CN109251196B - 氨基苯并[d]氮杂*基喹唑啉类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

氨基苯并[d]氮杂*基喹唑啉类化合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种氨基苯并[d]氮杂
Figure DDA0001557823460000011
基喹唑啉类化合物及制备和应用。本发明提供的氨基苯并[d]氮杂
Figure DDA0001557823460000012
基喹唑啉类化合物对人乳腺癌细胞株MCF‑7、人肺癌细胞株A‑549均具有显著的抑制活性，有望应用于制备预防或治疗人乳腺癌、人肺癌的药物。本发明提供了该氨基苯并[d]氮杂

Description

氨基苯并[d]氮杂*基喹唑啉类化合物及其制备方法和应用
(一)技术领域
本发明涉及一种氨基苯并[d]氮杂
Figure BDA0001557823450000012
基喹唑啉类化合物及其制备方法，以及所述化合物在制备预防或治疗肿瘤疾病的药物中的应用。
(二)背景技术
喹唑啉类化合物具有许多较好的生物活性，在医药领域有着广泛的应用，尤其一些特殊结构的喹唑啉类衍生物具有明显的抗病毒活性、抗菌活性、抗肿瘤活性等，喹唑啉类化合物作为抗肿瘤药物已经上市了一些品种。例如上市的用于治疗肺癌的吉非替尼(Gefitinib)和厄洛替尼(Erlotinib)，以及用于治疗乳腺癌的拉帕替尼(Lapatinib)，它们都属于喹唑啉类化合物。新型的喹唑啉类化合物及其生物活性也常见文献报道(参阅Y.-Y.Ke,H.-Y.Shiao,Y.C.Hsu,C.-Y. Chu,W.-C.Wang,Y.-C.Lee,W.-H.Lin,C.-H.Chen,J.T.A.Hsu,C.-W.Chang, C.-W.Lin,T.-K.Yeh,Y.-S.Chao,M.S.Coumar,H.-P.Hsieh,ChemMedChem 2013, 8,136-148；A.Garofalo,A.Farce,S.Ravez,A.Lemoine,P.Six,P.Chavatte,L. Goossens,P.Depreux,J.Med.Chem.2012,55,1189-1204)。当然多数喹唑啉类化合物并不具有抗肿瘤活性。
(三)发明内容
本发明的目的在于提供一种具有抗肿瘤活性的新型喹唑啉类化合物—氨基苯并[d]氮杂
Figure BDA0001557823450000013
基喹唑啉类化合物及其制备方法和应用，该类化合物在一定剂量下对人乳腺癌细胞株MCF-7、人肺癌细胞株A-549均具有显著的抑制率；且该类化合物制备方法简便，易于操作，原料易得，且生产成本较低，适于工业化应用。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种式(Ⅰ)所示的氨基苯并[d]氮杂
Figure BDA0001557823450000023
基喹唑啉类化合物，
Figure BDA0001557823450000021
第二方面，本发明提供一种式(Ⅰ)所示的氨基苯并[d]氮杂
Figure BDA0001557823450000024
