亡相关蛋白，进而诱导细胞凋亡。

Description

基于雷公藤红素的靶向Prdx2降解剂及其制备方法与医药 用途

技术领域

本发明属于药物化学领域，涉及基于雷公藤红素的靶向Prdx2降解剂及其制备方法与医药用途。

背景技术

癌症又称恶性肿瘤，是指在致癌因素的作用下，细胞的基因发生了改变，失去对其生长的正常调控。肿瘤发生的原因主要有外在环境因素和内在因素，其中外在环境因素主要包括：(1)化学致癌因素：主要是指由化学试剂诱导的，比如烷化剂、亚硝胺、黄曲霉毒素等；(2)物理致癌因素：主要是由辐射引起的基因突变，从而诱导癌症的发生，比如离子辐射、紫外线照射、热辐射等；(3)、病毒和细菌致癌：如RNA、DNA致瘤病毒及幽门螺杆菌等诱导的肿瘤。而内环境因素主要有遗传因素、免疫因素(细胞免疫为主)、性别因素、年龄因素等。

近年来，研究发现，过氧化物酶2(Peroxiredoxin2，Prdx2)在促进肿瘤生长、维持肿瘤细胞干性等发挥重要作用，大多数Prdx家族蛋白在各种癌症中增加，因此，Prdx家族蛋白可作为生物标志物。

靶向蛋白降解嵌合体PROTAC(Proteolysis targeting chimeras)是一种基于细胞自身的泛素蛋白酶体系统发展而来的新型靶向降解目标蛋白。作为一项新兴技术，PROTAC分子一端与目标蛋白结合，一端与E3连接酶结合，通过劫持内源性泛素-蛋白酶体系统来特异性降解靶蛋白。传统抑制剂蛋白抑制剂通过抑制目标蛋白活性来发挥作用，不能影响目标蛋白的含量，而PROTAC分子不同于传统蛋白抑制剂的原理，其能够将目标蛋白直接降解，减少目标蛋白的含量，从而发挥作用。由于PROATC分子可以实现在低剂量下瞬时结合至靶蛋白并诱导其降解，所以它不太容易受到靶标表达增加和靶蛋白突变的影响，具有降低用药剂量，并克服了对小分子抑制剂的潜在耐药性的缺点。

雷公藤红素(celastrol)又称南蛇藤素，属于五环三萜类化合物，是第一个从雷公藤属植物分离得到的活性化合物，是药用雷公藤的主要活性成分。近年来，研究工作者一直致力于寻找雷公藤红素的有效靶点，最近的蛋白质组学及其他药理研究表明，靶蛋白Prdx2和 Nur77为雷公藤红素的有效结合靶点。虽然雷公藤红素具有显著的药理活性，但是已有报道证实，雷公藤红素在临床上应用出现血液毒性、肝肾毒性、生殖毒性和胚胎发育毒性，因此，亟需开发能够在提升雷公藤红素活性的同时，降低其毒副作用的雷公藤红素衍生物。

目前，雷公藤红素的报道大多限于对其进行小分子结构修饰及前药方向研究，将其修饰合成为双功能小分子还有很多待研究的地方。

发明内容

本发明的目的在于基于蛋白降解靶向嵌合体(PROTAC)技术，将雷公藤红素设计为靶向 Prdx2的双功能分子降解剂，提供一种基于雷公藤红素的靶向Prdx2降解剂，该类基于雷公藤红素的靶向Prdx2降解剂活性显著增强，且毒性低、溶解性好、生物用度高，可用于胃癌等癌症或者其他Prdx2蛋白相关疾病的治疗。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

结构如式I所示的雷公藤红素PROTAC化合物或其药学上可接受的盐：

其中：

L为连接臂，选自如

所示的饱和烷基链、如

所示的烷氧基链， m为2～10的整数，n为1～3的整数；

D是E3泛素连接酶配体泊马度胺，其结构如下：

优选的，L选自

m为3～5的整数，n为1～2的整数。

本发明所述的雷公藤红素PROTAC化合物具体选自以下化合物：

本发明的另一个目的是提供所述的雷公藤红素PROTAC化合物的制备方法，合成路线如下：

其中，L和D的定义如前述。

包括以下步骤：

步骤(1)、在缚酸剂存在的条件下，2-(2,6-二氧代-哌啶-3-基)-4-氟基-异吲哚-1,3-二酮与式H2NL-NHBoc所示的化合物反应得到化合物II；

步骤(2)、化合物II在三氟乙酸存在的条件下经酸水解反应脱去Boc保护基，再在酰化活化剂和酰胺缩合剂存在的条件下，与雷公藤红素发生酰胺缩合反应得到式I所示的雷公藤红素PROTAC化合物。

