CN115043720B - 一种新型α-甲基查耳酮类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型α‑甲基查耳酮类化合物及其制备方法和应用，其分子结构式如下所示：；新查尔酮的名称为MB21‑11。本发明中：①利用药学前沿领域—计算机辅助药物设计法，以药物作用靶点的结合要求而设计出该新化合物的化学结构式；②利用缩合反应原理，以取代苯丙酮和取代苯甲醛为原料，在缓和的反应条件下合成该化合物；③在其分离纯化中，不需要硅胶柱层析，流程简单，不需要耗费大量的有机试剂，绿色环保；此方法可用于分离纯化性质非常接近的查尔酮类化合物，适用性广；分离纯化速度快，仅需几分钟就可以完成整个纯化分离过程；纯化产物回收率高，纯度高；所用的溶剂可回收重复利用，成本低；重现性好，晶型均一规则。

Description

一种新型α-甲基查耳酮类化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及药物化学中查尔酮类新化合物的结构设计、化学合成及合成之后目标产物的分离纯化技术领域，尤其涉及一种新型α-甲基查耳酮类化合物及其制备方法和应用。

背景技术

目前，子宫颈癌的化疗中，化疗毒性和癌的复发成为重要的临床疑难问题。从天然先导化合物的发现、衍生物的结构设计、化学合成和药理筛选，并从中筛选出有效低毒的创新候选药物是新药研究中的一个策略。

研究显示，肿瘤干细胞对放化疗不敏感，而放化疗结束后引起癌复发的主要根源。本课题组利用天然先导化合物的筛选及计算机辅助药物设计等手段，设计出了一种新型的α-甲基查尔酮类化合物，对查尔酮类的传统合成工艺和分离纯化工艺做了优化，并通过药理实验发现，本新化合物对肿瘤干细胞的6种标记物蛋白的表达可产生显著的下调作用，并本身还有显著的抑制子宫颈癌增殖及促进癌细胞凋亡的活性，从而显示出一种新型预防子宫颈癌复发转移的创新候选药物潜力。

在结构设计中，利用计算机辅助药物设计方法，在一种天然抗肿瘤先导化合物的基础上对新查尔酮做了结构设计。

在化学合成和分离纯化方面，对查尔酮类化合物的传统合成和纯化方法做了显著的改进。对查尔酮的结构修饰主要是在2个苯环上引入不同取代基来增加化合物活性，而对2个苯环之间α，β-不饱和酮进行取代的报道较少。在查尔酮结构中，除了α，β-双键自身存在顺反几何异构之外，羰基与α，β-双键间的构象还会因α位取代情况的不同而不同：在α位未取代的查尔酮衍生物的晶体结构中，羰基与α，β-双键呈顺式构象；当α位引入取代基时，两者之间即呈反式构象。而这种构象差异，也可导致化合物抗癌活性的不同。H.N.Pati等人研究发现，查尔酮的甲氧基具有增强查尔酮的抗有丝分裂作用，从而增强抗癌效果。EvelynWinter研究发现查尔酮A环上的2，4位上含有两个甲氧基效果最优。Nicholas J等人研究发现3，4，5-三甲氧基-3′-羟基-4′-甲氧基查尔酮在对K562细胞IC₅₀达到0.0043μM，具有很好体外的抑制活性。随着查尔酮类化合物合成方法的及生物活性的深入研究，为创新药提供了保障，现有的关于查尔酮类衍生物的纯化分离主要采用硅胶柱层析及半制备液相仪的使用，其局限性是操作流程复杂，需要消耗大量的有机试剂，还需要耗费大量时间摸索展开剂的配比，成本高，有机试剂有一定的毒性。

发明内容

本发明提供了一种新型α-甲基查耳酮类化合物及其制备方法和应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种新型α-甲基查耳酮类化合物及其制备方法和应用，其分子结构式如下所示：

作为本技术方案的进一步改进方案：

本类新化合物的结构设计原理中，利用计算机辅助药物设计法中的靶点/配基分子对接技术，以结合自由能最小化为依据，设计出具有预期抗癌潜力的该新化合物的分子结构式，其结构设计方法如下：

通过化合物与MDM2蛋白的晶体结构进行分子对接时打分最高的构象，显示化合物和MDM2蛋白结合的最低能量为-6.8kcal/mol。选择与晶体结构类似的最高打分对接构象进行具体的结合模式分析，化合物能较好的结合于MDM2蛋白的结合口袋内。如图6，4’-Cl苯基结合MDM2蛋白中的A位点，α-CH3结合其中的B位点，3-OCH3结合其中的C位点。

