DE2227087C2

DE2227087C2 - 3-Formyl-Rifamycin-SV-oxime

Info

Publication number: DE2227087C2
Application number: DE2227087A
Authority: DE
Inventors: Renato Varese Cricchio; Giancarlo Pavia Lancini
Original assignee: Gruppo Lepetit SpA
Current assignee: Gruppo Lepetit SpA
Priority date: 1971-06-07
Filing date: 1972-06-03
Publication date: 1982-09-02
Also published as: FR2140534A1; FI58923C; NL7207698A; DD99782A5; GB1338740A; DE2227087A1; IL39305A0; NO135316C; JPS517679B1; LU65461A1; DK137992C; FI58923B; NL153202B; IE37664B1; RO62437A; ES403548A1; DK137992B; AR192938A1; CH562248A5; IL39305A

Description

3 4

Die vorliegende Erfindung betrifft O-substituierte 3-Formyl-Rifamycin-SV-oxime der allgemeinen Formel

Me Me

Me

CH=NUR

OH

Me O

worin R eine n-Alkylgruppe mit 5-10 Kohlenstoffatomen, eine der folgenden verzweigtkettigen Alkylgruppen:

n-(C₃H₇>— CH-H-(C₃H₇) C₂H₅-CH-n-C₄H, n-C₃H,—CH-n-C₄H, CH₃-CH-^C₅H₁₁ oder

C₂H₅-CH-Ii-C₅H₁₁
eine der Alkenylgruppen

-CH₂-C(C₂Hj)=CH₂ -(CH₂J₄-CH = CH₂ oder den Geranylrest; eine der Phenylalkylgruppen

-CH₂-CH₂-C₆H₅ -CH₂-CH₂-CH₂-C₆H₅ die Diphenylmethyl-, p-Bromphenylmethyl- oder die Gruppe Cl

Cl

-CH-

eine Phenoxy-butyl-, -hexyl-, -octyl- oder -decyl- oder die 5,6-Dibromhexylgruppe
und Me die Methylgruppe
bedeuten.

Das Öxim von 3-Formyl-rifamycin SV, dessen O-Methyl- und O-Morpholinoäthylderivat sind aus der U.S.-Patentschrift 33 42 810 bekannt. Diese Verbindungen besitzen eine gute antibakterielle Wirkung, sind jedoch praktisch wirkungslos gegen Bakterien, die gegen andere Rifamycine, insbesondere das bekannteste und therapeutisch nützliche 3-(4-Methyl-l-piperazinyl-iminomethyl)-rifamycin SV (Rifampicin) resistent geworden sind.

Bekanntlich ist es äußerst schwierig, wenn ein Mikroorganismenstamm gegen ein bestimmtes Antibiotikum resistent geworden ist, eine weitere Verbindung aus der gleichen Antibiotika-Familie aufzufinden, die das Wachstum der resistenten Mutante inhibieren kann.

Manchmal ist es sogar überhaupt schwierig, auch unteir anderen Antibiotikaarten Verbindungen zu finden, die noch gegen einen solchen resistenten Stamm wirksam sind.

Überraschend wurde nun gefunden, daß bei Ersatz des Wasserstoffatoms der Oximinogruppe des 3-Formyl-Rifamycin-SV-oxims durch die vorstehend genannten Reste vielversprechende Verbindungen erhalten werden, die in niedrigen Konzentrationen das Wachüturn von Bakterienstämmen inhibieren, die gegenübex anderen Rifamycinen oder Cephaloridin resistent sind. Die erfindungsgemäßen Verbindungen zeigen insbesondere eine gute inhibierende Wirkung auf Stämme von Staphylococcus aureus, die gegen Rifampicin und Cephaloridin resistent sind.

Bei in vitro-Versuchen mit den erfindungsgemäßen Verbindungen wurde das Wachstum eines Staphylococcus aureus Tour-Stammes, der gegen Rifampicin

resistent ist, mit Konzentrationen von 1 bis 5 μg/ml inhibiert

Diese besondere Wirksamkeit ist außerdem mit einer guten Allgemeinwirkung gegen Mikroorganismen verbunden, die gewöhnlich auf die Rifamycine ansprechen.

Es wurde außerdem die Wirksamkeit in vitro der erfindungsgemäßen Verbindungen sowie des anerkannt guten Antibiotikums Cephaloridin als Vergleichssubstanz gegenüber dem Stamm Staphylococcus aureus ATCC 6538 resistent gegen Cephaloridin ermittelt; die Versucbsirgebnisse sind in nachfolgender Tabelle I angegeben.