基喹唑啉类化合物的制备方法，所述的方法为：(1)将式(Ⅱ)所示化合物与式(Ⅲ)所示化合物混合，在有机溶剂A中，于碱性催化剂B的作用下，25～120℃进行反应(TLC跟踪监测，展开剂为乙酸乙酯/石油醚＝1：3(v/v)，优选40～100℃反应0.5～12h)，反应完全后，将反应液分离纯化，制得式(Ⅳ)所示化合物；所述有机溶剂A选自下列之一：氯仿、甲苯、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、乙腈或N,N-二甲基甲酰胺；所述的碱性催化剂B选自下列之一：吡啶、二乙胺、三乙胺、喹啉、N,N-二甲苯胺、4-二甲氨基吡啶、4-吡咯烷基吡啶或碳酸钠(优选吡啶、二乙胺、三乙胺、N,N-二甲苯胺或4-二甲氨基吡啶)；
Figure BDA0001557823450000022
(2)将步骤(1)所得式(Ⅳ)所示的化合物溶解在有机溶剂D中,于还原剂 E作用下，在25～100℃反应完全(TLC跟踪监测，展开剂为乙酸乙酯/石油醚＝1： 1(v/v)，优选40～80℃反应0.5～12h)，反应液过滤，滤液减压浓缩后的浓缩物干燥(优选25℃真空干燥)，制得所述式(Ⅰ)所示的化合物；所述有机溶剂D为下列之一：氯仿、甲苯、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、乙腈或N,N-二甲基甲酰胺；所述还原剂E为下列之一：铁粉/浓盐酸，铁粉/醋酸，钯碳/甲酸铵或钯碳/ 水合肼；所述铁粉/浓盐酸是指铁粉与浓盐酸任意比例的混合、铁粉/醋酸是指铁粉与醋酸任意比例的混合，所述钯碳/甲酸铵是指钯碳与甲酸铵任意比例的混合，所述钯碳/水合肼是钯碳与水合肼任意比例的混合物。
进一步，步骤(1)中，所述式(Ⅲ)所示化合物与式(Ⅱ)所示化合物、碱性催化剂B的投料物质的量之比为1.0﹕0.8～1.2﹕1.0～8.0。
进一步，步骤(1)中，所述有机溶剂A的用量以式(Ⅲ)所示化合物的质量计为10～50mL/g。
进一步，本发明步骤(1)中所述反应液分离纯化的方法为：反应完全后，将反应液蒸除溶剂，取浓缩物用有机溶剂C将其溶解，获得溶解液，然后向溶解液中加入浓缩物1.0～2.0倍重量的柱层析硅胶(优选300～400目粗孔(zcx.II) 型柱层析硅胶)，混匀后，蒸除溶剂，干燥，获得浓缩物与硅胶的混合物，将混合物装柱，然后以体积比为1：0.1～10的石油醚与乙酸乙酯混合溶液为洗脱剂，收集含目标组分的流出液(优选以乙酸乙酯/石油醚＝1：3(v/v)为展开剂跟踪检测，收集目标组分，优选收集Rf值为0.5的组分)，减压浓缩，干燥(优选 50℃干燥)，获得式(Ⅳ)所示的化合物；所述有机溶剂C为下列之一：乙醇、氯仿、四氢呋喃或乙酸乙酯。所述有机溶剂C用量以能够溶解残留物即可。
进一步，步骤(2)中，所述的还原剂E为铁粉/浓盐酸或者铁粉/醋酸，式(Ⅳ) 所示的化合物与还原剂E中的铁粉、浓盐酸或醋酸的投料质量比为1.0﹕1.0～3.0 ﹕0.2～1.0。本发明中，浓盐酸质量浓度为36％～38％，醋酸采用冰醋酸。
进一步，步骤(2)中，所述的还原剂E为钯碳/甲酸铵或钯碳/水合肼，式(Ⅳ) 所示的化合物与还原剂E中的钯碳、甲酸铵或水合肼的投料质量比为1.0﹕ 0.1～0.5﹕1.0～3.0。本发明中适用的钯碳中钯的质量负载量为2～10％，优选5％，水合肼质量浓度为40～80％，优选80％。
进一步，步骤(2)中，所述有机溶剂D的用量以式(Ⅳ)所示的化合物的质量计为10～50mL/g。
本发明所述有机溶剂A、C和D均为有机溶剂，为了便于区分不同步骤所用有机溶剂不同而命名，字母本身没有含义。
第三方面，本发明还提供了一种式(Ⅰ)所示氨基苯并[d]氮杂
Figure BDA0001557823450000041
基喹唑啉类化合物在制备预防或治疗肿瘤药物中的应用，特别是在制备预防或治疗人乳腺癌药物中的应用。
优选地，所述药物为具有抑制人乳腺癌细胞株MCF-7活性的药物。本发明所述氨基苯并[d]氮杂