步骤(1)中，反应溶剂为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)；反应温度为加热回流反应。

所述的缚酸剂为N,N-二异丙基乙胺。

步骤(2)中，酸水解反应的反应溶剂为二氯甲烷或N,N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜 (DMSO)；反应温度为室温。

酰胺缩合反应的反应溶剂为二氯甲烷或N,N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜；反应温度为室温。

所述的雷公藤红素与化合物II的摩尔比为1:1.5。

所述的雷公藤红素与酰化活化剂的摩尔比为1:5。所述的酰化活化剂为N,N-二异丙基乙胺。

所述的雷公藤红素与酰胺缩合剂的摩尔比为1:1.5。所述的酰胺缩合剂为六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷。

本发明是另一个目的是提供一种药物组合物，它是以本发明所述的雷公藤红素PROTAC 化合物或其药学上可接受的盐为有效成分或主要有效成分，与药学上可接受的载体制成药学上可接受的剂型。

所述的剂型为片剂、胶囊、粉剂、糖浆、液剂、悬浮剂、冻干粉针或针剂中的任意一种剂型。

本发明所述的雷公藤红素PROTAC化合物或其药学上可接受的盐能够显著地靶向降解靶蛋白Prdx2，能够通过泛素-蛋白酶体途径降解Prdx2，调节凋亡相关蛋白，进而诱导细胞凋亡。因此，本发明的另一个目的是提供所述的雷公藤红素PROTAC化合物或其药学上可接受的盐在制备靶向Prdx2降解剂的用途。

本发明的另一个目的是提供所述的雷公藤红素PROTAC化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗Prdx2蛋白相关疾病药物中的用途。

所述的Prdx2蛋白相关疾病为肿瘤或其它Prdx2蛋白相关疾病。

所述的肿瘤为胃癌、胆管癌、结直肠癌、前列腺癌；所述的其它prdx2蛋白相关疾病如：动脉粥样硬化。

本发明的有益效果：

与雷公藤红素相比，本发明化合物对肿瘤细胞具有显著的细胞增殖抑制作用，同时具有 Prdx2降解活性，能够显著地靶向降解靶蛋白Prdx2，具有作为抗肿瘤药物治疗肿瘤的潜力。

附图说明

图1为不同浓度的化合物I-1在BGC-823细胞中的降解作用。

图2为化合物I-1对靶蛋白Prdx2的竞争性抑制和通过泛素-蛋白酶体发挥降解作用机制的结果。

图3为化合物I-1对靶蛋白Prdx2的浓度梯度降解作用的探究结果。

图4为化合物I-1对靶蛋白Prdx2的时间降解作用的探究结果。

图5为化合物I-1对下游信号通路的影响。

具体实施方式

为了便于理解本发明的技术方案，下面通过实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的技术方案的理解更加透彻全面。

实施例1：化合物I-1的制备

将183mg(0.665mmol)2-(2,6-二氧代-哌啶-3-基)-4-氟基-异吲哚-1,3-二酮溶解于5mL N,N- 二甲基甲酰胺中，分别加入缚酸剂N,N-二异丙基乙胺330μL(1.995mmol)和[2-(2-氨基乙氧基) 乙基]氨基甲酸叔丁酯177mg(0.865mmol)，80℃加热回流12h(TLC检测)，此时原料完全反应；反应液用20mL水稀释，用二氯甲烷萃取3次(每次40mL)，合并有机层，饱和NaCl溶液(100mL)洗涤，无水Na₂SO₄干燥，过滤，浓缩有机相，硅胶(200-300目)柱层析(洗脱剂为石油醚:乙酸乙酯＝4:1V/V)，真空干燥过夜，得到化合物II-1(150.8mg，产率49.3％)。

化合物II-1(0.303mmol)用3mL二氯甲烷溶解，加入0.5mL三氟乙酸，室温反应1小时，旋干有机相，用5mL二氯甲烷溶解，加入雷公藤红素91mg(0.202mmol)、酰化活化剂 N,N-二异丙基乙胺167μL(1.01mmol)、酰胺缩合剂六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷157.5mg(0.303mmol)，室温反应12h，悬干有机相，通过硅胶柱层析(洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝20:1V/V)得到化合物I-1，真空干燥过夜，橘黄色粉末(74mg，产率46.5％)。

化合物I-1的数据：¹H NMR(500MHz，DMSO,TMS):δ11.15(1H,s),8.47(1H,s), 7.58(1H,t,J＝8Hz),7.12(1H,d,J＝8Hz),7.07(1H,d,J＝8Hz),7.05(1H,d,J＝7.5Hz),6.6(1H,t, J＝6Hz),6.47(1H,s),6.31(1H,d,J＝7.5Hz),5.07-5.04(1H,m),3.67-3.53(2H,m),3.42-3.39(2H, m),3.18-3.09(3H,m),3.03(s,1H),2.09(s,3H),1.57(s,3H),1.37(s,3H),1.21(s,3H),1.03(s,3H), 0.54(s,3H).ESI-MS[M+Na]⁺:815.41.

