CN116925029A - 香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Classifications
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Abstract
本发明提供香豆素‑哌嗪‑二硫代氨基甲酸酯杂化物及其制备方法和应用，涉及香豆素药物化学技术领域，先合成香豆素2，再以哌嗪作为桥梁，其一端二级胺与香豆素2结合，另一端二级胺与二硫化碳，卤代烃发生三组分反应形成二硫代氨基甲酸盐，通过上述连续反应，快速合成香豆素‑哌嗪‑二硫代氨基甲酸酯杂化物4，且合成路线简洁，副产物少，分离纯化操作简单，产物溶解性和稳定性好，反应收率在35%以上，且制备的香豆素‑哌嗪‑二硫代氨基甲酸酯杂化物对多种癌细胞均表现出良好的细胞毒性，且对正常细胞的毒性较小，具有优异的选择性，因此具有良好的实际应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及香豆素药物化学技术领域，具体涉及一种香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物及其制备方法和应用。
背景技术
在世界各国，癌症正日益成为主要的死亡原因。据估计，2020年发生了1930万新的癌症病例，导致全球1000万人死于癌症，用药物进行化疗是治疗癌症的重要手段，超过60％的抗癌剂是天然产物衍生物。天然产物是临床用药的重要来源，在《国际药典》第九版的371个药物中，有80多个是天然产物及其衍生物，超过60％的抗癌剂是天然产物衍生物。
香豆素(Coumarin)是含有苯并吡喃酮结构的天然产物，是植物次生代谢物类黄酮的一部分。1820年，香豆素首次作为一种天然产物被分离出来，随后在伞形科、柚子科、木耳科、芸香科等30个不同的植物科中发现了近150种香豆素。香豆素及其衍生物被发现具有非常小的肾毒性、肝毒性、心脏毒性、皮肤毒性和其他副作用，然而香豆素在血浆和组织中稳定性差，限制了香豆素的应用。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物以提高香豆素的应用。
还有必要提供一种香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物的制备方法。
还有必要提供一种香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物的应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物，所述香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物的结构通式如下：
其中，
选自芳基或取代芳基；
R2选自烃基或含杂原子的烃基。
优选地，所述选自以下基团之一，
所述R2选自以下基团之一，
一种香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物的制备方法，制备如上所述的香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物，包括如下步骤：
S1：将酚类化合物1与4-氯乙酰乙酸乙酯在催化剂A的作用下，反应得到香豆素2；
S2：在反应容器中依次加入哌嗪、溶剂C、缚酸剂B得到混合溶液一，香豆素2溶于溶剂C中得到混合溶液二，将混合溶液二滴加至混合溶液一中回流反应，得到粗品中间体3，通过控制哌嗪的添加顺序及用量，尽可能减少二取代副产物的生成；
S3：将粗品中间体3与二硫化碳、卤代烃在缚酸剂B和溶剂D的作用下得到香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4；
如上所述的香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物的制备方法，所述催化剂A为浓硫酸；
所述缚酸剂B为三乙胺；
所述溶剂C为四氢呋喃；
所述溶剂D为氯仿。
如上所述的香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物的药学上可接受的盐。
如上所述的香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物或其药学上可接受的盐的药用组合物。
如上所述的香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物或其药学上可接受的盐的药物制剂，还包括至少一种药学上可接受的辅料或载体。
如上所述的香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物或其药学上可接受的盐的药物制剂，所述药物制剂为片剂、胶囊剂、颗粒剂或注射剂。
如上所述的香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物或其药学上可接受的盐或其药用组合物或其药物制剂在制备抗癌药物中的应用。
如上所述的香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物或其药学上可接受的盐或其药用组合物或其药物制剂在制备抗肝癌或抗肺癌或抗乳腺癌或抗肾癌或抗卵巢癌的药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1.本发明先合成香豆素2，再以哌嗪作为桥梁，其一端二级胺与香豆素2结合，另一端二级胺与二硫化碳，卤代烃发生三组分反应形成二硫代氨基甲酸盐，通过上述连续反应，快速合成香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4，且合成路线简洁，副产物少，分离纯化操作简单，产物溶解性和稳定性好，反应收率在35％以上。
2.本发明制备的香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物对多种癌细胞均表现出良好的细胞毒性，且对正常细胞的毒性较小，具有优异的选择性，因此具有良好的实际应用价值。
附图说明
图1为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4a的1HNMR谱图。
图2为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4a的13CNMR谱图。
图3为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4a的HRMS谱图。
图4为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4b的1HNMR谱图。
图5为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4b的13CNMR谱图。
图6为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4b的HRMS谱图。
图7为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4c的1HNMR谱图。
图8为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4c的13CNMR谱图。
图9为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4c的HRMS谱图。
图10为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4d的1HNMR谱图。
图11为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4d的13CNMR谱图。
图12为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4d的HRMS谱图。
图13为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4e的1HNMR谱图。
图14为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4e的13CNMR谱图。