Figure BDA0001557823450000042
基喹唑啉类化合物对人乳腺癌细胞株MCF-7具有显著的抑制作用。
本发明所述氨基苯并[d]氮杂
Figure BDA0001557823450000043
基喹唑啉类化合物还对人肺癌细胞株A-549 具有显著的抑制作用，可应用于制备预防或治疗人肺癌的药物。
本发明的有益效果主要体现在：(1)提供了一种新型的、具有很好的抗癌 (尤其是人乳腺癌或人肺癌)活性的喹唑啉类化合物，有望应用于制备预防或治疗人乳腺癌或人肺癌的药物中；(2)本发明提供的氨基苯并[d]氮杂
Figure BDA0001557823450000044
基喹唑啉类化合物(Ⅰ)的制备方法，简单易于操作，原料易得，且生产成本较低，适于实用。
(四)具体实施方式
本发明结合具体实施例作进一步的说明，以下的实施例是说明本发明的，而不是以任何方式限制本发明。
化合物(Ⅱ)的制备参照文献(Weinstock,J.et al.J.Med.Chem.,1986，29(11),2315-2325)的方法制备得到。4-氯-6-硝基喹唑啉(Ⅲ)的制备参照文献(Fernandes, C.etal.Bioorg.Med.Chem.,2007,15(12),3974-3980)的方法制备得到。
本发明实施例使用的钯碳(Pd/C)型号D5H5A，购于陕西瑞科新材料股份有限公司。
实施例1：硝基苯并[d]氮杂
Figure BDA0001557823450000051
基喹唑啉(Ⅳ)的制备
依次将1.20克(5.73mmol)4-氯-6-硝基喹唑啉(Ⅲ)和2.39克(6.87mmol) 化合物(Ⅱ)，3.62克(45.76mmol)吡啶，12毫升氯仿加入50毫升的反应瓶中，加热至40℃，TLC跟踪检测(展开剂为乙酸乙酯/石油醚＝1：3(v/v))，搅拌反应10小时，关闭反应，反应液蒸除溶剂，得到的浓缩物中加入10毫升乙酸乙酯将其溶解，获得溶解液，向溶解液中加入3.0克柱层析硅胶(300～400目柱层析硅胶)，混匀后，蒸除溶剂，得干燥的浓缩物与硅胶的混合物，将混合物装柱，然后以体积比为1：10的石油醚/乙酸乙酯混合溶液为洗脱剂，洗脱，TLC 跟踪检测(展开剂为乙酸乙酯/石油醚＝1：3(v/v))，根据TLC检测收集含式(Ⅳ)所示的化合物的洗脱液(Rf值为0.5)，收集液浓缩，50℃干燥得到式(Ⅳ) 所示的淡黄色固体产物，收率85.1％，熔点164～166℃。1H NMR(500MHz,CDCl3) δ:3.32-3.38(m,1H),3.63(dt,J＝3.4,15.5Hz,1H),3.75(s,3H),3.82(s,6H),3.91(dd, J＝8.1,14.3Hz,1H),4.03(td,J＝4.1,11.7Hz,1H),4.15(d,J＝11.5Hz,1H),4.72(dd, J＝8.3,14.2Hz,1H),5.14(t,J＝8.9Hz,1H),6.60(s,1H),6.90(d,J＝8.7Hz,2H), 7.08(d,J＝8.6Hz,2H),7.93(d,J＝9.1Hz,1H),8.48(dd,J＝2.4,9.2Hz,1H),8.71(s, 1H),8.96(d,J＝2.4Hz,1H)。IR(KBr,cm-1)ν:2917,2848,1616,1580,1510,1463, 1355,1327,1249,1038,847。
实施例2：硝基苯并[d]氮杂
Figure BDA0001557823450000052
基喹唑啉(Ⅳ)的制备
