DE2326698A1 - 3-formylrifamycinazine - Google Patents
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- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
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- Organic Chemistry (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
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Description
DR. JUR. DIFL-CHEM. WALTER BEIi O/
ALFRED HOEPPENER *»·
■DR. JUR. DiPL-CMEM. H.-J. WOLFF
DR. JUR. HANS CHR. BEJL
DR. JUR. HANS CHR. BEJL
623 FRANKFURTAM MAIN-HOCHST
Unsere Hr. 18 606
Gruppo Lepetit S.p.A. Mailand, Italien
3-Formylrifamycinazine
Die vorliegende Erfindung betrifft Rifamycin SV-Derivate. Insbesondere
betrifft die Erfindung Azin- und Bisazin-Derivate des 3-Formylrifamycin SV der Formel I und die entsprechenden 25-'Desacetyl-
und 16,17,18,19,28 und 29-Hexahydroderivate:
RLfa-CH=H-A-N=CH-Rifa
(D
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worin Rifa = ein Rifamicinrest der folgenden Formel ist
Me
MecOO
Me
Ke ο
und A = 1) eine direkte Bindung zwischen den beiden Stickstoff
atomen oder
2) eine -N-y-N- Gruppe bedeutet, I I
worin y = eine -CO-, -CNH-, -CS-, -SO2-J eine divalente, allphatische,
cycloaliphatische, aromatische, araliphatische oder heterocyclische Gruppe ist; und R2 und R^ = jeweils Wasserstoff
oder einen niederen Alkylrest oder zusammengenommen eine aliphatische divalente Kette mit 1 bis l\ Kohlenstoffatomen, welche die
zwei Endstickstoffatome verbinden, bedeuten, oder 3) eine divalente Gruppe -N=C-X-C=N-
i !
ist,
worin X = eine direkte Bindung zwischen den zwei Kohlenstoffatomen,
eine divalente aliphatische, cycloaliphatische, aromatische oder heterocyclische Gruppe ist; und R und R, = jeweils
-Wasserstoff, einen Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl- oder heterocyclischen Rest oder zusammengenommen eine aliphatische Kette mit
1 bis 8 Kohlenstoffatomen, welche die zwei Endkohlenstoffatome verbinden, bedeuten.
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In der Beschreibung und den Ansprüchen werden .unter "divalentem
Alkylrest" Alkylenreste mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen verstanden.
Diese Reste werden zweckmäßig durch gerade oder verzweigte Kohlenstoffketten gebildet und können ebenfalls durch Hydroxy-,
Nitro- und Carboxygruppen substituiert sein. Diese Kohlenstoffketten
können weiterhin eine oder mehrere Doppelbindungen enthalten oder als zwei KohlenstoffSegmente vorliegen, die -durch
die Reste -0-, -S-, -NH- und -SOp·=^ verbunden sind,, Unter "cycloaliphatischen
divalenten Resten" werden Gruppen verstanden, die aus cycloaliphatischen Ringen mit 3 bis 8 Ringgliedern erhalten
werden. Unter "aromatischen divalenten Resten" werden -Phenylen-,
Biphenylen-, Naphthylen-Gruppen und dergleichen verstanden. Unter
diesen Begriff fallen auch 6ruppens die aus zwei Phenylenresten,
die durch -S-, -0-s -NH-, -SOg-, -CH=CH- oder einen
Alkylenrest mit 1 bis Ai- Kohlenstoffatomen verbunden sind, bestehen.
Unter "divalenten araliphatischen Resten" werden im wesentlichen Xylylenreste verstanden. Typische Beispiele dieser
Reste sind m-Phenylendimethylen und p-Phenylendimethylen. Die
"divalenten heterocyclischen Reste" werden aus ein- oder zweikernigen
Systemen mit· 5 his 6 Ringgliedern erhalten» Diese
Systeme können ein oder mehrere Heteroatome, wie N, S und 0,
enthalten. Auch werden unter diesem Begriff divalente Reste verstanden, die aus Systemen gebildet sind, in denen zwei
heterocyclische Gruppen durch eine einfache Bindung, beispüsweise Bipyridin und Bithiazol, oder durch divalente Reste, wie
-0-, -S-, -CH=CH-, -NH- und niedere Alkylenreste mit 1 bis i+
Kohlenstoffatomen miteinander verbunden sind. Die aromatischen und/oder heterocyclischen Einheiten der erfindurtgsgemäßen Ver-.
