DE2314518A1 - Pyrono-rifamycine und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents

Description

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Unsere Nr. 18 490

23H518

22. Msrz !373

Gruppo Lepetit S.p.A. Mailand / Italien

Pyrono-rifamycine und Verfahren zu ihrer Herstellung

Gegenstand der Erfindung sind neue antimikrobielle Verbindungen, nämlich Rifarnycinderivate mit ankondensiertem Pyronring der allgemeinen Formel

OR

in der R ein niederer AlkyIrest, ein niederer Alkoxyrest oder die Hydroxygruppe ist.

Die Erfindung umfaßt auch die entsprechenden 25-Desacetylderivate und 16,17,18,19,28,29-Hexahydrorifamycine..

Die vorliegend verwendeten Ausdrücke "Alkylrest" und "Alkoxyrest" umfassen geradkettige und verzweigte aliphatische Reste-mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen»

Die neuen Verbindungen werden durch Umsetzung von 3-Formyl rifamycin ύΥ oder seinem 25T-Desacetyl- oder Hexahydroderivat mit der äcjuimolekularen Megei? einer Verbindung der allgemeinen Formel

COR
". H₂G II

hergestellt, in der R die oben angegebene Bedeutung hat und R₁ -CN, -COOH oder -COOR₃ ist, wobei R₃ einen aliphatischen geradkettigen Rest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen darstellt. Die Cyclisierung verläuft über eine Kondensation der -CHp-Gruppe der Verbindung II mit der in 3-Stellung des Rifamycinmoleküls befindlichen Formylgruppe und eine nachfolgende Kondensation zwischen R₁ und der in 4-Stellung des Rifamycinmoleküls befindlichen OH-Gruppe, Je nach der Beschaffenheit des Restes R₁ wird Wasser, Ammoniak, oder ein niederer Alkohol abgespalten. Die Reaktionsbedingungen entsprechen denen, wie sie gewöhnlich bei der Synthese von Cumarinen aus aromatischen o-Hydroxyaldehyden angewandt werden, die als Knoevenagel Reaktion bekannt ist (Org. Reactions, Bd. 15, S. 204). Gewöhnlich wird hierbei ein basischer Katalysator verwendet, der aus einer-Aminbase, wie Ammoniak, Piperidin, Pyridin oder Diäthyl-

_ -Jt. _

amin bestehen kann. In anderen Fällen kann der Katalysator ein Ammonium- oder Alkalimetallsalz, wie Ammoniumacetat, Kalium- oder Natriumacetat sein. Wenn die Verbindung der allgemeinen Formel II besonders reaktionsfähig ist, kann'die Umsetzung sogar in Abwesenheit eines Katalysators durchgeführt werden.

Gewöhnlich werden als Lösungsmittel niedere Alkenole, Benzol, Tetrahydrofuran oder Chloroform verwendet und, wenn Ammoniumacetat oder Alkalimetallsalze als Katalysatoren dienen, Essigsäure. Die Reaktionstemperatur kann je nach der Reaktionsfähigkeit der Verbindungen der allgemeinen Formel II zwischen etwa 0° C und der Siedetemperatur des Lösungsmittels liegen. Die neuen Verbindungen stellen gefärbte Feststoffe dar, die aus üblichen organischen Lösungsmitteln, wie Aceton, niederen Alkanolen, Äthylacetat oder Tetrahydrofuran kristallisiert werden können. Ihre Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln hangt offensichtlich von der Art und Größe des Substituenten -COR ab. Wenn eine Säurefunktion vorliegt, sind die Verbindungen auch in Wasser als Alkalimetallsalze löslich. Die neuen Verbindungen besitzen gute biologische Wirksamkeit gegen grampositive und gramnegative: Stämme: und außerdem geringe Toxizität. Repräsentative Untersuchungen zeigiai, daß Konzentrationen der Verbindungen der Beispiele 1 und 2 von 0,1 bis 5 ^/ml das Wachstum von „Streptococcus hemolyticus _{t m} Staphylococcus aureus, Diplococcus pneumoniae und Myoobacterium tuberculosis EUy Rv hemmen.

Die neuen Verbindungen hemmen in niedrigen Konzentrationen auch das Wachstum von Mikroorganismen, die gegenüber anderen bekannten und verbreitet angewandten Antibiotika resistent sind.