Tabelle I

Verbindung
des Beispiels

LD₅₀ (mg/kg)

10

Verbin	R	Minimale Hemmkon
dung des		zentration (pg/ml)
Beispiels		gegenüber Staphylo
		coccus aureus XfCC
		6538, resistent gegen
		Cephaloridin
1	H-C₅H₁₁	0,02
2	n-C₈H₁₇	0,1
3	H-C₉H₁₉	0,1
4	(CH₂J₂C₆H₅	0,05
5	(CH₂)₃C₆H₅	0,05
6	CH₂C₆H₄Br-P	0,05
7	C₆H₅CH C₆H₅	0,1
8	n-C₁₀H₂₁	2
9	1-C₇H₁₅	0,2
10	25-Desacetyl-n-C₈H_!7	0,2
11	ⁿ"C₆H₁₃	0,05
12	CH-n(C₃H₇)₂	0,05
13	(CH₂)₄-CH=CHj	0,02
14	CHjC(C₂Hs)=CHj	0,02
15	Geranyl	0,5
16	CHAH₃-O, p-Clj	0,1
17	C₂K₁CH-Ii-C₅H₁₁	0,1
18	B-CjH₇-CH-Ii-C₄H₉	0,2
19	CjH₅CH-nAH₉	0,2
20	CH₃CH-nAH_n	0,02
21	(CHj)₄OC₆H₅	0,02
22	(CH₂J₆OC₆H₅	0,05
23	(CH₂J₈OC₆H₅	0,2
Cephaloridin	>100

Die für erfindungsgemäße Verbindungen ermittelten Toxizitäten sir:d in nachfolgender Tabelle Π zusammengefaßt.

Tabelle II Toxizitäten LD₅₀ (mg/kg), i. v. Mäuse

Verbindung
des Beispiels

LO₅₀
(mg/kg)

15

20

25 11
12
IJ
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23

₁₉
(CHj)₂C₆H₅

(CHj)₃C₆H₅

CH₂C₆H₄Br-P C₆H₅CH₂C₆H₅

n-C₁₀H₂₁

Ti-C₁H₁₅ n-C₈H₁₇ 25-Desacetyl

U-C₆H₁₃ CH-n(C₃H₇)₂ (CHj)₄-CH=CH₂ CH₂C (C₂Hs)=CH₂ Geranyl

CH₂C₆H₃-O₁P-Cl₂ CjH₅CH-n-C₅H_n n-C₃H₇-CH-n-C₄H₉ C₂H₅CH-n-C₄H₉ CH₃CH-n-C₅H„ (CHj)₄OC₆H₅ (CHj)₆OC₆H₅ (CHj)₈OC₆H₅

96,0

76 102

90,0

98,2 152,0

86,0

66,0 80 71,0 89,0 73,5 73,0 79,0 139,0 96,5

₅₁₁
n-C₈H₁₇

82,9 88,0

Aufgrund der nur unwesentlich unterschiedlichen

Toxizitäten der Verbindungen der Beispiele 9 und 1, die sich von der Verbindung des Beispiels 11 lediglich dadurch unterscheiden, daß der Substituent R eine n-C6Hi3- anstelle einer ηΑΗ₎₅- bzw. n-CsHn-Gruppe ist, ist es in hohem Maße glaubhaft, daß die Toxizität der

Verbindung 11 nur unwesentlich hiervon abweicht

Analoges gilt für die Verbindung des Beispiels 12 und deren Toxizität, welche ein Isomeres der Verbindungen der Beispiele 19 und 20 ist: aus den Toxizitätswerten letzterer ergibt sich ein nur geringer Einfluß der Verzweigung der Heptylkette (R) auf die Toxizität, sowie Ähnliches für die Toxizität der Verbindung des Beispiels 23, die ein Homologes [R=(CH₂)SOCeH₅] der Verbindungen der Beispiele 2 [R=(CH₂^OC₆H₅] und 22 [R=(CH₂)BOC₆H₅] sowie ferner der entsprechenden Verbindung mit R=(CH₂)IoOQH₅ ist, für die, ein Wert LD₅O (i. v, Mäuse) von 162,0 mg/kg ermittelt wurde.

Auch die Toxizität der Verbindung des Beispiels 10 dürfte erwartungsgemäß derjenigen der Verbindung des Beispiels 2 größenordnungsmäßig entsprechen, die

so sich von ersterer lediglich dadurch unterscheidet, daß sie in 25-Stellung eine Acetylgruppe anstelle eines Wasserstoffatoms aufweist

Es wurde ferner die Wirksamkeit in vitro der nachfolgend angegebenen Verbindung mit derjenigen von Rifampicin als Vergleichssubstanz gegenüber einem Staphylococcus aureus Tour-Stamm resistent gegen Rifampicin ermittelt

Die Ergebnisse sind in nachfolgender Tabelle wiedergegeben:

Verbindung des Beispiels

Minimale Hemmkonz. LD₅₀

;/g/ml gegenüber S.aureus

Tour, resistent gegenüber mg/kg

Rifampicin

24 Rifampicin

(CH,)₄C(Br)HCH₂Br 2 >100

122,0 690,0

Aufgrund ihrer in vitro-Wirksamkeit gegenüber cephaloridin- und rifampicinresistenten S. aureus Stämmen lassen sich die erfindungsgemäßen Verbindungen als topische Mittel bei kutanen bakteriellen Infektionen, wie beispielsweise Wund- und Brandinfektionen, infizierte Ekzeme und Bartflechte mit gutem Erfolg anwenden.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind allgemein gegen die üblichen gram-positiven und gram-negativen Bakterien sehr aktiv. Insbesondere zeigen sie beträchtliehe Wirkung bei Stämmen von Staphylococcus aureus, Slieplococciis l'iiiviilis. Sliv|i!oo>i.viis liemolyliciis und Diplococcus pneumoniae. In diesen Fällen liegt die minimale inhibierende Konzentration zwischen etwa 0,001 und etwa 0,5 μg/mg.

Ein weiteres wichtiges Merkmai der erfindungsgemäßen Verbindungen ist ihre inhibierende Wirkung auf DNA-Polymerasen, die für Lymphoblasten in leukämischem menschlichem Blut charakteristisch sind, und auf typische Nukleotidyltransferasen (Polymerasen) von Viren, die von der normalen Zelle nicht verwendet werden. Aus Untersuchungen an repräsentativen Gliedern von Virusarten ist bekannt, daß die Viren in die Wirtszellen Polymerasen als wesentlichen Teil ihrer Replikation tragen oder dort induzieren. Es gibt Viren, z. B. Picorna-Viren oder Polio-Viren, welche die RNA-abhängige RNA-Polymerase induzieren, während andere Arten wie z. B. Leukämie-Sarkom-Viren eine RNA-abhängige DNA-Polymerase tragen. Die Anwesenheit und die wichtige Rolle der RNA-abhängigen DNA-Polymerase Revers- Transcriptase in oncogenen RNA-Viren wurde durch D. Baltimore, Nature, Bd. 226, (1970) S. 1209 und H. M.Temin et al. Nature, Bd. 226, (1970) S. 1211 entdeckt Die Entdeckung eines RNA-abhängigen DNA-Polymeraseenzyms in RNA-Tumorviren tierischer Herkunft wurde auch durch andere Autoren bestätigt, s. z. B. Green et al.: Mechanism of carcinogenesis by RNA tumor viruses. I. An RNA-dependent DNA-Polymeräse in murine sarcoma viruses; Proa Nat Acad. Sei. USA, Bd. 67, ίο (1970) S. 385-393; Spiegelman et al.: Characterization of the products of RNA directed DNA-polymerase in oncogenic RNA viruses, Nature, London, Bd. 227, (1970) S. 563; Hatanaka et aL: DNA polymerase activity associated with RNA tumor viruses. Proc. Nat Acad. Sei. USA, Bd. 67, (1970) S. 143: Scolnick et al.: DNA synthesis by RNA containing tumor viruses. Proa Nat Acad. ScU USA, Bd. 67,(1970) S. 1034.

Die Mitwirkung von RNA-Viren in einigen Tumoren wurde auch durch andere Tatsachen gestützt: Revers-Transcriptase wurde in Teilchen aus menschlicher Milch gefunden, die Von Ffäücfi mit Biuäikfcbs in der Familiengeschichte erhalten worden war (Scholn et al. Nature, Bd. 231, (1971) S. 97. Priori et aL (Nature, New Biology Bd. 232, (1971) S. 16 isolierten ein mit »ESB-1« bezeichnetes Virus, welches Revers-Transcriptase enthielt, aus Zellen der Rippenfell-Flüssigkeit eines Kindes mit Lymphom, und das mit Erfoig in Gewebekulturen gezüchtet werden konnte. Bei menschlichem Brustkrebs konnte die Anwesenheit einer RNA durch Molekülhybridation nachgewiesen werden, die der Virus-RNA aus Brustkrebstumoren von Mäusen homolog ist, siehe R. Axel et aL in Nature, Bd 235, (1972) S. 32. Bisher gibt es keine sehr wirksamen Medikamente zur Behandlung von Viruskrankheiten, da Viren und Zellen gemeinsame metabolische Anforderungen stellen. Der erfolgversprechendste Weg einer Chemotherapie bei Viruskrankheiten ist eindeutig die Bereitstellung geeigneter Chemikalien, die sich spezifisch mit der Polymerase von Viren- oder durch Viren transformierten Zellen vereinigen, jedoch nicht mit den Polymerasen der Wirtszellen, die den Ausdruck der genetischen Information der Viren kontrollieren. Spezielle Ihibitoren der Enzyme von Viruszellen oder durch Viren transformierten Zellen, insbesondere Inhibitoren der Polymerasen von RNA-Tumorviren, können eine wichtige Rolle bei der Bereitstellung von Medikamenten gegen Leukämie und anderen Krebskrankheiten spielen.