b'indungen können Substituenten, beispielsweise niedere Alkyl-,
Halogen-, Nitro-, Alkoxy-, Hydroxy-, Methylendioxy-, Cyan-, Sulfo-, Carboxy- oder Trifluorinethyl-Gruppen enthalten. Ein
allgemeines Verfahren zur Herateilung der erfindungsgemäßen Verbindungen
besteht darin, daß man 3-Formylrifamycin SV oder dessen
25-Desacetyl- oder 16,17,18,19,28,29-Hexahydroderivat in einem
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inerten organischen Lösungsmittel, beispielsweise einem niederen aliphatischen Alkanol, Tetrahydrofuran oder Dioxan mit einem
Hydrazinderivat der Formel H2N-A-NH2 nach dem folgenden Reaktionsschema
umsetzt:
CHO+H N-A-NH
Ι» Λ
Rifa-CH=N-A-N=CH-Rifa
worin. Rifa -und A = die oben angegebene Bedeutung haben. Obwohl
theoretisch je Mol Hydrazinverbindung 2 Mol des Rifamycin-Derivats
bei der Reaktion erforderlich sind,, kann in der Praxis
jede Komponente im Überschuß eingesetzt werden, ohne daß dabei
die Herstellung des gewünschten Produkts beeinträchtigt wird. Jedoch ist ein großer Überschuß des Hydrazinderivats über das
Rifamycinderivat nicht vorteilhaft, da anstelle des Azinderivats
das Monohydrazon des Rifamycins gebildet v/erden kann. In Abhängigkeit
vom Volumen des Hydrazinderivats kann die Reaktionstemperatur etwa zwischen Raumtemperatur und dem Siedepunkt des
Lösungsmittels liegen.
Die Reaktionszeit kann von etwa einer Stunde bis zu einigen Tagen b'etragen. Sie ist von der Temperatur des verwendeten Lösungsmittels
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und der Reaktionsfähigkeit des Hydrazinderivate abhängig»
Im allgemeinen begünstigt eine längere Reaktionszeit die Umwandlung
der zunächst entstandenen Monohydrazone zu den gewünschten Azinen. Die neuen Verbindungen sind farbige. Feststoffe,
die in den üblichen organischen Lösungsmitteln, beispMsweise niederen Alkanolen, Äthylacetat,, Dioxan, Tetrahydrofuran,
Benzol und chlorierten Kohlenwasserstoffen umkristallisiert werden können.
Ihre Löslichkeit in den organischen Lösungsmitteln ist offensichtlich
vom Typ und der Sperrigkeit der unterschiedlichen R-, E1- und X-Substituenten abhängig. Wenn Säuregruppen zugegen
sind, sind die Verbindungen ebenfalls als Alkalisalze in
Wasser löslich.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind gegen grampositive und gramnegative Bakterien bemerkenswert wirksam. Insbesondere isfc
diese neue Gruppe von Verbindungen besonders gegen Staphylococcus
aureus-Stämme v/irksam. In diesem Falle beträgt die Mindesthemmkonzentration
etwa 0,001 bis etwa 0,05/ug/ccm. Bei einigen repräsentativen
Versuchen an Mäusen hemmte die Verbindung des Beispiels 2 bei einer Dosis von etwa 1 mg/kg bis etwa 5 mg/kg
(subkutan) sehr wirksam die experimentelle Infektion durch Staphylococcus aureus. In anderen Versuchen erwiesen, sich repräsentative
erfindungsgemäße' Verbindungen bei einer Dosis von etwa 1 bis 5yug/ccm auch gegen Staphylococcus aureus Tour-Stämme
wirksam, die gegen andere, üblicherweise therapeutisch verwendet e; Rifamycine resistent sind. Die Toxizität der neuen Verbindungen
ist sehr gering und liegt bei etwa 250 bis etwa 1500 mg/
kg (intravenös).
Eine weitere sehr wichtige Eigenschaft der erfindungsgemäßen Verbindungen ist ihre Hemmwirkung auf DNS-Polymerasen, die für
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O a ig « » ρ a @
f , j £ υ υ ν) Q
Lymphoblasten aus menschlichem leukämischen Blut charakteristisch
sind, und gegen typische Nucleotidyl-Transferasen (Polymerasen)
von Viren,'die von der normalen Zelle nicht verwendet werden
können. Aus Untersuchungen an repräsentativen Gliedern von Virusgruppen ist bekannt, daß sie als wesentlichen Teil ihrer Reproduktion
Polymerasen in die Wirtszellen tragen oder in ihnen erzeugen. So gibt es Viren, wie ζ »Β«, Picornaviren oder Polioviren?
die RITS-abhängige RiIS-Polymerase erzeugen, während andere Gruppen,
wie z.B. Leukämie-Sarkom-Viren eine RNS-abhängige DNS-PoIy- merase
tragen» Die Gegenwart und die außerordentlich wichtige Rolle der RNS-abhängigen DNS-Polymerase bei Tumor bildenden RMS-Viren
wurde von D. Baltimore, Nature, Bd. 226, S. 1209 (1970) und von H.M. Temin u. Mitarb., Nature, Bd. 226, S. 1211" (1970)
entdeckt.