Sie besitzen ferner gute chemische Beständigkeit, da das Hydrochinon-System, das durch oxydierende Mittel leicht

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beeinträchtigt werden kann, nicht mehr vorhanden ist.

Eine weitere sehr wichtige Eigenschaft der erfindungsgemäßen Verbindungen ist ihre Hemmwirkung auf DNS-Polymerasen, die für Lymphoblasten aus menschlichem leukämischen "Blut charakteristisch sind, und gegen typische Nucleotidyl-Transferasen (Polymerasen) von Viren, die von der normalen Zelle nicht verwendet werden können. Aus Untersuchungen an repräsentativen Gliedern von Virusgruppen ist bekannt, daß sie als wesentlichen Teil ihrer Reproduktion Polymerasen in die Wirtszellen tragen oder in ihnen erzeugen. So gibt es Viren, wie z.B. Pieornaviren oder Polioviren, die RNS-abhängige RNS-Polymerase erzeugen, während andere Gruppen, wie z.B. Leukämie-Sarkom-Viren eine RNS-abhängige DNS-PoIymerase tragen. Die Gegenwart und die außerordentlich wichtige Rolle der RNS-abhängigen DNS-Polymerase (reverse Transcriptase) bei Tumor bildenden RNS-Viren wurde von D. Baltimore, Nature, Bd. 226, S. 1209 (1970) und von H.M. Temin u. Mitarb., Nature,-Bd. 226, S. 1211 (1970) entdeckt.

Die kürzliche Entdeckung von RNS-abhängigem DNS-Polymerase-Enzym in RNS-Tumorviren in Tierarten wurde auch von anderen Autoren bestätigt, wie z.B. aus den nachstehend aufgeführten Literaturstellen hervorgeht:

Green u. Mitarb., "Mechanism of carcinogenesis by RNA tumor viruses, I. An RNA-dependent DNA-Polymerase in murine sarcoma viruses" (Pro£. Nat» Acad_e Sei., USA, Bd. 67, S. 385 bis 393, 1970). -

Spiegelman u. Mitarb., "Characterization of the products of RNA directed DNA-polymerase in oncogenic RNA viruses" (Nature, London, Bd. 227, S₀ 563, 1970). -

Hatanaka u. Mitarb., "DNA polymerase activity associated with RNA tumor viruses" (Proc* Nat. Acad. Sei., USA, Bd. 67, S. 143, 1970). -

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Scolnick u. Mitarb., "DNA synthesis by RNA containing tumor viruses» (Proc. Nat. Acad. Sei. USA, Bd. 67, S. 1034, 1970).

Das Vorliegen von RNS-Viren in einigen Tumoren wird auch durch andere Pakten bestätigt: reverse Transcriptase wurde in Teilchen der Milch von Frauen mit bekannter Brustkrebsanamnese und von solchen Frauen, in deren Familie Brustkrebs aufgetreten war, gefunden (Scho.ln u. Mitarb„, Bd. 231, S. 97, 1971), während Priori u_o Mitarb. (Nature New Biology, Bd. 232, S. 16, 1971) ein als ESP-ibezeichnetes, reverse Transcriptase enthaltendes Virus aus Zellen der Pleuralflüssigkeit eines Kindes mit Lymphom isolierten und es erfolgreich auf Gewebekulturen züchteten.

Das Vorliegen von RNS-Homologen bei menschlichem Brustkrebs zu Tumorvirus-RNS bei der Mamma der Maus wurde von R. Axel u. Mitarb. (Nature, Bd. 235, S. 32, 1972) durch Molekularhybridisa ti onsversuche demonstriert. Die Möglichkeit eines Virus beim menschlichen Brustkrebs wurde auch durch Elektronenmikroskopie menschlicher Milch gestützt (N.H. Sarkar u. Mitarb., Nature, Bd. 236, S. 103, 1972). Auf RNS gerichtete DNS-Polymerasewirksamkeit und Virus-ähnliche Teilchen wurden auch aus menschlichen Rhabdcmyosarkomzellen isoliert (McAllister u. Mitarb,, Nature, Nevr Biol., Bck 235, 3. 3, 1972). Zur Zeit existieren keine sehr* wirksamen Arzneimittel zur Behandlung von Viruserkrankungen, da die Stoffwechselerfordernisse für Viren und Zellen gleich sind. Der meistversprechende Weg zur Chemotherapie von Viruserkrankungen ist die Entwicklung geeigneter Chemikalien, die sich in spezifischer Weise mit Viruspolymerasen oder mit von Viren transformierten Zellpolymerasen, aber nicht mit den Polymerasen der Wirtszellen, die die genetische Information der Viren kontrollieren, vereinigen. Spezifische Inhibitoren für Virus- oder durch Viren transformierte Zellenzyme und insbesondere Inhibitoren für Polymerasen von RNS-Tumorviren können eine bedeutende Rolle bei der Bereit-

