FI58923C - Foerfarande foer framstaellning av nya terapeutiskt aktiva 0-substituerade oximer av 3-formylrifamycin sv 3-formyl-16,17,18,19,28,29-hexahydro-rifamycin sv och 25-desacetyl-3-formylrifamycin sv - Google Patents

Description

RSrTl ΓβΊ mxKUULUTUSjULKAISU r qqq 7 jjBBffk IBJ (") UTLAGG N I NGSSKRI FT ^ 0 7 2. £> «^0^5 C Patentti myönnetty 11 05 1931

Patent meddelat >S * ^ (51) Kv.lk.3/lnfcCI.3 C 0? D 498/08 SUOH I — FI N L AN D (21) Pttenttlhakwnu» — Rttmcameknlnf 11+1*9/72 (22) Htkemltpllvt — Antttknbtftdkg 2l.05.72 ^ ^ (23) AlkuptM—Glttlghuttdag 21.05.72 (41) Tulkit JulklMkf! — Bllvlt offantllg qq -^2 J2 rUMttl- I» raki>Urllnllltli< (44) N««Mblp™« |.».Ι*Μ»η „*- TOM* och reglsturstyralam ' ΑηΛΙαη utlagd och utl.*krlft»n publicand 30.01.8l (32)(33)(31) «tuo+kuu* —(Ugtrd priorltat 07.06 .71 21.06.71 Italia-Italien(IT) 25193 A/71, 89607 A/71 (71) Gruppo Lepetit S.p.A., Via Durando 38, 20158 Milano, Italia-Italien(lT) (72) Renato Cricchio, Varese, Giancarlo Lancini, Pavia, Italia-Italien(lT) (7I) S.A. Munsterhielm

(51) Menetelmä uusien, terapeuttisesti aktiivisten 3-formyylirifamysiini SV:n, 3-formyyli-l6,17,l8,19,28,29-heksahydro-rifamysiini SV:n ja 25-desasetyyli-3-formyylirifamysiini SV:n 0-substituoitujen oksiimien valmistamiseksi - Förfarande för framställning av nya, terapeutiskt aktiva O-substituerade oximer av 3-formylrifamyein SV, 3-formyl--16,17,18,19,28,29-hexahydro-rifamycin SV och 25-d.esacetyl-3-formyl-rifamyein SV

Tämä keksintö koskee menetelmää terapeuttisesti aktiivisten 3-formyy1irifamysiini 3V:n, B-formyyli-lö,1/,18,19,28,29-heksahydro--rifamysiini 3V:n ja 25-äesasetyyli-3-formyylirifamysiini dV:n C--substituoitujen oksiimien valmistamiseksi, joilla on naava

Me Me Η5ΛΛ^,

Rt o heJ oi ij

Mej °H OH

MeO

J π XA. J-CH=N0R

1 0 ^ I

0 __j—OH

Me 0 jossa kaavassa R on (Cp-Cj^^^kyyli, hydroksi-alempialkyyli, kar-b ok s i-a 1e mp1a1kyy1i, karboksi-fenyylialempiaikyyli, C C ^-G ^-alke-nyyli, propargyyli, sykloheksyyli, alempialkoksi-alcmpialkyyli, 58923 fenoksi-()-alkyyli, karbometoksi-dekyyli, halogeeni-bentsyyli, difenyyli-metyyli, fenyyli-alempialkyyli tai alempialkyyli, joka on substituoitu pyrrolidino-, piperidino- tai piperatsinoryhmällä, joka on substituoitu raetyyliryhmällä, R^ on vety tai asetyyli ja pilkkuvii-vat tarkoittavat vaihtoehtoisia kaksoissidoksia.

Keksinnön mukainen menetelmä tunnetaan siitä, että 3-formyy-lirifamysiini SV, 25-desasetyyli-3-formyylirifamysiini SV tai 3--formyyli-16,17,18,19,28,29-heksahydro-rifamysiini SV saatetaan kosketukseen noin ekvimolaarisen määrän kanssa kaavan RONH^ mukaista 0--substituoitua hydroksyyliamiinia, jossa kaavassa R tarkoittaa samaa kuin edellä.

3-formyylirifamysiini SV:n oksiimi ja sen 0-metyyli- ja 0--morfolinoetyylijohdannaiset on esitetty FI-patenttijulkaisussa ^501^.

Hyvästä antibakteerisesta aktiviteetistaan huolimatta ei näillä yhdisteillä ole käytännöllisesti katsoen mitään vaikutusta sellaisia bakteereita vastaan, jotka ovat tulleet resistenteiksi muille rifamysiineille, varsinkin tunnetuimmalle ja terapeuttisesti käyttökelpoiselle 3-(U-metyyli-l-piperatsinyyli-iminometyyli)-rifamysiini SV:lie (rifampisiini).

Seuraavassa verrataan eräiden keksinnön mukaisten yhdisteiden in vitro-aktiviteettia rifampisiinille resistenttejä (pienin estävä kons. >100 jag/ml) Staphylococcus aureus-kantoja vastaan, FI-patentti -julkaisusta *+5 0M+ tunnetun 3-formyylirifamysiini SV:n oksiimin, sen 0-metyylioksiimin ja 0-morfolinoetyylioksiimin vastaaviin aktiviteetteihin. In vitro-antibakteerinen aktiviteetti määritettiin käyttämällä sarja-laimennusmenetelmää nestemäisessä ravintoväliaineessa. Pienin estävä konsentraatio on se määrä ko. yhdistettä, joka estää bakteerin näkyvän kasvun.

Yhdiste esimerkistä No Pienin estävä konsentraatio pg/ml 1 100 2 50 3 50 1+ 10 5 10 6 1 8 2 ,13 5 1*+ 5 15 2 3 58923

Yhdiste esimerkistä No Pienin estävä kondenstraatio up/m] 16 1 20 10 21 2 22 1 23 5 2k 50 25 5 26 10 27 2 28 10 29 50 30 50 32 2 33 10 35 20 38 50 39 2 ko 5 hl 2 k2 5 >+3 2 i+U- 5 t+5 2 k9 2 50 2 3-formyylirifamysiini SV:n oksiimi >100 3-formyylirifamysiini SV:n O-metyylioksiimi >100 3-formyylirifamysiini SV:n O-morfolinoetyyli- oksiimi > 100

Antibioottien asiantuntijoille on tunnettua, että kun mikro-orga-nismikanta tulee resistentiksi tietylle antibioottiselle lääkkeelle, on melko vaikeata löytää samaan antibioottiryhmään kuuluva yhdiste, joka pystyisi estämään mainitun resistentin mutantin kasvun. Eräissä tapauksissa on erittäin vaikeata löytää jopa muihin antibioottilajeihi n kuuluvia yhdisteitä, jotka olisivat aktiivisia tällaista resistenttiä kantaa vastaan.

ν 58923

Nyt on siis yllättävästi todettu, että substi!uoimalla 3--formyylirifamys iini SV-oksiimin oksiminoryhmän vetyatomi edellä määritellyllä R-radikaalilla saadaan erittäin hyviä yhdistei tä, jotka alhaisina konsentraatioina pystyvät estämään muille rifamysiIneilie resistenttien kantojen kasvun.

Tähän erityiseen aktiviteettiin liittyy hyvä yleisteho muita »sikro-organi saleja vastaan, jotka yleensä ovat rifamysi Lneille her kk: ä.

Keksinnon mukaisesti valmistettavat yhdisteet ovat yleensä erittäin aktiivisia myös tavallisia gram-positiivisia ja gram-negatiivisia bakteereita vastaan. Uusilla yhdisteillä on huomattava aktiviteetti erityisesti Staphylococcus aureus-, Streptococcus faecalis-, Streptococcus hemolyticus- ja Diplococcus pneumoniae-kantoja vastaan. Käissä tapauksissa on pienin estävä konsentraatio noin 0,001 - noin 0,5 jug/mg, ja seuraavassa taulukossa onkin esitetty keksinnön mukaisten yhdisteiden pienimpiä estäviä konsentraatioi ta.

