DE2301767A1 - 3-alkenylderivate von rifamycin sv und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents

Description

fECHTSAf

Α2Ί C- -■

!-'3M. WALTER BEIL "·-/. WOLFF

*.M -^vV-.i.,·-HOCHSI

12. Jan. 1373

iir. 13 327

Gruppo Lepetit S. p. k, Jailand/Italien

3-Alkenylderivate von Hifamycin SV und Verfahren zu

ihrer Herstellung

Gegenstand der Erfindung sind 3-Alkenylderivate von Rifamycin SV der allgemeinen Formel

Me '

HC

R¹O

MeO

CH=CR²-C-R Il

Me 0

in der R ein Wasserstoffatom, ein Alkyl- oder Arylnieder-alkylrest, R ein Wasserstoffatom oder der

2
Acetylrest, R ein Wasserstoffatom, ein niederer

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Alkylrest oder tert.-Butoxycarbonyl;°est, 2 Sauerstoff, die Imino-, eine substituierte Imino-, die Cxiaiino-, eine substituierte Oximino-, die Hydrazono- oder eine substituierte Hydrazonogruppe ist.

Die Ioaino- und substituierten Iminoderivate der allgemeinen Formel I stellen praktisch. Schiff'sehe Basen dar, die durch Umsetzung von Verbindungen der allgemeinen Formel I, in der X Sauerstoff ist, mit primären Aminen erhalten v/erden. Die Oxijiinoölerivate sind Eondensationsprodukte aus Verbindungen der allgemeinen Forjiel I, in der X Sauerstoff ist, mit-Hydroxylamin oder O-substituierten Eydrosylaminen. Die Ausdrücke Hydrazono- und substituierte Eydrazonogrui)pe beziehen sich auf Reaktionsprodukte aus Verbindungen der allgemeinen Formel I, in der X Sauerstoff ist, mit Hydrazin oder ü-substituierten Hydrazinen. Im letzteren Fall können die SuI-stituenten am Stickstoffatom auch einen iieterocyklischen Ring, z.B. einen Piperazin-, Üorpholin-,Piperidin-, Heptauethylenimin-, Octamethylenitain- oder einen 3»8-Diazabicyclo L5»2,1J octanring bilden.

Die Erfindung umfaßt auch die entsprechenden Eexahydrorifamycinverbindungen. Die Schlüsselverbindung für die Herstellung der obigen Substanzen ist ein 3-5Ora.7lrifamycin SV, das mit einem geeigneten AlkylidenphöspJioran oder Aralkylidenphosphoran unter Bedingungen umgesetzt wird, die als Wittig-Reaktion bekannt sind. Das nach-

Λ 2 fo]@nde Reaktionsschema, in dem R, R und R die oben angegebene . Bedeutung haben, veranschaulicht das Verfahren zur Herstellung der Carbony!verbindungen.

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lie

Me Me

II

OH

CH=CS^-C-R + ( C₁-H₁
Il ö

Für diese Umsetzung werden organische inerte Lösungsmittel verwendet, z.B. Tetrahydrofuran, Äthylacetat,
Dioxan, Benzol und Chloroforoi. Die Ylid Reaktionskomponenten erhalt nan aus Ealogenketonen und Triphenylphosphin nach dem von Ramirez u. ,.iitarb., J.Org.Cheoi. Bd.22, Z.41 ,. (1957) oder E. J. Bestman u. iviitarb.,
Chem.Ber. Bc³. 95, S. 1513 (19o2)beschriebenen Verfahren. Sin anderes geeignetes Verfahren zur Herstellung car Cirbony!verbindungen eier allgemeinen Formel II

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besteht in der Kondensation von 3-Forra.ylrif3.mycin £Y, seinem 25-Desacetyl-oder 16,17,18,19,28,29-Hexahydroderivat mit einem Aldehyd oder Keton der allgemeinen Formel

GH₂R²-GO-R

nach dem folgenden Schema:

HO

Me Me

CHO

+ CH₂R-CO-R

OH

Me Me

CH=CR-CO-R

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Die Umsetzung wird gewöhnlich in Gegenwart "basischer Katalysatoren, z.B. von Alkalihydroxiden, Aminen, Alkalialkylaten oder Alkalimetallacaiden durchgeführt. Sin "bevorzugtes Verfahren zur Durchführung der Kondensation wendet im wesentlichen die gleichen Reaktions-"bedingungen. an wie die Knoevenagel Kondensation (Org. Heactions 3d. 15, S. 204, John jViley 1967). In diesem ]?all ist der "basische Katalysator im allgemeinen Ammoniak oder ein Amin, wie Piperidin, Fyridin oder Diethylamin. Andere gewöhnlich verwendete Katalysatoren sind Ammonium- oder Alkalime.tallsalze mit organischen Säuren, wie Ammonium-, Kalium-oder Natriumacetat. Vorzugsweise wird die Umsetzung des 3-£^lormylrifamycin SV Derivats mit einem vorbestimmten Aldehyd oder Keton in Tetrahydrofuran als Lösungsmittel bei einer Temperatur von etwa 0 bis etwa 5° G durchgeführt. Als Katalysator wird eine Mischung aus Piperidin und Essigsäure im Verhältnis 5 : 1 verwendet.