实施例2：化合物I-2的制备

以2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基氨基甲酸叔丁酯215mg(0.865mmol)替换实施例1的 [2-(2-氨基乙氧基)乙基]氨基甲酸叔丁酯，其他条件不变，得到化合物I-2(78mg，产率 45.8％)，橘黄色粉末。

化合物I-2的数据：¹H NMR(500MHz，DMSO,TMS):δ11.05(1H,s),8.43(1H,s), 7.58(1H,t,J＝8Hz),7.12(1H,d,J＝7.5Hz),7.08(1H,d,J＝8Hz),7.05(1H,d,J＝7Hz),6.58(1H,t, J＝6Hz),6.40(1H,s),6.34(1H,d,J＝7Hz),5.08-5.07(1H,m),3.57-3.53(2H,m),3.42-3.39(6H, m),3.18-3.09(4H,m),2.08(s,3H),1.53(s,3H),1.38(s,3H),1.21(s,3H),1.07(s,3H),0.55(s, 3H).ESI-MS[M+Na]⁺:859.44.

实施例3：化合物I-3的制备

以13-氨基-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷酸1,1-二甲基乙酯252mg(0.865mmol)替换实施例1的[2-(2-氨基乙氧基)乙基]氨基甲酸叔丁酯，其他条件不变，得到化合物I-3(72mg，产率 40.8％)，橘黄色粉末。

化合物I-3的数据：¹H NMR(500MHz，DMSO,TMS):δ11.09(1H,s),8.67(1H,s), 7.60(1H,t,J＝10Hz),7.15(1H,d,J＝7.5Hz),7.08(1H,d,J＝7Hz),7.05(1H,d,J＝7Hz),6.58(1H,t, J＝6Hz),6.40(1H,s),6.35(1H,d,J＝7Hz),5.06-5.03(1H,m),3.61(2H,t,J＝5.2Hz),3.53(2H,t, J＝7Hz),3.47-3.42(8H,m),3.42-3.21(2H,m),3.34-3.17(2H,m),2.10(s,3H),1.52(s,3H),1.38(s,3H), 1.22(s,3H),1.07(s,3H),0.55(s,3H).ESI-MS[M+Na]⁺:903.46.

实施例4：化合物I-4的制备

以N-叔丁氧羰基-1,2-乙二胺138mg(0.865mmol)替换实施例1的[2-(2-氨基乙氧基)乙基] 氨基甲酸叔丁酯，其他条件不变，得到化合物I-4(90mg，产率60％)，橘黄色粉末。

化合物I-4的数据：¹H NMR(500MHz，DMSO,TMS):δ11.10(1H,s),8.67(1H,s), 7.70(1H,t,J＝8Hz),7.25(1H,d,J＝7.5Hz),7.03(1H,d,J＝7.5Hz),6.95(1H,d,J＝9Hz),6.68(1H,t, J＝6Hz),6.69(1H,s),6.29(1H,d,J＝9Hz),5.09-5.04(1H,m),3.04-3.13(2H,m),2.90-2.87(2H,m), 2.10(s,3H),1.52(s,3H),1.38(s,3H),1.21(s,3H),1.04(s,3H),0.55(s,3H).ESI-MS[M+Na]⁺: 771.40.

实施例5：化合物I-5的制备

以N-叔丁氧羰基-1,3丙二胺148mg(0.865mmol)替换实施例1的[2-(2-氨基乙氧基)乙基] 氨基甲酸叔丁酯，其他条件不变，得到化合物I-5(86mg，产率56％)，橘黄色粉末。

化合物I-5的数据：¹H NMR(500MHz，DMSO,TMS):δ11.05(1H,s),8.70(1H,s), 7.68(1H,t,J＝8Hz),7.08(1H,d,J＝8Hz),7.08(1H,d,J＝8Hz),6.95(1H,d,J＝9Hz),6.68(1H,t, J＝6Hz),6.66(1H,s),6.38(1H,d,J＝9Hz),5.05-5.02(1H,m),3.07-3.04(2H,m),2.94-2.90(2H,m), 2.11(s,3H),1.52(s,3H),1.39(s,3H),1.22(s,3H),1.06(s,3H),0.54(s,3H).ESI-MS[M+Na]⁺: 785.40.