图15为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4e的HRMS谱图。
图16为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4f的1HNMR谱图。
图17为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4f的13CNMR谱图。
图18为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4f的HRMS谱图。
图19为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4g的1HNMR谱图。
图20为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4g的13CNMR谱图。
图21为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4g的HRMS谱图。
图22为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4h的1HNMR谱图。
图23为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4h的13CNMR谱图。
图24为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4h的HRMS谱图。
图25为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4i的1HNMR谱图。
图26为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4i的13CNMR谱图。
图27为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4i的HRMS谱图。
图28为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4j的1HNMR谱图。
图29为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4j的13CNMR谱图。
图30为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4j的HRMS谱图。
图31为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4k的1HNMR谱图。
图32为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4k的13CNMR谱图。
图33为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4k的HRMS谱图。
图34为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4l的1HNMR谱图。
图35为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4l的13CNMR谱图。
图36为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4l的HRMS谱图。
图37为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4m的1HNMR谱图。
图38为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4m的13CNMR谱图。
图39为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4m的HRMS谱图。
图40为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4n的1HNMR谱图。
图41为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4n的13CNMR谱图。
图42为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4n的HRMS谱图。
图43为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4o的1HNMR谱图。
图44为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4o的13CNMR谱图。
图45为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4o的HRMS谱图。
图46为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4p的1HNMR谱图。
图47为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4p的13CNMR谱图。
图48为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4p的HRMS谱图。
图49为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4q的1HNMR谱图。
图50为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4q的13CNMR谱图。
图51为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4q的HRMS谱图。
图52为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4r的1HNMR谱图。
图53为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4r的13CNMR谱图。
图54为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4r的HRMS谱图。
图55为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4s的1HNMR谱图。
图56为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4s的13CNMR谱图。
图57为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4s的HRMS谱图。
图58为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4a、4d、4g、4o、4p、4q、4r、4s和VCR对HepG2和HEK-293T细胞的抑制作用变化图。
图59为香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4p诱导HepG2细胞凋亡图；图中：(A)HepG2细胞的流式细胞分析；(B)HepG2细胞总凋亡率。
具体实施方式
以下结合本发明的附图，对本发明实施例的技术方案以及技术效果做进一步的详细阐述。
一种香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物，所述香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物的结构通式如下：
其中，
选自芳基或取代芳基；
R2选自烃基或含杂原子的烃基。
进一步的，所述选自以下基团之一，
所述R2选自以下基团之一，
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1.本发明先合成香豆素2，再以哌嗪作为桥梁，其一端二级胺与香豆素2结合，另一端二级胺与二硫化碳，卤代烃发生三组分反应形成二硫代氨基甲酸盐，通过上述连续反应，快速合成香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4，且合成路线简洁，副产物少，分离纯化操作简单，产物溶解性和稳定性好，反应收率在35％以上。
