DE2326698A1 - 3-formylrifamycinazine - Google Patents

3-formylrifamycinazine

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DE2326698A1
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divalent
aliphatic
carbon atoms
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rifa
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DE2326698A
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Renato Cricchio
Giancarlo Lancini
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Lepetit SpA
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  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
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Description

RECHTSANWÄLTE
DR. JUR. DIFL-CHEM. WALTER BEIi O/
ALFRED HOEPPENER *»·
■DR. JUR. DiPL-CMEM. H.-J. WOLFF
DR. JUR. HANS CHR. BEJL
623 FRANKFURTAM MAIN-HOCHST
ADELONSTRASSE S8
Unsere Hr. 18 606
Gruppo Lepetit S.p.A. Mailand, Italien
3-Formylrifamycinazine
Die vorliegende Erfindung betrifft Rifamycin SV-Derivate. Insbesondere betrifft die Erfindung Azin- und Bisazin-Derivate des 3-Formylrifamycin SV der Formel I und die entsprechenden 25-'Desacetyl- und 16,17,18,19,28 und 29-Hexahydroderivate:
RLfa-CH=H-A-N=CH-Rifa
(D
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worin Rifa = ein Rifamicinrest der folgenden Formel ist
Me
MecOO
Me
Ke ο
und A = 1) eine direkte Bindung zwischen den beiden Stickstoff atomen oder
2) eine -N-y-N- Gruppe bedeutet, I I
worin y = eine -CO-, -CNH-, -CS-, -SO2-J eine divalente, allphatische, cycloaliphatische, aromatische, araliphatische oder heterocyclische Gruppe ist; und R2 und R^ = jeweils Wasserstoff oder einen niederen Alkylrest oder zusammengenommen eine aliphatische divalente Kette mit 1 bis l\ Kohlenstoffatomen, welche die zwei Endstickstoffatome verbinden, bedeuten, oder 3) eine divalente Gruppe -N=C-X-C=N-
i !
ist,
worin X = eine direkte Bindung zwischen den zwei Kohlenstoffatomen, eine divalente aliphatische, cycloaliphatische, aromatische oder heterocyclische Gruppe ist; und R und R, = jeweils -Wasserstoff, einen Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl- oder heterocyclischen Rest oder zusammengenommen eine aliphatische Kette mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, welche die zwei Endkohlenstoffatome verbinden, bedeuten.
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In der Beschreibung und den Ansprüchen werden .unter "divalentem Alkylrest" Alkylenreste mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen verstanden. Diese Reste werden zweckmäßig durch gerade oder verzweigte Kohlenstoffketten gebildet und können ebenfalls durch Hydroxy-, Nitro- und Carboxygruppen substituiert sein. Diese Kohlenstoffketten können weiterhin eine oder mehrere Doppelbindungen enthalten oder als zwei KohlenstoffSegmente vorliegen, die -durch die Reste -0-, -S-, -NH- und -SOp·=^ verbunden sind,, Unter "cycloaliphatischen divalenten Resten" werden Gruppen verstanden, die aus cycloaliphatischen Ringen mit 3 bis 8 Ringgliedern erhalten werden. Unter "aromatischen divalenten Resten" werden -Phenylen-, Biphenylen-, Naphthylen-Gruppen und dergleichen verstanden. Unter diesen Begriff fallen auch 6ruppens die aus zwei Phenylenresten, die durch -S-, -0-s -NH-, -SOg-, -CH=CH- oder einen Alkylenrest mit 1 bis Ai- Kohlenstoffatomen verbunden sind, bestehen. Unter "divalenten araliphatischen Resten" werden im wesentlichen Xylylenreste verstanden. Typische Beispiele dieser Reste sind m-Phenylendimethylen und p-Phenylendimethylen. Die "divalenten heterocyclischen Reste" werden aus ein- oder zweikernigen Systemen mit· 5 his 6 Ringgliedern erhalten» Diese Systeme können ein oder mehrere Heteroatome, wie N, S und 0, enthalten. Auch werden unter diesem Begriff divalente Reste verstanden, die aus Systemen gebildet sind, in denen zwei heterocyclische Gruppen durch eine einfache Bindung, beispüsweise Bipyridin und Bithiazol, oder durch divalente Reste, wie -0-, -S-, -CH=CH-, -NH- und niedere Alkylenreste mit 1 bis i+ Kohlenstoffatomen miteinander verbunden sind. Die aromatischen und/oder heterocyclischen Einheiten der erfindurtgsgemäßen Ver-. b'indungen können Substituenten, beispielsweise niedere Alkyl-, Halogen-, Nitro-, Alkoxy-, Hydroxy-, Methylendioxy-, Cyan-, Sulfo-, Carboxy- oder Trifluorinethyl-Gruppen enthalten. Ein allgemeines Verfahren zur Herateilung der erfindungsgemäßen Verbindungen besteht darin, daß man 3-Formylrifamycin SV oder dessen 25-Desacetyl- oder 16,17,18,19,28,29-Hexahydroderivat in einem