Die inhibierende Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen wurde anhand der RNA-abhängigen DNA-Polymerase-Aktivität von endogenen Sarkom-Viren von Nagetieren und der DNA-abhängigen DNA-Polymerase-Aktivität von gereinigten Enzymen getesiel. Die inhibierung wurde nach den Methoden von C. Gurgo et al.. Nature, New Biology, Bd. 229, (1971) S. Ill, getestet.

Der Effekt der verschiedenen Wirkstoffkonzentrationen auf die Polymerase-Aktivität wurde bestimmt, indem man den ³H-dTTP (tritiiertes Thymin-deoxyribosid-triphosphat)-Einbau in die unlösliche Fraktion verfolgte. Eine typische Versuchsanordnung ist folgende:

1) Isolierung der Viren und Reinigung
der Virus-Polymerase

Die Viren wurden aus durch Nagetier-Sarkom-Viren (Moloney-Typ) transformierten Rattenzellen (78Al -Zellen) und durch Nagetier-Sarkom-Viren (Harvey-Typ) transformierten Mäusezellen (NEH-Zellen) isoliert und gereinigt, siehe Green et al, Proc. Nat Acad. Sei USA, Bd. 67, (1970) S. 385-393, Rokutanda et aL Nature, Bd. 227, (1970) S. 1026-1028. Die Virus-Poiymerase wurde 20- bis 40fach gereinigt durch Inkubation der gereinigten Viren mit 04% NP-40 (Nonidet P-40) in 0,1 M NaCl, 0,01 M Tris-Puffer (pH 7,6), 0,001 M Äthylendiamintetraessigsäure während 5 Minuten bei Raumtemperatur mit Zonenzentrifugierung in 15 bis 30% Sucrose-Gradienten in 1OmM Natriumphosphat-Puffer (pH 7,4), 2,5 mM MgCl₂, 10 mM Dithiothreit und 5% Glycerin während 24 Stunden bei 38 000UpM in einem Spinco-SW41-Rotor. Die Fraktionen maximaler Enzymaktivität (13 — 17 von 22) wurden aufgefangen, vereinigt und bei - 70⁰C in 30% Glycerin aufbewahrt

DNA-Polymerase-Test

Die Enzym-Inkubation erfolgte 1 Stunde lang bei 37°C in 100 μΐ eines Reaktionsgemische, welches 40 mM Tris-Puffer (pH 8,0), 5 mM Dithiothreit 30 mM NaCl, 2,5 mM MgCb. 0.1 mM dATP, dGTP, dCTP und 10 μθ ³H-ViTTr {12— ίο Ci/ϊϊίΜΟμ cmhicli, siehe Green ei iii, in Proa Nat Acad. Sei. US, Bd. 67, (1970), S. 385-393. Die Reaktion wurde durch Zusatz von 150ui In-Perchlorsäure beendet Als Träger wurden 100 μg DNA aus Kalbsthvmus zugesetzt Das radioaktive DNA-Produkt wurde nach der Vorschrift der beiden genannten Veröffentlichungen aufgearbeitet Die Aktivität der endogenen RNA-abhängigen DNA-Polymerase wurde nach Zusatz von 0,01% PN-40 zu den gereinigten Viren zum Probezeitpunkt bestimmt Die DNA-Polymerase-Aktivität der gereinigten Virus-Poiymerase wurde unter Verwendung von 2 ug Poly d(A-T) (»Template«) und ohne NP-40 gemessen.

Test auf die Inhibierung durch Rifamycin-derivate

Rifamycin-Derivate wurden in Dimethylsulfoxyd in einer Konzentration von 5 mg/ml gelöst und bei 4⁰C

gelagert. Die Inhibierung der endogenen RNA-abhängigen DNA-Polymerase-Aktivität wurde getestet durch Zusatz von 2 μΐ der Derivatlösung in Dimethylsulfoxyd oder von 2 μΙ Dimethylsulfoxyd (Vergleich) zum Testgemisch vor Zugabe der zerkleinerten Viren, die 15 — 30 μg Virus-Protein enthielten. Die Enzym-inkubation erfolgte während 60 Minuten bei 37⁰C. Die Inhibierung des gereinigten Enzyms wurde getestet unter Vorinkubierung von 2 μΐ der Derivatlösung oder von 2μ1 Dimethylsulfoxyd mit 30 μΙ Enzym (l-2μg ι υ Protein) während 10 Minuten bei 37° C; dann wurden 70 μΐ Substratgemisch zugegeben und das Gemisch wurde wie oben beschrieben inkubiert und aufgearbeitet.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen der Beispiele 4, 5, 6, 13,14 und 16 verminderten bei Konzentrationen von 2 — 100 μg/ml oder weniger den Einbau von H³-dTTP auf weniger als 10% der Vergleichswerte. Dadurch wird die inhibierung des Mechanismus der Carcinogenese durch RNA-Tumorviren klar erwiesen.