Die kürzliche Entdeckung von RNS-abhängigem DNS-Polymerase-Enzym
in RITS-Tumorviren in Tierarten wurde auch von anderen Autoren
bestätigt, wie z.B. aus den nachstehend aufgeführten Literatursteilen hervorgeht:
Green u. Mitarb., "Mechanism of carcinogenesis by RNA tumor
viruses. An RNA-dependent DNA-Polymerase in murine sarcoma
viruses" (Proc. Nat. Acad. Sei., USA, Bd. 67, S. 385-393 (197O)).
Spiegelman u. Mitarb., "Characterization of the products of RiIA
directed DNA-polymerase in oncogenic RNA viruses" (Nature, London,
Bd. Z27, S. 563 (197O)).
Hatanaka u. Mitarb., "DNA polymerase activity associated with RNA tumor viruses" (Proc. Nat. Acad. Sei. USA, Bd. 67, S. 143
(197O)).
Scolnick u. Mitarb., "DNA synthesis by RNA containing tumor
viruses" (Proc. Nat. Acad. Sei. USA, Bd. 67, S. 1034 (1970)).
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^ <3 ^ e e q a
Das Vorliegen von RNS-Viren in einigen Tumoren wird auch durch
andere Fakten bestätigte reverse Transcriptase wurde in Teilchen der Milch von Frauen mit bekannter Brustkrebsanamnese und
von solchen Frauen, in deren Familie Brustkrebs aufgetreten war, gefunden (Scholn u'. Mitarb., Nature, Bd, 231 , S. 97 (197D)9
während Priori u. Mitarb. (Nature, New Biology, Bd» 232, S„ 16
(1971)) ein als ESP-1 bezeichnetes, reverse Transcriptase enthaltendes
Virus aus Zellen der Pleuralflüssigkeit eines Kindes
mit Lymphom isolierten und es erfolgreich auf Gewebekulturen
züchteten. Von -R. Axel und Mitarb,, (Nature/ Bd0 235, S. 32
(1972)) und T.W. Reid und Mitarb., (Biochem. Biophys0 Res.
Comm., Bd0 ZF6, S. 383 (1972)) wurde die Anwesenheit von RITS-abhängigen
DNS-Polymerasen in einigen Typen -von Menschentumoren
nachgewiesen.
Zur Zelt existieren keine sehr wirksamen Arzneimittel zur Behandlung
von Viruserkrankungenj da die Stoffwechselerfordernisse
für Viren und Zellen gleich sind» Der meistversprechende
V/eg zur Chemotherapie von Virus erkrankungen ist die Entwicklung
geeigneter Chemikalien, die sich in spezifischer V/eise mit Viruspolymerasen oder mit von Viren transformierten Zeilpolymerasen^aber
nicht mit den Polymerasen der Wirtszellen, die die genetische Information der Viren kontrollieren, vereinigen»
Insbesondere können Inhibitoren von RES-Tumorvirenpolymerasen
bei der Synthese von Medikamenten für di'e Leukämie= und andere Krebs-Therapie eine bedeutende Rolle spielen„ Die Hemmwirkung
der erfindüngsgemäßen Verbindungen wurde an RNS=abhängiger. DITS-Polymerase
von Viren aus endogenen Muridae-Sarkom-Viren und an
der DNS-abhängigen DNS-Polymerasewirksamkeit gereinigter Enzyme bestimmt. Die Hemmwirkung wurde nach dem Verfahren von C. Gurgo
und Mitarb., Nature, New Biology, Bd. 229S S, 111 (1971) bestimmt.
Die Wirkung der verschiedenen Arzneimittelkonzentrationen auf die Polymerasewirksamkeit wurde anschließend an die ^H-dTTP
(tritiertes Thymindesoxyribosidtriphosphat)-Einverleibung in die
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unlösliche Fraktion bestimmt. Ein typisches Beispiel für das
experimentelle Verfahren ist nachstehend beschrieben.
Das Virus wurde wie zuvor beschrieben (Green u. Mitarb», Proc.