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inerten organischen Lösungsmittel, beispielsweise einem niederen aliphatischen Alkanol, Tetrahydrofuran oder Dioxan mit einem Hydrazinderivat der Formel H2N-A-NH2 nach dem folgenden Reaktionsschema umsetzt:
CHO+H N-A-NH
Ι» Λ
Rifa-CH=N-A-N=CH-Rifa
worin. Rifa -und A = die oben angegebene Bedeutung haben. Obwohl theoretisch je Mol Hydrazinverbindung 2 Mol des Rifamycin-Derivats bei der Reaktion erforderlich sind,, kann in der Praxis jede Komponente im Überschuß eingesetzt werden, ohne daß dabei die Herstellung des gewünschten Produkts beeinträchtigt wird. Jedoch ist ein großer Überschuß des Hydrazinderivats über das Rifamycinderivat nicht vorteilhaft, da anstelle des Azinderivats das Monohydrazon des Rifamycins gebildet v/erden kann. In Abhängigkeit vom Volumen des Hydrazinderivats kann die Reaktionstemperatur etwa zwischen Raumtemperatur und dem Siedepunkt des Lösungsmittels liegen.
Die Reaktionszeit kann von etwa einer Stunde bis zu einigen Tagen b'etragen. Sie ist von der Temperatur des verwendeten Lösungsmittels
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und der Reaktionsfähigkeit des Hydrazinderivate abhängig»
Im allgemeinen begünstigt eine längere Reaktionszeit die Umwandlung der zunächst entstandenen Monohydrazone zu den gewünschten Azinen. Die neuen Verbindungen sind farbige. Feststoffe, die in den üblichen organischen Lösungsmitteln, beispMsweise niederen Alkanolen, Äthylacetat,, Dioxan, Tetrahydrofuran, Benzol und chlorierten Kohlenwasserstoffen umkristallisiert werden können.
Ihre Löslichkeit in den organischen Lösungsmitteln ist offensichtlich vom Typ und der Sperrigkeit der unterschiedlichen R-, E1- und X-Substituenten abhängig. Wenn Säuregruppen zugegen sind, sind die Verbindungen ebenfalls als Alkalisalze in Wasser löslich.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind gegen grampositive und gramnegative Bakterien bemerkenswert wirksam. Insbesondere isfc diese neue Gruppe von Verbindungen besonders gegen Staphylococcus aureus-Stämme v/irksam. In diesem Falle beträgt die Mindesthemmkonzentration etwa 0,001 bis etwa 0,05/ug/ccm. Bei einigen repräsentativen Versuchen an Mäusen hemmte die Verbindung des Beispiels 2 bei einer Dosis von etwa 1 mg/kg bis etwa 5 mg/kg (subkutan) sehr wirksam die experimentelle Infektion durch Staphylococcus aureus. In anderen Versuchen erwiesen, sich repräsentative erfindungsgemäße' Verbindungen bei einer Dosis von etwa 1 bis 5yug/ccm auch gegen Staphylococcus aureus Tour-Stämme wirksam, die gegen andere, üblicherweise therapeutisch verwendet e; Rifamycine resistent sind. Die Toxizität der neuen Verbindungen ist sehr gering und liegt bei etwa 250 bis etwa 1500 mg/ kg (intravenös).
Eine weitere sehr wichtige Eigenschaft der erfindungsgemäßen Verbindungen ist ihre Hemmwirkung auf DNS-Polymerasen, die für
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O a ig « » ρ a @
f , j £ υ υ ν) Q
Lymphoblasten aus menschlichem leukämischen Blut charakteristisch sind, und gegen typische Nucleotidyl-Transferasen (Polymerasen) von Viren,'die von der normalen Zelle nicht verwendet werden können. Aus Untersuchungen an repräsentativen Gliedern von Virusgruppen ist bekannt, daß sie als wesentlichen Teil ihrer Reproduktion Polymerasen in die Wirtszellen tragen oder in ihnen erzeugen. So gibt es Viren, wie ζ »Β«, Picornaviren oder Polioviren? die RITS-abhängige RiIS-Polymerase erzeugen, während andere Gruppen, wie z.B. Leukämie-Sarkom-Viren eine RNS-abhängige DNS-PoIy- merase tragen» Die Gegenwart und die außerordentlich wichtige Rolle der RNS-abhängigen DNS-Polymerase bei Tumor bildenden RMS-Viren wurde von D. Baltimore, Nature, Bd. 226, S. 1209 (1970) und von H.M. Temin u. Mitarb., Nature, Bd. 226, S. 1211" (1970) entdeckt.