Taulukko

Pienin estävä konsentraatio jig/ml

Yhdiste esi- Staphylococcus Streptococcus Diplococcus merkistä No aureus Tour hemolyticus pneumoniae C 203 U.CAl 1 0,005 0,01 0,005 2 0,005 0,05 0,02 3 0,005 0,05 0,02 V 0,01 0,1 0,02 5 0,01 0,2 0,02 6 0,1 0,5 0,02 ! 7 10 10 0,2 ! 3 02 5 002 9 0J05 0.005 ο’όί 10 2 0,5 0,5 11 0,1 1 1 12 0,2 1 0,2 17 0,02 0,1 0,02 19 0,02 0,2 0,01 15 0 01 0,5 0,01 16 0,1 0,5 0,05 17 0,05 0,01 0,005 13 0,05 0,01 0,02 19 01 0,01 0,05 22 2 1 0,1 21 0,1 2 0,05 22 0,5 10 0,2 23 0,05 0,5 0,02 2 2 0,1 2 5 0,05 1 0,05 27 2 5 ? I .2 7 0,01 0,1 0,05 t ! 5 58923 29 0,005 0,05 0,02 30 0,005 0,02 0,01 31 0,005 0,02 0,01 32 0,5 2 1' 32 0,02 0,5 0,2 39 5 2 2 35 0,005 ο,ι 0,05 36 0,005 0,01 0,01 37 0,005 0,05 0,02 33 0,01 0,05 0,02 39 0,05 1 0,5 9θ 0,2 1 1' 4-1 0,2 2 1 92 0,1 1 0,5 93 0,05 1 0,5 2-9 0,01 0,2 0,1 95 0,05 1 0,5 96 0,01 0,02 0,05 97 0,005 0,05 0,02 98 5 5 1

Keksinnön mukaisesti valmistettavien yhdisteiden in vivo-akti-viteetti määritettiin hiirissä aikaansaatua akuuttista kokeellista tulehdusta vastaan. Eläimet (CF-hiiriä, joiden paino oli 18-22 g) tartutettiin antamalla i.p. 0,5 ml Staphylococcus aureus-bakteerin sus-nensiota, joka sisälsi 5 % sianvatsamusiinia; käytettiin lo hiiren ryhmiä oraalisesti tai subkutaanisesti annetun antibiootin kutakin neljää sarja-annosta kohti. Hoito aloitettiin välittömästi tartunnan jälkeen ja jatkettiin 3 päivää (kerran päivässä). Seuraavassa taulukossa annetut ED^-arvot mg/kg:na laskettiin Spearman ja Karber'in menetelmän mukaisesti, vrt. Finney, Statistical Method in biological assay, Giffin 529 (1952), 10 päivää tartunnan jälkeen; käsittelemättömät kontrollit kuolivat 98 tunnin sisällä.

Uusien johdannaisten akuuttinen myrkyllisyys määritettiin antamalla yhdisteitä suoneen hiirille ja tarkkailemalla eläimiä 168 tunnin ajan. Seuraavassa taulukossa annetut LD^-arvot laskettiin käyttämällä Lichtfield ja Wilcoxon'in menetelmää - J. Pharmacol. Exp. Ther., £6, 99 (1999).

Taulukko

Yhdiste esi- E050 (S.aureus tulehdus ΙΛ)ςη merkistä No ' hiiressä) 3y mg/kg iv OS SC (hiiressä) 1 Μ7 0^76 159,0 2 2,96 1,37 99,5 3 1,37 1,91 93,5 9 5,28 9 60 73,2 5 , 5,28 9,29 82,9 6 " 13 17,1 88,0 6 58923 7 >16 >16 157,0 8 16 16 96,0 11 >16 >l6 12 >16 >16 510,0 13 ' >+,92 1+,92 76,5 I’m· 3’03 !o0 102.0 15 >16 >16' 90,0 16 >16 >16 ?3! 2

17 > b > ’+ 250.O

18 > >+ > >+ 180' 19 > 8 >8 116 20 >16 >16 152,0 21 „ „ 86,0 23 .12,8 3,57 ?J+ >16' >16 70,0 25 13 9,2 29 3;p iio’° 30 1,63 1,23 122 31 1Λ8 1,29 200 32 30,8 351’+ 30 I % 5’28 '?^9 35 8,0 6,96 110,0 36 0,93 0,76 330>0 37 1,73 1,32 256,0 33 3,73 39 >16 >16 71,0 -0 >16 >16 89,0 >16 >16 73,5 W2 >16 >16 73,0 > ' 79 0

Um 139,0 M 96 5 96 232,0 +7 212,0 162^0

Keksinnön mukaisten yhdisteiden eräs toinen erittäin tärkeä ominaisuus on niiden estävä vaikutus sellaisiin DNA-polymeraaseihin, jotka ovat tunnusomaisia verisyöpää sairastavan ihmisen veri-varhaistmusolu II -le (engl. Blood lymphoblast), sekä virusten tyypillisiä nukleotidi siä trans-feraaseja (polymeraaseja) vastaan, joita normaalisolu ei käytä hyväkseen.

Tiettyjä virusryhmiä koskevat tutkimukset ovat osoittaneet, että virukset joko siirtävät isäntäsoliiMn tai indusoivat niissä polymeraaseja niiden lisääntymisen eräänä tärkeänä osavaiheena. Niinpä on olemassa viruksia kuten picorna- tai poliovirukset, jotka indusoivat RNA-riippuvaista RNA-polymeraasia, kun taas muut virusryhmät, kuten leukemiä-sarkooma-virukset kantavat mukanaan RNA-riippuvaista DNA-polymeraasia.D.Baltimore , Nature, 226,1209 (1970) jaH.M. Ternin et ai.,Nature, 226, 1211(1970) ovat keksineet RNA-riippuvaisenDNA-polymeraasin eli päinvastaisen transkriptaasin läsnäolon ja sen erittäin tärkeän merkityksen kasvaimia synnyttävissä RNA-viruksissa, Hiljattain ovat myös muut tutkijat löytäneet RNA-riippuvaista DNA-poly meraasientsyyrniä eläinten RNA-kasva in viruksissa, n'’In icuin käy ilmi esimerkiksi seuraavista julkaisuista:

Green et ai.: Mechanism of carcinogenesis by RNA tumor viruses.

I An RNA-dependent ONA-polymerase in murine sarcoma viruses. Proc.

Vat. Acad. 3ci. USA 67, 385-393, 1970.

7 58923

Spiegelman et al.s Characterization of the products of RNA directed DNA-polymerase in oncogenic RNA viruses, Nature, London, 22Z, 563, 1970.

Hatanaka et ai.: DNA polymerase activity associated with RNA tumor viruses. Proc. Nat.Acad.Sci. USA, £2., 1^3, 1970.

Scolnick et ai.; DNA synthesis by RNA containing tumor viruses. Proc.Nat.Acad.Sci., USA, 67T 103^, 1970.

RNA-viruksen esiintymistä eräissä kasvaimissa tukevat myös muut tosiasiat: päinvastaista transkriptaasia on löydetty hiukkasista, jotka on eristetty sellaisten naisten maidosta, joiden suvussa on esiintynyt rintasyöpää tai jotka kuuluvat väestöryhmiin, joissa esiintyy sukusiitosta (Scholn et ai., Nature, 231T 97, 1971). Priori et ai. (Nature, New Biology, 2^2T 16, 1971) ovat eristäneet ESP-l-nimistä, päinvastaista transkriptaasia sisältävää virusta lymfomaa sairastavan lapsen keuhkopussinesteestä ja onnistuneesti viljelleet sitä kudosvil-jelyissä. R. Axel et ai. (Nature, 235T 32, 1972) ovat molekyylihybri-daatiokokeilla osoittaneet, että ihmisen rintasyövässä esiintyy hiiren nisäkasvainviruksen RNA: RNA-homologeja. Vielä el ole olemassa mitään erityisen tehokkaita lääkkeitä virussairauksia vastaan koska virusten ja solujen aineenvaihduntatarpeet ja -toiminta ovat samankaltaiset. Lupaavin menettely viruskemoterapiassa on selvästi sellaisten sopivien kemiallisten aineiden kehittäminen, jotka spesifisesti yhtyvät virusta! virus-muunnettuun solupolymeraasiin mutta eivät isäntäsolujen niihin polymeraaseihin, jotka säätävät virusten geneettisen informaation ilmaisumuodon. Virus- tai virus-muunnettujen soluentsyymien spesifisillä inhibiittoreilla, ja erityisesti RNA-kasvainvirusten polymeraasi--inhibiittoreilla voi olla huomattava merkitys leukemian hoitoon tarkoitettujen lääkkeiden kehittämisessä sekä syöpäterapian muilla aloil-ia.

Keksinnön mukaisten yhdisteiden estävää vaikutusta on kokeiltu hiirisarkoomaviruksen RNA-riippuva!seen DNA-polymeraaslin (endogeeninen) sekä puhdistettujen entsyymien DNA-riippuvalseen DNA-polymeraasi-aktiviteettiin. Estovaikutus määritettiin käyttämällä C. Gurgo et ai/in menetelmiä, Nature, New Biology, 229, 111, 1971.

Lääkkeiden vaikutus eri konsentraatioina polymeraasiaktivitoettiin määritettiin mittaamalla %-dTTP:n (tritoidun tymiini-deoksiribo-sidi-trifosfaatin) liittymistä liukenemattomaan fraktioon. Seuraavassa esitetään esimerkkinä eräs tyypillinen koemenetelmä.

Viruksen eristäminen ia virusnolymeraasin puhdistaminen

Virus eristettiin ja puhdistettiin hiirisarkoomaviruksella (Moloney eriste) muunnetuista rotansoluista (7ÖA1 soluja) ja hiirisar- 8 58923 koomaviruksella (Harvey eriste) muunnetuista hiirensoluista (MEH-soluja) niin kuin aikaisemmin on selitetty (Green et ai., Proc. Nat.