如图7所示，3-OCH₃结合于微管蛋白中的A位点，2’，4’-Cl苯基较好结合于B位点。化合物中的，4’-Cl，3-OCH₃及α-CH₃位于由MDM2蛋白氨基酸残基MET-50，TYR-100，LEU-54，LEU-57，PHE-91所形成的疏水性腔袋内，形成强烈的疏水性相互作用。

在以前的(文献里)查尔酮类化合物的合成路线基础上，通过改进反应合成条件，使合成变为在常温(不耗能)缓和(不剧烈)条件下完成的合成方法，反应产量比传统方法(31.2％)显著提高(63.1％为)，显著降低合成的成本。同时，在粗品的分离纯化技术方面做了显著的改进，不用查尔酮类化合物的分离纯化常用的柱层析方法，而利用有机溶剂中加水、酸化和低温重结晶方法，不耗传统分离纯化方法中的大量用有毒有机溶剂的方法，而用绿色环保的新分离纯化方法，进一步降低了产品的制备成本，显著提高了成药性。反应路线和条件为：

作为本技术方案的进一步改进方案：其合成流程为：将芳香醛和所示的芳香酮溶于有机溶剂中，在催化剂作用下，常温反应一段时间，将反应液调节PH值至1～2，之后进行重结晶，纯化，干燥得到目标物具有抗宫颈癌活性的α-甲基查尔酮化合物。

作为本技术方案的进一步改进方案：所述有机溶剂为无水乙醇或无水甲醇。

作为本技术方案的进一步改进方案：所使催化剂为40％的氢氧化钠或者氢氧化钾。

作为本技术方案的进一步改进方案：常温反应一段时间为7-8h。

作为本技术方案的进一步改进方案：采用稀盐酸将反应液调节PH值至1～2。

作为本技术方案的进一步改进方案：进行重结晶，纯化具体为；利用含水有机溶剂法在低温下形成结晶并再进行重结晶方法得到高纯度高产率的目标化合物。

作为本技术方案的进一步改进方案：用于制备抗肿瘤药物的应用。

作为本技术方案的进一步改进方案：所述肿瘤为子宫颈癌。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)不需要硅胶柱层析，流程简单；

(2)不需要耗费大量的有机试剂，绿色环保；

(3)可用于分离纯化性质非常接近的查尔酮类化合物，适用性广；

(4)分离纯化速度快，仅需几分钟就可以完成整个纯化分离过程；

(5)纯化产物回收率高，纯度高；

(6)产物通过核磁共振¹H-NMR、¹³C-NMR、HR-ESI-MS进行结构表征；

(7)所用的溶剂可回收重复利用，成本较低；

(8)该方法重现性好，晶型均一规则。

抗宫颈癌生物活性方面：通过以上的分子设计和化学合成方法而制备的新查尔酮显示显著强的抗癌生物活性。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。本发明的具体实施方式由以下实施例及其附图详细给出。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为本发明提出的一种新型α-甲基查耳酮类化合物及其制备方法和应用的纯化分离路线图；

图2为本发明提出的一种新型α-甲基查耳酮类化合物及其制备方法和应用的核磁共振H谱图；

图3为本发明提出的一种新型α-甲基查耳酮类化合物及其制备方法和应用的核磁共振C谱图；

图4为本发明提出的一种新型α-甲基查耳酮类化合物及其制备方法和应用的高分辨质谱检测结果图；

图5为本发明提出的一种新型α-甲基查耳酮类化合物及其制备方法和应用中对HeLa细胞的促凋亡实验结果图；

图6为本发明提出的一种新型α-甲基查耳酮类化合物及其制备方法和应用中与MDM2蛋白结合位点图；

图7为本发明提出的一种新型α-甲基查耳酮类化合物及其制备方法和应用中3g与MDM2蛋白的相互作用图；

图8为本发明提出的一种新型α-甲基查耳酮类化合物及其制备方法和应用中3g对MDM2、P53 mRNA相对表达量的影响图；

图9为本发明提出的一种新型α-甲基查耳酮类化合物及其制备方法和应用中Western blot检测各组细胞凋亡相关蛋白的表达水平图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。在下列段落中参照附图以举例方式更具体地描述本发明。根据下面说明和权利要求书，本发明的优点和特征将更清楚。需说明的是，附图均采用非常简化的形式且均使用非精准的比例，仅用以方便、明晰地辅助说明本发明实施例的目的。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明实施例中，本发明分离纯化α-甲基-3，4，5-甲氧基-2′，4′-二氯查尔酮的操作方法按照如下步骤进行，参见图1：