Die inhibierende Wirkung von Revers-Transcriptase wurde ebenfalls durch Versuche mit Polymerase aus Nagetier-Leukämie-Viren bestätigt Die RN A-Polymerase der Leukämie-Viren wurde nach der Vorschrift von Gallo et al. Nature, New Biology, Bd. 232 (1971), S. 141 aus zerkleinerten Viren in Triton X 100 hergestellt Viren vom Rauscher- und vom Moloney-Typ wurden zunächst gereinigt durch Bandenbildung in der 1,16 g/ ml-Region eines Sucrose-Dichte-Gradienten (60% Sucrose bis 20% Sucrose) nach erfolgter Zentrifugierung bei niedriger Geschwindigkeit zwecks Entfernung von Zellrückständen. Die Endkonzentration des Virus-Präparats betrug 10¹1 Teilchen/ml. Als Vorlage (Template) wurde endogene 70S-RNA verwendet Konzentrationen von 50 μg/ml oder weniger erwiesen sich als wirksam nur Inhibierung des Enzyms. Beispielsweise wurden Inhibierungen von ca. 50% mit Konzentrationen von nur etwa 10—25 μg/ml der Verbindung der Beispiele 5,6 bzw. 14 erzielt

Ähnliche Ergebnisse wurden bei Verwendung von Tumorzellen-Polymerase menschlichen Ursprungs erhalten. In diesem Fall wurde die inhibierende Wirkung auch an Polymerasen aus normalen Zellen untersucht um einen selektiven Effekt festzustellen. Repräsentative Derivate der Formel I wurden hinsichtlich ihrer Wirkung auf zwei gereinigte DNA-Polymerasen bewertet die (1) aus normalen menschlichen (PHA-stimulierten) Blutlymphozyten, (2) einer Lymphoblast-Zellen-Familie (von einem normalen Spender) und (3) leukämischen menschlichen Blut-Lymphoblasten erhalten wor- so den waren. Es wurden synthetische oder native Vorlagen (Templates) verwendet

Ein typisches Beispiel der Versuchsausführung wird nachstehend geschildert:

Lymphoblasten aus menschlichem Blut

Leukämische Lymphoblasten wurden aus dem peri- pheren Blut von Patienten mit akuter lymphozytischer Leukämie (ALL) durch Leukophorese isoliert Die Zellen wurden .gewaschen und die Erythozyten wurden durch hypotonische Lysis entfernt Ferner werden normale Lymphczyten aus dem peripheral Blut aus gesunden Spendern nach Entfernung der Granulozyten durch Nylon-Säulenchromatographie erhalten, sie wurden mit Phytohämagglutinin (PHA) 72 Stunden wie oben beschrieben (GaOo et aL Nature, Bd. 228 (1970), S. 927, Gallo et aL Science, Bd. 165 (1968), S. 400) stmrafiert, um die DNA-Polymerase-Aktivität zu erhöhen.

Wegen der rechnerischen Probleme bei der Bereitstellung ausreichender Mengen dieser Zellen wurde eine »normale« Gewebskultur (1788) verwendet, die weniger hochgereinigte DNA-Polymerasen für die ersten Orientierungsversuche lieferten. Die interessanten Verbindungen wurden dann mit den stärker gereinigten Enzymen aus den normalen und leukämischen Blutlymphozyten näher untersucht. Die Zellen aus Gewebskulturen waren von Associated Biomedic System, Inc. erhalten worden.

DN A-Polymerase- Präparate

Zell-DNA-Polymerase wurde aus normalen Blutlymphozyten (PHA-stimuliert), leukämischen Blutlymphozyten sowie 1788-Lymphoidzellen durch Homogenisierung in hypotonischer Pufferlösung mit anschließender Extraktion der extraiysosomalen Pellets mit Triton X100 und/oder Lösungen mit hohem Salzgehalt gewonnen und gereinigt. Nach der Differential-Zenlrifugierung wurden die Zellextrakte durch Säulenchromatographie an DEAE-Cellulose, Phosphocellulose und Sephadex G 200 weitergereinigt.