2.本发明制备的香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物对多种癌细胞均表现出良好的细胞毒性，且对正常细胞的毒性较小，具有优异的选择性，因此具有良好的实际应用价值。
一种香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物的制备方法，制备如上所述的香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物，包括如下步骤：
S1：将酚类化合物1与4-氯乙酰乙酸乙酯在催化剂A的作用下，反应得到香豆素2；
S2：在反应容器中依次加入哌嗪、溶剂C、缚酸剂B得到混合溶液一，香豆素2溶于溶剂C中得到混合溶液二，将混合溶液二滴加至混合溶液一中回流反应，反应液水洗，萃取，减压浓缩得到粗品中间体3，通过控制哌嗪的添加顺序及用量，尽可能减少二取代副产物的生成；
S3：将粗品中间体3与二硫化碳、卤代烃在缚酸剂B和溶剂D的作用下以中等至良好的收率(35％～89％)得到香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4；杂化物4的极性远小于香豆素2和其它副产物，易于通过柱层析分离；很好的解决了中间体3难以分离纯化的问题，同时通过两步连续反应减少了中间体的柱层析操作，节约了时间和成本；
如上所述的香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物的制备方法，所述催化剂A为浓硫酸，以将酯羰基质子化，然后与酚进行酯交换反应，再经烯醇式互变、迈克尔加成、脱水反应得到香豆素2；
所述缚酸剂B为三乙胺，中和反应中生成的酸，促进反应进行。
所述溶剂C为四氢呋喃，由于卤代烃活性差，选择高沸点溶剂，回流反应，以增加卤代烃的反应活性；
所述溶剂D为氯仿。
如上所述的香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物的药学上可接受的盐。
如上所述的香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物或其药学上可接受的盐的药用组合物。
如上所述的香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物或其药学上可接受的盐的药物制剂，还包括至少一种药学上可接受的辅料或载体。
如上所述的香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物或其药学上可接受的盐的药物制剂，所述药物制剂为片剂、胶囊剂、颗粒剂或注射剂。
如上所述的香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物或其药学上可接受的盐或其药用组合物或其药物制剂在制备抗癌药物中的应用。
如上所述的香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物或其药学上可接受的盐或其药用组合物或其药物制剂在制备抗肝癌或抗肺癌或抗乳腺癌或抗肾癌或抗卵巢癌的药物中的应用。
为了便于理解，本发明通过以下实施例进一步说明：
实施例一至实施例十九：
在0℃时，向25mL圆底烧瓶中依次加入4-氯乙酰乙酸乙酯(1.48mL，11mmol)、浓H2SO4(5mL)，搅拌5min后分批加入酚类化合物1(10mmol)，待酚类化合物1完全溶解后将反应温度缓慢升至室温，TLC监控反应进程，待酚类化合物1消耗完(约1h)，将反应液倾入50mL冰水中，搅拌，抽滤，滤饼用无水乙醇重结晶，过滤、干燥得香豆素2a-2d；
在50mL三口瓶中依次加入哌嗪(0.172g，2mmol)，重蒸四氢呋喃(15mL)，三乙胺(0.3mL，2mmol)后，缓慢滴加香豆素2a-2d(1mmol)的四氢呋喃(5mL)溶液，回流8h后停止加热，将反应液冷却至室温，向反应液中加入30mL二氯甲烷，用饱和盐水洗涤(3×30mL)。然后，有机层经无水Na2SO4干燥，过滤，并减压蒸馏除去溶剂得到中间体3的粗品，直接用于下一步。
在室温下，向粗品3中依次加入氯仿(15mL)，CS2(0.3mL，5mmol)，三乙胺(0.6mL，4mmol)，搅拌15min后，加入卤代烃(2mmol)，TLC检测反应进程，待反应结束后(约3h)，直接减压蒸馏除去溶剂，硅胶柱层析分离纯化，得到香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4a-4s。
上述卤代烃为氯代烃或溴代烃，如苄氯、苄溴。
香豆素2a-2d的结构式、产率、原料如表1所示：
表1
香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4a-4s的结构式、产率、原料如表2所示：
表2
请参看图1至图57，通过1HNMR、13CNMR、HRMS手段对实施例一至实施例十九所制备的产物进行表征。
杂化物4a：1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.58～8.55(m,1H),7.88～7.86(m,1H),7.72(dd,J＝28.5,8.8Hz,2H),7.66～7.63(m,2H),7.38(d,J＝7.4Hz,2H),7.32(t,J＝7.3Hz,2H),7.27(d,J＝8.9Hz,1H),6.61(s,1H),4.57(s,2H),4.51～4.25(m,2H),4.15～3.92(m,2H),3.76(s,2H),2.68(s,4H)；13CNMR(101MHz,CDCl3)δ197.0,161.0,152.1,151.2,135.8,134.9,129.5,128.9,128.7,127.8,127.7,127.3,124.3,123.3,122.8,120.4,114.5,114.1,58.9,52.9,42.4；IR(KBr)ν/cm-1:2926,1713,1696,1632,1467,1375,1264,1218,749；HRMSm/z:calcdforC26H25N2O2S2[M+H]+461.1352,found461.1343.
杂化物4b：1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.58～8.55(m,1H),7.88～7.86(m,1H),7.77～7.67(m,2H),7.66～7.63(m,2H),7.27(d,J＝7.9Hz,2H),7.12(d,J＝7.7Hz,2H),6.60(s,1H),4.53(s,2H),4.46～4.23(m,2H),4.13～3.84(m,2H),3.75(s,2H),2.68(s,4H),2.33(s,3H)；13CNMR(101MHz,CDCl3)δ197.1,160.9,152.1,151.2,137.5,134.9,132.6,129.4,129.4,128.9,127.7,127.3,124.2,123.3,122.7,120.4,114.5,114.1,58.9,52.9,42.2,21.3；IR(KBr)ν/cm-1:2926,1714,1033,423,411；HRMSm/z:calcdforC27H27N2O2S2[M+H]+475.1508,found475.1468.
杂化物4c：1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.51～8.49(m,1H),7.83(d,J＝6.8Hz,1H),7.68(dd,J＝27.5,8.9Hz,2H),7.62～7.57(m,2H),7.22(d,J＝7.6Hz,1H),7.03～6.94(m,2H),6.56(s,1H),4.48(s,2H),4.43～4.29(m,2H),3.93(s,2H),3.71(d,J＝4.4Hz,2H),2.66(s,4H),2.41～2.26(m,6H)；13CNMR(101MHz,CDCl3)δ197.0,160.7,152.0,150.9,137.7,137.1,134.6,131.3,130.4,129.8,128.7,127.6,127.1,126.9,124.0,123.0,122.5,120.2,114.2,113.9,58.6,52.7,40.7,21.1,19.2；IR(KBr)ν/cm-1:2924,1728,1462,1260,1054,1032；HRMSm/z:calcdforC28H29N2O2S2[M+H]+489.1665,found489.1659.