(1)化合物I的合成：将2，4-二氯苯丙酮和3，4，5-甲氧基苯甲醛各5mmol加入三颈瓶中，再加入30mL无水乙醇超声溶解，置于磁力搅拌锅上放入搅拌子，将转速调至最大。向三颈瓶中加入新配置的5mL质量分数为40％的KOH溶液，反应时间9h。

(2)纯化分离过程：反应完全后，将三颈瓶中的反应液倒入250mL烧杯中，加入1mol/L稀HCl调pH至1～2，产生大量黄色颗粒，放置冰箱2h后，除去滤液，将固体部分用无水乙醇加热溶解，待无水乙醇沸腾时迅速加入2：1比例的冰的蒸馏水，溶液呈黄色，不断有微型针晶不断析出，放置4℃冰箱，30min后抽滤，收集滤饼于50℃烘箱中避光干燥。

(3)结构表征：用¹H-NMR、¹³C-NMR、HR-ESI-MS进行结构表征，产物的产率为63.1％，产品纯度在98％以上，¹H-NMR图谱、¹³C-NMR图谱和HR-ESI-MS图谱分别为图2、图3和图4。

(4)抗宫颈癌活性测试：本发明实施例中，通过MTT法测定化合物对人子宫颈癌细胞(SiHa和HeLa)及中国仓鼠正常卵巢细胞(CHO)的体外抗增殖活性。MTT是一种黄色的染料。活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTT，生成可溶性的甲臜(Formazan)化合物，甲臜的含量可以用酶标仪在490nm处进行测定。在通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可根据光密度OD值推测出活细胞的数目，并进一步计算出IC₅₀值。；采用流式细胞仪技术检测对HeLa细胞的促凋亡作用；通过CADD方法，利用AutodockTools软件对化合物与鼠双微体蛋白2(MDM2)进行分子对接，测定化合物结合能量及结合位点；荧光定量RT-PCR法检测化合物对细胞凋亡相关基因p53、MDM2的表达调控；Western-blot法检测化合物对p53、MDM2蛋白表达水平的作用。

表1

1)本发明实施例中，测试的细胞包括人子宫颈癌细胞(SiHa和HeLa)及中国仓鼠正常卵巢细胞(CHO)。实验结果表明：α-甲基-3，4，5-甲氧基-2′，4′-二氯查尔酮对HeLa细胞作用24、48、72h后的IC₅₀值分别为32.79,24.11，16.51μmol·L-1，对SiHa细胞作用24、48、72h后的IC₅₀值分别为78.39,35.72,28.43μmol·L-1，且IC₅₀值均小于阳性对照物顺铂；而对CHO细胞作用24、48、72h后的IC₅₀值均超过100μmol·L-1，说明化合物α-甲基-3，4，5-甲氧基-2′，4′-二氯查尔酮具有明显的抗肿瘤作用且对正常细胞的毒性较低，可用于作为具有抗宫颈癌潜力的活性小分子化合物。

2)将细胞密度配制每孔1×10⁵个，使用6孔板进行铺板，每孔2mL细胞液，同时每孔补加1mL培养液，置入37℃的CO₂细胞培养箱培养24h，取出6孔板，并吸弃上清液，每孔加入2mL含化合物3g的培养液，浓度依次为10、25、50、75μmol·L-1，每个浓度设3个复孔。以只含细胞及完全培养基作为空白对照，以20μmol·L-1的顺铂注射液为阳性对照，培养24h后，离心收集细胞。室温避光进行染色15min，过滤，上流式细胞仪进行检测，如图5所示，检测结果如下：