Nat» Acad. Sei, USA, Bd. 67 s S0 385-393 (197O)5 Rokutanda u»
Mitarb», Nature, Bd* 227', £„ 1026=1028 (197O)) aus durch
Muridae-Sarkom-Virus (Moloney-Isolat) veränderten Rattenzellen
(78A1 Zellen) und aus durch Muridae-Sarkom-Virus (Harvey-Isolat)
veränderten Mäusezellen (MEH Zellen) isoliert und gereinigt«, Die Viruspolymerase wurde durch Inkubation des gereinigten
Virus mit O55 % NP-ZfO (nonidet P-40) in O51 molarem
NaCl5 0,01 molarem Tris-Puffer (pH 736)9 0,001 molarer Äthylendiamintetraessigsäure
während. 5 Minuten bei Raumtemperatur und durch Zonenzentrifugation in von 15 auf 30 % ansteigender
Saccharose in 10 BiM Natriumphosphatpuffer (pH 7S4)3 2,5 mM
MgCl2, 10 mM Dithiothreit und 5 % Glyzerin während 24 Stunden
bei 38 000-UpM in einem Spinco SV! 41 Rotor 20- bis 40fach
gereinigt. Die Spitzenfraktionen der Enzymwirksamkeit (13-17) der 22 gesammelten Fraktionen wurden vereinigt und bei -7O0C
in 30 % Glyzerin aufbewahrt»
Die Enzyminkubation wurde^ wie von Green u. Mitarb, in Proc Nat,
Acad. Sei., USA, Bd„ 67, S. 385-393 (1970) beschrieben, eine
Stunde bei 37°C in IOO/1I .eines Seaktionsgemisches, das 40 mM
Tris-Puffer (pH 8,0), 5 mM Dithiothreit, 30 mM.NaCl, 2,5 usM
MgCl2, 0,1 mM dATP, dGTP, dCTP und 10/iCi 5H-dTTP (12-18 Ci/
Millimol) enthielt, durchgeführt. Die Reaktion vnirde durch Zugabe
von I5O/1I 1n Perchlorsäure beendet. Als Träger vnirde
Kalbthymus-DNS (lOOyug) zugesetzt«, Das radioaktive DNS-Produkt
wurde,wie in den beiden oben angegebenen Literaturstellen be-
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schrieben; aufgearbeitet ο Die endogene RNS-abhängige DIJS=PoIymerasewirksamkeit
wurde nach, der Zugabe v.on 0,01. % NP-40 zu
dem gereinigten Virus zum Zeitpunkt des Versuchs gemessen. Die
DNS-Polymer as ev/irksamkeit der gereinigten Virus polymer as e wurde
mit 2yug von Poly d(A-T) als Matrize und ohne NP-ZfO gemessen.»
Test zur Ermittlung_der Hemmwirkung^von^Rifamycinderivaten
Rifamycinderivate wurden in Dimethylsulfoxid (DMSO) in einer
Konzentration von 5 mg/ml gelöst und bei k° C aufbewahrt» Die
Hemmung der endogenen RNS~abhängigen DNS-Polymerasewirksamke.it
v/urde dadurch untersucht, daß man das Probegemisch mit 2 μΐ des
±n. DMSO entsprechend verdünnten Derivats oder 2 ^uI DMSO (Kontrolle)
versetzte j bevor man es dem aufgebrochenen Virus zusetzte j das 15 bis'30yug Virusprotein enthielt» Die Enzyminkubation
v/urde 60 Minuten lang bei 37° C durchgeführt» Die
Hemmung des gereinigten Enzyms v/urde durch Vorinkubation von 2 yul
des Derivats oder von DMSO mit 30yul Enzym (1 bis 2 yug Protein)
während 10 Minuten bei 37° C untersucht; dann wurden 70/ul Substratgemisch
zugesetzts und das Gemisch wurde, wie oben beschrieben,
weiterinkubiert und aufgearbeitete
In repräsentativen Versuchen verringerten die erfindungsgemäßen Verbindungen in einer Konzentration von 2 ~'100yug/ml oder weniger
die Einverleibung vori H-^-dTTP auf weniger als 10 %, als sie
in. den Kontrollversuchen festgestellt wurde, wodurch die-Hemnwirkung
auf den Mechanismus der Carcinogenese durch RNS-Tumorviren
nach den neuesten biochemischen Erkenntnissen klar gezeigt wurde.
Die Hemirairkung der reversen Transkript as en v/urde auch durch
Versuche an Polymerase aus Muridae-Leukämie-Viren bestätigt.