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stellring von Arzneimitteln zur Behandlung der Leukämie und anderer Krebserkrankungen spielen; Die Hemmwirkung der erfindurigsgemäßen Verbindungen wurde an RNS-abhängiger DNS-Polymerase des endogenen Muridae-Sarkom-Virus und an der DNS-abhängigen DNS-Polymerase-Wirksamkeit gereinig ter Enzyme untersucht (poly d A-Tas Matrize). Die Hemmwir kung wurde gemäß den von C. Gurgo u. Mitarb, in Nature, New Biology, Bd. 229, S. 111, 1971, beschriebenen Methoden getestet.

Die Wirkung der verschiedenen Arzneimittelkonzentrationen auf die Polymerasewirksamkeit wurde anschließend an die %-dTTP (tritiertes Thymindesoxyribosidtriphosphat)-Einverleibung in die unlösliche Fraktion bestimmt. Ein typisches Beispiel für das experimentelle Verfahren ist nachstehend beschrieben.

Der Virus wurde wie zuvor beschrieben-(Green u_o Mitarb_os Proc. Hat. AcacL Sci_o USA, 'BcIo 67* "S₀ 385^593_s 19705 Ro= kutanäa u. Mitarb», Nature_P Bd₀ 22.T₉ So 1026=1028₈ 1970) aus diircli Musdae~Sarkom.=Yirus (Molonej=Isolat) veränderten Rsttenzellen und aus öuroh Murida©=Sarkom=>Virus (Has?-= •vey-Iaolat) verändertsn Mäiisesellen Isoliert und ger©inigt_o Die Viruspolymerase wurde duroh Inkubation des gereinigten Virus mit O ₉ 5 % NP-=40 (nonidet-P°4o) in O₅I molarem NaCl, 0,01 molarem Tris-Piiffer (pH 7₂6)_s 0_P001 molarer Äthylendiamintetraessigsäure während 5 Minuten bei. Raumtemperatur und durch Zonenzentrifugation in von 15 auf 30 % ansteigender Saccharose in 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,4), 2,5 mM MgCl₂, 10 mM Dithiothreit und 5 % Glyzerin während 24 Stunden bei 38 000 UpM in einem Spinco SW 41 Rotor 20- bis 40fach gereinigt. Die Spitzenfraktionen der Enzymwirksamkeit (13-17) der 22 gesammelten Fraktionen . wurden vereinigt und bei -70° C in 30 % Glyzerin aufbewahrt.

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Die Enzyminkubation wurde wie von Green u. Mitarb, in Proc. Nat. Acad. Sei., USA, Bd. 67, S. 385-393, 1970 beschrieben, eine Stunde bei 37° C in 100 gü. eines Reakti ons gemisches, das 40 mM Tris-Puffer (pH 8,0), 5 mM Dithiothreit, 30 mM NaCl, 2,5 mM MgCl₂, 0,1 mM dATP, dGTP, dCTP und 10 ;iCi ³H-dTTP (12-18 Ci/Millimol) enthielt, durchgeführt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 150 μΐ 1η Perchlorsäure beendet. Als Träger wurde Kalbthymus-DNS (100 _tug) zugesetzt. Das radioaktive DNS-Produkt wurde wie in den beiden oben angegebenen Literaturstellen beschrieben aufgearbeitet. Die endogene RNS-abhängige DNS-Polymerasewirksamkeit wurde nach der Zugabe von 0,01 % NP-40 zu dem gereinigten Virus zum Zeitpunkt des Versuchs gemessen. Die DNS-Polymerasewirksamkeit der gereinigten Viruspolymerase wurde mit 2 μg von Poly d(A-T) als Matrize und ohne NP-40 gemessen.