Die kürzliche Entdeckung von RNS-abhängigem DNS-Polymerase-Enzym in RITS-Tumorviren in Tierarten wurde auch von anderen Autoren bestätigt, wie z.B. aus den nachstehend aufgeführten Literatursteilen hervorgeht:
Green u. Mitarb., "Mechanism of carcinogenesis by RNA tumor viruses. An RNA-dependent DNA-Polymerase in murine sarcoma viruses" (Proc. Nat. Acad. Sei., USA, Bd. 67, S. 385-393 (197O)).
Spiegelman u. Mitarb., "Characterization of the products of RiIA directed DNA-polymerase in oncogenic RNA viruses" (Nature, London, Bd. Z27, S. 563 (197O)).
Hatanaka u. Mitarb., "DNA polymerase activity associated with RNA tumor viruses" (Proc. Nat. Acad. Sei. USA, Bd. 67, S. 143 (197O)).
Scolnick u. Mitarb., "DNA synthesis by RNA containing tumor viruses" (Proc. Nat. Acad. Sei. USA, Bd. 67, S. 1034 (1970)).
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^ <3 ^ e e q a
Das Vorliegen von RNS-Viren in einigen Tumoren wird auch durch andere Fakten bestätigte reverse Transcriptase wurde in Teilchen der Milch von Frauen mit bekannter Brustkrebsanamnese und von solchen Frauen, in deren Familie Brustkrebs aufgetreten war, gefunden (Scholn u'. Mitarb., Nature, Bd, 231 , S. 97 (197D)9 während Priori u. Mitarb. (Nature, New Biology, Bd» 232, S„ 16 (1971)) ein als ESP-1 bezeichnetes, reverse Transcriptase enthaltendes Virus aus Zellen der Pleuralflüssigkeit eines Kindes mit Lymphom isolierten und es erfolgreich auf Gewebekulturen züchteten. Von -R. Axel und Mitarb,, (Nature/ Bd0 235, S. 32 (1972)) und T.W. Reid und Mitarb., (Biochem. Biophys0 Res. Comm., Bd0 ZF6, S. 383 (1972)) wurde die Anwesenheit von RITS-abhängigen DNS-Polymerasen in einigen Typen -von Menschentumoren nachgewiesen.
Zur Zelt existieren keine sehr wirksamen Arzneimittel zur Behandlung von Viruserkrankungenj da die Stoffwechselerfordernisse für Viren und Zellen gleich sind» Der meistversprechende V/eg zur Chemotherapie von Virus erkrankungen ist die Entwicklung geeigneter Chemikalien, die sich in spezifischer V/eise mit Viruspolymerasen oder mit von Viren transformierten Zeilpolymerasen^aber nicht mit den Polymerasen der Wirtszellen, die die genetische Information der Viren kontrollieren, vereinigen» Insbesondere können Inhibitoren von RES-Tumorvirenpolymerasen bei der Synthese von Medikamenten für di'e Leukämie= und andere Krebs-Therapie eine bedeutende Rolle spielen„ Die Hemmwirkung der erfindüngsgemäßen Verbindungen wurde an RNS=abhängiger. DITS-Polymerase von Viren aus endogenen Muridae-Sarkom-Viren und an der DNS-abhängigen DNS-Polymerasewirksamkeit gereinigter Enzyme bestimmt. Die Hemmwirkung wurde nach dem Verfahren von C. Gurgo und Mitarb., Nature, New Biology, Bd. 229S S, 111 (1971) bestimmt. Die Wirkung der verschiedenen Arzneimittelkonzentrationen auf die Polymerasewirksamkeit wurde anschließend an die ^H-dTTP (tritiertes Thymindesoxyribosidtriphosphat)-Einverleibung in die
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unlösliche Fraktion bestimmt. Ein typisches Beispiel für das experimentelle Verfahren ist nachstehend beschrieben.