Muridae-Leukämie-Virus-RNS-abhängige DNS-Polymerase wurde, wie
von Gallo u. Mitarb, in Nature, Hew Biology, Bd. 232, S. 1/fl
121
(197D beschrieben, aus mit Triton X 100 aufgebrochenen Viren
hergestellt. Viren der beiden Arten Rauscher und Moloney wurden zuvor durch Bandenbildung im I516 g/ml-Bereich eines
Saccharosedichtegradienten nach anfänglicher Zentrifugation bei geringer Geschwindigkeit zur Entfernung von Zellbruchstücken
und Schichtenbildung auf Saccharosekonzentrationsgradient
en von 60 % bis 20 % gereinigte Die Endkonzentration des
1 1
Viruspräparats betrug 10 Teilchen/mlo Als Matrize wurde
endogene 70S RNS verwendete Es wurde festgestellt3 daß Konzentrationen
von 50 jug/ml oder weniger das Enzym wirksam hemmten«
Ähnliche Ergebnisse wurden bei Verwendung von Tumorzellpolymerasen
menschlichen Ursprungs erzielto In diesem Fall wurde
die Hemmwirkung auch an Polymerasen normaler Zellen untersucht,
um einen selektiven Effekt zu charakterisieren. Repräsentative Rifamycinderivate der Formel I wurden auf ihre Wirkung
auf zwei gereinigte DNS-Polymerasen untersucht, die (I)
aus menschlichen normalen (PHA-stimulierten) Blutlymphöcyten,
(II) aus Lymphoblastzellen (von einem normalen Spender) und
(III) aus menschlichen leukämischen Blutlymphoblasten isoliert worden waren. Es wurden synthetische und/oder native Matrizen,
verwendet.
Ein typisches Beispiel für das experimentelle Verfahren ist nachstehend beschrieben:
Leukämische Lymphoblasten wurden aus dem peripheren Blut von
Patienten mit akuter lymphocytischer Leukämie (ALL) durch Leμkophorese isoliert. Die Zellen wurden gewaschen und die
Erythrocyten durch hypotonische Auflösung entfernt. Normale Lymphocyten wurden aus dem peripheren Blut von gesunden Spendern
nach der Entfernung der Granulocyten durch Nylon-Säulen-
30 9 8 50/121
- ' 11
Chromatographie erhalten« Sie wurden ,wie vorstehend 'beschrieben (Gallo Uo Mitarb., Nature, Bd0 228, So 92? (ΐ97φ Gallo uo
Mitarbo, Science, Bd. Ί65s S„ 4OO (1968)), 72 Stunden lang mit
Phytohämagglutinin (PHA) behandelt, um ihre DNS-Polymerasewirksamkeit
zu verstärken»
Wegen des Problems, ausreichende Mengen dieser Zellen zu erhalten,
wurde zur Gewinnung weniger gereinigter DNS-Polymerasen
für einige der anfänglichen Untersuchungen zur Gewinnung eines Überblicks eine menschliche "normale" Gewebezellkultur (1788)
verwendet.. Die interessierenden Verbindungen wurden dann an den stärker gereinigten Enzymen aus den normalen und leukämischen
Blutlymphocyten genauer untersucht» Die Gewebezellkulturen vrar=»
den von der Associated Biomedic Systems 9- InC05 erhalten»
DNS-Polymerasepräparate
DNS-Zellpolymerasen wurden aus normalen Blut=(PHA-stimulierten)-lymphocyten5
leukämischen Blutlymphocyten und (1788) Lymphoid»
zeilen durch Homogenisierung in hypotonischer Pufferlösung und
nachfolgende Behandlung mit Triton X 100 und/o.der starke Salzextraktion
des extralysosomalen Pellets extrahiert und gereinigt. NaChx der Differentialzentrifugation wurden die Zellextrakte durch
Säulenchromatographie über Diäthylaminoäthylcellulose, Phosphocellulose und Sephadex G 200 weiter gereinigt»
Untersuchung der DNS-Polymerase
Die Untersuchung der DNS-Polymerase wurde in einem Endvolumen
von IOO/1I durchgeführt. Das untersuchte Gemisch enthielt 50 mM
Tris-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 8?33 69O mM MgAc5 8,0 rnM
Dithiothreit und 6p mM NaCl„ Die Einstellung des pH-Wertes vrurde
nach der Zugabe der zuvor in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelösten Inhibitoren durchgeführt. Die Endkonzentration an DMSO
232669a
betrug 0,5 %, und alle Kontrollproben enthielten diese Menge
an DMSO. Im Versuch wurde eine Enzymkonzentration verwendet, die die'Einverleibung von etwa 1,0 pMol/Std. katalysiert. Das
Enzym war in den meisten Fällen 5 Minuten lang mit dem Inhibitor vorinkubiert worden. Die Umsetzung wurde dann durch Zugabe
von entweder synthetischer DNS (Poly d (AT) Miles Lab.) und DNS-RNS-Hybrid (Oligo dT.poly rA), 5yug/ml, oder nativer
Matrize : aktivierte Salm-Sperma-DNS, 50/ig/ml, und endogene
70S Virus-RNS; 10 μΟΙ (^H-Methyl)-TTP (New England Nuclear,
18,6 mCi/uMol, lyophilisiert und erneut gelöst in 0,01 m HCl
unmittelbar vor der Anwendung) und dATP (8 χ 10"-7M, mit synthetischer
Matrize) oder allen drei Desoxynucleosid-triphosphaten
(8 x 10"5M'mit RNS oder DNS als Matrize) eingeleitet..