依次将1.20克(5.73mmol)4-氯-6-硝基喹唑啉(Ⅲ)和1.59克(4.57mmol)化合物(Ⅱ)，1.67克(22.83mmol)二乙胺，60毫升甲苯加入100毫升的三口烧瓶中，加热至100℃，TLC跟踪检测(展开剂为乙酸乙酯/石油醚＝1：3(v/v))，搅拌反应2小时，关闭反应，反应液蒸除溶剂，得到的浓缩物中加入20毫升乙醇将其溶解，获得溶解液，向溶解液中加入2.5克柱层析硅胶(300～400目柱层析硅胶)，混匀后，蒸除溶剂，得干燥的浓缩物与硅胶的混合物，将混合物装柱，然后以体积比为1：5的石油醚/乙酸乙酯混合溶液为洗脱剂，洗脱，TLC跟踪检测(展开剂为乙酸乙酯/石油醚＝1：3(v/v))，根据TLC检测收集含式(Ⅳ)所示的化合物的洗脱液(Rf值为0.5)，收集液浓缩，50℃干燥得到式(Ⅳ) 所示的淡黄色固体产物，收率72.6％，熔点164～166℃。1H NMR和IR同实施例1。
实施例3：硝基苯并[d]氮杂
Figure BDA0001557823450000061
基喹唑啉(Ⅳ)的制备
依次将1.20克(5.73mmol)4-氯-6-硝基喹唑啉(Ⅲ)和1.99克(5.72mmol) 化合物(Ⅱ)，0.58克(5.73mmol)三乙胺，60毫升乙醇加入100毫升的三口烧瓶中，加热至60℃，TLC跟踪检测(展开剂为乙酸乙酯/石油醚＝1：3(v/v))，搅拌反应8小时，关闭反应，反应液蒸除溶剂，得到的浓缩物中加入20毫升氯仿将其溶解，获得溶解液，向溶解液中加入2.5克柱层析硅胶(300～400目柱层析硅胶)，混匀后，蒸除溶剂，得干燥的浓缩物与硅胶的混合物，将混合物装柱，然后以体积比为10：1的石油醚/乙酸乙酯混合溶液为洗脱剂，洗脱，TLC 跟踪检测(展开剂为乙酸乙酯/石油醚＝1：3(v/v))，根据TLC检测收集含式(Ⅳ)所示的化合物的洗脱液(Rf值为0.5)，收集液浓缩，50℃干燥得到式(Ⅳ) 所示的淡黄色固体产物，收率77.2％，熔点164～166℃。1H NMR和IR同实施例1。
实施例4：硝基苯并[d]氮杂
Figure BDA0001557823450000062
基喹唑啉(Ⅳ)的制备
依次将1.20克(5.73mmol)4-氯-6-硝基喹唑啉(Ⅲ)和2.20克(6.32mmol) 化合物(Ⅱ)，1.40克(11.46mmol)4-二甲氨基吡啶，60毫升异丙醇加入100 毫升的三口烧瓶中，室温25℃搅拌，TLC跟踪检测(展开剂为乙酸乙酯/石油醚＝1：3(v/v))，反应12小时，关闭反应，反应液蒸除溶剂，得到的浓缩物中加入20毫升四氢呋喃将其溶解，获得溶解液，向溶解液中加入4.0克柱层析硅胶 (300～400目柱层析硅胶)，混匀后，蒸除溶剂，得干燥的浓缩物与硅胶的混合物，将混合物装柱，然后以体积比为5：1的石油醚/乙酸乙酯混合溶液为洗脱剂，洗脱，TLC跟踪检测(展开剂为乙酸乙酯/石油醚＝1：3(v/v))，根据TLC 检测收集含式(Ⅳ)所示的化合物的洗脱液(Rf值为0.5)，收集液浓缩，50℃干燥得到式(Ⅳ)所示的淡黄色固体产物，收率80.2％，熔点164～166℃。1H NMR 和IR同实施例1。
实施例5：硝基苯并[d]氮杂
Figure BDA0001557823450000071
基喹唑啉(Ⅳ)的制备