实施例6：化合物I-6的制备

以N-叔丁氧羰基-1,4丁二胺163mg(0.865mmol)替换实施例1的[2-(2-氨基乙氧基)乙基] 氨基甲酸叔丁酯，其他条件不变，得到化合物I-6(67mg，产率43％)，橘黄色粉末。

化合物I-6的数据：¹H NMR(500MHz，DMSO,TMS):δ11.08(1H,s),8.67(1H,s), 7.59(1H,t,J＝8Hz),7.25(1H,d,J＝7.5Hz),7.02(1H,d,J＝7.5Hz),6.95(1H,d,J＝8Hz),6.48(1H,t, J＝6Hz),6.40(1H,s),6.34(1H,d,J＝8Hz),5.04-5.01(1H,m),3.04-3.01(2H,m),2.93-2.90(2H,m), 2.10(s,3H),1.52(s,3H),1.38(s,3H),1.21(s,3H),1.08(s,3H),0.55(s,3H).ESI-MS[M+Na]⁺: 799.41.

实施例7：化合物I-7的制备

以N-叔丁氧羰基-1,5-戊二胺174mg(0.865mmol)替换实施例1的[2-(2-氨基乙氧基)乙基] 氨基甲酸叔丁酯，其他条件不变，得到化合物I-7(108mg，产率68％)，橘黄色粉末。

化合物I-7的数据：¹H NMR(500MHz，DMSO,TMS):δ11.08(1H,s),8.65(1H,s), 7.59(1H,t,J＝7.5Hz),7.07(1H,d,J＝7Hz),7.04(1H,d,J＝6Hz),7.03(1H,d,J＝7Hz),6.48(1H,t, J＝6Hz),6.38(1H,s),6.34(1H,d,J＝7Hz),5.09-5.04(1H,m),3.33-3.31(2H,m),3.01-2.97(2H,m), 2.09(s,3H),1.53(s,3H),1.38(s,3H),1.21(s,3H),1.07(s,3H),0.55(s,3H).ESI-MS[M+Na]⁺: 813.43.

实施例8：化合物I-8的制备

以N-叔丁氧羰基-1,6-己二胺187mg(0.865mmol)替换实施例1中的[2-(2-氨基乙氧基)乙基]氨基甲酸叔丁酯，其他条件不变，得到化合物I-8(93mg，产率57％)，橘黄色粉末。

化合物I-8的数据：¹H NMR(500MHz，DMSO,TMS):δ11.09(1H,s),8.68(1H,s), 7.57(1H,t,J＝8Hz),7.05(1H,d,J＝8Hz),7.03(1H,d,J＝7Hz),7.01(1H,d,J＝7Hz),6.49(1H,t, J＝6Hz),6.40(1H,s),6.34(1H,d,J＝7Hz),5.06-5.01(1H,m),3.34-3.23(2H,m),3.01-2.91(2H,m), 2.08(s,3H),1.52(s,3H),1.38(s,3H),1.21(s,3H),1.07(s,3H),0.55(s,3H).ESI-MS[M+Na]⁺: 827.434.

实施例9：化合物I-9的制备

以N-叔丁氧羰基-1,7-庚二胺200mg(0.865mmol)替换实施例1的[2-(2-氨基乙氧基)乙基] 氨基甲酸叔丁酯，其他条件不变，得到化合物I-9(112mg，产率68％)，橘黄色粉末。

化合物I-9的数据：¹H NMR(500MHz，DMSO,TMS):δ11.09(1H,s),8.65(1H,s), 7.59(1H,t,J＝7.5Hz),7.07(1H,d,J＝9Hz),7.07(1H,d,J＝9Hz),7.03(1H,d,J＝7Hz),6.50(1H,t, J＝5.5Hz),6.40(1H,s),6.34(1H,d,J＝7Hz),5.06-4.98(1H,m),3.27-3.23(2H,m),3.01-2.93(2H,m), 2.08(s,3H),1.52(s,3H),1.38(s,3H),1.21(s,3H),1.04(s,3H),0.55(s,3H).ESI-MS[M+Na]⁺: 842.46.