杂化物4d：1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.56～8.53(m,1H),7.87～7.85(m,1H),7.76～7.66(m,2H),7.65～7.61(m,2H),7.34(dd,J＝8.3,5.3Hz,2H),6.99(t,J＝8.5Hz,2H),6.59(s,1H),4.54(s,2H),4.40(s,2H),3.97(s,2H),3.75(s,2H),2.68(s,4H)；13CNMR(101MHz,CDCl3)δ196.6,162.3(d,J＝246.2Hz),160.9,152.0,151.2,134.8,131.8(d,J＝3.4Hz),131.1(d,J＝8.1Hz),128.9,127.7,127.3,124.2,123.3,122.7,120.3,115.6(d,J＝21.5Hz),114.5,114.1,58.8,52.8,41.3；IR(KBr)ν/cm-1:2948,2836,1650,1450,1412,1113,1024；HRMSm/z:calcdforC26H24FN2O2S2[M+H]+479.1258,found479.1260.
杂化物4e：1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.57～8.55(m,1H),7.88～7.85(m,1H),7.72(dd,J＝27.5,8.7Hz,2H),7.65～7.63(m,2H),7.32(d,J＝8.3Hz,2H),7.27(d,J＝6.7Hz,2H),6.60(s,1H),4.54(s,2H),4.40(s,2H),3.97(s,2H),3.76(s,2H),2.68(s,4H)；13CNMR(101MHz,CDCl3)δ196.4,160.9,152.0,151.2,134.9,134.8,133.5,130.8,128.9,128.8,127.7,127.3,124.2,123.3,122.7,120.3,114.5,114.1,58.9,52.9,41.3；IR(KBr)ν/cm-1:2903,1714,1697,1462,1376,1261,1095,1033,870,813,749；HRMSm/z:calcdforC26H24ClN2O2S2[M+H]+495.0962,found495.0897.
杂化物4f：1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.60～8.57(m,1H),7.89～7.87(m,1H),7.78～7.68(m,2H),7.67～7.64(m,2H),7.38(s,1H),7.26～7.23(m,3H),6.62(s,1H),4.56(s,2H),4.41(s,2H),4.02(d,J＝28.8Hz,2H),3.78(s,2H),2.70(s,4H)；13CNMR(101MHz,CDCl3)δ196.2,160.8,152.0,151.1,138.3,134.8,134.3,129.8,129.4,128.8,127.7,127.7,127.6,127.2,124.2,123.2,122.6,120.3,114.4,114.0,58.7,52.8,41.3；IR(KBr)ν/cm-1:2899,2834,1712,1693,1608,1463,1424,1376,1263,868,813,749；HRMSm/z:calcdforC26H24ClN2O2S2[M+H]+495.0962,found495.0952.
杂化物4g：1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.56～8.53(m,1H),7.87～7.84(m,1H),7.71(dd,J＝26.3,8.7Hz,2H),7.65～7.62(m,2H),7.58(d,J＝8.0Hz,2H),7.49(d,J＝8.0Hz,2H),6.60(s,1H),4.64(s,2H),4.39(s,2H),3.97(s,2H),3.76(s,2H),2.69(s,4H)；13CNMR(101MHz,CDCl3)δ195.6,160.9,152.0,151.2,142.4,134.9,132.3,130.1,128.9,127.7,127.3,124.2,123.3,122.7,120.3,118.8,114.5,114.0,111.3,58.8,52.8,41.0；IR(KBr)ν/cm-1:2894,2828,1714,1260,1217,800；HRMSm/z:calcdforC27H24N3O2S2[M+H]+486.1304,found486.1270.
杂化物4h：1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.56～8.54(m,1H),8.15(d,J＝8.4Hz,2H),7.88～7.85(m,1H),7.71(dd,J＝26.5,8.8Hz,2H),7.65～7.62(m,2H),7.55(d,J＝8.4Hz,2H),6.60(s,1H),4.69(s,2H),4.40(s,2H),3.99(s,2H),3.77(s,2H),2.70(s,4H)；13CNMR(101MHz,CDCl3)δ195.5,160.9,152.0,151.2,147.3,144.6,134.9,130.2,129.0,127.8,127.4,124.3,123.8,123.3,122.7,120.3,114.5,114.1,58.8,52.8,40.7；IR(KBr)ν/cm-1:2901,1712,1607,1516,1460,1375,1343,1262,1226,868,749；HRMSm/z:calcdforC26H24N3O4S2[M+H]+506.1203,found506.1188.
杂化物4i：1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.52～8.49(m,1H),7.84～7.82(m,1H),7.73～7.64(m,2H),7.60(td,J＝6.7,5.8,3.0Hz,2H),7.54(d,J＝8.1Hz,2H),7.48(d,J＝8.1Hz,2H),6.57(s,1H),4.62(s,2H),4.45～4.26(m,2H),3.96(s,2H),3.73(s,2H),2.67(s,4H)；13CNMR(101MHz,CDCl3)δ196.0,160.8,152.0,151.1,140.6,134.8,129.7,129.4,128.8,127.7,127.2,125.5(q,J＝3.8Hz),124.2,123.1,122.8,122.6,120.3,114.4,114.0,58.7,52.8,41.1；IR(KBr)ν/cm-1:2902,2816,1713,1690,1561,1464,1324,1119,1067,974,867,813；HRMSm/z:calcdforC27H24F3N2O2S2[M+H]+529.1226,found529.1214.