Rxfamycinderivate wurden in Dimethylsulfoxid (DMSO) in einer Konzentration von 5 mg/ml gelöst und bei 4 C aufbewahrt. Die Hemmung der endogenen RNS-abhängigen DNS-Polymerasewirksamkeit wurde dadurch untersucht, daß man das Probegemisch mit 2 ul des in DMSO entsprechend verdünnten Derivats oder 2 ^l DMSO (Kontrolle) versetzte, bevor man es dem aufgebrochenen Virus zusetzte, das 15 bis 30 ug Virusprotein enthielt. Die Enzyminkubation wurde 60 Minuten lang bei 37° C durchgeführt. Die Hemmung des gereinigten Enzyms wurde durch Vorinkubation von 2 μΐ des Derivats oder von DMSO mit 30 ^l Enzym (1 bis 2 μg Protein) während 10 Minuten bei 37° C untersucht; dann wurden 70 μΐ Substrat gemisch zugesetzt, und das Gemisch wurde, wie oben beschrie ben, weiterinkubiert und aufgearbeitet.

In repräsentativen Versuchen verringerten die erfindungs- " gemäßen Verbindungen in einer Konzentration von 2 bis

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100 μg/ml oder weniger die Einverleibung von H^-dTTP auf weniger als 10 %, als sie in den Kontrollversuchen festgestellt wurde, wodurch die Hemmwirkung auf den Mechanis- · mus der Carcinogenese durch RNS-Tumo'rviren nach den neuesten biochemischen Erkenntnissen klar gezeigt wurde.

Die Hemmwirkung der reversen Transkriptasen wurde auch durch Versuche an Polymerase.aus Muridae-Leukämie-Viren bestätigt. Muridae-Leukämie-Virus-RNS-abhängige DNS-Polymer as e wurde wie von Gallo u. Mitarb, in Nature, New Biology, Bd. 232, So 141 (1971) beschrieben aus mit -Triton X 100 aufgebrochenen Viren hergestellt. Viren der beiden Arten Rauscher und Moloney wurden zuvor durch Bandenbildung im 1,16 g/ml-Bereich eines Saccharosedichtegradienten nach anfänglicher Zentrifugation bei geringer Geschwindigkeit zur Entfernung von Zellbruchstücken und Schichtenbildung auf Saccharosekonzentrationsgradienten von 60 % bis 20 % gereinigt. Die Endkonzentration des Virusprocpa-

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rats betrug 10 Teilchen/ml. Als Matrize wurde endogene 70S RNS verwendet. Es wurde festgestellt, daß Konzentra-

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tionen von 50 ug\oder weniger das Enzym wirksam hemmten.

Ähnliche Ergebnisse wurden bei Verwendung von Tumorzellpolymerasen menschlichen Ursprungs erzielt. In diesem Fall wurde die Hemmwirkung auch an Polymerasen normaler Zellen untersucht, um einen selektiven Effekt zu charakterisieren. Repräsentative Rifamycinderivate der Formel I wurden auf ihre Wirkung auf zwei gereinigte DNS-Polymerasen untersucht, die (I) aus menschlichen normalen (PHA-stimulierten) Blutlymphocjften, (II) aus Lymphoblastzellen (von einem normalen Spender) und (III) aus menschlichen leukämischen Blutlymphoblasten isoliert worden waren. Es wurden synthetische und/oder native Matrizen verwendet.

Ein typisches Beispiel für das experimentelle Verfahren ist nachstehend beschrieben:

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Menschliche__BlutlYmghoblasten

Leukämische Lymphoblasten wurden aus dem peripheren Blut von Patienten mit akuter lymphocytischer Leukämie (ALL) durch Leukophorese isoliert. Die Zellen wurden gewaschen und die Erythrocyten durch hypotonische Auflösung entfernt. Normale Lymphocyten wurden aus dem peripheren Blut von gesunden Spendern nach der Entfernung der Granulocyten durch Nylon-Säulenchromatographie erhalten. Sie wurden wie vorstehend beschrieben (Gallo u. Mitarb., Nature, Bdo 228, S. 927 , 1970; Gallo u. Mitarb., Science, Bd. 165, S. 400, 1968) 72 Stunden lang mit Phytohämagglutinin (PHA) behandelt, um ihre DNS-Polymerasewirksamkeit zu verstärken.