实施例10：化合物I-10的制备

以N-叔丁氧羰基-1,8-辛二胺212mg(0.865mmol)替换实施例1的[2-(2-氨基乙氧基)乙基] 氨基甲酸叔丁酯，其他条件不变，得到化合物I-10(82mg，产率49％)，橘黄色粉末。

化合物I-10的数据：¹H NMR(500MHz，DMSO,TMS):δ11.04(1H,s),8.67(1H,s),7.58(1H,t,J＝6Hz),7.07(1H,d,J＝6Hz),7.06(1H,d,J＝6Hz),7.03(1H,d,J＝7Hz),6.48(1H,t, J＝5.5Hz),6.39(1H,s),6.33(1H,d,J＝7Hz),5.06-4.98(1H,m),3.27-3.19(2H,m),2.93-2.87(2H,m), 2.09(s,3H),1.51(s,3H),1.38(s,3H),1.21(s,3H),1.04(s,3H),0.55(s,3H).ESI-MS[M+Na]⁺: 856.48.

实施例11：化合物I-11的制备

以N-叔丁氧羰基-1,10-癸二胺235mg(0.865mmol)替换实施例1的[2-(2-氨基乙氧基)乙基] 氨基甲酸叔丁酯，其他条件不变，得到化合物I-11(109mg，产率63％)，橘黄色粉末。

化合物I-11的数据：¹H NMR(500MHz，DMSO,TMS):δ11.09(1H,s),8.66(1H,s),7.58(1H,t,J＝8Hz),7.09(1H,d,J＝9Hz),7.07(1H,d,J＝7.5Hz),7.03(1H,d,J＝7Hz),6.50(1H,t, J＝5.5Hz),6.38(1H,s),6.33(1H,d,J＝7Hz),5.08-4.98(1H,m),3.28-3.19(2H,m),2.90-2.83(2H,m), 2.09(s,3H),1.54(s,3H),1.38(s,3H),1.21(s,3H),1.07(s,3H),0.55(s,3H).ESI-MS[M+Na]⁺: 883.51.

实施例12

仪器：超净工作台(SW-CJ-1FD，AIRTECH，苏净安泰)、恒温CO₂培养箱(3111，Thermo，美国)、倒置生物显微镜(IX71，Olympus，日本)、酶联免疫检测仪(Model680，Bio-rad，美国)、平板摇床(Kylin-bell lab Instruments)、高压灭菌锅(YXO.SG41.280，上海华线)，离心机(Sigma)，天能凝胶成像仪(上海天能)。

试剂：1640培养基(Gibco)、胎牛血清(Gibco)、Western及IP细胞裂解液(Sigma)、胰蛋白酶(Sigma)、DMSO(Sigma)、BCA蛋白含量检测试剂盒(Sigma)、New-Surper-ECL检测试剂盒(Sigma)、Prdx2特异性一抗(Abcam)、Bax特异性一抗(Abcam)、Bcl-2特异性一抗(江苏凯基生物技术股份有限公司)、Caaspase-3特异性一抗(江苏凯基生物技术股份有限公司)、β- actin特异性一抗(Abcam)和辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(江苏凯基生物技术股份有限公司)。

细胞株：人胃癌细胞株BGC-823(江苏凯基生物技术股份有限公司)，人正常胃腺细胞 GES-1(江苏凯基生物技术股份有限公司)。

体外抗肿瘤活性研究

采用四甲基氮唑蓝比色法(MTT法)对本发明化合物进行抗肿瘤活性测试，选取CDDO- Me(Bardoxolone methyl)、雷公藤红素(celastrol)作为阳性对照药。

方法：

配制1640完全培养基：450mL1640培养基中加入50mL胎牛血清配制成完全培养基，置于4℃冰箱中保存待用。以下所提及培养基均为该完全培养基。

复苏冻存的细胞株，采用1640完全培养基，置于恒温37℃、CO₂培养箱中培养，每天更换培养基一次，待其处于指数生长期且状态良好时，加入1mL 0.25％胰蛋白酶消化液消化 1～2min，显微镜下观察贴壁细胞变圆皱缩时停止消化，收集细胞，加入培养基制备单细胞悬液，细胞计数，以每孔5×10⁴个细胞数及总孔数计算所需细胞悬液的量，将细胞悬液接种于96孔细胞培养板，100μL/孔，96孔板周围用PBS液封，置于37℃、CO₂培养箱内培养 24h。用1640完全培养基配制待测化合物，加入96孔板中，使待测化合物终浓度为10μM/ 孔，设立3个复孔，继续培养48h。培养结束，将浓度为5mg/mL的MTT试剂加入到96孔板中，终体积为10μL/孔，继续孵育4h。吸除孔内培养基，每孔加入100μL DMSO，平板摇床振摇10min。使用酶联免疫检测仪，在波长570nm处检测每孔的吸光值，并按下列公式计算化合物对细胞的抑制率，3次初筛结果平均值为其最终抑制率。受试化合物进一步浓度梯度筛选，计算其IC₅₀值(Graphpad软件计算)，3次重复实验结果为所测化合物的最终IC₅₀值。