表2化合物和顺铂对HeLa细胞作用24h的凋亡率

注：Q1代表机械损伤和坏死，Q2代表晚期凋亡和坏死，Q3代表活细胞，Q4代表早期凋亡。

*P＜0.05，与空白组相比。

3)通过化合物与MDM2蛋白的晶体结构进行分子对接时打分最高的构象，显示化合物和MDM2蛋白结合的最低能量为-6.8kcal/mol。选择与晶体结构类似的最高打分对接构象进行具体的结合模式分析，化合物能较好的结合于该蛋白的结合口袋内。如图6，4’-Cl苯基结合MDM2蛋白中的A位点，α-CH₃结合其中的B位点，3-OCH₃结合其中的C位点。化合物中的4’-Cl，3-OCH₃及α-CH₃位于由MDM2蛋白氨基酸残基MET-50，TYR-100，LEU-54，LEU-57，PHE-91所形成的疏水性腔袋内，形成强烈的疏水性相互作用(如图7所示)。

4)化合物在40μmol·L-1时与空白组相比，能显著下调MDM2基因mRNA相对表达量，在10、20、40μmol·L-1时，不同程度上调p53基因mRNA相对表达量，并呈现浓度依赖性，与空白组相比(P＜0.05)有显著性差异。肿瘤抑制因子p53在宫颈癌细胞凋亡及细胞周期等细胞调节过程中发挥重要作用。鼠双微粒体2(murine double minute 2，MDM2)是一种p53蛋白特异性的E3泛素连接酶，在调节p53稳定性中起核心作用。在非应激状态下的细胞中，MDM2通过不断泛素化p53形成p53-MDM2复合物，使p53在蛋白酶作用下降解从而失去生理活性。因此，抑制MDM2和p53蛋白之间的相互作用，可能是治疗宫颈癌的一种方法。该化合物可能通过抑制MDM2基因表达，使p53基因表达上调，从而阻止其与p53蛋白使形成p53-MDM2复合物，促进宫颈癌细胞凋亡(如图8所示)。

5)Western-blot法检测HeLa细胞中凋亡相关蛋白表达量。取对数生长期的HeLa细胞，按照1.0×105ml-1浓度接种于培养皿中。将细胞分为4组，分别为对照组(含10％FBS的完全培养基)，化合物干预组组(分别含10、20、40μmol/L)，每组设置3个平行复孔，用药后常规培养24h。后采用全蛋白提取试剂盒对各组HeLa细胞分别进行蛋白提取；用BCA蛋白浓度检测试剂盒对所提蛋白进行浓度检测；取20μg蛋白和4μl 5×SDS上样缓冲液混合均匀，100℃变性10min；上样，SDS-PAGE凝胶电泳分离后转至PVDF膜上；用5％脱脂牛奶封闭2h；PBS洗膜；PBS洗膜后分别加入一抗(MDM2、p53和β-actin)，在4℃下孵育过夜；PBS洗膜；加入HRP标记的羊抗兔IgG二抗(1∶5000)，室温孵育1h；PBS洗膜；用ECL化学发光试剂盒进行显色。以β-actin为内参蛋白，采用imageJ图像分析软件进行灰度比分析后可知，与空白对照组相比，MDM2蛋白表达水平显著降低，p53蛋白表达水平显著升高(P＜0.05)，接近空白组的两倍，其结果如图9。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制；凡本行业的普通技术人员均可按说明书附图所示和以上所述而顺畅地实施本发明；但是，凡熟悉本专业的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变等，均仍属于本发明的技术方案的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种新型α-甲基查耳酮类化合物，其特征在于，该新型α-甲基查耳酮的结构式如下所示：

。

2.根据权利要求1所述的一种新型α-甲基查耳酮类化合物的制备方法，其特征在于，其合成路线为：

。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，其合成流程为：将芳香醛和所示的芳香酮溶于有机溶剂中，在催化剂作用下，常温反应一段时间，将反应液调节PH值至1-2，之后进行重结晶，纯化，干燥得到目标物具有抗宫颈癌活性的α-甲基查耳酮化合物。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为无水乙醇。

5.根据权利要求2所述的一种新型α-甲基查耳酮类化合物的制备方法，其特征在于，常温反应一段时间为7-8h。

6.根据权利要求2所述的一种新型α-甲基查耳酮类化合物的制备方法，其特征在于，采用稀盐酸将反应液调节PH值至1~2。

7.根据权利要求2所述的一种新型α-甲基查耳酮类化合物的制备方法，其特征在于，进行重结晶，纯化具体为；利用含水有机溶剂法在低温下形成结晶并再进行重结晶方法得到高纯度高产率的目标化合物。

8.根据权利要求1所述的一种新型α-甲基查耳酮类化合物，在用于制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤为子宫颈癌。