Acad. Sei. USA 62., 385-393, 1970, Rokutanda et ai., Nature, 227, 1026-1028, 1970). Viruspolymeraasi puhdistettiin 20-^+0 kertaa hautomalla puhdistettua virusta 0,5^:lla NP-M) (Nonidet P-kO) 0,1 M NaCl: ssa, 0,01 M tris-puskurissa (pH 7,6), 0,001 M EDTAtssa 5 minuuttia huoneen lämpötilassa, ja vyöhykesentrifugoimalla l5-30#:n sukroosi-väkevyyksissä 10 mM natriumfosfaattipuskurissa (pH 7,*0, 2,5 mM MgCl^sssa, 10 mM ditiotreitolissa, ja sa glyserolia 2*f tuntia nopeudella 38ΟΟΟ kierr./min. Spinco SW^-l-root torissa. Kahdestäkymme-nestäkahdesta fraktiosta kerättiin entsyymiaktiviteetln piikkifrak-tiot (13-17), ne yhdistettiin ja varastoitiin -70°C:ssa 3P$lsssa glyserolia.

DNA-polymeraasikoe

Entsyymiä haudottiin yksi tunti 37°Csssa 100 μΐίβββ reaktio-seosta, joka sisälsi kO mM tris-puskuria (pH 8,0), 5 »M ditiotreito-lia, 30 mM NaClsää, 2,5 mM MgClgtää, 0,1 mM dATPitä, dGTPttä, dCTP:tä, ja 10 μΟί ^I-dTTP:tä (12-18 Ci/mmooli) Green et ai.'in mukaan, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 6»2, 385-393, 1970. Reaktio keskeytettiin lisäämällä 150 μΐ IN perkloorihappoa. Kantajaksi lisättiin vasikan kateenkor-va-DNA:ta (100 ^g)5 radioaktiivista DNA-tuotetta käsiteltiin edelleen niin kuin on selitetty kahdessa edellämainitussa julkaisussa. Endogee-nisen RNA-riippuvaisen DNA-polymeraasin aktiviteetti mitattiin sen jälkeen kun puhdistettuun virukseen oli lisätty 0,01 % NP-*K) mittaus-hetkellä. Puhdistetun viruspolymeraasin DNA-polymeraasiaktiviteetti määritettiin käyttämällä 2 μζ poly d(A-T):tä templaattina (engl. template) ilman NP-*K).

Rifamysiinijohdannaiset liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO) 5 mg/mlsn konsentraatiossa ja varastoitiin ^Csssa. Estävää vaikutusta endogeenisen RNA-riippuvaisen DNA-polymeraasin aktiviteettiin määritettiin lisäämällä 2 μΐ johdannaista, joka oli sopivasti laimennettu DMSOslla, tai 2 μΐ DMSOjta (kontrolli) koeseokseen, ennen sen lisäämistä hajonneeseen virukseen, joka sisälsi 15-30 μ% virus-proteiinia. Entsyymi-inkubaatio suoritettiin 60 minuutin ajan 37°C:ssa. Puhdistetun entsyymin estyminen määritettiin esihautomalla 2 μΐ johdannaista tai DMSO:ta 30 μ1:η kanssa entsyymiä (1-2 jug proteiinia) 10 minuutin ajan 37°C:ssa$ sen jälkeen lisättiin 70 jul substraatti-seosta ja seosta haudottiin ja käsiteltiin edelleen kuten edellä on selitetty.

9 58923

Eräissä tyypillisissä kokeissa keksinnön esimerkkien 1,3 A? 5,6,7,10, 13,IA ja 16 mukaiset yhdisteet 2-100 p.g/mltn tai pienemmissä konsen-traatioissa vähensivät ^H-dTTPrn liittymisen arvoon, joka oli alle 10# kontrollikokeisiin verrattuna, selvästi osoittaen yhdisteillä olevan estävä vaikutus RNA-kasvainviruksiin perustuvaan karsinogenee-si-mekanismiin uusimman biokemiallisen näkökannan mukaan.

Estävä vaikutus päinvastaisiin transkriptaaseihin on havaittu myös hiirileukemiaviruksen polymeraaseja koskevissa kokeissa. Hii-rileukemiaviruksen RNA-polymeraasia valmistettiin Triton X 100sila hajotetuista viruksista Gallo et ai.'in mukaan, Nature, New Biology, £3£, l!+l (1971). Sekä Rauscher- että Moloney-tyyppiä olevaa virusta puhdistettiin etukäteen keräämällä sukroositiheysgradientti&rvoa 1,16 g/ml vastaava fraktio sen jälkeen kun solu-sivutuotteet oli poistettu hitaalla alkusentrifugoinnilla ja kerätty tyynylle 60# sukroo-sia kautta 20# sukroosia. Virusvalmisteen loppukonsentraatio oli lO^·1 hiukkasta/ml. Templaattina käytettiin endogeenista 70 S RNAsta. Todettiin 50 ;ug/ml:n tai pienempien konsentraatioiden olevan tehokkaita entsyymin estämiseen. Estovaikutus oli esimerkiksi noin 50# käytettäessä vain noin 10-25 >ig/ml*n konsentraatioita tyypillisiä yhdisteitä 5,6 ja Ib.

Samanlaisia tuloksia saatiin käyttämällä ihmisestä peräisin olevaa kasvainsolupolymeraasia. Tässä tapauksessa tutkittiin estävä aktiviteetti myös normaalisolujen polymeraaseja vastaan selektiivisen vaikutuksen selvittämiseksi. On määritetty eräiden kaavan I mukaisten tyypillisten rifamysiinijohdannaisten vaikutus kahteen puhdistettuina DNA-polymeraasiin, jotka oli eristetty (1) ihmisen normaaleista (PHA-stimuloiduista) verilymfosyyteistä, (2) varhaisimusoluista (terveestä yksilöstä) ja (3) verisyöpää sairastavan ihmisen varhaisimusoluista. Käytettiin synteettisiä ja/tai luonnollisia templaatteja. Seuraavassa esitetään esimerkkinä tyypillinen koemenetelmä.

Ihmisen verivarhaisimusolut

Leukeemisiä varhaisimusoluja eristettiin leukoforeesin avulla akuuttista lymfosyyttistä leukemiaa (ALL) sairastavien potilaiden perifeerisestä verestä. Solut pestiin ja erytrosyytit poistettiin hy-potonisella lyysillä. Normaaleja lymfosyyttejä saatiin terveiden henkilöiden perifeerisestä verestä sen jälkeen kun granulosyytit oli poistettu nailon-pylväskromatografiällä. Ne stimuloitiin fytohemagglu-tinlinillä (PHA) 72 tuntia kuten edellä on selitetty (Gallo et ai., Nature, ££8 , 927, 1970; Gallo et ai., Science, l65T MX), 1968) DNA--polymeraasiaktiviteetin saattamiseksi maksimiinsa.

10 58923

Niiden käytännöllisten vaikeuksien Johdosta, Jotka kuitenkin liittyvät näiden solujen eristämiseen riittävin määrin, käytettiin ihmisen "normaalia" kudossolusukupolvea (1788) vähemmän puhdistetun DNA-polymeraasin tuottamiseksi eräitä alkututkimuksia varten. Mielenkiinnon kohteena olevia yhdisteitä tutkittiin sitten yksityiskohtaisemmin käyttämällä normaaleista Ja leukeemisistä verilymfosyyteistä eristettyä puhtaampaa entsyymiä. Nämä kudosviljelysolut saatiin Associated Biomedic Systems, Inc.^stä.

DNA-polvmeraasivalmlsteet

Solu-DNA-polymeraasia uutettiin Ja puhdistettiin normaaleista (FHA-stirauloiduista) verilymfosyyteistä, leukeemisistä verilymfosyy-teistä sekä 1788-imusoluista homogenoimalla hypotonisessa puskurissa Ja sen Jälkeen uuttamalla ekstralysosomaalinen sakka Triton X 100:11a Ja/tai väkevällä suolalla. Differentiaalisentrifugoinnin Jälkeen solu-uutteet puhdistettiin edelleen DEAE-selluloosa-, fosfoselluloosa-Ja Sephadex G 200-pylväskromatografiällä.

PNA-polyftQrftapikqkeQt DNA-polymeraasikokeet suoritettiin käyttämällä 100 ^il:n lop-putilavuutta. Koeseos sisälsi tris-HC1-puskuria, pH 8,3, 50 mMf MgAcstä, 6,0 mM; ditiotreitolia, 8,0 mM$ NaClsää, 60 mM. pH säädettiin sen Jälkeen kun dimetyylisulfoksidiin (DMSO) esiliuotetut inhibiittorit oli lisätty. DMS0:n loppukonsentraatio oli 0,5# Ja kaikki kontrollinäytteet sisälsivät tämän määrän DMSO:ta. Kokeessa käytettiin sellaista entsyymikonsentraatiota, Joka katalysoi noin 1,0 pmoolin tuntinopeudella tapahtuvaa liittymistä. Entsyymiä esihaudot-tiin yleensä viiden minuutin aikana inhibiittorin kanssa. Reaktio saatettiin sitten alkuun lisäämällä templaattia, Joko synteettistä DNA:ta (poly d(AT), Miles Lab.) Ja DNA.RNA-hybridiä (oligo dT.poly rA), 5 >ig/ml:n konsentraatiossa, tai luonnollisia templaatteja: aktivoitua lohislfimenneste-DNA:ta konsentraatiossa 50 ;ug/ml, Ja endogeenista 70S virus-RNA:ta; 10 ^uCi (3H-metyyli)-TTP:tä (New England Nuclear, 18,6 mCi/^imooli, lyofilisoitu Ja liuotettu uudestaan 0,01 M HClsään Juuri ennen käyttöä) Ja dATP:tä (8 x 10“5m, synteettinen templaatti) tai kaikkia kolmea deoksinukleosiditrifosfaattia (8 x 10“5m, RNA- tai DNA-templatoidut reaktiot). Muutamissa kokeissa ei entsyymiä esihau-dottu inhibiittorin kanssa. Näissä tapauksissa reaktiot saatettiin alkuiin lisäämällä entsyymiä täydelliseen reaktioseokseen, Joka sisälsi myös inhibiittoria. Näytteitä otettiin hautomisen alkuvaiheessa ja 30 minuutin kuluttua Ja keskeytettiin lisäämällä 2 ml 0,08 M natrium-pyrofosfaattia, ja saostettiin 12,5#:ssa kylmässä trikloorietikkaha- 11 58923 possa (TCA) käyttämällä hiiva-RNA:ta (*+00 pg) kantajana. Tuotteet kerättiin Millipore-suodattimelle, pestiin huolellisesti 5#ilia TCA: 11a ja 1 ml:lla DMSO-etanoli-0,1 M NaCl-seosta (0,5 : 70 : 29,5), kuivattiin ja laskettiin 2 ml:ssa BBS^:a (Beckman) ja 10 ml*ssa liquifluor'ia (New England Nuclear) Packard nestetuikelaskurissa.