Bei einigen Versuchen wurde das Enzym nicht mit dem Inhibitor vorinkubiert. ,
In diesen Fällen wurden die Reaktionen durch Zugabe des Enzyms zu dem vollständigen, den Inhibitor enthaltenden Reaktionsgemisch eingeleitet,- Zu Beginn der Inkubation und nach 30 Minuten
wurden Proben entnommen, die Vorgänge in ihnen durch Zugabe von 2 ml 0,08 m Natrxumpyrophosphat unterbrochen, und anschließend
wurden diese Proben in 12,5 %iger kalter Trichloressigsäure (TCE). mit Hefe-RNS (ZfOO jag) als Träger ausgefällt. Die
Produkte ivurden auf einem Milliporenfilter gesamme-lt, gründlich
mit 5 %iger Trichloressigsäure und 1 ml DMSO-Äthanol-0,1 m
NaCl (0,5 : 70 : 29,5) gewaschen, getrocknet und in 2 ml BBS7
(Beckman) und 10 ml Liquifluor (New England Nuclear) in einem
Packard-Flüssigkeits-Szintillationszähler gezählt. Es wurde gefunden, daß Konzentrationen von 5 bis 20 χ/ml bei einer synthetischen
DNS-Matrize eine 50 %ige Hemmung der Leukämie-PoIymerase
bewirken. Bei einer synthetischen RNS-Matrize (Poly rA.rtl)
war die Reaktion sogar noch empfindlicher. Repräsentative Untersuchungen, die mit einer nativen Matrize an Polymerase von normalen
und Tumorzellen durchgeführt wurden, ergaben eine höhere
3098 507 1212
Empfindlichkeit der Tumorenzyme gegenüber den untersuchten Verbindungen.
Andere biologische Eigenschaften der neuen Rifamycinderivate sind die Hemmung der Fokusbildung bei Zellen der Maus,
der Ratte und des Menschen durch den Moloney- und Kirsten-Stamm des Muridae-Sarkom-Virus, die selektive Hemmung der Viruserzeugung
durch bereits veränderte Maus- und menschliche Zellen, die Auffindung sich zurückbildender Zellen unter Verwendung
der durch Muridae-Sarkom-Viren veränderten nichtproduzierenden
Maus- und Rattenzellsysteme. Die erfindungsgemäßen Rifaraycinverbindungen
haben sich außerdem als selektiv toxisch für durch Viren veränderte Zellen von Mäusen, Ratten und Menschen erwiesen,
xvenn sie auf ihre Kolonie-bildende Fähigkeit untersucht wurden.
In Versuchen zur Ermittlung der Wirkung der erfindungsgemäßen
Verbindungen, die Fokusbildung durch Moloney-Sarkom-Viren be.·. BALB/3T3-Gewebekultüren zu hemmen, wird das folgende Verfahren
angewandt: _,
BALB/3T3-Zellkulturen werden in 250 ml-Kunststoffflaschen in einem
Wachstumsmedium gezüchtet, das aus Eagle's minimalem essentiellen Medium mit 10 % fötalem Rinderserum besteht. Mit einem Coulter-Zähler
v/erden nach der Suspendierung der Zellen mit Trypsin-Äthylendiamintetraessigsäure
und dem Verdünnen mit Wachstumsmedium Zellzählungen durchgeführt. Als Tumorhomogenat wird
Moloney-Muridae-Sarköm-Virus verwendet. Man unterwirft es viermal
einer Zellpassage in Mausembryozellen der Schweizer Rasse mit hoher Passagezahl und untersucht es auf Fokus bildende Einheiten
in den BALB/3T3-Zellen. Bei der Durchführung der Untersuchungen
wird eine Modifizierung der von Hartley und Rowe, Proc. Nat. Acad. Sei., Bd. 55, S. 780 (1966) beschriebenen Methode angewandt.
Im vorliegenden Fall werden Flaschen mit 1 - 2 χ 10 Zellen in 25 ml des Wachstumsmediums geimpft, und 21+ Stunden lang
bei 37° C inkubiert. Nach Entfernung der Flüssigkeiten wird das
3 09 85 07 12 12
232669a
Virus mit einer vorbestimmten Anzahl von Fokus-bildenden Einheiten
in 0,5 ml des Wachstumsmediums eingeführt. Dann läßt
man es 90 Minuten lang bei 37° C an der Monoschicht der Zollen
adsorbieren. Nach dieser Adsorptionsperiode wird eine vorbestimmt.e
Menge, gewöhnlich etwa 5 bis 10yug/ml einer Rifamycinverbindung
(die zuvor in Dimethylsulfoxid in einer Konzentration von 1 mg/ml gelöst-worden war) in 25 ml des Wachstümsmediums
gebracht, und die Kulturen werden in den Inkubator zurückgebracht. Als Kontrolle wird Dimethylsulfoxid allein im
Wachstumsmedium zu einer getrennten Kultur zugesetzt. Nach 3-tägiger Inkubation sind die Kulturen flüssig-verändert, und
die Foki der veränderten Zellen werden am 7· Tag gezählt.