Die Carbonylverbindungen der allgemeinen Formel II können nach herkömmlichem Verfahren mit der etwa einmolaren Menge eines ausgewählten primären Amins oder Hydroxyl-

oder-

amins/Hydrazins weiter umgesetzt werden. Diese Kondensationsreaktion wird im allgemeinen bei Raumtemperatur und unter Verwendung von Tetrahydrofuran als bevorzugtem Lösungsmittel durchgeführt. Die Endprodukte stellen gefärbte Feststoffe dar, die sich -beim Schmelzen zersetzen und sich leicht aus Äthylacetat oder anderen organischen Lösungsmittel], wie Meiiianol und .iltenol kristallisieren lassen. Sie sind gut löslich in Aceton, Tetrahydrofuran, Dioxan und Chloroform. Die erfindungsgemäßen Verbindungen besitzen starke antibakterielle Wirksamkeit, insbesondere gegen Streptococcus hemolyticus und Diplpcoccus fsneumoniae.

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•ν. b» > . .

In repräsentativen Untersuchungen wurde festgestellt, daß die kleinste Hemmkonzentration gegenüber diesen Mikroorganismen 0,002 bis 0,05AgAiI beträgt, wie aus der nachstehenden Tabelle 1 ersichtlich ist.

Ta b e 1 1 e 1

Kleinste Hemmkonzentr at ionen (aq/clL) in vitro

Verbindung des Beispiels 1 2 3_ 4 5 6

Staphylococcus aureus 0,1 0,1 0,02 0,01 0,2 0,01

Staphylococcus aureus 0,2 0,05 0,2 0,05 0,02 0,02 (mit 20% Rinderserum)

^S. aureus Tour. 0,1 0,1 0,05 0,02 0,1 , 0,02

Streptococcus hemolyticus 0,005 0,2 0,05 0,002 0,002 0,01

Streptococcus faecalis 0,5^ 1 0,1 0,1 0,5 0,01"

Diplocoocus -pneumoniae 0,005 0,05 0,002 0,002 0,,002 0,02

Proteus 100 50 50 50 100 100

E. coli 100 10 50 50 100 ' 100

Klebsiella pneumoniae 100 100 100 50 100 100

Pseud. aereata " 100 100 100 100 100 100

Myc. Tub. H₅₇Rv. 0,5 0,5 0,5 0,1 1 1

Die antimikrobielle Wirksamkeit ist mit einer geringen Toxiäität verbunden. Eine andere sehr wichtige Eigenschaft' der erfindungsgemäßen Verbindungen ist ihre Hemmwirkung auf DNS-Polymerasen, die für Lymphoblasten aus menschlichem leukämischen Blut charakteristisch sind-, und gegen typische Mucleotidyl-Transferasen

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(Polymerasen) von Viren, die von der normalen Zelle nicht versends'z werden. Aus Untersuchungen an repräsentativen Gliedern -von Virusgruppen ist Gekannt, dad sie als .ve sent liehen Teil ihrer Reproduktion in die J/irtsaelien Polymer as en tragen oder in ih®n erzeugen. So -~ibi: es Viren, ".vie z.B. Picomaviren oder Polioviren, die BiTS-abhän^ige RtiS-Polymerase erzeugen, wahrend andere Gruppen, .vie Leukaoiie-Sarkofa Viren eine RilS-abhän^ise DNS-Polymerase tragen. Die Gegenwart und die au.-srardaablieh -,vieiitige Solle der RlTS-abhängigen KTS-polymerase (Gegen-Transcriptase) bei Tumor bildenden Ξ-ίο-Viren wurde von B. Baltimore, Nature, Bd. 225, S. 1209 (1970) und von E.J.-.Teiiiin u. :.iitarb., Jaturs, 3d.. 226, S. 1211 (197C) entdeckt. Die kürzliche Satdeckung von RJS-abhang ig; era IMS-Po Iy- jierase Snzysi in HUS-'Iumorviren von Tierarten ,rarde auch von anderen Autoren bestätigt, wie 2.3. aus den nachfolgend aufgeführten Literaturstellen hervorgeht: Graenu. Llitarb., ¹¹I(Iechanism of carcino, eneses by 2H3 tuüior viruses, I. An EiTÄ-dependent DHA-poly.aerase in iurine sarcoma viruses" (Proc.Nat.Acad.Sci. USAjBd. 67, S.335-393j ^x97O)· - Spiegeliian u. liitarb., "Characterization of the products of HSA directed IMA-polymerases in oncogenic 3λΑ viruses" (Nature, London, £d. 227, S. 503? 197c). - Eatanaka u. Mitarb., "DlTA polymerase activity 8.ssociatad with RHA tumor viruses" (Proc. ITat. Acad.Sci. UBA, Bd. 67, S. 143, 1970). - Scolnick u. Mitarb., "BNA synthesis by RNA containing'tumor viruses" (Proc.Nat.Acad.Sci. USA, Bd. 67, S. 1034, 1970). Das Vorliegen von RHS-Viren in einigen Tumoren wird auch durch andere Fakten gestützt: Gegen-Transcriptase ivurde in Teilchen der'UiIch von Frauen gefunden, in deren Samilißii Brustkrebs aufgetreten v/ar und bei denen innerhalb der Familien geheiratet wurde (Scholn u. Mitarb., -iature, 3d. 251, S. 97, 1971), während Priori u. iaitarb.,

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(Nature New Biology, Bd. 232, S. 1b, 1971) aus Zellen der PHeucralflüssigkeit eines Kindes mit Lymphadenitis ein Gegen-iranscriptase enthaltendes, als BSP-1 bezeichnetes Virus isolierten und es erfolgreich auf Gewebekultüren züchteten.