依次将1.20克(5.73mmol)4-氯-6-硝基喹唑啉(Ⅲ)和1.79克(5.15mmol) 化合物(Ⅱ)，1.04克(8.58mmol)N,N-二甲苯胺，12毫升N,N-二甲基甲酰胺加入50毫升的反应瓶中，加热至120℃，TLC跟踪检测(展开剂为乙酸乙酯/石油醚＝1：3(v/v))，搅拌反应0.5小时，关闭反应，反应液蒸除溶剂，得到的浓缩物中加入20毫升四氢呋喃将其溶解，获得溶解液，向溶解液中加入5.0克柱层析硅胶(300～400目柱层析硅胶)，混匀后，蒸除溶剂，得干燥的浓缩物与硅胶的混合物，将混合物装柱，然后以体积比为1：1的石油醚/乙酸乙酯混合溶液为洗脱剂，洗脱，TLC跟踪检测(展开剂为乙酸乙酯/石油醚＝1：3(v/v))，根据TLC检测收集含式(Ⅳ)所示的化合物的洗脱液(Rf值为0.5)，收集液浓缩， 50℃干燥得到式(Ⅳ)所示的淡黄色固体产物，收率89.6％，熔点164～166℃。1H NMR和IR同实施例1。
实施例6：硝基苯并[d]氮杂
Figure BDA0001557823450000072
基喹唑啉(Ⅳ)的制备
依次将1.20克(5.73mmol)4-氯-6-硝基喹唑啉(Ⅲ)和2.39克(6.87mmol) 化合物(Ⅱ)，3.62克(45.76mmol)吡啶，20毫升丙醇加入50毫升的反应瓶中，加热至40℃，TLC跟踪检测(展开剂为乙酸乙酯/石油醚＝1：3(v/v))，搅拌反应10小时，关闭反应，反应液蒸除溶剂，得到的浓缩物中加入20毫升乙酸乙酯将其溶解，获得溶解液，向溶解液中加入3.5克柱层析硅胶(300～400目柱层析硅胶)，混匀后，蒸除溶剂，得干燥的浓缩物与硅胶的混合物，将混合物装柱，然后以体积比为1：1的石油醚/乙酸乙酯混合溶液为洗脱剂，洗脱，TLC 跟踪检测(展开剂为乙酸乙酯/石油醚＝1：3(v/v))，根据TLC检测收集含式(Ⅳ)所示的化合物的洗脱液(Rf值为0.5)，收集液浓缩，50℃干燥得到式(Ⅳ) 所示的淡黄色固体产物，收率78.3％，熔点164～166℃。1H NMR和IR同实施例1。
实施例7：氨基苯并[d]氮杂
Figure BDA0001557823450000081
基喹唑啉(Ⅰ)的制备
依次将实施例1方法制备的0.40克(0.77mmol)硝基苯并[d]氮杂
Figure BDA0001557823450000082
基喹唑啉(Ⅳ)，0.40克(6.34mmol)甲酸铵，0.04克5％Pd/C，4.0毫升氯仿加入到反应瓶中，室温25℃搅拌，TLC跟踪检测(展开剂为乙酸乙酯/石油醚＝1：1(v/v))，反应12小时，过滤，滤液浓缩，25℃真空干燥得到淡黄色固体产物氨基苯并[d] 氮杂
Figure BDA0001557823450000083
基喹唑啉(Ⅰ)，收率98.2％，熔点122～126℃。1H NMR(500MHz,CDCl3) δ:3.40-3.48(m,2H),3.71(s,3H),3.82(s,3H),3.83(s,3H),3.87-3.98(m,5H), 4.45(dd,J＝6.3,13.8Hz,1H),4.95(dd,J＝6.5,9.2Hz,1H),6.47(s,1H),6.90(d,J＝ 8.7Hz,2H),6.95(d,J＝2.5Hz,1H),7.11(d,J＝8.6Hz,2H),7.15(dd,J＝8.9,2.5Hz, 1H),7.69(d,J＝8.9Hz,1H),8.50(s,1H)。IR(KBr,cm-1)ν:3368,3215,2932,2825, 1628,1566,1512,1487,1353,1248,1036,834。
实施例8：氨基苯并[d]氮杂
Figure BDA0001557823450000084
基喹唑啉(Ⅰ)的制备
依次将实施例2方法制备的0.40克(0.77mmol)硝基苯并[d]氮杂
Figure BDA0001557823450000085