Das Virus wurde wie zuvor beschrieben (Green u. Mitarb», Proc. Nat» Acad. Sei, USA, Bd. 67 s S0 385-393 (197O)5 Rokutanda u» Mitarb», Nature, Bd* 227', £„ 1026=1028 (197O)) aus durch Muridae-Sarkom-Virus (Moloney-Isolat) veränderten Rattenzellen (78A1 Zellen) und aus durch Muridae-Sarkom-Virus (Harvey-Isolat) veränderten Mäusezellen (MEH Zellen) isoliert und gereinigt«, Die Viruspolymerase wurde durch Inkubation des gereinigten Virus mit O55 % NP-ZfO (nonidet P-40) in O51 molarem NaCl5 0,01 molarem Tris-Puffer (pH 736)9 0,001 molarer Äthylendiamintetraessigsäure während. 5 Minuten bei Raumtemperatur und durch Zonenzentrifugation in von 15 auf 30 % ansteigender Saccharose in 10 BiM Natriumphosphatpuffer (pH 7S4)3 2,5 mM MgCl2, 10 mM Dithiothreit und 5 % Glyzerin während 24 Stunden bei 38 000-UpM in einem Spinco SV! 41 Rotor 20- bis 40fach gereinigt. Die Spitzenfraktionen der Enzymwirksamkeit (13-17) der 22 gesammelten Fraktionen wurden vereinigt und bei -7O0C in 30 % Glyzerin aufbewahrt»
Die Enzyminkubation wurde^ wie von Green u. Mitarb, in Proc Nat, Acad. Sei., USA, Bd„ 67, S. 385-393 (1970) beschrieben, eine Stunde bei 37°C in IOO/1I .eines Seaktionsgemisches, das 40 mM Tris-Puffer (pH 8,0), 5 mM Dithiothreit, 30 mM.NaCl, 2,5 usM MgCl2, 0,1 mM dATP, dGTP, dCTP und 10/iCi 5H-dTTP (12-18 Ci/ Millimol) enthielt, durchgeführt. Die Reaktion vnirde durch Zugabe von I5O/1I 1n Perchlorsäure beendet. Als Träger vnirde Kalbthymus-DNS (lOOyug) zugesetzt«, Das radioaktive DNS-Produkt wurde,wie in den beiden oben angegebenen Literaturstellen be-
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schrieben; aufgearbeitet ο Die endogene RNS-abhängige DIJS=PoIymerasewirksamkeit wurde nach, der Zugabe v.on 0,01. % NP-40 zu dem gereinigten Virus zum Zeitpunkt des Versuchs gemessen. Die DNS-Polymer as ev/irksamkeit der gereinigten Virus polymer as e wurde mit 2yug von Poly d(A-T) als Matrize und ohne NP-ZfO gemessen.»
Test zur Ermittlung_der Hemmwirkung^von^Rifamycinderivaten
Rifamycinderivate wurden in Dimethylsulfoxid (DMSO) in einer Konzentration von 5 mg/ml gelöst und bei k° C aufbewahrt» Die Hemmung der endogenen RNS~abhängigen DNS-Polymerasewirksamke.it v/urde dadurch untersucht, daß man das Probegemisch mit 2 μΐ des ±n. DMSO entsprechend verdünnten Derivats oder 2 ^uI DMSO (Kontrolle) versetzte j bevor man es dem aufgebrochenen Virus zusetzte j das 15 bis'30yug Virusprotein enthielt» Die Enzyminkubation v/urde 60 Minuten lang bei 37° C durchgeführt» Die Hemmung des gereinigten Enzyms v/urde durch Vorinkubation von 2 yul des Derivats oder von DMSO mit 30yul Enzym (1 bis 2 yug Protein) während 10 Minuten bei 37° C untersucht; dann wurden 70/ul Substratgemisch zugesetzts und das Gemisch wurde, wie oben beschrieben, weiterinkubiert und aufgearbeitete
In repräsentativen Versuchen verringerten die erfindungsgemäßen Verbindungen in einer Konzentration von 2 ~'100yug/ml oder weniger die Einverleibung vori H-^-dTTP auf weniger als 10 %, als sie in. den Kontrollversuchen festgestellt wurde, wodurch die-Hemnwirkung auf den Mechanismus der Carcinogenese durch RNS-Tumorviren nach den neuesten biochemischen Erkenntnissen klar gezeigt wurde.
Die Hemirairkung der reversen Transkript as en v/urde auch durch Versuche an Polymerase aus Muridae-Leukämie-Viren bestätigt. Muridae-Leukämie-Virus-RNS-abhängige DNS-Polymerase wurde, wie von Gallo u. Mitarb, in Nature, Hew Biology, Bd. 232, S. 1/fl
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(197D beschrieben, aus mit Triton X 100 aufgebrochenen Viren hergestellt. Viren der beiden Arten Rauscher und Moloney wurden zuvor durch Bandenbildung im I516 g/ml-Bereich eines Saccharosedichtegradienten nach anfänglicher Zentrifugation bei geringer Geschwindigkeit zur Entfernung von Zellbruchstücken und Schichtenbildung auf Saccharosekonzentrationsgradient en von 60 % bis 20 % gereinigte Die Endkonzentration des
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Viruspräparats betrug 10 Teilchen/mlo Als Matrize wurde endogene 70S RNS verwendete Es wurde festgestellt3 daß Konzentrationen von 50 jug/ml oder weniger das Enzym wirksam hemmten«
Ähnliche Ergebnisse wurden bei Verwendung von Tumorzellpolymerasen menschlichen Ursprungs erzielto In diesem Fall wurde die Hemmwirkung auch an Polymerasen normaler Zellen untersucht, um einen selektiven Effekt zu charakterisieren. Repräsentative Rifamycinderivate der Formel I wurden auf ihre Wirkung auf zwei gereinigte DNS-Polymerasen untersucht, die (I) aus menschlichen normalen (PHA-stimulierten) Blutlymphöcyten,
(II) aus Lymphoblastzellen (von einem normalen Spender) und
(III) aus menschlichen leukämischen Blutlymphoblasten isoliert worden waren. Es wurden synthetische und/oder native Matrizen, verwendet.