Wegen des Problems, ausreichende Mengen dieser Zellen zu erhalten, wurde zur Gewinnung weniger gereinigter DNS-PoIymerasen für einige der anfänglichen Untersuchungen zur Gewinnung eines Überblicks eine menschliche "normale" Gewebezellkultur (1788) verwendet. Die interessierenden Verbindungen wurden dann an den stärker gereinigten Enzymen aus den normalen und leukämischen Blutlymphocyten genauer untersucht. Die Gewebezellkulturen wurden von der Associated Biomedic Systems, Inc., erhalten.

DNS-Zellpolymerasen wurden aus normalen Blut(PHA-stimulier-. ten)-lymphocyten, leukämischen Blutlymphocyten und (1788) Lymphoidzellen durch Homogenisierung in hypotonischer Pufferlösung und nachfolgende Behandlung mit Triton X 100 und/oder starke Salzextraktion des extralysosomalen Pellets extrahiert und gereinigt. Nach der Differentialzentrifugation wurden die Zellextrakte durch Säulenchromatographie über Diäthylaminoäthylcellulose, Phosphocellulose und Sephadex G 200 weiter gereinigt.

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Die Untersuchung der DNS-Polymerase wurde in einem Endvolumen von 100 μΐ durchgeführt. Das untersuchte Gemisch enthielt 50 mM Tris-HCl-Puffer mit einem pH-¥ert von 8,3, 6,OmM MgAc, 8,0 mM Dithiothreit und 60 mM NaCl. Die Einstellung des pH-Wertes wurde nach der Zugabe der zuvor in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelösten Inhibitoren durchgeführt. Die Endkonzentration an DMSO betrug 0,5 %, und alle Kontrollproben enthielten diese Menge an DMSO. Im Versuch wurde eine Enzymkonzentration verwendet, die die Einverleibung von etwa 1,0 pMol/Std. katalysiert. Das Enzym war in den meisten Fällen 5 Minuten lang mit dem Inhibitor vorinkubiert worden. Die Umsetzung wurde dann durch Zugabe .von entweder synthetischer UNS (Poly d (AT) Miles Lab.) und DNS-RNS-Hybrid (Oligo dT. poly rA), 5 ug/ml, oder nativer Matrizei aktivierte Salm-Sperma-DNS, 50 ug/ml, und endogene 70S Virus-RNS} 10 uCi. (³H-Methyl)-TTP (New England Nuclear, 18,6" mC'i/uMol, lyophilisiert und erneut gelöst in 0,01 m HCl unmittelbar vor der Anwendung) und dATP (8 χ 10 M, mit synthetischer Matrize) oder allen drei Desoxynucleosid-triphosphaten (8 χ 10"^M mit RNS oder DNS als Matrize) eingeleitet. Bei einigen Versuchen wurde das Enzym nicht mit dem Inhibitor vorinkubiert.

In diesen Fällen wurden die Reaktionen durch Zugabe des Enzyms zu dem vollständigen, den Inhibitor enthaltenden Reaktionsgemisch eingeleitet. Zu Beginn der Inkubation und nach 30 Minuten wurden Proben entnommen, die Vorgänge in ihnen durch Zugabe von 2 ml 0,08 m Natriumpyrophosphat unterbrochen, und anschließend wurden diese Proben in 12,5 ftLger kalter Trichloressigsäure (TCB) mit Hefe-RNS (400 ug) als Träger ausgefällt. Die Produkte wurden auf einem Milliporenf ilter gesammelt, gründlich mit 5 &Lger Trichloressigsäure und 1 ml DMSO-Äthanol-0,1 m NaCl (0_t5i70:29,5) gewaschen, getrocknet und in 2 ml BBSj (Beck-