细胞抑制率％＝[(空白对照OD值－给药组OD值)/空白对照组OD值]×100％

本发明化合物的体外抗肿瘤活性结果如表1。

表1.化合物I-1～I-11对BGC-823细胞株的抑制作用

表2.化合物I-1对GES-1细胞株的抑制作用

由表1可知，本发明化合物I-1～I-11对人胃癌细胞BGC-823有明显的抑制作用，其中以化合物I-1活性最佳，其IC₅₀值为0.38±0.02μM，且化合物I-1对人正常胃腺细胞 GES-1的毒性低于雷公藤红素；根据表2，由SI值(IC₅₀GES-1/IC₅₀BGC-823)可知，化合物I- 1的SI值为3.63，显示出较高的选择性。

由表1可总结本发明化合物的构效关系：

(1)、化合物I-1～I-11对BGC-823细胞均存在良好的增殖抑制作用，均优于雷公藤红素，其中，当连接链为烷氧基链

时，n＝1时活性最佳；当连接链为烷基链

时，m＝3时活性相对较好，m＝4、5时活性与m＝3时接近，太长或太短的碳链都会使抗肿瘤活性降低。

综上所述，本发明化合物具有显著的抗肿瘤细胞增殖，有望成为新的抗肿瘤药物，值得深入研究。

Western blot实验检测化合物I-1对Prdx2的降解活性

将BGC-823细胞(6×10⁵细胞/孔)细胞接种在6孔板中，与指定浓度的化合物I-1、雷公藤红素及空白对照DMSO孵育48h后收集细胞，加入RIPA细胞裂解液；将裂解液在4℃、12000rpm下离心10分钟，取上清液，即为蛋白溶液；蛋白溶液于-78℃储存，备用。使用 BCA分析试剂盒进行蛋白定量，确定每个样品蛋白浓度。然后用5×的蛋白上样缓冲液将样品稀释至相同浓度，然后在10％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE，10％凝胶)中进行电泳分离后转移到PVDF膜上。使用在TBST缓冲液中的脱脂奶粉(5％)封闭膜。然后将膜用TBST漂洗3次，并在4℃下用Prdx2特异性一抗和β-actin特异性一抗孵育过夜。然后将膜用TBST冲洗3次，并用辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)的二抗在室温下处理 2h。随后将膜用TBST冲洗3次。最后通过发光成像仪显影将蛋白条带可视化。利用图像处理软件(Image Lab Plus 6.0)确定相应条带光密度值。每个处理重复实验三次，实验结果表达为平均值。

化合物I-1对Prdx2的降解活性结果如图1所示，可以观察到，在BGC-823细胞系中，化合物I-1具有显著的Prdx2降解作用，在2μM时表现出降解活性，在4μM时表现出最优的降解活性；与DMSO空白对照组相比，雷公藤红素没有降解活性。

Western blot实验检测化合物I-1对Prdx2的降解机制

设置DMSO空白组(DMSO-)及DMSO加药组(DMSO-，化合物I-1)、MG132空白组(MG132-)及MG132加药组(MG132+，化合物I-1)、MLN4924空白组(MLN4924-)及 MLN4924加药组(MLN4924+，化合物I-1)、泊马度胺空白组(P.M.-)及泊马度胺加药组 ((P.M.+，化合物I-1)、雷公藤红素空白组(CEL-)及雷公藤红素加药组(CEL+，化合物I-1)。为了更直观的观察到降解活性，将化合物I-1的给药浓度设置为8μM。