DNA-Polymerase-Tests

Die Tests auf DNA-Polymerase wurden in einem End volumen von 100 μΐ durchgeführt Das Testgemisch enthielt 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 83), 6,0 mM MgAc, 8,0 mM Dithiothreit und 60 mM NaCl. Die Einstellung des pH-Werts erfolgte nach Zugabe der Inhibitoren, die zuvor in Dimethylsulfoxyd gelöst worden waren. Die Endkonzentration an Dimethylsulfoxyd betrug 0,5%, und alle 'Vergleichsproben enthielten diese Menge Dimethylsulfoxyd. Eine Enzymkonzentration, die einen Einbau von ca. 1,0 pMol/Std. katalysierte, wurde verwendet Das Enzym wurde in den meisten Fäiien mit dem Inhibitor 5 Minuten vorinkubiert Die Reaktion wurde dann durch Zugabe von 5μg/ml synthetischer DNA (Poly d(AT), Miles Lab.) oder DNA.RNA-Hybrid (oligo-dT.PoIy-rA) oder nativen Stoffen, nämlich aktivierter Salmsperm-DNA in einer Menge von 50 ug/ml und endogener 70S Virus-RNA, 10 μα (3H-Methyl)-TTP (New England Nuclear, 18,6 mCi/μΜοΙ, lyophilisiert und direkt vor Verwendung in 0,01m-Salzsäure wieder gelöst) und dATP (8 χ 10-⁵ M, zusammen mit synthetischem Material) oder sämtlichen drei Deoxynucleosidtriphosphaten (8 χ 10~⁵ M bei RNA- oder DNA-basierenden Reaktionen) initiiert Bei einigen Versuchen erfolgte keine Vorinkubation des Enzyms mit dem Inhibitor. In diesen Fällen wurden die Reaktionen beim Zusatz des Enzyms zum gesamten Reaktionsgemisch, welches den Inhibitor enthielt, initiiert Proben wurden zu Beginn der Inkubation und nach 30 Minuten abgezogen, ihre Reaktion wurde durch Zugäbe von 2 m! O,08m-Natriumpyrophosphatlösung beendet, und die Ausfällung erfolgte in 12£%iger kalter Trichloressigsäure mit Refe-RNA-(400 ug) als Träger. Die Produkte wurden auf einem Milliporen-Filter gesammelt, sorgfältig mit 5%iger Trichloressigsäure und 1 ml eines Gemischs aus Dimethylsulfoxyd, Äthanol, O.lm-Natriumchlorid (0,5:70:29,5) gewaschen und getrocknet, dann erfolgte Zählung in 2 ml BBS₃ (Beckman) und 10 ml Iiquifluor (New England Nuclear) in einem Packard-Scintülationszähler.

Es wurde gefunden, daß Konzentrationen von 5—10 ug/ml der Verbindungen der Beispiele 1,2 und 5 eine 50%ige Inhibierung der leukämischen Polymerase bei einer synthetischen DNA-Vorlage (Template) bewirkten. Bei synthetischer RNA (Poly rAxU) war die

Reaktion noch stärker.

Versuche mit Polymerase aus normalen und Tumorzellen bei nativer Vorlage (Template) zeigten eine höhere Empfindlichkeit der Tumorenzyme auf die getesteten Verbindungen.

Weitere biologische Eigenschaften der neuen Rifamycin-derivate sind die Inhibierung der Focus-Bildung durch Nagetier-Sarkom-Viren der Moloney- und Kirsten-Stämme in Mäuse-, Ratten- und menschlichen Zellen; die selektive Inhibierung der Virusproduktion durch bereits transformierte Mäuse- oder menschliche Zellen; und die Auffindung revertierender Zellen unter Verwendung von durch das Sarkom-Virus-transformierten, keine Viren produzierenden Mäuse- und Rattenzellen. Die selektive Toxizität der erfindungsgemäßen Verbindungen für durch Viren transformierte Zeilen von Mäusen oder Ratten oder Zeilen menschlichen Ursprungs wurde ferner beim Test auf die Fähigkeit zur Koloniebildung bestätigt.

Bei Versuchen zur Ermittlung der inhibierenden Wirkung auf die Focus-Bildung durch Moloney-Sarkom-Viren-BALB/3T3-Gewebekulturen wurde folgende Methode angewandt:

BALB/3T3-Zellkulturen wurden in 250mI-Kunststoffkolben in einem Wachstumsmedium aus Eagle's Mindestnährstoff-Medium mit 10% Fötus-Rinderserum gezüchtet Die Zählung der Zellen erfolgte mit einem Coulter-Zähler, nachdem die Zellen mit Trypsin-Äthylendiamintetraessigsäure suspendiert und im Wachstumsmedium verdünnt worden waren. Moloney-Sarkom-Virus wurde als Tumorhomogenat verwendet Es wurde 4 Passagen einer Mäuseembryozellreihe unterworfen, dann auf Focus-bildende Einheiten in BALB/ 3T3-Zellen untersucht Bei den Versuchen wurde nach einer Abwandlung der Methode von Hartley and Rowe, Proc. Nat Acad. ScL Bd. 55 (1966), S. 780 gearbeitet Die Kolben wurden mit 1 -2χ lOS-Zellen in 25 ml Wachstunismedium geimpft und bei 37° C 24 Stunden inkubiert Nach Entfernung des flüssigen Anteils werden Viren mit einer vorher ermittelten Anzahl Focus-bildender Einheiten in 0,5 ml des Wachstumsmediums eingeführt und an der Schicht aus einer Zellage 90 Minuten bei 37^s C adsorbiert Nach dieser Adsorptionszeit wird eine vorbestimmte Menge, gewöhnlich eine Dosis von etwa 5-10μg/ml einer Rifamycin-Verbindung (in Dimethylsulfoxyd in einer Konzentration von 1 mg/ml gelöst) in 25 ml Wachstumsmedium zugegeben und die Kulturen werden in die Inkubationsvorricntung zurückgesetzt. Zum Vergleich wird Dimethylsulfoxyd allein im Wachstumsmedium einer weiteren Kultur zugegeben. Nach 3tägiger Inkubierung erfolgt Flüssigkeitsaustausch und die Kerne transformierter Zellen werden am Tag 7 gezählt.