Tyypillisissä kokeissa todettiin että 5-10 jag/ml esimerkkien 5,6 ja 1*+ yhdisteitä estää 50 #:sesti leukeemisen polymeraasin, jolla oli synteettinen DNA-templaatti. Reaktiot, joilla oli synteettinen RNA-templaatti (poly rA.rU), olivat vieläkin herkemmät.

Normaalia ja kasvainsolupolymeraasia koskevat kokeet, joissa käytettiin luonnollistatemplaattia, osoittivat kasvainentsyymeillä olevan suurempi herkkyys koeyhdisteitä vastaan.

Uusien rifamysiinijohdannaisten muista biologisista ominaisuuksista mainittakoon niiden estävä vaikutus hiirisarkoomaviruksen Moloney- ja Kirsten-kantojen pesäkemuodostukseen hiiren, rotan ja ihmisen soluissa; niiden selektiivinen estovaikutus jo muunnettujen hiiri- tai ihmissolujen virustuottoon; lisäksi on havaittu solujen palautuvan entiselleen hiirlsarkoomaviruksella muunnetuissa ei-tuotta-vissa hiiri- ja rottasolusysteemeissä. Esillä olevan keksinnön mukaisten yhdisteiden selektiivinen myrkyllisyys hiirestä, rotasta ja ihmisestä peräisin olevia virus-muunnettuja soluja vastaan, on todettu myös kokeissa, joissa virusten pesäke-muodostamisominaisuuksia on tutkittu.

Tutkimuksissa, joiden tarkoituksena on määrittää yhdisteiden estovaikutus Moloney'in sarkoomaviruksen pesäke-muodostukseen BALB/ 3T3 kudosviljelyissä, käytetään seuraavaa menetelmää: BALB/3T3-soluviljelmiä pidetään 250 ml:n muovipulloissa kas-vuaineessa, jossa on Eagle'n 11 Minimal Essential Medium'ia", joka sisältää 10 % sikionaudanseerumia. Solut lasketaan Coulter-laskurilla sen jälkeen kun solut on suspensoitu trypsiini-EDTA:lla ja laimennet-tu kasvuaineessa. Kasvain-homogenaattina käytetään Moloney n hiiri-sarkoomavirusta. Virusten annetaan lisääntyä neljä kertaa sveitsiläistä alkuperää olevissa suurtehoisissa hiirisikiö-soluissa ja pesäkkeitä muodostavat yksiköt määritetään BALB/3T3-soluissa. Näissä tutkimuksissa käytetään Hartley'n ja Rowe'n, Proc.Nat.Acad. Sei. 780 (1966) menetelmän erästä muunnosta. Ko. tapauksessa lisätään pulloihin 1-2 x 10^ solua 25 mlsssa kasvuainetta ja pidetään 37°C:ssa 2*+ tuntia. Nesteet poistetaan, minkä jälkeen virusta, jossa on määrätty määrä pesäkkeitä muodostavia yksiköitä, lisätään 0,5 ml:aan kasvuainetta ja annetaan adsorboitua solujen muodostamalle yksinkertaiselle 12 58923 kerrokselle 90 minuutin aikana 37°C:sessa. Tämän adsorptioajan jälkeen lisätään määrätty määrä, yleensä noin 5-10 jig/ml rifamysiiniyhdistettä (joka on etukäteen liuotettu dimetyylisulfoksidiin 1 mg/ml:n konsen-traatiossa) 25 ml:ssa kasvuainetta ja viljelmät siirretään takaisin lämpökaappiin. Kontrollina lisätään pelkkää dimetyylisulfoksidia kas-vuaineessa erilliseen viljelyyn. Kolme päivää kestäneen ymppäyksen jälkeen viljelysten neste vaihdetaan ja seitsemäntenä päivänä lasketaan muunnettujen solujen pesäkkeet.

Samaa menetelmää käyttäen tutkitaan suun rakkulatulehdusta aiheuttavaa virusta, New Jersey serotyyppiä. Tämän viruksen viljelemisessä ja tutkimisessa käytettyjä menetelmiä ovat selostaneet Hacket et ai., Virology, li1* (1967).

Edellä mainitut ominaisuudet osoittavat, että näillä yhdisteillä on tehokas estävä aktiviteetti viruksilla indusoituja kasvaimia vastaan eläimissä.

Keksinnön mukainen menetelmä uusien yhdisteiden valmistamiseksi suoritetaan siten, että 3-formyylirifamysiini SV:tä tai sen 25-desase-tyyli- ja 16,17,18,19,28,29-heksahydrojohdannaista käsitellään orgaanisessa liuottimessa stökiömetrisellä määrällä kaavan NH2-0-R mukaista O-substituoitua hydroksyyliamiinia, jossa kaavassa R tarkoittaa samaa kuin edellä. Annetaan seistä huoneen lämpötilassa jonkin aikaa, joka vaihtelee 20 minuutista aina muutamaan tuntiin, minkä jälkeen raaka yhdiste eristetään väkevöimällä tai haihduttamalla liuotin. Näiden johdannaisten puhdistaminen ei tuota orgaanisen kemian asiantuntijoille mitään suurempia vaikeuksia, ja se suoritetaan yleensä kiteyttämällä sopivasta liuottimesta, joka esimerkiksi on alempi alkanoli tai bent-seeni.

Uudet yhdisteet ovat värillisiä kiinteitä aineita, jotka liukenevat tavallisiin orgaanisiin liuottimiin, kuten bentseeniin, etyyliasetaattiin, kloroformiin, dioksaaniin, tetrahydrofuraaniin tai vastaaviin.

Esimerkkien 1-16, 18, 20, 21, 23, 33 ja 35 mukaisten rifamysii-nien valmistamiseksi käytettävät hydroksyyliamiinit ovat tunnettuja yhdisteitä ja valmistetaan tunnettujen menetelmien mukaan, vrt. esim. E.L. Schumann, R.V. Heinzelman, M.E. Greig ja W. Veldkamp, J. Med.

Chem. 2, 329 (196k). Esimerkeissä 28, 29, 32, 31*, 36-38, Mf, k-7 ja *+8 käytettävät hydroksyyliamiinit on valmistettu B. Cavalleri, G. Volpe, A. Perazzi, A. Omodei-Sal£'n mukaan, Il Farmaco-Ed-Sci 22 (9) 710-719. Erityisesti on esimerkeissä 28, 29, 32 ja 31* käytettävät hydroksyyliamiinit valmistettu seuraavan kaavion I mukaisesti: 13 58923

KAAVIO I

konhcooc2h? R'-CH -Br-^ R'-CH.ONH-COOC.H.

κ Dr (c H 0H) 2 2 5

T 22 II

Na ^/(C2H^0Hlaimea) R'-CH0-ONH9 .HC1 p/

* III

kondensoimalla sopiva kaavan I mukainen alkenyylibromidi hydroksiure-taanin K-suolan kanssa ja hydrolysoimalla alkalisesti välituotteena muodostunut kaavan II mukainen O-alkenyylihydroksiuretaani. Lopputuotteena saadut kaavan III mukaiset hydroksyyliamiinit on identifioitu seuraavassa taulukossa R' lähtöyhdiste allamainitun k.p./mmHg esimerkin raukaisen rifamy-siinijohdannaisen valmistamiseksi CH2=C - 28 90-100/10 c2R5 CH3-CH=CH- 29 90/0,5 CH3 CH3-(j:=CH(CH2)2-C =CH- 32 135-^0/0,5 CH3 CH3-C=CH-(CH2-CH2-C =CH)2- l>+0/0,02.