Auf die gleiche Weise wird das Bläschenstomatitis-Virus, New
Jersey Serotyp, untersucht. Methoden zur Vermehrung und Untersuchung dieses Virus wurden von Hackett ur Mitarb, in Virology,
Bd. 31, S. 114 (1967) beschrieben.
Diese Eigenschaften zeigen, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen
eine Hemmwirkung auf durch Viren hervorgerufene Tumore bei Tieren besitzen.
Nachfolgend ist die Herstellung einiger repräsentativer erfindungsgemäßer
Verbindungen beschrieben.
Bisazin des 3-Formylrifamycin SV mit Diphenylglyoxal.
Zu einer Suspension von 15 g (20 Millimol) 3-Formylrifamycin SV
in 150 ecm Tetrahydrofuran wurden 4,8. g (20 Millimol) Diphenylglyoxaldihydrazon
gegeben. Die Mischung wurde 16 Stunden bei
/und
Raumtemperatur gehalten, dann das Produkt abfiltriert/in Tetrahydrofuran
umkristallisiert. Ausbeute 12 g, (Zersetzungspunkt bei 25O0C).
30 98 5 0/121-2
2326696
Analyse für C90H104NgO24,
Ber.: C = 65,36; H = 6,34» N = 5,08.
Gef.: 65,15; 6i35» 5,12.
^ max (ταμ) 528 348 307
1%
E · 113,4 258,5 274,8
1 cm
Beispiel 2
3-Formylrifamycin SV-azin.
3-Formylrifamycin SV-azin.
Zu 7,5 g 3-Formylrifamycin SV,- die in I50 ecm Äthanol gelöst
waren, wurden bei Raumtemperatur 0,30. ecm Hydrazinhydrat gegeben.
Nach etwa einer Stunde wurde der Niederschlag abfiltriert und in Äthylacetat umkristallisiert. Ausbeute 6g,
F.: 160° C (Zers.).
Analyse für C76H94N4O24,
Ber.: C = 63,05; H = 6,54; N = 3,87.
Gef.: 62,10; 6,46; 3,95. .
■*-max (mju) 504 342
λ%
■
.
E 157,5 260,3
1 cm
Beispiel 3
16,17,1 8,19,28,29-Hexahydr0-3-formylrifamycin SV-azin.
Das 16,17,18,19,28,29-Hexahydroderivat des 3-Formy!rifamycin
SV (1,5 g), gelöst in 40 ecm Tetrahydrofuran wurde mit 50 mg
309850/1212
Hydrazinhydrat versetzt. Nach 2 Stunden, "bei Raumtemperatur wurde
die Lösung bis zur Trockne konzentriert und der Rückstand in Methanol gelöst. Die Mischung wurde 10 Stunden bei Raumtempsratur
stehengelassen und dann das Lösungsinittel verdampft. Der
Rückstand wurde in Methanol umkristallisiert. Ausbeute: 600 ng des obengenannten Produkts. F.: 20Zf bis 208° C (Zers.).
Analyse für C76H106N^O24,
Ber.: C = 62,53; H = 7,32; N = 3,84.
Gef.: .61,96 7,26; 3,39-
max (mju) 504 342.
E 117 266
1 cm
1 ,4~Piperazinyliden~bis-(3,3"-iminomethylrifainycin SV).
80 mg 1 ,Zf-Diaminopiperazin und 850 mg 3-Formylrifamycin SV
wurden in 30 ecm Tetrahydrofuran gelöst und die Mischung etvra.
l\ Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen» Der Niederschlag
wurde abfiltriert. Ausbeute 64O mg„ F.: 20Zj. bis 215° C.
Analyse für Cg0H102NgO2^,
Ber.: C .= 62,74; H = 6,71-; N = 5,49.
Gef.: 62,02; 6,88; 5,62,
* max 337 475
E 334 171 1 cm
309850/1212
Nach den in den obengenannten Beispielen beschriebenen Verfahren
wurden unter Verwendung von 3-Forrnylri f amycin SV und
dessen 25-Desacetyl- oder 16,17,18,19,28 und 29~Hexahydro-Derivat
und den fol-genden Hydrazinderivaten Verbindungen der
Formel (I) hergestellt.