基喹唑啉(Ⅳ)，1.20克(19.18mmol)80wt％水合肼，0.20克5％Pd/C，20.0毫升甲苯加入到50毫升的反应瓶中，加热至100℃，TLC跟踪检测(展开剂为乙酸乙酯/ 石油醚＝1：1(v/v))，搅拌反应0.5小时，冷却过滤，滤液浓缩，25℃真空干燥得到淡黄色固体产物氨基苯并[d]氮杂
Figure BDA0001557823450000091
基喹唑啉(Ⅰ)，收率100.0％，熔点 122～126℃。1H NMR和IR同实施例7。
实施例9：氨基苯并[d]氮杂
Figure BDA0001557823450000092
基喹唑啉(Ⅰ)的制备
依次将实施例3方法制备的0.40克(0.77mmol)硝基苯并[d]氮杂
Figure BDA0001557823450000093
基喹唑啉(Ⅳ)，0.08克浓盐酸(质量浓度36～38％)，0.40克铁粉，20.0毫升甲醇加入到 50毫升的反应瓶中，加热至40℃，TLC跟踪检测(展开剂为乙酸乙酯/石油醚＝1： 1(v/v))，搅拌反应8小时，冷却过滤，滤液浓缩，25℃真空干燥得到淡黄色固体产物氨基苯并[d]氮杂
Figure BDA0001557823450000094
基喹唑啉(Ⅰ)，收率94.1％，熔点122～126℃。1H NMR和IR同实施例7。
实施例10：氨基苯并[d]氮杂
Figure BDA0001557823450000095
基喹唑啉(Ⅰ)的制备
依次将实施例4方法制备的0.40克(0.77mmol)硝基苯并[d]氮杂
Figure BDA0001557823450000096
基喹唑啉(Ⅳ)，0.40克醋酸，1.20克铁粉，20.0毫升异丙醇加入到50毫升的反应瓶中，加热至80℃，TLC跟踪检测(展开剂为乙酸乙酯/石油醚＝1：1(v/v))，搅拌反应3小时，冷却过滤，滤液浓缩，25℃真空干燥得到淡黄色固体产物氨基苯并[d]氮杂
Figure BDA0001557823450000097
基喹唑啉(Ⅰ)，收率97.5％，熔点122～126℃。1H NMR和IR同实施例7。
实施例11：抗癌活性体外测试
(1)将制得的化合物(Ⅰ)和(Ⅳ)进行人乳腺癌生物活性测试。
测试方法：四氮唑盐还原法(MTT法)。
细胞株：人乳腺癌细胞株MCF-7。上述肿瘤细胞株购自中国科学院上海生命科学院细胞库。
实验步骤如下：
1)样品的准备：对于可溶样品，每1mg用40μL DMSO溶解，取2μL用1000μL 培养基稀释，使浓度为100μg/mL，再用培养液连续稀释至使用浓度。
2)细胞的培养
①培养基的配制:每1000mL DMEM培养基(Gibco)中含80万单位青霉素， 1.0g链霉素，10％灭活胎牛血清。
②细胞的培养：将肿瘤细胞接种于培养基中，置37℃，5％CO2培养箱中培养，3～5d传代。
③测定样品对肿瘤细胞生长的抑制作用
将第10代细胞用EDTA-胰酶消化液消化，并用培养基稀释成1×106/mL，加到96孔细胞培养板中，每孔100μL，置37℃，5％CO2培养箱中培养。接种24h后，加入用培养基稀释的100μg/mL、10μg/mL和1μg/mL样品，每孔100μL，每个浓度加3孔，置37℃，5％CO2培养箱中培养，72h后在细胞培养孔中加入5mg/mL的MTT，每孔10μL，置37℃孵育3h，加入DMSO，每孔150μL，用振荡器振荡，使甲臢完全溶解，用酶标仪在570nm波长下比色。以同样条件下不含样品，含同样浓度DMSO的培养基培养的细胞作为对照，计算样品对肿瘤细胞生长的IC50。
测试的结果如表1所示：
表1.化合物(Ⅰ)和(Ⅳ)对癌细胞株MCF-7生长的抑制作用
Figure BDA0001557823450000101