将MG132、MLN4924、泊马度胺、雷公藤红素和化合物I-1用DMSO配制为10mM的母液。将BGC-823细胞(6×10⁵细胞/孔)细胞接种在6孔板中，在DMSO空白组及DMSO加药组中加入DMSO使DMSO终浓度为8μM，在MG132空白组及MG132加药组中加入 MG132母液使MG132终浓度为3μM，在MLN4924空白组及MLN4924加药组中加入 MLN4924母液使MLN4924终浓度为0.5μM，在泊马度胺空白组及泊马度胺加药组中加入泊马度胺母液使泊马度胺终浓度为8μM，在雷公藤红素空白组及雷公藤红素加药组中加入雷公藤红素母液使雷公藤红素终浓度为8μM，预孵育2h，然后在DMSO加药组、MG132加药组、MLN4924加药组、泊马度胺加药组和雷公藤红素加药组分别加入化合物I-1母液使化合物I-1终浓度为8μM，孵育12h，收集细胞，加入RIPA细胞裂解液；将裂解液在4℃、 12000rpm下离心10分钟，取上清液，即为蛋白溶液；蛋白溶液于-78℃储存，备用。使用 BCA分析试剂盒进行蛋白定量，确定每个样品蛋白浓度。然后用5×的蛋白上样缓冲液将样品稀释至相同浓度，然后在10％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE，10％凝胶)中进行电泳分离后转移到PVDF膜上。使用在TBST缓冲液中的脱脂奶粉(5％)封闭膜。然后将膜用TBST漂洗3次，并在4℃下用Prdx2特异性一抗和β-actin特异性一抗孵育过夜。然后将膜用TBST冲洗3次，并用辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)的二抗在室温下处理 2h。随后将膜用TBST冲洗3次。最后通过发光成像仪显影将蛋白条带可视化。利用图像处理软件(Image Lab Plus 6.0)确定相应条带光密度值。每个处理重复实验三次，实验结果表达为平均值。

结果如图2所示，可以观察到，用蛋白酶体抑制剂MG132、NEDD8抑制剂 MLN4924、泊马度胺和雷公藤红素预处理，再加入化合物I-1，均没有降解活性；而用 DMSO预处理，再加入化合物I-1，则表现出显著的Prdx2降解作用。说明蛋白酶体抑制剂 MG132、NEDD8抑制剂MLN4924、泊马度胺和雷公藤红素预处理后，均能竞争性的结合或者抑制化合物I-1的蛋白降解作用，说明化合物I-1通过泛素-蛋白酶体途径降解Prdx2。

Western blot实验检测化合物I-1对Prdx2浓度降解依赖性的研究

将BGC-823细胞(6×10⁵细胞/孔)细胞接种在6孔板中，并与指定浓度的化合物I-1孵育 24h，收集细胞，加入RIPA细胞裂解液；将裂解液在4℃、12000rpm下离心10分钟，取上清液，即为蛋白溶液；将蛋白溶液于-78℃储存直至用于分析。使用BCA分析试剂盒进行蛋白定量，确定每个样品蛋白浓度。然后用5×的蛋白上样缓冲液将样品稀释至相同浓度，然后在10％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE，10％凝胶)中进行电泳分离后转移到PVDF膜上。使用在TBST缓冲液中的脱脂奶粉(5％)封闭膜。然后将膜用TBST漂洗3次，并在4℃下用Prdx2特异性一抗和β-actin特异性一抗孵育过夜。然后将膜用TBST冲洗3 次，并用辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)的二抗在室温下处理2h。随后将膜用TBST冲洗3次。最后通过发光成像仪显影将蛋白条带可视化。利用图像处理软件(Image Lab Plus 6.0)确定相应条带光密度值。每个浓度重复实验三次，实验结果表达为平均值。

结果如图3所示，化合物I-1对靶蛋白Prdx2的降解具有浓度梯度依赖性。

Western blot实验检测化合物I-1对Prdx2时间降解依赖性的研究

用DMSO将化合物I-1配制为10mM的母液；将BGC-823细胞(6×10⁵细胞/孔)细胞接种在6孔板中，加入化合物I-1母液(终浓度为8μM)，分别孵育3h、6h、12h和24h，收集细胞，设置DMSO空白对照组，并孵育24h，然后分别收集各组细胞，加入RIPA细胞裂解液；将裂解液在4℃、12000rpm下离心10分钟，取上清液，即为蛋白溶液；蛋白溶液于 -78℃储存，备用。使用BCA分析试剂盒进行蛋白定量，确定每个样品蛋白浓度。然后用 5×的蛋白上样缓冲液将样品稀释至相同浓度，然后在10％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶 (SDS-PAGE，10％凝胶)中进行电泳分离后转移到PVDF膜上。使用在TBST缓冲液中的脱脂奶粉(5％)封闭膜。然后将膜用TBST漂洗3次，并在4℃下用Prdx2特异性一抗和β-actin 特异性一抗孵育过夜。然后将膜用TBST冲洗3次，并用辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 IgG(H+L)的二抗在室温下处理2h。随后将膜用TBST冲洗3次。最后通过发光成像仪显影将蛋白条带可视化。利用图像处理软件(Image Lab Plus 6.0)确定相应条带光密度值。每个浓度重复实验三次，实验结果表达为平均值。