CH3 CH3 0-(2-propenyyli)-hydroksyyliamiini-hydrokloridin (sul.p. 172°C haj.) valmistus on selitetty julkaisussa O.L. Brady, F.H. Peakin, J. Chem. Soc. 1930. 226 ja 0-(2-propinyyli)-hydroksyyliamiini-hydroklori-din valmistus on selitetty julkaisussa CA 6^+, P5053 (1966). Esimerkkien 36-38, M+, >+5, V7 ja *+8 mukaisten rifamysiinien valmistamiseksi käytettävät hydroksyyliamiinit valmistettiin seuraavan kaavion II mukaisesti: • 'Φ* ^

Ik 5892 3

KAAVIO II O

II

C

ho/7 |l J o

^ ^ Q

R'-CH9-Br O / 2 ^ R'-CEU-O-N II |

^ d V K yJ

K2C0 DMF) Y

J 0 R'CH20NH2. Z 1)CH3C00H /HC1 2) (C00H)2 saattamalla sopiva alkokslalkyyli-bromidi reagoimaan N-hydroksiftalimi-din kanssa DMFrssä kaliumkarbonaatin läsnäollessa ja hydrolysoimalla muodostunut välituote happamasti seuraavien hydroksyyliamiinien valmistamiseksi : R' Z lähtöyhdiste alla- sul.p. k.p./mmHg mainitun esimerkin mukaisen rifamysii-nijohdannaisen valmistamiseksi CH3OCH2- (C00H)2 36 Qk-85 c2h^och2- (cooh)2 37 ^3-^5 nC^HgOCHg (C00H)2 38 175-80/0,5 C6H^0-(CH2)3- (C00H)2 kk 115-6 c6h^o-(ch2)^- Ccooh)2 *+5 65-6 7 CH3-CH-0CH2- (C00H)2 k7 160/0,5 ch3 C6H^0(CH2)9- i(C00H)2 If8 89-90

Seuraavassa taulukossa on identifioitu muut uuden kaavan R0NH2 mukaiset O-substituoidut hydroksyyliamiinit, jotka valmistetaan edellä annetun kaavion I mukaisesti.

A

- ,1 15 58923

R lähtöyhdiste allamainitun k.p. (mm),°C

esimerkin mukaisen rifamy-siinijohdannaisen valmistamiseksi -CH(C3H7)C3H7 25 37-38 (0,1) -CH(C2H^)C1+H9 36-39 (0,1) -0Η(03Η?)0^Η9 *+l hi-1+5 (0,1) -CH(C2H9)C9H„ 37-^0 (0,1) -CH(CH3)C?H„ ^3 31-32 (0,5) -(ch2)6oh 8^-85 (0,3) -Ci^-C6H3-o,p-Cl2 39 85-86 (0,2) -0Η2-0Η2-ο-Ν0^Η8 17 52-53 (0,1) -CH2-CH2-c-N(CH2-CH2)2N-CH3 19 80-83 (0,>+).

Keksintöä havainnollistetaan seuraavilla esimerkeillä.

Esimerkki 1

Suspensioon, jossa oli 0,01 moolia 3-formyylirifamysiini SV:tä 100 ml:ssa tetrahydrofuraania lisättiin 0,01 moolia O-etyylihydroksyy-liamiinia huoneen lämpötilassa samalla hämmentäen. Hämmennetään noin 30 minuuttia, minkä jälkeen liuos kokeillaan ohutkerroskromatografi-sesti piihappogeelillä (CHCl^MeOH 9:1) jolla voidaan todeta milloin lähtöaine on hävinnyt ja lopputuote muodostunut. Kun karbonyyliyhdis-te on hävinnyt kokonaan liuos väkevöidään kuiviin ja raakatuote kerätään ja puhdistetaan kiteyttämällä etyyliasetaatti-ligroiinista, jolloin saanto on 62 % 3-f‘ormyylirifamysiini SV-O-etyylioksiimia, sul.p. 21^-215°C.

Elementaarianalyysi; laskettu: C 62,^8; H 6,82; H N 3*6^ saatu: C 61,55; H 7,l*f; H N 3,36

Signifikatiiviset UV- ja näkyvät juovat (nm): V70 182,8) ja 325 «äi*eB 283,6).

Lähtöyhdiste kaavan I mukaisten rifamysiinien heksahydrojohdannaisten, ts. l6,17,l8,19,28,29-heksahydro-3-formyylirifamysiim SV:n valmistamiseksi saadaan seuraavalla tavalla: 20 g rifamysiini S:ää suspensoituna 600 ml:aan kuivaa etanolia, 16 58923 hydrataan Parr-pommissa 2 g:lla PtC^ katalysaattorina, 3 tuntia huoneen lämpötilassa noin 5 atmosfäärin vetypaineessa. Katalysaattori suodatetaan pois, minkä jälkeen liuos haihdutetaan kuiviin ja raaka tuote, tetrahydrofuraaniin liuotettuna, hämmennetään 18 g:n kanssa MnC^ huoneen lämpötilassa. Epäorgaaninen sakka suodatetaan pois, suo-dos haihdutetaan pieneen tilavuuteen, minkä jälkeen seos liuotetaan etyyliasetaattiin (300 ml), ja pestään vedellä. Orgaaninen kerros kuivataan Na2S0^:llä ja haihduttamisen jälkeen saadaan 8 g heksahydro-rifamysiiniä, sul.p. 158-60°C (metanolista). Tuote muutetaan sen jälkeen vastaavaksi 3-formyylijohdannaiseksi käyttämällä GB-patenttijulkaisussa 1 219 360 esimerkissä 5 selitettyä menetelmää, esimerkiksi kuumentamalla noin 16 tuntia ^5-50°C:sessa seosta, jossa on heksahydro-rifamysiini S:ää ja kaksi ekvimolaarista määrää formaldehydiä ja tert. butyyliamiinia tetrahydrofuraanissa, käyttämällä mukana saman primäärisen amiinin ylimäärää ja mangaanidioksidia hapetusaineena. Kiinteän aineen poissuodattamisen jälkeen lisätään suodokseen askorbiinihapon vesipitoista rikkihappoliuosta ja tunnin kuluttua ^5-50°C:sessa liuos väkevöidään tyhjössä ja jäähdytetään 10°C:seen kunnes 16,17,18,19,28, 29-heksahydro-3-formyylirifamysiini SV on kiteytynyt. Raaka tuote voidaan puhdistaa pylväskromatografoimalla sen kloroformiliuosta piigee-lin läpi ja eluoimalla kloroformilla, joka sisältää 1% metanolia. Kro-matografoitua liuosta haihduttamalla saatu yhdiste on 16,17,18,19,28, 29-heksahydro-3-formyylirifamysiini SV, joka sulaa 126-133°C:sessa.

Täysin analogisesti esimerkissä 1 selostetun menetelmän kanssa valmistettiin seuraavassa taulukossa luetellut yhdisteet.

17 58923

I I I I I 1 I I I I

o I I I I 1 I I I I

-p 3 I I 1 I I I I i J

Q) *r-3 I I I I I I I I I

CO I I I I I I I I I

•H -P I I I I I I I I I

> vrt 1 I I I I I I I I

•H '> & I C\J C\J I ON O I ON CO I CM O- I SOVO I PO\r\ 10 0*00 » >r| ^ O* a-s #v I r-r> I r> I <n r> | *-> ** | r* rv | r r | r». r* |

+3^¾¾. I I—I ON I O-ON I nO r-t COJ- I WJ- I CO CO I NO O I ΓΟΟΝ I

Cd -cd r—i H I ON ON 10-0- I 0-00 I 0-0- I Λ CO I CO CM I U\U\ I CON I

Ρ β ta I I—I C\J I HfM li—iCNJ I I—I C\J I ι—I CM I»—I CM I ι—|C\J It—I CM I

•H I I I I I I I I I

Cm Cd I I I I I I I I I

η ·γ-3 en I I I I I I I I I

d id I I I I I I I I I

M I P cd ICOnO I CO O- IOOnO I CO Un I UnOn IOO lOO I OllN I

•H !> Cti S I NO CM I NO OJ I nO CM I Np CU I O-CM I CO OO I 00 CO I tOOJ I

tnB > ι J- co Ijpro ip|-coi,3-ooiJ-coiphcni,i-coiJ-co i

I I I I I I I I I

i c^Ti—i I o-O I HN I uvun loON I co Un I mir\ i no Ο i

I Un Un I Un o— I UNnO I J-N I CJJ· I OtM I (\)cO I ΙλΟν I

22 I »N r· J CN CN I r» *·« | «^ **· | r- *- I | •H i roro ] roro l roro I roro l on ro l roro i roro l roro i

CO I I I I I I I I I

> .OI UN o I UnCM I 00 H I O CO I nO O I CO ON I 0-00 I O-CO f

S id P I ON ON I ON i—I I O H 1 C\1 OJ I U\nO I ON o I NO O- I NO ON I

t—I CO Cd I *- «- 1 «- ·- I r-^-l .-.- | .- .- I #-r-| r-«-| |

cd cd cd I ΝΟΝΟ I NO O- I 0-0- I O-[O I [NO- l 0-00 I 0-0- I ΝΟΝΟ I

d rH w I I llllll I

CÖ I OON I o 00 IOUnIOOCUInOCOInOO-I i—ICO I H OJ I

I ONH i On Un i roj- ι nOnO l 0-0 l O Un l H H l CMJ- l Q | «s r. | «s r> | r r | »sr»| r»^.| r r> | f» r | r r> | I CM oo I CM CM I roro I roro l J-O IvOUn i UnU\ ι h O l