杂化物4j：1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.57～8.55(m,1H),7.88～7.85(m,3H),7.75(d,J＝9.1Hz,2H),7.68(d,J＝9.0Hz,1H),7.66～7.63(m,2H),6.61(s,1H),4.71(s,2H),4.41(s,2H),3.99(s,2H),3.77(s,2H),2.71(s,4H)；13CNMR(101MHz,CDCl3)δ195.1,160.9,152.0,151.3,139.7,134.9,131.8(q,J＝33.4Hz),129.6,129.0,127.8,127.4,124.7,124.3,123.3,122.8,122.0,120.3,114.6,114.1,58.8,52.9,40.4；IR(KBr)ν/cm-1:2884,2829,1718,1375,1280,1127；HRMSm/z:calcdforC28H23F6N2O2S2[M+H]+597.1100,found597.1025.
杂化物4k：1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.55～8.52(m,1H),7.87～7.84(m,1H),7.70(dd,J＝29.3,8.7Hz,2H),7.64～7.60(m,2H),6.59(s,1H),5.92(ddt,J＝17.0,9.9,7.1Hz,1H),5.31(dd,J＝16.9,1.7Hz,1H),5.16(d,J＝10.0Hz,1H),4.38(s,2H),4.00(d,J＝7.0Hz,2H),3.74(s,2H),2.67(t,J＝5.1Hz,4H)；13CNMR(101MHz,CDCl3)δ196.7,160.9,152.1,151.1,134.8,132.5,128.9,127.7,127.3,124.2,123.2,122.7,120.3,118.9,114.4,114.1,58.8,52.8,40.4；IR(KBr)ν/cm-1:2905,2816,1714,1698,1562,1463,1377,1265,1133,1075,980,868,748；HRMSm/z:calcdforC22H23N2O2S2[M+H]+411.1195,found411.1227.
杂化物4l：1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.58～8.54(m,1H),7.88～7.85(m,1H),7.72(dd,J＝29.2,9.0Hz,2H),7.66～7.63(m,2H),6.63(s,1H),6.61(s,1H),4.41(s,2H),4.13～3.90(m,2H),3.76(s,2H),3.72(t,J＝5.8Hz,2H),3.51(t,J＝6.9Hz,2H),2.69(s,4H),1.95(p,J＝6.4Hz,2H)；13CNMR(101MHz,CDCl3)δ197.9,161.0,152.1,151.2,134.9,129.0,127.8,127.4,124.3,123.3,122.7,120.4,114.5,114.1,60.6,58.9,52.9,33.6,32.2；IR(KBr)ν/cm-1:3425,2842,1634,1465,1424,1377,1264,1015；HRMSm/z:calcdforC22H25N2O3S2[M+H]+429.1301,found429.1303.
杂化物4m：1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.55～8.52(m,1H),7.86～7.84(m,1H),7.70(dd,J＝27.1,8.8Hz,2H),7.64～7.60(m,2H),7.28(t,J＝7.8Hz,2H),6.94(t,J＝7.4Hz,1H),6.90(d,J＝8.2Hz,2H),6.59(s,1H),4.40(s,2H),4.06(t,J＝6.1Hz,2H),3.99(s,2H),3.73(s,2H),3.52(t,J＝7.1Hz,2H),2.68～2.65(m,4H),2.22(p,J＝6.6Hz,2H)；13CNMR(101MHz,CDCl3)δ197.1,160.8,158.8,152.0,151.0,134.7,129.5,128.8,127.7,127.2,124.1,123.1,122.6,120.8,120.3,114.5,114.3,114.0,66.2,58.7,52.8,33.7,28.6；IR(KBr)ν/cm-1:2924,1694,1461,1376,1263,1032,1015,868,813,747；HRMSm/z:calcdforC28H29N2O3S2[M+H]+505.1614,found505.1601.
杂化物4n：1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.53～8.49(m,1H),7.84(dd,J＝6.4,3.4Hz,1H),7.73～7.69(m,1H),7.67～7.57(m,3H),7.39～7.31(m,5H),6.56(s,1H),5.18(s,2H),4.34(s,2H),4.20(s,2H),4.11～3.87(m,2H),3.71(s,2H),2.67～2.64(m,4H)；13CNMR(101MHz,CDCl3)δ195.1,168.4,160.7,151.9,151.0,135.4,134.7,128.8,128.5,128.3,128.3,127.6,127.2,124.1,123.1,122.5,120.3,114.3,113.9,67.5,58.6,52.6,39.0；IR(KBr)ν/cm-1:2924,1719,1260,1236,1163,799,749；HRMSm/z:calcdforC28H27N2O4S2[M+H]+519.1407,found519.1411.