结果如图4所示，化合物I-1对靶蛋白Prdx2的降解具有时间梯度依赖性。

Western blot实验检测化合物I-1对下游信号通路的影响

将BGC-823细胞(6×10⁵细胞/孔)细胞接种在6孔板中，并与指定浓度的化合物I-1孵育 24h，收集细胞，设置DMSO空白对照组，孵育24h，然后分别收集各组细胞，加入RIPA 细胞裂解液；将裂解液在4℃、12000rpm下离心10分钟，取上清液，即为蛋白溶液；蛋白溶液于-78℃储存，备用。使用BCA分析试剂盒进行蛋白定量，确定每个样品蛋白浓度。然后用5×的蛋白上样缓冲液将样品稀释至相同浓度，然后在10％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE，10％凝胶)中进行电泳分离后转移到PVDF膜上。使用在TBST缓冲液中的脱脂奶粉(5％)封闭膜。然后将膜用TBST漂洗3次，并在4℃下分别用Bax特异性一抗、 Bcl-2特异性一抗、Caspase-3特异性一抗和β-actin特异性一抗孵育过夜。然后将膜用TBST 冲洗3次，并分别用辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)的二抗在室温下处理2h。随后将膜用TBST冲洗3次。最后通过发光成像仪显影将蛋白条带可视化。利用图像处理软件 (Image Lab Plus6.0)确定相应条带光密度值。每个处理重复实验三次，实验结果表达为平均值。

结果如图5所示，促凋亡蛋白Bax和caspase-3水平显著增加，相反，抗凋亡蛋白Bcl-2 表达明显受到抑制，说明化合物I-1可以调节凋亡相关蛋白，进而诱导细胞凋亡。

综上，本发明化合物能够有效的靶向BGC-823细胞，与先导化合物雷公藤红素相比，本发明化合物具有显著的细胞增殖抑制作用，同时能够显著地靶向降解靶蛋白Prdx2，具有作为抗肿瘤药物治疗肿瘤的潜力。

Claims (10)

1.结构如式I所示的雷公藤红素PROTAC化合物或其药学上可接受的盐：

其中：

L选自

m为2～10的整数，n为1～3的整数；

D结构如下：

2.根据权利要求1所述的雷公藤红素PROTAC化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于：L选自

m为3～5的整数，n为1～2的整数。

3.雷公藤红素PROTAC化合物或其药学上可接受的盐.其特征在于：选自下列化合物：

4.一种权利要求1所述的雷公藤红素PROTAC化合物的制备方法，其特征在于：合成路线如下：

包括以下步骤：

步骤(1)、在缚酸剂存在的条件下，2-(2,6-二氧代-哌啶-3-基)-4-氟基-异吲哚-1,3-二酮与式H₂N-L-NHBoc所示的化合物反应得到化合物II；

步骤(2)、化合物II在三氟乙酸存在的条件下经酸水解反应脱去Boc保护基，再在酰化活化剂和酰胺缩合剂存在的条件下，与雷公藤红素发生酰胺缩合反应得到式I所示的雷公藤红素PROTAC化合物。

5.根据权利要求4所述的雷公藤红素PROTAC化合物的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的缚酸剂为N,N-二异丙基乙胺。

6.根据权利要求4所述的雷公藤红素PROTAC化合物的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，酸水解反应的反应溶剂为二氯甲烷或N,N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜；

酰胺缩合反应的反应溶剂为二氯甲烷或N,N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜；

所述的雷公藤红素与化合物II的摩尔比为1:1.5；

所述的雷公藤红素与酰化活化剂的摩尔比为1:5；所述的酰化活化剂为N,N-二异丙基乙胺；

所述的雷公藤红素与酰胺缩合剂的摩尔比为1:1.5；所述的酰胺缩合剂为六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷。

7.一种药物组合物，其特征在于：它是以权利要求1～3任一项所述的雷公藤红素PROTAC化合物或其药学上可接受的盐为有效成分或主要有效成分，与药学上可接受的载体制成药学上可接受的剂型。

8.权利要求1～3任一项所述的雷公藤红素PROTAC化合物或其药学上可接受的盐在制备靶向Prdx2降解剂的用途。

9.权利要求1～3任一项所述的雷公藤红素PROTAC化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗Prdx2蛋白相关疾病药物中的用途。

10.根据权利要求9所示的用途，其特征在于：所述的Prdx2蛋白相关疾病为肿瘤或动脉粥样硬化。

Images