l NOnO I nOnO I nOnO i nOnO I nOnO I nOnO I nOnO I nOnO I

im ι ι—ι ι (M ι oj ι o ι j- ι f—ι ι i ι cl, ι co tm ic\j ίο ι o o too ίο ι

• o I ι—I IC\J I CNJ IC\I I ι—I I H I ι—I I C\J I

H o II II I I I I I I I I I I I I I

0 ι ι—ι l ON IOIOIOOIUN 10-10 I

en 1C» I CNJ ICUIOIOOIONIO-IO ι

I r-t_IC\)_I CM j C\J I H !_I H ι CM__I

1¾¾. ι ι iiiiii ι S InO INO Id ICO ΙΟ ΙνΟ ΙΟ ΙΟ ι

CÖO ICO ICO I O- ι ON I OO li I O- I NO I

en p ι ι ι ι ι ι _!___!_._ι

------r-----1-----1----1-1-1 ι r~r I

1 -H I I -H |l I I I ι ι ι ^ I

•h d -h ι -h d ι 1 2 1 1 1 i 1 1 1 ι S* 1 1

rH -H S I ι—I ·Η O I I S S Il Ö II lllll I >> I

S-H-H I S-H did I I S IS I CD I id I O'-' I O I ' to I

S Μ -Η ι SWPhO li-H+J (»Ιΐρ,ΙΙΟΙΙΌ-Hldll^i-d I

ε s cn ι S sw ι ι — α> ι ι ι v-^-n i wh i n/'n i cd i

Ph ε id 1 d S I rt -H I I -H I I -H I I -H I I -H I I S I I -H I I -H I

OedO ι ΟίΰΟΗβ ΙΟΗ I lOi—I I Ori lOi—I I O S I O rH lOen I I

(Η<Η I I Cm Cd I S-H ι I S/"~' 1 'SI 'S' 'S' lidl I S I lid'-'i

I -H > I I -H > S-H I > S-H l>'SI>>»l>SI><D I > S ' > Ο -H I

CO d CA I dldCQftKl ICQPH ICO-P UO-P 103-P HOd UQd itOdH I

-1-1-1-1-1-1-1-1-1

I -H I -Η I -Η I -Η I ·Η I I ·Η I .m I

I d I ι—I I rH I r—! I rH I ι—I I Ή I pH I I T3 I

p I -Η ΙΟ ΙΟ ΙΟ ΙΟ IO Id ΙΟ I ·Η cti 1

Sen-p Id Id id id Ιβ ΙΟ Ιβ ι rH cd I

cd ·η ο led led led led led i-poicd ι S P ι

PSd I p l-p IP IP IP I CD CM I p ISO I

.Η.Μ.Η I CD I CD I CD I CD l<D I en ϋ I CD ipen I

id p p is IS IS IS IS led iS iCDeti ι

I I llllll I

ι iii SCr ι ι ι iii ι d ι

ϋ I d I I I id I I 1H I lllll I I CD I I IlSlII

0·Ηβ I O-^Oed IBS I I '—' I d ·—' ι I ^ I ' ι I '—' ι CD '—- I d rH -H I d -H d -Η ·Η I I s I d ·Η ι φ ·Η I id -H I O -H I Ο ·Η I I .H -H I

Ό S-H ι ÖHdH d I HP I » Η ι PhH I OP I TdH I βΗ IpJcnrH I

S S S I v—' S S S'H I — <D i'-'Sls-'SlwSl'^SlwSi^idSl d w id ii >»a: s-η iip ι is« ip»»i isi is· ·>»' io>^i

I O Pi I n S I O iH lOplOplOPIOidlOdlOdPI

-(-1-1-1-1-1-1-1-1

I I llllll I

I I llllll I

ι ι ι ι ι ι ι ι id '

I I I I I I I I Ο I

I 10-1 I I IUNI I CM I

cc ι ι td ι ι η ι co ι cm ι on ι id ι IO- ICO I ON I ι—I I ι—I 1 iJ Ip I Ο ι ι id ι ο ι id ι id ι id ι cm i id ι cm i

ICO II l_i IUnIOO IP I ON I id I

IO ι-H IO IO IO IO lo lo I

_I_I_I_I_!_!_!_!_I

I I llllll I

I ο ι I llllll I

I id S I I llllll I

H d I CM ICO IJ-IUNlvOIO-IOOlON I

cn CD -H I I llllll I

M8idi I iiiiii I

_ι_j_!_!_!_!_1_I_J

i8 58923 I I I-1-1-—I-1-1-1

O I I I III II

-P 0 I I I III II

Q) ·Γ-3 I I I I I I - I I

tO I I I III II

•p -p Si Oco I O O I Ο Ο t κΩ ro ι mO ι h\C i J- cm i ^ O I rs lev#*. |«vc^ jr^#N | r-« | #-. #v [ *-v r-> |

•P ’> ^R. I m m 10-0 I 00 Ό I m Ο- I Ο Ό ι Ίο O I ΓΟΗ I

•P >> I—I <—I 10-0- llTMjO I Ό J- I Ό Ό IvDln I J-J- I PO m I

-P ,id C£) I ι—I OJ I ι—I CM I I—I CM I rH CM I ι-H CM I HOI I rP CM I

cö :cd ι ι ι ill ii rid C ι ι ι ill ii •P I I I III I 1

t*-j c? to I I I I I I I I

•H T-J rid I I I I I I I I

C 03 I Ο Ό I Ο Ό I Ο Ό IOJCO I CM CO I OcO I O O I

ω I -P S I O-OJ I O.OJ I (OCX! I O-CM i o-C\j I ο-CV I 00 m I

ή p> o3 r- ι J- co irtro ι j-m ι J-οι ι jro ι j-m ι j-m ι

to jo ι I I III II

-1-1-1-1-1-1-1-'1 ι on ο ι co ο ι iaqo ι ho ivoo ι coio ι ooo ι

I POvO I OJ H I HO ΙΓΟΟ- I C\l Ό I O (\l I OH I

PD I»-»- ί r- r- l^-rs | r-· I#-*- 1 r- r- I r~ r- I

I mm I COCO I rom I coco l roro l mm I coco I

•H I I I III II

to · pi I HN I J-H I \ΟΌ IOOO- lOO I IOtX3 lim I

p> _!d -P I O-vD I 00 CO I m CM IvDsO It30t0 ICO^D I j-j· I

!> td Cl Ct3 I ^ |·Ν#τ I#rr> I *·· c- I c- *- I *- ·- |

A cö ctf l ΌνΟ I \OvD IvO^O I MDvO I \OvO IItMtn IvO\D I

(ί Η ΙΟ I I I I I I I I

Sd lOO ι HH IOO I OOO I HO IQO I mir\ I

ctj ι j-fo ι oo\o ι uao ι rnixN ι o-vo iJh i ocm i I e* β*' I ·-· I r» r> | r- | *··· ·> | #v #>» (·»#*. ]

I ι—I OJ I ι—ι O I COCM I ΌΌ I \r\lr\ I OOO I O-O- I

I Ό\Ω I I vOsO I \OvO I \OO I ΌΌ l \OM0 I

-1-1-1-1-1-1-1-1

• I CO I ι—I I O I J· I ι—I ICO IO I

d, i\o ίο- ι \λ im ivo ιΐΐ'' ιό i

• I ι—ί I ι—I I ι—I I ι—1 I ι—1 I ι—I I ι—I I

rH O II il II II II II II I

pj Ο I Ό 100 I Its I ο ΙΟ I Ό I Ό I

to ι so ιό ι J- ι <m ιό ι itn ι j- ι

Ii—I I ι—I I ι—I I ι—I I H I ι—I I I—I I

-!-1-1-1-1-1 1-1

I I I I III II

S io io ico im iph ico io- ·

So io- ι m i\o i\o 100 i\o ι ό i

to -P I I I III II

-!-,-,-,-,-,-,-,

I ·Η I I I III II

•h C -Η ι ι A ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι

1-1 -P E I -H I ·Ρ I -P I A 1 2 ·Η I I I I ι I I I I I I II

!>,·Η ·ρ I I to S'A ι I to . I I to >>·Ρ I I ·Η I I I ·Η ^ I I ·Ρ ^ I ·Ρ I ^ I

>, to .p ι >i5 I Hrd tnp I <H -id >>iP I CM I mp -Η I J- I P P I -d -Η ·Η I

S !>> to mo-Pftmo4!SmoC!>,i^ i>>*H » ^ S'sl ι W*H >><H ι p i

P S .id I IrQOOl IXitUPol I ,Ο φ S I I >>H I I I I S >> >> I I k*> >> I

0 cd O 1 O P S P I O P S A IOPCh-P IOÖ>^IOCPhIOOC1>>IOS|>>I

tpCpl I IcdiPil ICÖISI IctiltPI I OJ >T, I ΐωοι I P <D -P I I Cj +3 I

ι -η > ι p> pd oj -π ι p> -id ensi ι > ,id cm ·η ι t> -p i>tMP i>^ch(ii i><d<d i enpen imi ihimi i h i m i iHicoituicQifticQi ιΘιμ<+ηΘι _I_I-1-1-1-1-1-1