Das Vorliegen von RMS-Eomologen bei menschlichem Brustkrebs zu Tumorvirus-EHB bei der Mammader Maus wurde von R. Axel u. Mitarb., (Nature, Bd. 235» £>· 52, 1972) durch Molekularhybridisationsversiiche demonstriert. Die Möglichkeit eines Virus beim menschlichen Brustkrebs wurde auch durch Slektronenmikroskopie iienschlicher Milch gestützt ( ff.H. Sarkar u. Mitarb.,_ Nature, Bd. 236, S. 103, 1972). Auf RNS gerichtete DNS-Polymerase ■.iiirksamkeit und Virus-;ähnliche Teilchen wurden auch aus menschlichen MiabdomstBsrkomzellen isoliert (ücAllister u.Mitarb., Ifature, NewBiol., Bd. 235, S. .5, 1972). Zur Zeit existieren keine sehr wirksamen Arzneimittel zur Behandlung von Virus erkrankungen, da die Stoffwechselerfordernisse für Viren und Zellen gleich sind. Der meistversprechende Weg zur Chemoiberapie von Viruserkrankungen ist die Entwicklung geeigneter Chemikalien, die sich in spezifischer Weise mit Viruspolymerasen oder mit von Viren transformierten Zelpolymerasen vereinigen, aber nicht mit den Polymerasen der Wiriizellen die die genetische Information der Viren kontrollieren. Spezifische Inhibitoren für Virus-oder durch Viren transformierte Zellenzyme und insbesondere Inhibitoren für von- "

Polymerasen/löJS-Tumorviren können eine bedeutende Rolle bei der Bereitstellung von Arzneimitteln zur Behandlung der Leukämie und anderer Krebserkrankungen spielen.

Die Hemmwirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen wurde an RNS-abhängiger DNS-Folymerase des Muridae-Sarkom Virus (endogen) und art. der DNS-abhängigen DNS-Polymerase

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."irksamkeit gereinigter Enzyme (i-oly c .i-uh.s Platte) untersucht, xiaii -.-/endete hierfür die von C. Gurgo α. .,itarb., Hature, ITe-v Bio logs'-, Bd. 229, ώ. 111, 1971) beschriebenen niethoden an. Die Jirkun^ der verschiedenen Arzneimittelkonzentrationen auf die Poly-aerase- ^irksamkeit wurde anschließend an die ^Ii-dTTP (tritiertes ThymindesoxyribosiOwtriphosphatEinverleibung in die unlösliche Fraktion bestimmt.

Ein typisches Beispiel für das experimentelle Verfahren ist nachfolgend beschrieben.

1) Isolierung des Virus und Reinigung der Viruspolymerase

Das Virus wurde ..vie zuvor beschrieben (Green u. Mitarb., Proc. Hat. Acad. Sei. USA, Bd. 57, 3. 3Ö5 - 393, 1970, HolrutrJida u. „litart)., Jature, Bd. 227, 3· 1026 - 1028, 197c) aus durch ;iurids.e-Sarko.auVirus veränderten 2attenzellen (^ioloiiey-Isolat) und aus durch iiuridae-Sarkom Virus veränderten ^äusezellen (Harvey-Isolat) isoliert und gereinigt. Die Viruspolyierase wurde c-urch Inkubation des gereinigten Virus mit 0,5 °/o γΓΡ-4-Ο (nonid-ät ?-40) in 0,1 molarem ITaCl, 0,01 molarem iris-Puffer (pH 7,6), 0,üC1 molarem i-lDT.£ v/ährend 5 Minuten bei Raumtemperatur und durch Zonenzentrifugation in von 15 auf 30 % ansteigender Saaherose in 10 mu Natriumphosphatpuffer (pH 7»^)> 2,5 mM MgCl^» 10 mivl Dithiothreit und 5 % Glyzerin während 24 Stunden bei 38 000 U^M in einem Spinco S./ 41 Rotor 20-40-fach gereinigt, pie Spitzenfraktionen der Jünzyrn-.virksamkeit (13 - 17) der 22 gesammelten Fraktionen wurden vereinigt und bei - 70° C in 30 % Glyzerin aufbewahrt.