杂化物4o：1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.47～8.44(m,1H),7.81～7.78(m,1H),7.69～7.60(m,2H),7.57(td,J＝7.4,6.6,3.7Hz,2H),6.53(s,1H),4.41～4.24(m,2H),4.13(s,2H),3.94(t,J＝14.7Hz,2H),3.72(s,3H),3.69(s,2H),2.65(t,J＝5.0Hz,4H)；13CNMR(101MHz,CDCl3)δ195.3,169.1,160.9,152.0,151.2,134.8,128.9,127.7,127.3,124.2,123.2,122.7,120.3,114.5,114.1,58.8,52.9,52.8,38.9；IR(KBr)ν/cm-1:2816,1715,1610,1562,1474,1427,1376,1304,1265,1162；HRMSm/z:calcdforC22H23N2O4S2[M+H]+443.1094,found443.1078.
杂化物4p：1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.49～8.47(m,1H),7.83～7.80(m,1H),7.66(dd,J＝29.9,8.5Hz,2H),7.61～7.56(m,2H),6.55(s,1H),4.35(s,2H),4.10(q,J＝7.1Hz,2H),4.01～3.91(m,2H),3.71(s,2H),3.34(t,J＝7.3Hz,2H),2.64(t,J＝5.0Hz,4H),2.41(t,J＝7.4Hz,2H),2.01(p,J＝7.3Hz,2H),1.23(t,J＝7.1Hz,3H)；13CNMR(101MHz,CDCl3)δ196.9,172.8,160.7,152.0,151.0,134.7,128.8,127.6,127.1,124.1,123.1,122.5,120.3,114.3,114.0,60.4,58.7,52.7,36.1,33.2,24.2,14.3；IR(KBr)ν/cm-1:2949,2837,1646,1450,1411,1112,1017；HRMSm/z:calcdforC25H29N2O4S2[M+H]+485.1563,found485.1564.
杂化物4q：1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.65(s,1H),7.64(d,J＝8.6Hz,1H),7.54(d,J＝7.9Hz,2H),7.46(d,J＝7.9Hz,2H),6.85(d,J＝10.8Hz,2H),6.35(s,1H),4.59(s,2H),4.41～4.29(m,2H),4.07～3.82(m,2H),3.64(s,2H),2.62(s,4H)；13CNMR(101MHz,CDCl3)δ195.4,162.5,160.7,155.2,142.4,132.2,129.9,125.9,118.6,113.5,111.5,110.7,103.2,58.1,52.6,40.8；IR(KBr)ν/cm-1:2922,2853,2227,1717,1682,1606,1564,1460,1363,1230,1134,1019；HRMSm/z:calcdforC23H22N3O3S2[M+H]+452.1097,found452.1098.
杂化物4r：1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.43(s,1H),7.75(d,J＝7.8Hz,2H),7.56(d,J＝8.2Hz,3H),6.84(d,J＝8.7Hz,1H),6.26(s,1H),4.64(s,2H),4.26(s,2H),3.92(s,2H),3.65(s,2H),2.56(s,4H),2.14(s,3H)；13CNMR(101MHz,DMSO-d6)δ193.9,160.5,158.8,153.1,152.4,142.9,132.2,130.0,123.2,118.7,111.6,110.7,110.7,110.0,109.7,57.1,52.3,8.0；IR(KBr)ν/cm-1:2952,2924,2854,1718,1605,1457,1376,1230,1145,1018；HRMSm/z:calcdforC24H24N3O3S2[M+H]+466.1254,found466.1250.
杂化物4s：1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.36(s,1H),7.86(s,1H),7.77(d,J＝7.8Hz,2H),7.58(d,J＝7.9Hz,2H),6.89(s,1H),6.33(s,1H),4.65(s,2H),4.27(s,2H),3.94(s,2H),3.70(s,2H),2.58(s,4H)；13CNMR(101MHz,DMSO-d6)δ193.9,159.9,156.2,153.4,151.5,143.0,132.3,130.1,126.1,118.7,116.8,111.5,111.3,110.0,103.3,56.8,52.2；IR(KBr)ν/cm-1:2924,2855,1728,1607,1458,1376,1266,1019；HRMSm/z:calcdforC23H21ClN3O3S2[M+H]+486.0707,found486.0710.