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■ - ΛΛ -

man) und 10 ml Liquifluor (New England Nuclear) In einem PackardrFlüssigkeits-Szintillationszähler gezählt. Es wurde gefunden, daß Konzentrationen von 5 bis 20 ug/ml bei einer synthetischen DNS-Matrize eine 50 $ige Hemmung der Leukämie-Polymerase bewirken. Bei einer synthetischen RNS-Matrize (Poly rA.rU) war die Reaktion sogar noch empfindlicher. Repräsentative Untersuchungen, die mit einer nativen Matrize an Polymerase von normalen und Tumorzellen durchgeführt wurden, ergaben eine höhere Empfindlichkeit der Tumorenzyme gegenüber den untersuchten Verbindungen. Andere biologische Eigenschaften der neuen Rifamycinderivate sind die Hemmung der Fokusbildung bei Zellen der Maus, der Ratte und des Menshen durch den Moloney- und Kirsten-Stamm des Muridae-Sarkom-Virus, die selektive Hemmung der Viruserzeugung durch bereits veränderte Maus- und menschliche Zellen, die Auffindung sich zurückbildender Zellen unter Verwendung der durch Muridae-Sarkom-Viren veränderten nichtproduzierenden Maus- und Rattenzellsysteme. Die erfindungsgemäßen Rifamycinverbindungen haben sich außerdem als selektiv toxisch für durch Viren veränderte Zellen von Mäusen, Ratten und Menschen erwiesen, wenn sie auf ihre Kolonie-bildende Fähigkeit untersucht wurden.

In Versuchen zur Ermittlung der Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen, die Fokusbildung durch Moloney-Sarkom-Viren bei BALB/3T3-Gewebekultüren zu hemmen, wird das folgende Verfahren angewandt:

BALB/3T3-Zellkulturen werden in 250 ml-Kunststoffflaschen in einem Wachstumsmedium gezüchtet, das aus Eagle's minimalem essentiellen Medium mit 10 % fötalem Rinderserum besteht. Mit einem Coulter-Zähler werden nach der Suspendierung der Zellen mit Trypsin- Versen und dem Verdünnen mit Wachstumsmedium Zellzählungen durchgeführt. Als Tumorhomogenat wird Moloney-Muridae-Sarkom-Virus verwendet. Man unterwirft es viermal einer Zellpas-

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sage in MausembryozeIlen der Schweizer Rasse mit hoher Passagezahl und untersucht es auf Fokus-bildende Einheiten in den BALB/3T3-Zellen. Bei der Durchführung der Untersuchungen wird eine Modifizierung der von Hartley und Rowe, Proc. Nat. Acad. Sei., Bd. 55, S. 780 (1966) beschriebenen Methode angewandt. Im vorliegenden Fall werden Flaschen mit 1 ■- 2 χ 10 Zellen in 25 ml des Wachstumsmediums geimpft und 24 Stunden lang bei 37° C inkubiert. Nach Entfernung der Flüssigkeiten wird das Virus mit einer vorbestimmten Anzahl von Fokus-bildenden Einheiten in 0,5 ml des Wachstumsmediums eingeführt. Dann läßt man es 90 Minuten lang bei 37° C an der Monoschicht der Zellen adsorbieren. Nach dieser Adsorptionsperiode wird eine vorbestimmte Menge, gewöhnlich etwa 5 Ms 10 yg/ml einer Pyrono-Rifamycinverbindung (die zuvor in Dimethylsulfoxid in einer Konzentration von 1 mg/ml gelöst worden war) in 25 ml des Wachstumsmediums gebracht, und die Kulturen werden in den Inkubator zurückgebracht. Als Kontrolle wird Dirnethylsulfoxid allein.im Wachstumsmedium zu einer getrennten Kultur zugesetzt. Nach dreitägiger Inkubation sind die Kulturen flUssig-verändert, und die Foki der veränderten Zellen werden am siebten Tag gezählt.

Auf die gleiche Weise wird das Bläschenstomatitis-Virus, New Jersey Serotyp, untersucht. Methoden zur Vermehrung und Untersuchung dieses Virus wurden von Hackett u„ Mitarb, in Virology, Bd. 31, S. 114 (1967) beschrieben.

Diese Eigenschaften zeigen, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen eine Hemmwirkung auf durch Viren hervorgerufene Tumore bei Tieren besitzen.

Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren. Hierbei ist die Nomenklatur und Bezifferung in bezug auf den in 4,3-Stellung des 4-Desoxyrifamycins SV ankondensierten 2-Pyronrings willkürlich. Die Zahlen

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mit dem Index beziehen sich auf Substituenten des Pyronringes und die ohne Index auf das Rifamycin-System.