(2)参照文献(Rao,G.-W.et al.ChemMedChem,2013,8(6),928-933)的方法制备得到4-氯喹唑啉，再根据实施例1，将4-氯-6-硝基喹唑啉用4-氯喹唑啉代替，其他操作同实施例1，合成了喹唑啉类化合物(a)，结构如下所示：
Figure BDA0001557823450000111
根据上述方法将制得的喹唑啉类化合物(a)进行了人乳腺癌细胞株MCF-7生物活性测试，测试结果表明喹唑啉类化合物(a)对人乳腺癌细胞株MCF-7的抗癌活性远不如化合物(Ⅰ)。具体结果如表2所示：
表2.化合物(a)对癌细胞株MCF-7生长的抑制作用
Figure BDA0001557823450000112
实施例12：抗癌活性体外测试
(1)将制得的化合物(Ⅰ)、(Ⅳ)进行人肺癌癌生物活性测试。
测试方法：四氮唑盐还原法(MTT法)。
细胞株：人肺癌细胞株A-549。上述肿瘤细胞株购自中国科学院上海生命科学院细胞库。
实验步骤如下：
1)样品的准备：对于可溶样品，每1mg用40μL DMSO溶解，取2μL用1000μL 培养基稀释，使浓度为100μg/mL，再用培养液连续稀释至使用浓度。
2)细胞的培养
①培养基的配制:每1000mL DMEM培养基(Gibco)中含80万单位青霉素， 1.0g链霉素，10％灭活胎牛血清。
②细胞的培养：将肿瘤细胞接种于培养基中，置37℃，5％CO2培养箱中培养，3～5d传代。
③测定样品对肿瘤细胞生长的抑制作用
将第10代细胞用EDTA-胰酶消化液消化，并用培养基稀释成1×106/mL，加到96孔细胞培养板中，每孔100μL，置37℃，5％CO2培养箱中培养。接种24h后，加入用培养基稀释的100μg/mL、10μg/mL或1μg/mL样品，每孔100μL，每个浓度加3孔，置37℃，5％CO2培养箱中培养，72h后在细胞培养孔中加入5mg/mL的 MTT，每孔10μL，置37℃孵育3h，加入DMSO，每孔150μL，用振荡器振荡，使甲臢完全溶解，用酶标仪在570nm波长下比色。以同样条件用不含样品，含同样浓度DMSO的培养基培养的细胞作为对照，计算样品对肿瘤细胞生长的IC50。
测试的结果如表3所示：
表3.化合物(Ⅰ)和(Ⅳ)对癌细胞株A-549生长的抑制作用
Figure BDA0001557823450000121
(2)参照文献(Rao,G.-W.et al.ChemMedChem,2013,8(6),928-933)的方法制备得到4-氯喹唑啉，再根据实施例1，将4-氯-6-硝基喹唑啉用4-氯喹唑啉代替，其他操作同实施例1，合成了喹唑啉类化合物(a)，结构如下所示：
Figure BDA0001557823450000131
根据上述方法将制得的喹唑啉类化合物(a)进行了人肺癌细胞株A-549生物活性测试，测试结果表明喹唑啉类化合物(a)对人肺癌细胞株A-549的抗癌活性远不如化合物(Ⅰ)。具体结果如表4所示：
表4.化合物(a)对癌细胞株A-549生长的抑制作用
Figure BDA0001557823450000132

Claims (10)

1.一种式(Ⅰ)所示的氨基苯并[d]氮杂
Figure FDA0001557823440000012
基喹唑啉类化合物：
Figure FDA0001557823440000011
2.一种如权利要求1所述的式(Ⅰ)所示的氨基苯并[d]氮杂
Figure FDA0001557823440000013
基喹唑啉类化合物的制备方法，其特征在于所述的方法为：