DNS-Polymer as e Bestimmung

Die Enzyminkubation wurde eine Stunde bei 37° 0 in 100 id. eines Gemisches durchgeführt, das 40 mM

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iO -

Tris-Puffer (pH 8,0), 5 αώί Dithioth"3it, 30 ü NaOl, 2,5 r^vi ligOlp, 0,1 .raid dATP, dGUlP, dCiEF und 10^Oi •^K-dTTP (12 - 18 Ci/Millimol) enthielt, vergleiche Green u. jiätarb. in Proc. iTat. Acad. .Sei., USA, Bd. 67, S. 385 - 393 j 1970). 'Die Umsetzung /vurde durch die Zugabe von 150 lil 1n Perchlorsäure beendet. Als Träger wurde Kalbthymus-DJS (100 #g) augefügt. Das radioaktive DHS-Produlit »vurde wie in den beiden oben angegebenen Literaturstellen beschrieben aufgearbeitet. Die endogene BHS-abhängige DHS-Polyaerase /irksaskeit wurde nach der Zugabe von 0,01 % 1CP-4C zu dem gereinigten Virus zum Zeitpunkt des Versuchs gemessen. Die DrTS-Polymerase ■Wirksamkeit der gereinigten Viruspolyoierase _;/urde mit 2^/tg von Poly d (A-T) als Platte und ohne SP-40 gemessen.

Test zur Ermittlung der Hemmy/irkang von Rifamycin Derivaten

Rifamycin-Derivate wurden in Dimethylsulfoxid (DMSO) in einer Konzentration von 5 mg/ml gelöst und bei 4° C aufbewahrt. Die Hemmung der endogenen.SifS-abhängigen DiiS- ■ Polymerase 'Wirksamkeit wurde dadurch untersucht, daß man 2 jaX des in DMSO entsprechend verdünnten Derivats oder 2 uX DMSO (Kontrolle) zu dem Probengemisch gab, bevor man dieses dem aufgebrochenen Virus zufügte, das 15 t>is 30 itg Virusprotein enthielt. Die Enzyminkubation wurde 60 Minuten bei 37° G durchgeführt. Die Hemmung des gereinigten Enzyms wurde durch Vorinkubation von 2>1 des Derivats oder von DMSO mit 30^aI Enzym (1 bis 2^/cg Protein) während 10 Minuten bei 37° C untersucht. Dann wurden ^OyCiL Substratgemisch zugegeben und das Gemisch wurde weiter inkubiert und aufgearbeitet wie oben beschrieben.

In repräsentativen Versuchen verringerten die erfindungsgemäßen Verbindungen in einer Konzentration von 2 - 1CQ,Ag/ml

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7.

oder weniger die Einverleibung/ van E -dSiir auf weniger als 10 %, εΐε sie in den Kontrollversuchen festgestellt wurde. Sie demonstrieren damit eine klare Eeaa-•»virkung auf den Mechanismus der Garcinogenese durch 3jJS-Tumorviren nach den neuesten biochemischen Erkenntnissen.

Die Eeiiia.viriuing, von Gegen-iranscriptasen &urde auch durch Versuche an Polymerase aus iiuridae-Leukämie Viren bestätigt. Muridae-Leukämie Virus 3US~abhängige DIfS-Polyoierase ivurde v/le von Gallo u. i.iitarb. in Hature, Hew Biology, 3d. 2$2, S. 14-1, (1971) beschrieben aus jiit Triton Z ΊΟΟ aufgebrochenen Viren hergestellt. Viren der beiden Irten Haus eher und kioloney «iirurden zuvor durch Bindung im 1,16 g/ml Bereich eines Sacharose-Dichtsgradienten nach anfänglicher Zentrixugation bei geringer Geschvindlgkeit ^ur Entfernung von Zellbruchstücken und Dämpfen auf 60 °/o Sacharose über 20 % Sacharose gereinigt. Die Sndkonzentration des Viruspräparates betrug 10 Teilchen/ml. Als Platte wurde endogene 70 SH.ii.S.. vsrr/endet. Es wurde festgestellt, daß Konzentrationen von 50_/^g/oal oder weniger das Enzym wirksam hemmen. Hh α liehe Ergebnisse wurden bei Verwendung von Tuaior-Sellpolymerasen menschlichen Ursprungs erhalten. In diesem Fall wurde die Hemaiwirkung auch an PoIyaierasen noraaler Zellen untersucht, um einen selektiven Sffekt zu ciseakterisieren. Repräsentative Rifamycin Derivate öer allgemeinen formel I «jurden auf ihre Wirkung auf 2 gereinigte DiTS-Polymerasen untersucht, die aus (I) menschlichen normalen (üiA-stimulierten) Blutlymphocyten, (TI) I^ymphoolastzellen (von einem normalen Spender) und' (III) menschlichen leukämischen Blutlymphoblasten isoliert worden *jaren. Es v/urden synthetische und/oder native Platten verwendet. Ein typisches Beispiel für das experimentelle Verfahren

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Ill

— Ί 2 ' ■ⁱ

ist nachfolgend beschrieben:
Menschliche Blutlymphoblasten.