Beispiel 1 3'-Acetyl-2»-pyrono[*-cj4-desoxyrifamycin SV

Zu einer Lösung von 2 Millimolen 3-Formylrifamycin SV in 70 ml Tetrahydrofuran werden 1 ml Piperidin und 2 Millimole Äthylacetoacetat gegeben. Nach 30 Minuten langem Erhitzen zum Sieden ist die Umsetzung beendet. Das Reaktionsgemisch wird zur Trockene eingedampft, mit Äthylacetat behandelt und mit Mineralsäure auf pH 2 angesäuert. Die organische Phase wird mit dem Dreifachen ihres Volumens an Wasser .
extrahiert. Die wässrige Schicht wird mit Äthylacetat extrahiert und die organische Lösung nach dem Trocknen zur Trockene, eingedampft. Der rohe Rückstand wird aus Aceton kristallisiert.

F = 175 bis 183° Cj Ausbeute 50 96.

Das gleiche Endprodukt erhält man, wenn man Methylacetoacetat anstelle von Äthylacetoacetat verwendet.

Analyse: berechnet für C^2HLqNO,. ^

C 63,71i H 6,24j N 1,77?
gefunden C 60,72? H 6,32; N 1,36

UV-Spektrum λ 525 346 311

IHcLjC

^E1cm ⁸²'^{7 295}'^{1 233}'¹

Beispiel 2 3 '-Carboxy-2¹ -pyrono jjfeiiysF-o] 4-desoxyrif amycin SV Zu einer Lösung von 2 Millimolen 3-Formylrifamycin SV in 70 ml Chloroform werden 2 ml Piperidin und 2 Millimole Malonsäure gegeben. Nach vierstündigem Erhitzen unter Rückfluß ist die Umsetzung beendet. Das Reaktionsgemisch wird zur Trockene eingedampft, mit Äthylacetat behandelt und

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mit Mineralsäure auf pH 2 angesäuert. Die organische Phase wird mit etwa dem Dreifachen ihres Volumens an Wasser extrahiert, Die wässrige Schicht wird mit Äthylacetat extrahiert und die organische Lösung nach dem Trocknen zur Tr okkene eingedampft. Das Rohprodukt wird aus Aceton kristallisierto

F = 191 bis 202° Cj Ausbeute 40 %,

Analyse; berechnet für Cλ,.ELyNO^j-

C 62,03; H 5,97} N 1,76; gefunden C 61,69; H 5,68; N 1,41

UV-Spektrum h_max 475 333 307 ^E1cm ¹¹⁶»^{7 328 269}>²

In analoger Weise wurden Pyronderivate von Rifamycin mit der allgemeinen Formel I hergestellt, in der -COR die fol genden Bedeutungen hat:

-COOCH₃, -COOC₂H₅, -COOC₃H₇, -CO-C₃H₇, -CO-CH(CH₃)₂

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Claims (4)

-45- Patentansprüche

1. Pyrono-Rifamycine der allgemeinen Formel

Me Me

MeO

Me 0

COR

in der R ein niederer Alkylrest, ein niederer Alkoxyrest oder die Hydroxygruppe ist, und deren 25-Desacetyl- und 16,17,18,19,28,29-Hexahydroderivate.

2. 3'-Acetyl-2'-pyrono JV*,J'-cj 4-desoxyrifamycin SV.

3. 3'-Carboxy-2'-pyrono ffc^_x |'-cj4-desoxyrifamycin SV.

4. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man 3-Formylrifamycin SV oder dessen 25-Desacetyl- oder 16,17,18,19, 28,29-Hexahydroderivat mit einer etwa äquimolekularen Menge einer Verbindung der allgemeinen Formel

COR

CH.

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umsetzt, in der R die oben angegebene Bedeutung hat und R₂ -COOH, -CN oder -COOR, ist, wobei R₃ einen aliphatischen geradkettigen Rest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen darstellt.

Therapeutische Zubereitung, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einer oder mehreren Verbindungen nach Anspruch 1 bis 3» und übliche Stoffe.

Für

Gruppo Lepetit S_op.A. Mailand / Italien

Dr. W. Beil

Rechtsanwalt