I | A | A | CSJ | I | csj | -53 | OJ | I | I | |
co | 53 . | 53 | σ | tr) | S3 | I | tu | |||
O
I |
I | I |
ω
• |
ι | O | υ | ||||
W | ι | .. J | >v ■/ | |||||||
>z; | Ö | \y | ||||||||
to | 1 |
O
a |
ι | I | 53 | 53 | ►J | |||
A | 1 | I | W | |||||||
I | 53 | I | ||||||||
O | I | |||||||||
O | ||||||||||
as | ||||||||||
53 | ||||||||||
i | ||||||||||
CNI
Ü
O
O
11
53
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5
5
£3
53
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ο
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f O
co O -
ess
CS!
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Ci
it P
co
O 11
309850/1212
53 Il
<N 1
fi
Ϊ3
■ffi
τ—·
tu
te ϊζ;
(N I
309850/1212
iz; —
309850/1212
309850/1212 Sz;
Claims (1)
- PatentansprücheRLfamycinderivate der allgemeinen Formel (I) und deren 25-Desacetyl- und 16,17,18,19,28 und 29~Hexahydro~Derivate .Rifa-CH=N-A-N=CH-Rifa(Dworin Rifa = ein Rifamycinrest der.folgenden Formel istHO.MeMeCOO.MeOOHMe "Ö ·und A = 1 ) eine direkte Bindung zwischen den beiden Stick stoffatomen oder
2) eine -N-y-N- Gruppe "bedeutet,R2 R3worin y = eine -CO-, -CNH-, -CS-, -SOp-, eine divalente,
aliphatische, cycloaliphatische, aromatische, araliphatische oder heterocyclische Gruppe ist; und R^ und R-, = jeweils Wasserstoff oder einen niederen Alkylrest oder zusammengenommen eine aliphatische divalente Kette mit 1 bis 1+ Kohlenstoffatomen, welche die zwei Endstickstoffatome verbinden,-3.0-9850/1212bedeuten, oder3) eine divalente Gruppe -N=C-X-C=N- istI IJX Xt-iworin X = eine direkte Bindung zwischen den zwei Kohlenstoffatomen, eine divalente aliphatische, cycloaliphatische, aromatische oder heterocyclische Gruppe ist; und R und R, = Jeweils Wasserstoff, einen Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl- oder heterocyclischen Rest oder zusammengenommen eine aliphatische Kette mit 1 bis. 8 Kohlenstoffatomen, welche die zwei Endkohlenstoffatome verbinden, bedeuten.2. Verfahren zur Herstellung von Rifamycinderivaten der Formel (I)Ri fa-CH=N-A-N=CH-Rifa(Dworin Rifa = ein Rifamycinrest der folgenden Formel istund A = 1) eine direkte Bindung zwischen den beiden Stickstoffatomen oder2) eine -N-y-N- Gruppe bedeutet, I I
R2 R3309850/1212worin y = eine -CO-, -CIiH-, -CS-, -SO2-, eine divalente, aliphatische, cycloaliphatische, aromatische,.araliphatische oder heterocyclische Gruppe ist; und R2 und R^ = jev/eils Wasserstoff oder einen niederen Alkylrest oder zusammengenommen eine aliphatische divalente Kette mit 1 bis l\ Kohlenstoff atomen, welche die zwei Endstickstoffatome verbinden, bedeuten, oder3) eine divalente Gruppe -N=C-X-C=H- istI t R R1worin X = eine direkte Bindung zwischen den zwei Kohlenstoffatomen, eine divalente aliphatische, cycloaliphatische, aromatische oder heterocyclische Gruppe ist; und R und R, = jev/eils Wasserstoff, einen Alkyl-, Cycloalkyl-, .Aryl- oder heterocyclischen Rest oder zusammengenommen eine aliphatische Kette mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, welche die zwei Endkohlenstoffatome verbinden, bedeuten, dadurch gekennzeichnet, daß man 3-Formylrifamycin SV oder dessen 25-Desacetyl- oder 16,17,18,19s28 und 29-Hexahydroderivat mit einer Hydrazinverbindung der Formel H2N-A-KHp, worin A = die obengenannte Bedeutung hat, in einem inerten organischen Lösungsmittel bei einer Temperatur von Raumtemperatur bis zur Siedetemperatur des Lösungsmittels umsetzt.3. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein 3-Formylrifamycin SV-azin ist.Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein 16,17,18,19,2-^> 29-Hexahydro-3-formylrifamycin SV-azin ist.309850/12125»- Verbindung nach Anspruch Ί, dadurch gekennzeichnet, daft sie ein l,4-Piperazinyliden-bis-(353'-iminomethyl-rifamycin SV) ist.Für: Gruppe Lepetit S.p.Ä. /Dr.H.J.Wolff Rechtsanwalt309®50/1212
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