Leukämische Lymphoblasten wurden aus dem peripheren Blut von Patienten mit akuter lymphoeytischer Leukämie (ALL) durch Leukophorese isoliert; Die Zellen wurden gewaschen und die Erythrocyten durch hypotonische Auflösung entfernt..Normale Lymphocyten wurden aus dem peripheren Blut von gesunden Spendern nach der Entfernung der Granulocyten durch Hylon-Säulenchromatographie erhalten. Sie wurden wie zuvor beschrieben (Gallo u. Mitarb., Nature Bd. 228, S. 927, 1970; Gallo u. Mitarb., Science, Bd. 165, S. 400, 1968) 72 Stunden mit Phytohämagglutinin (PHA) behandelt, um ihre DHS-Polymerase Wirksamkeit so weit wie möglich zu verstärken, «liegen des Problems, ausreichende Mengen dieser Zellen zu erhalten, wurde jedoch zur Gewinnung weniger gereinigter DNS-Polymerasen für einige der anfänglichen UnterBuchungen zur Gewinnung eines Überblicks eine menschliche "normale" Gewebe -Zellkultur (1788) verwendet. Die interessierenden Verbindungen wurden dann genauer an den stärker gereinigten -Enzymen aus den normalen und leukämisehen Blutlymphocyten untersucht. Die Gewebe-Zellkulturen wurden von der Associated Biomedic Systems, Inc. erhalten.

DiTS-Polymerase Präparate

DNS-Zellpolymerasen wurden aus normalen Blut (PHA-stimulierten)-lymphocyten,leukämischen Blutlymphocyten und 1788 Lymphoidzeilen durch Homogenisierung in hypertonischer Pufferlösung und nachfolgende. Behandlung mit Triton X 100 und/oder starke Salzextraktion des extralysosomalen Pellets extrahiert und gereinigt. Nach der Differentialzentrifugation wurdeα die Zellextrakte durch Säulenchromatographie über dJ\AÄ -Cellulose,

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- 1

cellulose und Sephadex G 200 reiter gerei-

Untersuchung der DNS-Polymerase.

Die Untersuchung c.er DHS-Polymerase wurde in einem lündvoluaien von 10O₇^L durchgeführt. Das untersuchte Gemisch enthielt 50 mLi Tris-HCl Puffer von pH 8,3; 6,0 "i^T !...agnesiumacetat; 8,0 mM Dithiothreit und 60 JiM DTaCl. Die Einstellung, des pH 7/ertes wurde nach der Zugabe der zuvor in Dirnethylsulfoxid (DI»iSO) gelösten Inhibitoren durchgeführt. Die Sndkonzentration an DHSO betrug 0,5 % und alle Eontrollproben enthielten diese Menge an DMSO. Im Versuch wurde eine Enzymkonzentration verwendet, welche die Einverleibung von etwa 1,0 pilol/Stunde katalysiert. Das Enzym war in den meisten Fällen mit dem Inhibitor 5 Minuten vorinkubiert worden. Die Umsetzung wurde dann durch die Zugabe von entweder synthetischer DiTS (Poly d(AT) Miles Lab.) und DIiS.RHS Hybrid (Oligo dT.poly rA), 5/tg/ml, oder nativen Ursprungs: aktivierte Salm Sperma-DHS, 50/«g/ml, und endogene 70S Virus~RHS; 10^Ci (^H-Methyl)-TTP (New England STuclear, 18.6 mCi/fciviol, lyophilisiert und erneut gelöst in 0^01 M HCl unmittelbar vor der Anwendung) und dATP (8 χ 10 JUS, mit synthetischer Substanz) oder allen drei Desoxynucleosid-triphosphaten. (8 χ 10""⁵M mit RHS oder DNS)durchgeführt. In einigen Fällen wurde das Enzym nicht mit dem Inhibitor vorinkubiert. In diesen Fällen wurden die Reaktionen durch die Zugabe von Enzym zu dem vollständigen Gemisch, einschließlich des Inhibitors eingeleitet. Zu Beginn der Inkubation und nach 30 Minuten wurden Proben entnommen, die Vorgänge in ihnen durch die Zugabe von 2 ml 0,08 M Hatriumpyrophosphat unterbrochen und in 12,5 %-ige kalte Trichloressigsäure (TCS) mit Hefe-RHS(4-00/i.g) als irager gefällt. Die Produkte wurden auf einem Milli-

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porenfliter gesaiaaielt, gründlich mit 5 % '.Trichloressigsäure und 1 al DüSO-iLthano 1-0,1 üolaremJaCl (0,5:70:29t5) gewaschen, getrocknet und in 2 al· BBS₃, (Beckman ) und 10 ml Liquifluor (Hew England luclear) in einem Packard i'lässigkeit-Szintillationszähler gezählt.

Bs wurde gefunden, da3 Konzentrationen von 5 20/4g/ml bei synthetischem DlfS-Templat eine 50 ?o-ige Hemmung der Leukämie-Polynierase bewirken. Bei synthetischem RFS-Templat' (Poly rA.rU) war die Reaktion sogar empfindlicher.

.Repräsentative Untersuchungen, die mit nativem Templat an Polymerase von normalen und Tumorzellen durchgeführt wurden, ergaben eine höhere Empfindlichkeit der Tuinorenzyme gegenüber den untersuchten Verbindungen.