Ein typisches Beispiel für das experimentelle Verfahren ist nachstehend beschrieben:
Leukämische Lymphoblasten wurden aus dem peripheren Blut von Patienten mit akuter lymphocytischer Leukämie (ALL) durch Leμkophorese isoliert. Die Zellen wurden gewaschen und die Erythrocyten durch hypotonische Auflösung entfernt. Normale Lymphocyten wurden aus dem peripheren Blut von gesunden Spendern nach der Entfernung der Granulocyten durch Nylon-Säulen-
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Chromatographie erhalten« Sie wurden ,wie vorstehend 'beschrieben (Gallo Uo Mitarb., Nature, Bd0 228, So 92? (ΐ97φ Gallo uo Mitarbo, Science, Bd. Ί65s S„ 4OO (1968)), 72 Stunden lang mit Phytohämagglutinin (PHA) behandelt, um ihre DNS-Polymerasewirksamkeit zu verstärken»
Wegen des Problems, ausreichende Mengen dieser Zellen zu erhalten, wurde zur Gewinnung weniger gereinigter DNS-Polymerasen für einige der anfänglichen Untersuchungen zur Gewinnung eines Überblicks eine menschliche "normale" Gewebezellkultur (1788) verwendet.. Die interessierenden Verbindungen wurden dann an den stärker gereinigten Enzymen aus den normalen und leukämischen Blutlymphocyten genauer untersucht» Die Gewebezellkulturen vrar=» den von der Associated Biomedic Systems 9- InC05 erhalten»
DNS-Polymerasepräparate
DNS-Zellpolymerasen wurden aus normalen Blut=(PHA-stimulierten)-lymphocyten5 leukämischen Blutlymphocyten und (1788) Lymphoid» zeilen durch Homogenisierung in hypotonischer Pufferlösung und nachfolgende Behandlung mit Triton X 100 und/o.der starke Salzextraktion des extralysosomalen Pellets extrahiert und gereinigt. NaChx der Differentialzentrifugation wurden die Zellextrakte durch Säulenchromatographie über Diäthylaminoäthylcellulose, Phosphocellulose und Sephadex G 200 weiter gereinigt»
Untersuchung der DNS-Polymerase
Die Untersuchung der DNS-Polymerase wurde in einem Endvolumen von IOO/1I durchgeführt. Das untersuchte Gemisch enthielt 50 mM Tris-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 8?33 69O mM MgAc5 8,0 rnM Dithiothreit und 6p mM NaCl„ Die Einstellung des pH-Wertes vrurde nach der Zugabe der zuvor in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelösten Inhibitoren durchgeführt. Die Endkonzentration an DMSO
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betrug 0,5 %, und alle Kontrollproben enthielten diese Menge an DMSO. Im Versuch wurde eine Enzymkonzentration verwendet, die die'Einverleibung von etwa 1,0 pMol/Std. katalysiert. Das Enzym war in den meisten Fällen 5 Minuten lang mit dem Inhibitor vorinkubiert worden. Die Umsetzung wurde dann durch Zugabe von entweder synthetischer DNS (Poly d (AT) Miles Lab.) und DNS-RNS-Hybrid (Oligo dT.poly rA), 5yug/ml, oder nativer Matrize : aktivierte Salm-Sperma-DNS, 50/ig/ml, und endogene 70S Virus-RNS; 10 μΟΙ (^H-Methyl)-TTP (New England Nuclear, 18,6 mCi/uMol, lyophilisiert und erneut gelöst in 0,01 m HCl unmittelbar vor der Anwendung) und dATP (8 χ 10"-7M, mit synthetischer Matrize) oder allen drei Desoxynucleosid-triphosphaten (8 x 10"5M'mit RNS oder DNS als Matrize) eingeleitet.. Bei einigen Versuchen wurde das Enzym nicht mit dem Inhibitor vorinkubiert. ,