(1)将式(Ⅱ)所示化合物与式(Ⅲ)所示化合物混合，在有机溶剂A中，于碱性催化剂B的作用下，25～120℃进行反应，反应完全后，将反应液分离纯化，制得式(Ⅳ)所示化合物；所述有机溶剂A选自下列之一：氯仿、甲苯、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、乙腈或N,N-二甲基甲酰胺；所述的碱性催化剂B选自下列之一：吡啶、二乙胺、三乙胺、喹啉、N,N-二甲苯胺、4-二甲氨基吡啶、4-吡咯烷基吡啶或碳酸钠；
(2)将步骤(1)所得式(Ⅳ)所示的化合物溶解在有机溶剂D中,于还原剂E作用下，在25～100℃反应完全，反应液过滤，滤液减压浓缩后的浓缩物干燥，制得所述式(Ⅰ)所示的化合物；所述有机溶剂D为下列之一：氯仿、甲苯、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、乙腈或N,N-二甲基甲酰胺；所述还原剂E为下列之一：铁粉/浓盐酸、 铁粉/醋酸、 钯碳/甲酸铵或钯碳/水合肼；所述铁粉/浓盐酸是指铁粉与浓盐酸任意比例的混合， 铁粉/醋酸是指铁粉与醋酸任意比例的混合，所述钯碳/甲酸铵是指钯碳与甲酸铵任意比例的混合，所述钯碳/水合肼是钯碳与水合肼任意比例的混合物；
Figure FDA0001557823440000021
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述式(Ⅲ)所示化合物与式(Ⅱ)所示化合物、碱性催化剂B的投料物质的量之比为1.0﹕0.8～1.2﹕1.0～8.0。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述有机溶剂A的用量以式(Ⅲ)所示化合物的质量计为10～50mL/g。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(2)中当所述的还原剂E为铁粉/浓盐酸或者铁粉/醋酸，式(Ⅳ)所示的化合物与还原剂E中的铁粉、浓盐酸或醋酸的投料质量比为1.0﹕1.0～3.0﹕0.2～1.0。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(2)中当所述的还原剂E为钯碳/甲酸铵或钯碳/水合肼，式(Ⅳ)所示的化合物与还原剂E中的钯碳、甲酸铵或水合肼的投料质量比为1.0﹕0.1～0.5﹕1.0～3.0。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述有机溶剂D的用量以式(Ⅳ)所示的化合物的质量计为10～50mL/g。
8.如权利要求2～7之一所述的方法，其特征在于：步骤(1)所述反应液分离纯化的方法为：反应完全后，将反应液蒸除溶剂，取浓缩物用有机溶剂C将其溶解，获得溶解液，然后向溶解液中加入浓缩物1.0～2.0倍重量的柱层析硅胶，混匀后，蒸除溶剂，干燥，获得浓缩物与硅胶的混合物，将混合物装柱，然后以体积比为1：0.1～10的石油醚与乙酸乙酯混合溶液为洗脱剂，收集含目标组分的流出液，减压浓缩，干燥，获得式(Ⅳ)所示的化合物；所述有机溶剂C为下列之一：乙醇、氯仿、四氢呋喃或乙酸乙酯。
9.如权利要求1所述的式(Ⅰ)所示的氨基苯并[d]氮杂
Figure FDA0001557823440000031
基喹唑啉类化合物在制备预防或治疗人乳腺药物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述人乳腺癌药物为具有抑制人乳腺癌细胞株MCF-7活性的药物。
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