Andere biologische Eigenschaften der neuen Rifamycin Derivate sind die Hemmung der iOkusbildung bei Zellen der Maus, der Ratte und des Menschen durch den Holoney- und Kirsten-Stamm des Muridae-Sarkom Virus; die selektive Hemmung der Viruserzeugung durch bereits veränderte Maus- und menschliche Zellen; die Auffindung sich zurückbildender Zellen unter Verwendung der durch Muridae-Sarkom Viren veränderten nicht-produzierenden Maus- und Rattenzellsysteme. Die Eydrazonverbindungen der Erfindung haben sich außerdem als selektiv toxisch für durch Viren veränderte Zellen von Mäusen, Ratten und Menschen erwiesen, wenn sie auf ihre Kolonie-bildende Fähigkeit untersucht v/urden.

In Versuchen zur Ermittlung der ΐ/irkung der erfindungsgemäßen Verbindungen, die Fokusbildung durch Moloney — Sarkom-Virus bei BALB/3T3 Gewebeiulturen zu hemmen, wird aas folgende Verfahren angewandt.

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J3ALB/3T3 Zellkulturen werden in 250 ml Kunststofff laschen in einem facias turns medium gesücntet, das aus Eagle's minimalem wesentlichen Medium mit 10 % fötalem Rinderserum besteht, wlit einem Coulter Zähler werden nach der Suspendierung der Zellen mit Trypsin-Versen und dem Verdünnen mit tfachstumsmedi-UOi Zellzählungen durchgeführt. Als Tumorhomogenat ./ird Moloney-Sarkom-Yirus verwendet. I.Ian unterwirft es viermal in einem Mausembryo der Schweizer Rasse mit hoher Passagezahl einer Zellpassage und untersucht die Fokus bildenden Einheiten in. BALB/3T3 Zellen. Bei der Durchführung der Untersuchungen v/ird eine Modifizierung der von Hartley und Sowe, Proc. Hat. Acad. Sei. Bc. Zö, 3. 780 (1966) beschriebenen liethode angewandt. Im vorliegenden Fall v/erden flaschen mit 1-2 χ 10° Zellen in 25 ml .iachstumsmedium geimpft und 24 Stunden bei 37 G inkubiert. ITach der Entfernung der Flüssigkeiten wird Virus mit einer vorbestimmten Anzahl von Fokus bildenden Einheiten in 0,5 ml ,Vaehstumsmedium eingeführt. Dann IaBt man es 90 Minuten bei 37 C auf der Monoschicht der Zellen adsorbieren. ITach dieser Adsorbtionsperiode wird eine vorbestimmte Menge, gewöhnlich etwa bis lO^Ag/ml einer 2ifamycinalkenylverbindung (zuvor in einer Konzentration von 1 mg/ml in Dirnethylsulfoxid gelöst) in 25 ml Wachstumsmedium zugefügt und die Kulturen werden in den Inkubator zurückgegeben. Als Kontrolle wird Dirne thylsulf oxid allein im ;Vachstumsmedium zu einer getrennten Kultur gegeben. liach 3-tägiger Inkubation sind die Kulturen flüssigverändert und die Foki veränderter Zellen werden am Tag 7 gezählt.

Auf die gleiche iffeise wird Bläschenstomatitis Virus, äe\-i Jersey Eerotyp untersucht. Methoden zur Vermehrung

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und Untersuchung, dieses Virus wurden von Hackett und Mitarb., in Virology, Bd. 31, S. 114 (196?) beschrieben.

Diese Eigenschaften zeigen an, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen Heminwirkung auf durch Viren hervorgerufene Tumoren bei Tieren haben.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

3-(3-0xo-1-butenyl)-rifamycin SV

Zu einer Lösung von 10 g Acetonylidentriphenylphosphoran in 600 ml Tetrahydrofuran werden 7»2 g 3-SOrmylrifamycin SV gegeben und das Gemisch wird 3 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Einengen auf ein kleines Volumen werden 300 ml Ithylacetat zugefügt und die organische Lösung wird mit saurem Wasser (pH=2) und dann mit Wasser gewaschen. Der nach dem Eindampfen der getrockneten organischen Lösung erhaltene Rückstand wird zweimal aus iithylacetat kristallisiert. Ausbeute 60 %.'Der erhaltene Feststoff hat keinen gutdefinierten Schmelzpunkt. Er zersetzt sich langsam zwischen •200 und 290° G.

Die wesentlichsten- Absorptionsbanden im sichtbaren und UV-Bereich sind:

max OyO 485 340 262

160,5 291,5 386,5

Analyse:

ber. für C₄₁H₅₁M)₁₅ C 64,30; H 6,71; Ή 1,83

gef. C 63',62; H 6,61; Έ 1,30

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Beispiel 2

3-(3-Phenylhydrazono-1-butenyl)-rifamycin SV

Zu einer Lösung von 1,5 g der Verbindung des vorstehenden Beispiels in 50 ml Tetrahydrofuran werden bei Raumtemperatur und unter Rühren 220 mg Phenylhydrazin gegeben. Nach zwei Stunden wird der ausgefällte feststoff auf einem !Filter gesammelt und aus ithylacetat kristallisiert. Ausbeute 60 %. Der Feststoff zersetzt sich beim Erhitzen auf über 210° G.

max (m/u.) 475 360

E¹ °^/o 181,9 379,9
1 cm

Analyse:

ber. für C₄₇H₅₇N₅O₁₂ G 65,95; H 6,71; N 4,91

gef. ' 0 65,40; H 6,58; N 4,35

Beispiel 3

3-(3-Phenäthyloximino-1-butenyl)-rifamycin SV

Diese Verbindung wird nach dem Verfahren des vorstehenden Beispiels unter Verwendung von O-Phenäthylhydroxylamin anstelle von Hydrazin hergestellt. Ausbeute 87 %. F = 168 - 173° C (Zersetzung).