In diesen Fällen wurden die Reaktionen durch Zugabe des Enzyms zu dem vollständigen, den Inhibitor enthaltenden Reaktionsgemisch eingeleitet,- Zu Beginn der Inkubation und nach 30 Minuten wurden Proben entnommen, die Vorgänge in ihnen durch Zugabe von 2 ml 0,08 m Natrxumpyrophosphat unterbrochen, und anschließend wurden diese Proben in 12,5 %iger kalter Trichloressigsäure (TCE). mit Hefe-RNS (ZfOO jag) als Träger ausgefällt. Die Produkte ivurden auf einem Milliporenfilter gesamme-lt, gründlich mit 5 %iger Trichloressigsäure und 1 ml DMSO-Äthanol-0,1 m NaCl (0,5 : 70 : 29,5) gewaschen, getrocknet und in 2 ml BBS7 (Beckman) und 10 ml Liquifluor (New England Nuclear) in einem Packard-Flüssigkeits-Szintillationszähler gezählt. Es wurde gefunden, daß Konzentrationen von 5 bis 20 χ/ml bei einer synthetischen DNS-Matrize eine 50 %ige Hemmung der Leukämie-PoIymerase bewirken. Bei einer synthetischen RNS-Matrize (Poly rA.rtl) war die Reaktion sogar noch empfindlicher. Repräsentative Untersuchungen, die mit einer nativen Matrize an Polymerase von normalen und Tumorzellen durchgeführt wurden, ergaben eine höhere
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Empfindlichkeit der Tumorenzyme gegenüber den untersuchten Verbindungen. Andere biologische Eigenschaften der neuen Rifamycinderivate sind die Hemmung der Fokusbildung bei Zellen der Maus, der Ratte und des Menschen durch den Moloney- und Kirsten-Stamm des Muridae-Sarkom-Virus, die selektive Hemmung der Viruserzeugung durch bereits veränderte Maus- und menschliche Zellen, die Auffindung sich zurückbildender Zellen unter Verwendung der durch Muridae-Sarkom-Viren veränderten nichtproduzierenden Maus- und Rattenzellsysteme. Die erfindungsgemäßen Rifaraycinverbindungen haben sich außerdem als selektiv toxisch für durch Viren veränderte Zellen von Mäusen, Ratten und Menschen erwiesen, xvenn sie auf ihre Kolonie-bildende Fähigkeit untersucht wurden.
In Versuchen zur Ermittlung der Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen, die Fokusbildung durch Moloney-Sarkom-Viren be.·. BALB/3T3-Gewebekultüren zu hemmen, wird das folgende Verfahren angewandt: _,
BALB/3T3-Zellkulturen werden in 250 ml-Kunststoffflaschen in einem Wachstumsmedium gezüchtet, das aus Eagle's minimalem essentiellen Medium mit 10 % fötalem Rinderserum besteht. Mit einem Coulter-Zähler v/erden nach der Suspendierung der Zellen mit Trypsin-Äthylendiamintetraessigsäure und dem Verdünnen mit Wachstumsmedium Zellzählungen durchgeführt. Als Tumorhomogenat wird Moloney-Muridae-Sarköm-Virus verwendet. Man unterwirft es viermal einer Zellpassage in Mausembryozellen der Schweizer Rasse mit hoher Passagezahl und untersucht es auf Fokus bildende Einheiten in den BALB/3T3-Zellen. Bei der Durchführung der Untersuchungen wird eine Modifizierung der von Hartley und Rowe, Proc. Nat. Acad. Sei., Bd. 55, S. 780 (1966) beschriebenen Methode angewandt. Im vorliegenden Fall werden Flaschen mit 1 - 2 χ 10 Zellen in 25 ml des Wachstumsmediums geimpft, und 21+ Stunden lang bei 37° C inkubiert. Nach Entfernung der Flüssigkeiten wird das
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Virus mit einer vorbestimmten Anzahl von Fokus-bildenden Einheiten in 0,5 ml des Wachstumsmediums eingeführt. Dann läßt
man es 90 Minuten lang bei 37° C an der Monoschicht der Zollen adsorbieren. Nach dieser Adsorptionsperiode wird eine vorbestimmt.e Menge, gewöhnlich etwa 5 bis 10yug/ml einer Rifamycinverbindung (die zuvor in Dimethylsulfoxid in einer Konzentration von 1 mg/ml gelöst-worden war) in 25 ml des Wachstümsmediums gebracht, und die Kulturen werden in den Inkubator zurückgebracht. Als Kontrolle wird Dimethylsulfoxid allein im Wachstumsmedium zu einer getrennten Kultur zugesetzt. Nach 3-tägiger Inkubation sind die Kulturen flüssig-verändert, und die Foki der veränderten Zellen werden am 7· Tag gezählt.