I I I I I ·Η I -H I ·Η I

IGI I I II I ι—I I ι—I I ι—I I

-P I .P I I I I vH I I I . I ·Η ·Η I Ο I O I O I

>,np II -p ι -H CdS I -H CÖ ig IrH-PIÖ 1C 1C I

o-ΡΟ 1+3¾ ΙΉΡΒ I ι—I P ·Η I [>» I +3 I ce ι cti Icö I

-P S p3 Ido I -H +3 O l-H-PR I i>> tl) CI) I -P l-P l-P I

P :cO ·Ρ I <D CU I p (DH I Ή O h I -P ID a) I O) I tl) I φ I

^:+3^3 i-Qto ι x3 -P rid ι ä +3 λ itucfl-piS iS IS ι

I I III II

2 1.11 I I I I I I I I I I I A 1 ι

1 I p I ·Η Ar I P I ·Η' I p I ·Η I I I I I O I O >».p III I

rid I τΗ I tö cm fH -Η ι ttJ ΓΟΗ Ή I (SniHp I (D I I I (DP I IP I φ Φ I I

ο ·Η α I ,id I I rid I >>H I X I >»·Η I P ID'-' I P I ö C I tn I

P rP -P I ι ·Η >» C? I I -H S >> I ι -Η >>Η ι I ·Η ·Η I I ·Ρ ·Ρ I I tD -P I ·Ρ -P ·Ρ I

TO >>-P IHinpglHOlPSIHtoOil tMHH I rOi-H H UPh Φ I Ό ι—I H I

SSS I^MCDOI^ridtU-Pl^^dtDtnl^-SAl^^Sl^lS I w >> ί>> I

xjtocö ι lOSpi lOSgi I OPPI I >« Ρ-ί I !>>>il l-p-p I !>»>>l

10^0 I ft I OP IrQ I OP I tD IOC-P lOÖP^lOSrP I O Ö -P I

-1-1-1-(-1-1-1-μι CM I I III II

I s I I Ό I I I I I

ι m ι ι ι ® ι ι ι ι ι

1¾ 'Ä Ivo I ΐΌι I I

ΙΟ ΙΟ ΙΟ I IffJI I I

I·"-" I CM I CM I I s£) I p, I I

ltd ltd ioio ii ι ι

IO IO IO ltd I CM Ip I CM I

l^-x I '—n IvO ltd I PQ I ·—' I

pd ltd ltd ltd io io ι i ιόι

IO IOCMIO (CM I CM ltd lid I

io ι o ^ io ltd ltd i\o ivo ι io locnio io io io ι ο ι

I'-' 1^¾ I —- I CM I CM I CM I

ltd. itdo ltd ltd 'td ι td ltd ι

IO· I o w to IO io IO IO I

-(-(-1-1-1-1-(-1

I ο I I I I I I I I

I ϋ S I I I I I I I I

-P P I I I III II

ϊ) φμ I O I P I CM I m I J- I Ό I so I

MSrid Ii—I Ii—I Ii—I I H Ii—I Ii—I Ii—I I

I I I III II

1_I_I_I_I_!_\__J_I

19 5 8 9 2 3 -,-1--1-T-Γ I I “

-Pill il I I

(Dill II 1 1 cn I I I ii 1 1 __ -

•H-P Si O O I O O I O O I IA I JnVn I ΙΝΊτν I COnO

>._j Ol·'·' i «- «^ I ·» »- I *· I *· ·· I *· ·· I o'-

•H> ^ I 0-0 I t\lts I 00 H I tN_J I CMJ- I CO UN I CN-0O

H to H H I nOUn I V0J- I UnUn I no CM I UNpj- I UnUn I

+J^ Η I HW IHC\1 I H CM I H CM I H CM I H CM I HIM

cd -ccS I 1 1 11 1 1 id C I I I I 1 1 1

•Hill ll I I

Cm ttf -P M I I I II 1 I

•H -<-3 Cö X I I I I I ' ' _ r- H > (i I ΛΙΝ I O UN I O UN IOOI UN00 no in > o n~

taO I O S I INCM I IN.CM I tNCM I CO rO I INCM I INCM I IN CM

•H s ^ v— i _J no I _J no I J-no I J- no I pf- ro ij-no ij-co cη ζζ) j_[_]_I _I __ I_j____

I CM IN 1 noo IvOlXN ICOO I JO I UNO I

I OvO I ONO IJ-CM I H CM I no i—I I J CO inOr-l

S I r- «- I »· «s (•s·' I ^ I I»-». I r\Z

I lrv± I J- Un I nO NO I no no I no no inono inono •H I I I II I 1 ^nl

cn · H l O UN I ΗΌ IHON l CO CM I Un H I H no I

N >1 4J I H no I CM CM I CM nO I N-CO I J" J- I IN-00 I nOPT

N CÖ CO Cj I r- I ^ I I I «- *- I - ^

H (Ö ίϋ I ININ IIN-CN I IN (N I NN I INN IIN-IN I N N

¢1 Hie I I I, II I „ I - vr.

C I N-CM I COnO I JH I nOH I CM CM I Ό O I NO nO

CÖ I ON I Jo I rOH IJJ I JCn IHj- iO^O

Q I r- r- I r- r~ | #* r- | »- r | f- r- I #- I ^ I nOH I nono I CM CM I UnUn I pj pj- I UNpf- I -J ^ I \OnO I nOnO I NO nO I nO nO I nO nO I nO nO | nO Ό _I-1-1-1-1---—-1-1--

ICO I I CO IHIO I Un I Q

p, I nO I 100 IOIJ- I CM I -J

. I Η ΙΟ I H IHIH I H I H

HO II IIN II II II II II

30 I CM IH IIN IN I J ICO ICN

cn I nO I I 00 I CJ\ I no IH I no

It—I I I I—I II t—I I I—I I 1 I

-1-1-(-)-1-" -----1-1--

1¾¾. I I I -II I I

5 I Ον I CM InO I J I O I Un I U>

a O I no I Un I I nD I pJ I0O lOO

cn -p I I I I_j_j_j___

I H I I I II I I

•HÖH I I I I I I I II I H I I

Η-HS I II I H >a I I -Ö II I P< Il I I ® « Jd >»H H I I H Q) I I Ό >> I I H S I I I φ I Φ 1^ W H 2 I Φ

Stn-H ICMHHI I CM H -P I J H 51 Hnt I 3 I 1,01 I O I Φ H *d I J2 1

£ >>W iwOH^nInm^q; l'-'^ ftH H I '-'^n I I ν-μ-ο Sg I

P a X IIP >>H I I Φ H II >»H toH I I H I I H I I H I >, Ξ I I H

0 cö O I O p >»H I O P<H I lO-PPtiNNjIOHlOH lOHUN-pdiOH

Cm Cm I I I >» Ö >» I I Η >»^ IICDIÖtolltollfo I I to CM Φ Ή I J >4 1 H > l>p,H>»l>fti>»HI>SHHP>l>b!?l>t», I > >> ® O 1 > no p cn ICO IO-P ICQ I öH ICO I I C/l Φ I CO -¾ I CO -P I CO -P ·«· cti v-a I 03 ® _I-1-1-1-1-1-H-j--

I I I I I I I I I H I I Λ H

I Ö I H I H I H I H H I I -P I -P I H I I -P C μ

-P I H IH IH IÖ I H P I H cö -P Φ IO

>»W-o ΙΟ ΙΟ ΙΟ I Ο Φ I H cö Φ Φ IÖ ir-I^^P

OHO IÖ lö I -P I P -P I to -P Ρ<·Η H I cti I to+-3 Η φ -P S H Iflj I cö ΙΦ I -P -P I t>4 Φ\ H p I P I >1® N ®

H -CÖ H I -P I -P I CO I CD φ I -P W Η Ο Φ I Φ | -p W H H

ϋΡΗ I CD I φ I cö ΙΟπΦΙΦΛ-ΡΡ-ΡΙβ I CD Co -P H

_I-1-1-1-1-1--—-+—-

1,1111 II I I

I I J I I φ H I I I I I I

I I p I P<H I I I I -P I I I I I I

X I H I >» I H I Φ H CÖ ·Η n-\ I I I I I I I III

0 H Ö I P.H H I P, >»H I S I p H H I I I Pr-v I I ^ I ^

P H H I I Ό s? I I ö H I I ·Η Φ >4 H I CD H I Φ H I J1 H I φ H

Ό>>·Η ICMH-P* I CM H t>> I J H Pt t>> !>. I Ό Η Ιί!Η IOH I £H

>»t>»S Ι^ΗΦ 1-^--0^ I ^ i>»H Ö >4 I — >-» I — >a |nm>, I ^ >>

Jd Vi cö I I O H I I H -P I I to Ρ,Η -P I I >4 I I >4 ll>> ll>4 IOPH ΙΟΡΦ IO-P I W<D I O J IO-P IO-P lOcn

III II I I

III II I I

I I I no I I I I

I I I jxj I I I I

I I loll I H I

I III II I H I

I I I /25 I I I >> I

I _ I S \ I f \ I I I >4 I

tr; I f I ii I -p I

I I I II I CD I

I I I inoino inotn I no I\/I\/|\/ I W I « Itöcö I Cö 1¾ 1¾ I» I O I O I O cn I o I CM I CM I CM I ON I NO I IN Φ I lr\ IH I tr! I H Ι'-'Ό 1^

I CJ I o I o I CM I CM I CM I I CM

-\ I CM I CM I CM IffilW I K in ICd

lo\l w 1 w I CC I o I O I O CM IO

1 -J s \ I o io io iwiw I — I —-

H P ’—I-1-1-1-1 I I

M (D .rl IIN ICO ION I O I H I CM ICO

WS^d IH IH IH I CM I CM I CM I CM

_I_I_I_I_I_ I_j_ /.