A max (m/v) 478 337 262

E^{1 %} 136,5 339,4 349,5

Analyse:

Der, f^jlr C._ΟΕ,,.^₀O_Λ7 C 66,50; H 6,fcJ; N 3,16

gef. C 65,23; K 6,3^; F 3,28

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Beispiel 4

3-(3-Benzyloximino-l-butenyl)-rifamycin SV

j Zu einer Lösung von 800 mg der Verbindung des Bei- ! spiels 1 in 40 ml Tetrahydrofuran werden 160 mg ΟΙ Benzylhydroxylamin Hydrochlorid und 2 ml Pyridin ge- ; geben. Nach 60 Minuten wird die Lösung zur Trockene eingeengt und der Rückstand in i-Lthylacetat gelöst. Die organische Lösung wird mit Wasser gewaschen und dann im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird aus Äthylacetat kristallisiert und schmilzt unter Zersetzung bei 183 - 190° C. Ausbeute 60 %.

Λ max (mA ) 470 336 2^8 Schulter bei

E¹ ^ 154,8 338 391

1 cm

Analyse:

ber. für C₄₈H₅₈N₂O₁₃ G 66,19; H 6,71; N" 3,22

gef. G 65,08; H 6,61; H 2,67

Beispiel 5

3- Z"3-(4-Metnyl-l-piperazinyl)-imino-l-butenyiy -j rifamycin SV

Diese Verbindung wird nach dem Verfahren des Beispiels 2 unter Verwendung von 1-Amino-4-methylpiperazin anstelle von Phenylhydrazin hergestellt. Ausbeute 65 %\ 1 = 160° G (Zersetzung).

max (m/O 480 338 261 271

351,6 369,1 295,8 136,8

^0/o

1 cm

309830/1184

Analyse:

ber. für G₄₆H₆₂W₄O₁₂ G 64,02; H 7>24; N 5,49

gef. G 64,12; H 7,24; N 5,78

Beispiel 6

3-(ß-Formyl-vinyl)-rifamycin SV

1 3 3-*£Ormylrifaaiycin SV wird in 70 ml Tetrahydrofuran suspendiert und nach dem Kühlen in einem Eisbad auf 0-5 G wird eine Mischung aus 1 ml Piperidin und 0,2 ml Essigsäure zugefügt. Nach der Zugabe von 0,2 ml Acetaldehyd v/ird das Gemisch 2 Stunden gerührt und dann im Vakuum, auf ein kleines Volumen eingeengt. Der !Rückstand wird mit Äthylacetat verdünnt und die Lösung mit saurem Wasser gewaschen. Die organische Phase wird eingedampft und der Rückstand unter Verwendung von Chloroform-Aceton 1 : 1 über 100 g auf pE 6 gepuffertes liieselsäuregel chromatographiert. Ausbeute 250 mg der oben angegebenen Verbindung. Sie schmilzt unter Zersetzung über 200° G.

^A max (3lä, ) 500 3S5

176 410

1 cm
Analyse:

ber. für G₄₀Ii₄₉ITO₁₃ G S3,90; H 6,57; H 1,86 gef. G 63,46; H 6,68; Ή 1,77

Beispiel 7

3- /*3-(4-Hethyl-l-piperazinyl)-imino-l-propenyl7-rifamycin SV Diese Verbindung wird aus 3(ß-IOrmyl-vinyl)-rifamycin SV

309830/1184

und 1-Aaiino—4-methylpiperazin nach, dem "Verfahren des Beispiels 2 hergestellt. Sie schmilzt unter Zersetzung

260

über 200 C.	)	485	384
/^max (mA-		164	426
E1 °/o
1 cm
Analyse:	,H62	N4O12	C
ber. für C^, r			C
gef.

C 63,66; H 7,12; Ή 6,60 C 64,60; K 6,64; H 5,91

■p,

Beispiel 8

3- / 3-0xo-2-(tert.-butoxycarbonyl)-l-but3iiyl J -rifamycin SV

Diese Verbindung erhält man durch Umsetzung von 3-5Ormylrifaraycin SV und tert .-Butylacetoacetat na.ch dem Verfahren des Beispiels 6. Sie schmilzt bei 140 - 145° C.