Auf die gleiche Weise wird das Bläschenstomatitis-Virus, New Jersey Serotyp, untersucht. Methoden zur Vermehrung und Untersuchung dieses Virus wurden von Hackett ur Mitarb, in Virology, Bd. 31, S. 114 (1967) beschrieben.
Diese Eigenschaften zeigen, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen eine Hemmwirkung auf durch Viren hervorgerufene Tumore bei Tieren besitzen.
Nachfolgend ist die Herstellung einiger repräsentativer erfindungsgemäßer Verbindungen beschrieben.
Beispiel 1
Bisazin des 3-Formylrifamycin SV mit Diphenylglyoxal.
Zu einer Suspension von 15 g (20 Millimol) 3-Formylrifamycin SV in 150 ecm Tetrahydrofuran wurden 4,8. g (20 Millimol) Diphenylglyoxaldihydrazon gegeben. Die Mischung wurde 16 Stunden bei
/und
Raumtemperatur gehalten, dann das Produkt abfiltriert/in Tetrahydrofuran umkristallisiert. Ausbeute 12 g, (Zersetzungspunkt bei 25O0C).
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Analyse für C90H104NgO24,
Ber.: C = 65,36; H = 6,34» N = 5,08. Gef.: 65,15; 6i35» 5,12.
^ max (ταμ) 528 348 307 1%
E · 113,4 258,5 274,8 1 cm
Beispiel 2
3-Formylrifamycin SV-azin.
Zu 7,5 g 3-Formylrifamycin SV,- die in I50 ecm Äthanol gelöst waren, wurden bei Raumtemperatur 0,30. ecm Hydrazinhydrat gegeben. Nach etwa einer Stunde wurde der Niederschlag abfiltriert und in Äthylacetat umkristallisiert. Ausbeute 6g, F.: 160° C (Zers.).
Analyse für C76H94N4O24,
Ber.: C = 63,05; H = 6,54; N = 3,87. Gef.: 62,10; 6,46; 3,95. .
■*-max (mju) 504 342
λ% ■ .
E 157,5 260,3
1 cm
Beispiel 3
16,17,1 8,19,28,29-Hexahydr0-3-formylrifamycin SV-azin.
Das 16,17,18,19,28,29-Hexahydroderivat des 3-Formy!rifamycin SV (1,5 g), gelöst in 40 ecm Tetrahydrofuran wurde mit 50 mg
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Hydrazinhydrat versetzt. Nach 2 Stunden, "bei Raumtemperatur wurde die Lösung bis zur Trockne konzentriert und der Rückstand in Methanol gelöst. Die Mischung wurde 10 Stunden bei Raumtempsratur stehengelassen und dann das Lösungsinittel verdampft. Der Rückstand wurde in Methanol umkristallisiert. Ausbeute: 600 ng des obengenannten Produkts. F.: 20Zf bis 208° C (Zers.).
Analyse für C76H106N^O24,
Ber.: C = 62,53; H = 7,32; N = 3,84. Gef.: .61,96 7,26; 3,39-
max (mju) 504 342.
E 117 266
1 cm
Beispiel 4
1 ,4~Piperazinyliden~bis-(3,3"-iminomethylrifainycin SV).
80 mg 1 ,Zf-Diaminopiperazin und 850 mg 3-Formylrifamycin SV wurden in 30 ecm Tetrahydrofuran gelöst und die Mischung etvra. l\ Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen» Der Niederschlag wurde abfiltriert. Ausbeute 64O mg„ F.: 20Zj. bis 215° C.
Analyse für Cg0H102NgO2^,
Ber.: C .= 62,74; H = 6,71-; N = 5,49. Gef.: 62,02; 6,88; 5,62,
* max 337 475
E 334 171 1 cm
309850/1212
Nach den in den obengenannten Beispielen beschriebenen Verfahren wurden unter Verwendung von 3-Forrnylri f amycin SV und dessen 25-Desacetyl- oder 16,17,18,19,28 und 29~Hexahydro-Derivat und den fol-genden Hydrazinderivaten Verbindungen der Formel (I) hergestellt.
I A A CSJ I csj -53 OJ I I
co 53 . 53 σ tr) S3 I tu
O
I 		I I ω
• 		ι O υ
W ι .. J >v ■/
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a 		ι I 53 53 ►J
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I 53 I
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309850/1212
53 Il
<N 1
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Ϊ3
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te ϊζ;
(N I
309850/1212
iz; —
309850/1212
309850/1212 Sz;

Claims (1)

  1. Patentansprüche
    RLfamycinderivate der allgemeinen Formel (I) und deren 25-Desacetyl- und 16,17,18,19,28 und 29~Hexahydro~Derivate .