Auf die gleiche Weise werden Stomatitis-Viren (New Jersey Serotyp) untersucht; Methoden zur Züchtung und Testung dieser Viren wurden von Hackett et ah. Virology, Bd. 31 (1967), S. 114 beschrieben.

ίο Die Ergebnisse zeigen, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen eine inhibierende Wirkung auf durch Viren induzierte Tumore bei Tieren besitzen.

Ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen besteht darin, daß man 3-Formylrifamycin-SV oder dessen 25-Desacetylderivat in einem organischen Lösungsmittel mit der stöchiometrischen Menge eines O-substituierten Hydroxyiamins der Formel NH2 —O —R, in welcher R die obige Bedeutung besitzt, behandelt Nachdem man das Reaktionsgemisch einige Zeit, beispielsweise 20 Minuten bis einige Stunden, bsi Rqumtemperatur stehen gelassen hat wird das Rohprodukt durch Einengen oder Abdampfen des Lösungsmittels gewonnen. Die Reinigung bereitet keine besonderen Schwierigkeiten, sie erfolgt im allgemeinen durch Kristallisieren aus einem geeigneten Lösungsmittel, beispielsweise einem niedrigen Alkanol oder Benzol. Die neuen Verbindungen sind gefärbte Feststoffe, die in den üblichen organischen Lösungsmitteln wie Benzol Äthylacetat, Chloroform, Dioxan, Tetrahydrofuran und

jo dgl. löslich sind.

Allgemein erfolgt die Herstellung der Oxime, indem man zu einer Lösung von 0,01 Mol 3-Formylrifamycin-SV oder dessen 25-Desacetylderivat in Tetrahydrofuran 0,01 Mol des O-substituierten Hydroxyiamins unter Rühren bei Raumtemperatur zusetzt. Nach 20minütigem bis 3stündigem Rühren wird ein Tropfen der Lösung durch Dünnschichtenchromatographie an Silikagel getestet, wobei das Verschwinden des Ausgangsmaterials und die Bildung des Endprodukts festgestellt wenden können. Sobald keine Carbonylverbindung mehr vorhanden ist wird die Lösung zur Trockene eingeengt wobei man das Rohprodukt erhält das durch Kristallisieren aus einem Lösungsmittel gereinigt wird.

In Tabelle UI sind die chemischen und physikalischen Daten der erfindungsgemäßen Verbindungen aufgeführt.

I'ubelle IH

Beispiel R

Kristallisations lösungsmittel	Ausbeute %	F., ⁰C	Analyse C	H	N	Charaktenst u. sichtbare	. U. V. Banden	U)	K)
			ber.: gef.:			*^tIUlX*	ΕΓ™		K) K)
Methanol	93	200-202	63,68 63,62	7,20 7,23	3,45 3,75	468 325	173,2 274,7		O OO
Methanol	80	188-190	64,76 65,03	7,56 7,69	3,28 3,47	475 329	142,6 234,6	"Vl
Methanol	70	177-181	65,11 65,18	7,67 7,78	3,23 3,35	480 330	156,0 250,0
Äthylacetat	63	130-134	65,38 65,50	6,68 6,67	3,31 3,70	472 328	163,6 257,3
Methanol	84	160-161	65,71 65,60	6,80 6,70	3,26 3,50	472 328	160,3 256,5
Methanol	68	156-158	59,40 58,19	5,87 5,68	3,08 3,25	475 328	145,1 240.6
Methanol	67	145-150	67,53 67,25	6,44 6.43	3,08 3,15	480 330	133,4 231,2
Leichtbenzin	64	97-101	65,43 65,41	7,78 7,82 ·	3,18 3,29	480 330	137,5 224
Äthylacetat	40	134-140	64,72 64,72	7,45 7,41	3,34 3,10	475 328	152,5 244,5
Methanol	85	118-125	65,16 64,40	7,71 7,83	3,45 3,30	473 327	158,7 255,5
Äthylacetat Leichtbenzin	85	137-140	64,06 63,66	7,33 7,42	3,39 3,10	470 327	167,8 258,6
Methanol	80	167-171	64,42 64,35	7,45 7,47	3,34 3,48	470 326	151 235
Methanol	85	174-175	64,22 63,80	7,10 7,12	3,40 3,20	470 327	176,2 175,2
Methanol	80	163-165	63,84 63,05	6,98 7,02	3,46 3,69	472 327	183,6 280,9