(m/O 475 370 280

90,4 101,5 511,3

1 cm

Analyse: " . "

ber. für C₄₆H₅₉IO₁₅ C 63,80; H 6,87; N 1,62 gef. . C 63,91; H 6,90; tf 1,72

In gleicher //eise werden Rifamycine der allgemeinen Formel I und ihre 25-Desacetyl- und He:;;:sliydro-Derivate

hergestellt, in denen S, H und X die nachstehend angegebenen Bedeutungen haben:

309830/ 1 1 84

'N-NH-

NO.

=N-N NH

=N-N

CII

-N-NH-(CH^)₃-C₆H₅

-N-N(C₃H₇)₂

=N-NH-

-NO-

CH.

CIL

»N-NHCH, "N-NH-CH -CH OH

m 2t

309830/ 1 1 84

CH.

-CH.

CH CH.

N-NH-CH

CH,

=N-NH·

CH.

X ^>vy.SO CHF 2

CH.

SO₂CH₃

CH,

CH, CIL

^C2»5

■^C2"S

=N-NH.

309830/1

Vao.

NO.

-1.

H H

=Ν-ΝΗγ \

•^C2^H5

H H H =N~NH-CH -CH=CH

Jt Λ*

=N-NH-CH-CH=CH-C₆H

=N-N. N

CH

-N-NIT N-CH-C₆H

CH.

C₂H₅

•^C ₂ ^H5

H H H H H

=NO-geranyl -N-O(CH₂)3-

=N-NH-C H -N-N

NO.

NO.

(CH₂)₄-CH₃

309830/ 1184

H =N-OH

-N-O-C₂H₅ =N-0-CH -CH -Q-J?

-(CH₂)

/^CH3

^CH

=N-HC

^C6^H5

=N-N

^C6"₅

=N-NH

COOH

=N-0-CH -CH.

-^C2^H5

=N-N'

.CH,

CH.

H =0

30 9 8 30/1184

.CH-C-CH CH

-^C3^U7

-^C3^H7

=N-CH -

CO-NH

-^C3^H7

=N-N

⁰W₅

C3	H7	CK3
C3	"7	?H3
CH		2-?-CH3
CH

-N-O-CH₂-C₆H₅ =N-O-CH -CH=CH

=N-N

f"3 .CH₂-C-CH₃

CH.

=N-N N-

CH.

II -N-O-(CH )

309830/118 A ^{2 2}

H H

H H

=0

=N-NH,

=N-N

/^CH3

=N-NH-

CH, N

H H

-N-O-C₂H₅

=N-OH

=N-O-CH -CH -COOH

2 i

-CH.

-CH.

=0

=N-N

-CH.

^=N-N. NH

-CH,

309830/1

■^C3"7

-CH.

-C H.

-NO.

-CH.

-CH,

-CH.

-^C3^H7

=N-O-CH -C^SCH

=N-O-CH-COOH CH(CH₃)₂

■^C3^H7 CH
I 3 7

=N-N-C,H_r 6 5

■^C3^H7 =N-N

•^C3^H7 =N-O-CH -CH -1

■^Λ^ί =0

(CH ) -C H_£

-C H_ =N-NH-CH -CH -N

7 δ i

^C2^H5

■^C3^H7

=N-N \

-CH₃ =0

309830/1184

-CH.

N-NHCH -CH -Js 2

-CH.

CH.

=n-n

CH.

-CH.

=N-O-CH -CH- COOH

-CH.

-CH.

-CH.

CH

3 CH

^s. •

^-C-CH,

CH/

CH.

^CH

. ^CH3

-CH.

CH.

=N-N

CH.

-CH.

30 9 830/1184

Claims (2)

1. Γ ä f ϊ a I A ί S P R J G H J

   3-Alkenylderivate von Rifamycin £Y der allgemeinen Formel

   HO

   ie O

   Me Me

   OH

   CH = CR" -C-R

   Me O

   in der R ein Wasserstoffatom, ein Alkyl- oder ein Aryl-nieder-alkylrest, R ein Wasserstoffatom oder

   der Acetylrest, R ein //assers t of fatoni, ein niederer Alkylrest oder der tert.-Butoxycarbonylrest und X Sauerstoff, die Imino-, eine substituierte Imino-, die Oxiaiino-, eine substituierte Oximino-, die Hydrazono- oder eine substituierte Hydrazonogruppe ist, und deren 16,17,18,19,28,29-Hexahydroderivate.
2. 2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach. Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man 3-Formylrifamycin SV oder sein 25-Desacetyl- oder 16,17»18₅ 19i28,29-Hexahydroverivat mit einer Carbony!verbindung der allgemeinen Formel

   Z - CR² -CO-R umsetzt, in der Z«Ho oder (Cg

   ist und E und R

   309830/1184

   23Q¹767 - I -

   die oben angegebene Bedeutung, haben, und gegebenenfalls die erhaltenen Oarbonylderivate mit primiren Aminen, Kydrazinen oder Eydroxylaaiiiien .vii

   3· Therapeutische Zubereitung, dadurch ^ekennseichnet, daß sie eine oder mehrere Verbindungen nach Anspruch 1 und übliche Substanzen enthält.

   Für

   Gruppo Lepetit S.p.A. Mai1and/xtalien

   Rech.tsan-.valt

   309830/1184