通过上述表征证实所得到产物为目标产物。
实施例二十：
在0℃时，向25mL圆底烧瓶中依次加入4-氯乙酰乙酸乙酯(1.48mL，11mmol)、浓H2SO4(5mL)，搅拌5min后分批加入2-萘酚(10mmol)，待2-萘酚完全溶解后将反应温度缓慢升至室温，TLC监控反应进程，待2-萘酚消耗完(约1h)，将反应液倾入50mL冰水中，搅拌抽滤，滤饼用无水乙醇重结晶，过滤、干燥得香豆素2a；在50mL三口瓶中依次加入哌嗪，重蒸四氢呋喃(15mL)，三乙胺(0.3mL，2mmol)后，缓慢滴加香豆素2a(1mmol)的四氢呋喃(5mL)溶液，回流8h后停止加热，将反应液冷却至室温，向反应液中加入30mL二氯甲烷，用饱和盐水洗涤(3×30mL)。然后，有机层经无水Na2SO4干燥，过滤，并减压蒸馏除去溶剂得到中间体3的粗品，直接用于下一步。在室温下，向粗品3中依次加入氯仿(15mL)，CS2(0.3mL，5mmol)，三乙胺(0.6mL，4mmol)，搅拌15min后，加入卤代烃(2mmol)，TLC检测反应进程，待反应结束后(约3h)，直接减压蒸馏除去溶剂，硅胶柱层析分离纯化，得到香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4a'，杂化物4a'与杂化物4a结构相同。
所述哌嗪的加入量及产物4a'的收率如表3所示：
表3
表3结果显示，哌嗪与香豆素2a物质的量比为2时，香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4a'的收率最高(66％)。
对比例1
在0℃时，向25mL圆底烧瓶中依次加入乙酰乙酸乙酯(1.48mL，11mmol)、NaHSO4·H2O(5g)，搅拌5min后分批加入2-萘酚(10mmol)，待2-萘酚完全溶解后将反应温度升至130℃，TLC监控反应进程，待2-萘酚消耗完，搅拌抽滤，滤饼用无水乙醇重结晶，过滤、干燥得中间体1，再将中间体1用NBS对其烯丙位甲基区域选择性溴代合成4-溴甲基香豆素2'发现溴代位置难以控制，副产物多，无法得到预期产物，导致无法进行后续反应。
因此选用本发明制备香豆素2的制备步骤收率适中(48％～59％)，制备方法简单，且副产物少，后处理容易。
1.实施例制备的4a、4d、4g、4o、4p、4q、4r、4s进行生物活性测试：
1)将上述所制备的香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4a、4d、4g、4o、4p、4q、4r、4s进行生物活性研究，考察上述化合物对人肝癌细胞系HepG2和人胚肾正常细胞HEK-293T的细胞毒性及选择性，其中以长春新碱(VCR)作为对照样品；
实验方法：取对数生长期，生长状态良好的HepG2细胞和HEK-293T细胞，以4×103个/100μL接种到96孔培养板中，在37℃下孵育过夜(在细胞孔周围的孔中加入100μL无菌PBS)；待细胞贴壁生长良好24h后，吸收旧的培养液，向HepG2和HEK-293T细胞的各个培养孔中加入10μL不同浓度的杂化物4和VCR(浓度分别为1、10、50、100、200μg/mL)。每个浓度设3个平行重复孔，同时设等体积二甲基亚砜(DMSO)溶剂的和不含药物培养基的空白对照孔，于37℃，5％CO2的培养箱内继续培养。将待测物质培养48h后，弃去上清液，并利用倒置显微镜观察细胞形态；然后，每孔加10μL(2mg/mL inPBS)MTT，继续培养4h后，1000r/min离心10min，吸出孔内培养上清液，每孔加入150μL二甲基亚砜，震荡10min使蓝紫色结晶物溶解充分后，于波长568nm处用酶标仪测定每孔样品的吸光度值(A)，取平均值。细胞抑制率＝[A568(阴性对照)-A568(给药)]/A568(阴性对照)×100％。
结果如图58及表4所示：
表4
HepG2＝人肝癌细胞系；HEK-293T＝人胚肾正常细胞；VCR＝长春新碱；IC50值表示抑制肿瘤和正常细胞增殖50％所需的化合物浓度(μM)，并使用三次测量的浓度计算。SI：为了确定药物作用的安全范围，指数越大越安全。其值为正常细胞的IC50/肿瘤细胞的IC50。
如图58所示，不同浓度的杂化物4对HepG2和HEK-293T细胞的抑制率，从图中可以看出，杂化物4p，4q和4s以浓度依赖性的方式显著抑制HepG2细胞的增殖，且表4结果显示，当香豆素母核含萘环时，二硫代氨基甲酸盐(Dithiocarbamate,DTC)的苄基上取代基的变化对活性无影响(4a，4d，4g)，当苄基改为酯基时(4o，4p)，抗增殖活性明显提升，特别是引入烷基链较长的酯(4p)，活性显著增强。当把香豆素母核萘环变为苯环时(4q，4r，4s)，惊喜的发现其抗增殖活性显著提升，特别是连有羟基的苯环(4q)，抗增殖活性是萘环(4g)的十倍以上。杂化物4q(IC50＝43.86μM)对HepG2细胞的抑制活性最高，优于对照药物VCR(IC50＝92.63μM)。
高选择性指数(正常细胞系的IC50与癌细胞系的IC50之比)是化合物作为抗肿瘤药物的先决条件。因此，我们测试了杂化物4对正常细胞HEK-293T的毒性，以评价它们的安全性。如表4所示，与对照药物VCR(IC50＝74.21μM)相比，杂化物4p(IC50＝255.66μM)对人胚胎肾正常细胞HEK-293T的毒性更小，4p对肝癌细胞HepG2(IC50＝76.09μM)的选择性指数(SI＝IC50ofHEK-293T/HepG2)约为3，是最有效最安全的化合物，优于对照药物VCR(SI≈1)，因此具有良好的实际应用价值。