    Rifa-CH=N-A-N=CH-Rifa
    (D
    worin Rifa = ein Rifamycinrest der.folgenden Formel ist
    HO.
    Me
    MeCOO.
    MeO
    OH
    Me "Ö ·
    und A = 1 ) eine direkte Bindung zwischen den beiden Stick stoffatomen oder
    2) eine -N-y-N- Gruppe "bedeutet,
    R2 R3
    worin y = eine -CO-, -CNH-, -CS-, -SOp-, eine divalente,
    aliphatische, cycloaliphatische, aromatische, araliphatische oder heterocyclische Gruppe ist; und R^ und R-, = jeweils Wasserstoff oder einen niederen Alkylrest oder zusammengenommen eine aliphatische divalente Kette mit 1 bis 1+ Kohlenstoffatomen, welche die zwei Endstickstoffatome verbinden,-
    3.0-9850/1212
    bedeuten, oder
    3) eine divalente Gruppe -N=C-X-C=N- ist
    I I
    JX Xt-i
    worin X = eine direkte Bindung zwischen den zwei Kohlenstoffatomen, eine divalente aliphatische, cycloaliphatische, aromatische oder heterocyclische Gruppe ist; und R und R, = Jeweils Wasserstoff, einen Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl- oder heterocyclischen Rest oder zusammengenommen eine aliphatische Kette mit 1 bis. 8 Kohlenstoffatomen, welche die zwei Endkohlenstoffatome verbinden, bedeuten.
    2. Verfahren zur Herstellung von Rifamycinderivaten der Formel (I)
    Ri fa-CH=N-A-N=CH-Rifa
    (D
    worin Rifa = ein Rifamycinrest der folgenden Formel ist
    und A = 1) eine direkte Bindung zwischen den beiden Stickstoffatomen oder
    2) eine -N-y-N- Gruppe bedeutet, I I
    R2 R3
    309850/1212
    worin y = eine -CO-, -CIiH-, -CS-, -SO2-, eine divalente, aliphatische, cycloaliphatische, aromatische,.araliphatische oder heterocyclische Gruppe ist; und R2 und R^ = jev/eils Wasserstoff oder einen niederen Alkylrest oder zusammengenommen eine aliphatische divalente Kette mit 1 bis l\ Kohlenstoff atomen, welche die zwei Endstickstoffatome verbinden, bedeuten, oder
    3) eine divalente Gruppe -N=C-X-C=H- ist
    I t R R1
    worin X = eine direkte Bindung zwischen den zwei Kohlenstoffatomen, eine divalente aliphatische, cycloaliphatische, aromatische oder heterocyclische Gruppe ist; und R und R, = jev/eils Wasserstoff, einen Alkyl-, Cycloalkyl-, .Aryl- oder heterocyclischen Rest oder zusammengenommen eine aliphatische Kette mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, welche die zwei Endkohlenstoffatome verbinden, bedeuten, dadurch gekennzeichnet, daß man 3-Formylrifamycin SV oder dessen 25-Desacetyl- oder 16,17,18,19s28 und 29-Hexahydroderivat mit einer Hydrazinverbindung der Formel H2N-A-KHp, worin A = die obengenannte Bedeutung hat, in einem inerten organischen Lösungsmittel bei einer Temperatur von Raumtemperatur bis zur Siedetemperatur des Lösungsmittels umsetzt.
    3. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein 3-Formylrifamycin SV-azin ist.
    Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein 16,17,18,19,2-^> 29-Hexahydro-3-formylrifamycin SV-azin ist.
    309850/1212
    5»- Verbindung nach Anspruch Ί, dadurch gekennzeichnet, daft sie ein l,4-Piperazinyliden-bis-(353'-iminomethyl-rifamycin SV) ist.
    Für: Gruppe Lepetit S.p.Ä. /
    Dr.H.J.Wolff Rechtsanwalt
    309®50/1212
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SU (1) SU514572A3 (de)
ZA (1) ZA732293B (de)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2608218A1 (de) * 1975-03-05 1976-09-16 Lepetit Spa Neue piperazinylimino-rifamycine, verfahren zu ihrer herstellung, sowie dieselben enthaltende pharmazeutische praeparate

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DE2608218A1 (de) * 1975-03-05 1976-09-16 Lepetit Spa Neue piperazinylimino-rifamycine, verfahren zu ihrer herstellung, sowie dieselben enthaltende pharmazeutische praeparate

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CA992961A (en) 1976-07-13
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IE37481B1 (en) 1977-08-03
LU67695A1 (de) 1973-08-02
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