1	C5HII
2	CgH\|7
3	C9H17
4	CH₂CH₂C₆H₅
5	CH₂CH₂CH₂C₆H₅
6	CH₂C₆H₄Br-P
7	CH(C₆Hj)₂
8	(CHj)₉CH₃
9	(CH₂J₆CH₃
10 11	(CH₂J₇CH₃ 25-Desacetyl (CH₂)₅CH₃
12	CH(C₃H₇J₂
13	(C H₂),, — CH = CH₂
1,1	CH₂-C = CH₂

C₂H₅

Fortsetzung	j	]	CH₃ CH₃ I	Cl	Kristallisations	Ausbeute	F., ⁰C	Analyse	Cl	64,77	M	7,88	N	Churakterist	U.V.	Ul	K)
Beispiel R	! 17		CH₂CH = C-CH₂-CH₂-CH = C	CH₂-<ζ^>—Cl	lösungsmittel	%		C		64,61		7,94		u. sichtbare	Banden		K)
Nr.		; 19						bei.:						*H_11111x*	Eiern		"S
								gef.:			7,56					O
			CH₃						64,77	7,36	7,80	3,19				OO
	18	• 1 ²⁰		Methanol	85	138-140	65,73	64,08	7,45		3,13	480	149,8
i ¹⁵		CH(CHz)₄-CH₃				65,35					330	2Λ2.7
							64,42		7,56
	21						64,47	5,82	7,66	3,11
		C₂H₅	Methanol/Wasser	90	193-105	60,06		5,79		3,20	476	138
16						58,98	64,42	7,45		330	226
	I 22	CH-C₄H₉				63,70	7,59

	OO					64,85	7,45	3,28
	C₃H₇	Methanol/Wasser	90	100-110	64,55	7,43	3,38	475	149,5
	CH-C₄H,			(Zers.)				238	206,8
					65,49	6,80
				65,16	6,92	3,28
C₂H₅	Methanol/Wasser	95	102			3,22	475	148
CH-C₅H_n			(Zers.)		7,03		328	254,4
I					7,19	3,34
CH₃	Methanol/Wasser	70	195		3,45	472	167,2
-(CH₂J₄-O-C₆H₅			(Zers.)			329	270,4
					3,34
	Methanol	90	133-136	3,25	475	165,6
-(CH₂)J-O-C₆H₅					328	266,7
				3,15
	Äthylacetat/	60	126,9	3,00	475	159,8
	Petroläther				327	248,2
			3,05	225	391,9
Äthylacetat/	30	138-142	2,86	478	148,8
Petroläther				330	237,7
				320	439,5

Fortsetzung

Beispiel R Nr.

Kristallisationslösungsmittel

Ausbeute %

F., ⁰C

Analyse	H	N	Charakterist.	U.V.-	K) K)
C ber.:			u. sichtbare 1 *"max*	Sanden cl% "Um
gef.:					K)
	7,25	2,97			O
66,08	7,26	3,10	480	129,6	OO
66,29			331	217,3
			228	417,6
			327	_
		474

23 -(CH₂)J-O-C₆H₅

24 (CHJ₄C(Br)HCH₂Br

Äthylacetat/ Petroläther

Methanol

70

75

102-106

123-126

Claims

Patentanspruchs:

1. 3-Formyl-Rifamycin-SV-Qxiine der allgemeinen Formel

Me Me

CH=NOR

OH

Me O

wurin R eine n-Alkylgruppe mit 5-10 Kohlenstoffatomen, eine der folgenden verzweigtkettigen Alkylgruppen:

I I

n-(C₃H₇)—CH-n-(C₃H₇) C₂H₅-CH-H-C₄H,

I I

CH-^C₄H, CH₃-CH-n-C₅H„

C₂H₅-CH — n-CjH,,
eine der Alkenylgruppen

-CH₂-C(C₂Hs)=CH₂ -(CHj)₄-CH = CH₂ oder den Geranylrest; eine der Phenylalkylgruppen -CH₂-CH₂-C₆H₅ -CH₂-CH₂-CH₂-C₆H₅

die Diphenylmethyl-, p-Bromphenylmethyl- oder die Gruppe C!

eine Phenoxy-butyl-, -hexyl-, -octyl- oder -decyl- oder die 5,6-Dibromhexylgruppe und Me die Methylgmppe bedeuten.
2. 25-Desacetyl-3-(O-n-octyl-oxirninomethyl)-ril'amycin-SV.