2)鉴于杂化物4p对HepG2细胞优异的选择性抑制作用，我们进一步测试了4p对若干其他人癌细胞和相应正常细胞的抗增殖活性，实验方法与上述HepG2和HEK-293T相似，杂化物4p的浓度是0.2、5、20、50、100μg/mL，测试结果见表5。
表5
Calu-1＝人肺腺癌细胞系；SK-BR-3＝人乳腺癌细胞系；786-O＝人肾癌细胞系；SK-OV-3＝人卵巢癌细胞系；WI-38＝人肺正常细胞系；MCF-10A＝人正常乳腺上皮细胞系；HEK-293T＝人胚肾细胞系；KGN＝人卵巢细胞系。
如表5所示，杂化物4p对所有受试人癌细胞(Calu-1,SK-BR-3,786-O,SK-OV-3)的抑制活性(IC50＝66.04～73.12μM)均强于对相应人正常细胞(WI-38,MCF-10A,HEK-293T,KGN)的抑制活性(IC50＝116.21～255.66μM)。杂化物4p对所有受试细胞的选择性指数在2至4之间。因此，杂化物4p作为治疗多种类型癌症的候选药物，值得被深入研究。
3)进一步通过流式细胞分析研究了杂化物4p对HepG2细胞的凋亡诱导作用，试验方法：HepG2细胞接种在6孔板上，在37℃培养24小时后，用不同浓度(10，50和100μg/mL)杂化物4p的新鲜培养基替换培养基。阴性对照孔设置相同体积的DMSO。细胞分别在37℃下培养48小时，然后向每个孔中添加0.25％不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰蛋白酶。胰蛋白酶消化后，使用膜联蛋白V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒对处理过的细胞进行染色。在室温下遮光孵育5～15分钟后，立即通过CytoFLEX流式细胞仪分析凋亡细胞，实验平行重复3次，取平均值，检测结果如图59所示。
如图59所示，分别以10，50和100μg/mL的杂化物4p作用于HepG2细胞48小时，早期凋亡和晚期凋亡细胞的总数(右下象限和右上象限)分别为19.12％，35.00％和59.90％，而对照组仅为7.29％。上述结果表明，杂化物4p通过浓度依赖性方式诱导HepG2细胞凋亡。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于发明所涵盖的范围。
Claims (10)
1.一种香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物，其特征在于，所述香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物的结构通式如下：
其中，
选自芳基或取代芳基；
R2选自烃基或含杂原子的烃基。
2.如权利要求1所述的香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物，其特征在于，
所述选自以下基团之一，
所述R2选自以下基团之一，
3.一种香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物的制备方法，制备如权利要求1或2所述的香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物，其特征在于，包括如下步骤：
S1：将酚类化合物1与4-氯乙酰乙酸乙酯在催化剂A的作用下，反应得到香豆素2；
S2：在反应容器中依次加入哌嗪、溶剂C、缚酸剂B得到混合溶液一，香豆素2溶于溶剂C中得到混合溶液二，将混合溶液二滴加至混合溶液一中回流反应，得到粗品中间体3；
S3：将粗品中间体3与二硫化碳、卤代烃在缚酸剂B和溶剂D的作用下得到香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物4；
4.如权利要求3所述的香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物的制备方法，其特征在于，所述催化剂A为浓硫酸；
所述缚酸剂B为三乙胺；
所述溶剂C为四氢呋喃；
所述溶剂D为氯仿。
5.如权利要求1-4任意一项所述的香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物的药学上可接受的盐。
6.如权利要求1-5任意一项所述的香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物或其药学上可接受的盐的药用组合物。
7.如权利要求1-5任意一项所述的香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物或其药学上可接受的盐的药物制剂，其特征在于，还包括至少一种药学上可接受的辅料或载体。
8.如权利要求7所述的香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物或其药学上可接受的盐的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂为片剂、胶囊剂、颗粒剂或注射剂。
9.如权利要求1-8任意一项所述的香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物或其药学上可接受的盐或其药用组合物或其药物制剂在制备抗癌药物中的应用。
10.如权利要求9所述的香豆素-哌嗪-二硫代氨基甲酸酯杂化物或其药学上可接受的盐或其药用组合物或其药物制剂在制备抗肝癌或抗肺癌或抗乳腺癌或抗肾癌或抗卵巢癌的药物中的应用。
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