20 58923 I ! I r -1-1--

I I I I I II

I t>> I I I I I I

•H .J*! I I I I I I

> :cg E I H ON I I C\J CO I \TN\0 I \0 ON I HJ- \0 J- •Η η ϋ I ^ ^ I I r> r. I r> r> | r· r> | r> r- •h ^¾. I Q(> I Hio ivOiTN ι ua on I ono I I—t oo j- ir\ P ίβ-Ρ HH iin Ι\Α(η I l>-t>- I CM O IOOCO I 00 IN 00 00 CÖT-5CÖ Ct] It—I CM I I—I CNJ I HOI I H CvJ I HW I H CM i—| C\j

Jt t> I I I I I I

H I O I I I I I I

H > J en I I I I I I

rl T-s Jbti I I I I I I

G cti I IfN O I Ο Ό I O O- I [>-0 I CM O- I O O-

fcuO-M +3 E I OOO I CN CM I !NC\! I 0-00 I O-CM I CM CM

•η φ :co I j-co U-ro I j-n i j- m i j-n i j- ro j- no

ai in > I I I__I_I I

I mw I j-oo iqo ι \o no ι \o on ι cm in on cm I rH o I oOJ- I J- (M I WJ· I J-\D I ItnJ- O Ua ^ I *v f' I r Λ I r· I r r | rs p. | «v r (v r> •h I mm I rom ι no no i mm ι no no ι no no noro

CO I I I 1 II

> · d lOOJ- I ΙΛΝ I O CM I I—I On IOOCM I J- H J- On >. Λ H IOO(M J-J· I ,—I t—I I CM i—I I O' O I CO CO C^v£> t—I ® CO J I — — I — — 1-- I — «- | — — | r r «- #-

nJ ctf J I 0-0- I 0-0- I 1^0- I COCO I NO O- l\D\D aO vO

G rH to I I I I I I

CÖ I UA CM I CM Ί-ΓΝ IC\JO IHO I J- Its I \D IN On CM

I 0-0- I J" oO I CM CO inOO I 00 O I J-\D no ON

r_~) l c» r* I i' r I »« r> I r« r< | r·* *> | #s #- r> r

I UaUn I J-J- Ij-co I J-J- ΙΓΟΓΟ I oOCM rOH

I NO nO I NO nO I NO NO I nOnO I nO nO I NO nO nO nO

-1-1-1-1-1-1-- • I rO I (—I I VA I I ΙΛ loo ro PX I γα. I O- I O- I CM I \0 100 Ο-

• I I—I I i—I I I—I I On I I—I I t—I I—I

HO I I I I II II II II I

JO I O I O- I J- I UN I rO I lr\ O

CO IN I Φ I N ICO I NO I CO ΙΟΙ I—I I I—I I I—I I I t—I I 1—I I—I

-1-1-1-1-1-1--

I Vi. lilt II

SO I o I o I lr\ I o I o IO ir\ tn-p ICO IO0 ICO I lr\ loo to on -1-1-1-1-1-1--

I till II

•H H II I I I I I I

hG-h i lii I o G I ι

}>»H E I I I I H I I I I — - I fi m I I Η I I

FoH H lG'-'ΙΙΗ'-'ΙΙ I Jd ΟΟΟΝΌ S I I OH I I ·>> I

E CO H I J H I H >»H I J- I I I O IHOlöS I N ID >t I C\J S (Ml I

Ph >> CO I^HI^SHI^O^I ^^HG|wH>, I'-'G --0)--

Ο 2Λ! I I t» I I ft !>> I I -P H I I ·Η COOO $ H I I t>»H I I CD I PXH

<H (Ö O lOMOO^IOCHIOHHWiliSlOPd IO-PI OOH

I Η I |IJiliPHHIia)i>»ll!>>--a)Hlia)rQ I I ^ IPh>> ηΟ·Η> l>CDI>PXJI>P,t>>l> |>>nO On ,£ t) ' > Ö H I > jp > PX >, um I coo I ra I p I to I β I ιορηη ι ·η i μ i i icoih ra ι β -1-1-1-1-1-1---- I I H I H I I ·Η I ·Η ·Η

I G I IHIHI I H IH H

H I H II I O IO II IO IO o

Stop IOIG IG ΙΟ I £ i£ G

CD HO IGHIcd I Cti I Ph H I CTj I CC) Cti H E J I mc I P I H IMG IH l-P 4-) H CCÖ ·Η I H H I 0) IQ) I H H IQ) Id) Q) di+JH IHHlE IE ihh IS IE E 1 2

I I I I II

I II lilt I I I CD II

I I I I Ο ι I C ^ ι I I I -—' l-P O —

dsi I H I 0) I I Ph J I I 0) H I I I CD H H I J I Ph H

O H G I JrH I p, ® — I PXH II — I S G H I ® — PXH

Ph H H I £ H I I H H I I fc-> I ·Η I I 0) >a I I H I >» ® ί>>Η I J H I H H H I J- ρ» IOH I CM φ S I <MH CM to

SSE ι — >> ι —' >> >» I — G I —' {>> I'-'H-P I'-'S ^ G

Xltocti I I to I I to to I I 0) I I to I I t>> J I I >> 10)

I ΟΛ I Ο PXH I Ο -P IOH lOHJilOG OCX

__I_I_I_I_I_u__

till II

2

I II I I

II I I ON I I

II I I CNJ I I

Il I I r> I I

II I I 00 I I

I I I CNJ I CM I I m I I ι ίΠ I - I I» ® I I I p I ON ο I I o

I ro I III ihPh I II CM

I to I CM I ffi I no —Ό I CM I tXn ® ιρ ι — ip ι ® co to ι® un ι o o toitr^ ii ion® ΙΟ ® I II n

I H I ffi I no I CN- - a} I II CM I ® CEJ

I — I no I — I —' 0-(/} lo —ο I o o

I CM I O I CM I CM HM II II I

-V I tu I — ι® I® -0) I CM I CM CM

ι c\ ίο ι® to iono® ι® ι® tn ι j; ® \ ι '— io i^ i^ hi ίο io o •rH p -1-1-1-1-1-1--

CO 0) H I J- I Un tvO I N too ΙΟ O

WE·^ I CM I CM I CM I CM ICM ICM no _I_I_I_I _I_I__ 21 58923 --1—-1---1-1......... i !

II II I

lii il I , ! : ! : : :

j> -H SllTNI CO t>- I UN I OO UN I CO CM

•HC Ol •'I »> ·* I •'I ” ·~ I·'·' ft I [N-OO I CJN CM I O CO I r-H _± ΙνβΙΙΛ P rt P rH ΗI v£> Ό I J-J· I IN-00 I Λ CO I UN J-

Π3 ·ι-> CÖ &3 I H CM I H CM I i—I CM I rH CM 1 H CM

X > I I II I

•H I O I I I I I

ft> 3 I I II

ft CD ··-> CO I I I I I I

d X I CO\0 I OO I OOOI OO O NO

ao-p ρ Cö I r^-CM I CO co I C"-C\] I OO CO I 0--CU

•η Φ :cö S I j- co I J- co I J-coi J-co ij-co co co ni _I ___I__i_-— -1--, I OUN I CXNCO I ooo I nO H I InO !

I n£)UN I rH 1—1 I J-vO I OO I c\j CO

*- r- I I '

ft ΙΓΟΓΟΙ COCO I COCOI CM CO I COCO

CO I I II 1 , s. · dl INO I n£) UN I o O I 00 I—I ION-

> ^!-PI J-C^ I 0OJ- I rH CM I \OCO I UNUN

rl S n til ' ' I r- »- I r-i'l »- *- I *· *-

d cC (III νΟνΟ I [NCn. I ININ· I C-^IN I nOnO

d ft co I I I I I ^

CO I CM O I COO I Hi I Mrwo I tNCN

I CMnO I C^CO I CM N I COO I HO

n I «V rv I r> r I r. r | r. r I ^ ^ I CO CM I UN UN I J- CO I ININ I J· _± I vOvO I vOvO I nOnO I nOnO_I nOnO_

I J- I O I IN- I CO I O J

. I o I J- I cO I U\ I Λ

ft I rH I H I CM I rH IrH

..1111 I I I I II

rH O I CM I 00 I UN I O ' IN

30 I ON I CO I CO I UN ICO

CO I I—I_I_rH_ j_CM j_rH_j rH_, ! ! ! ! ! j SO ICOIUN l O I N I U> dp I On I 00 I ON I ON_I On_j III II I ! •H -H I I ' I I ' ,

rH d ·Η I I I · r—J. I I I

•»ft £3 I I II lid^)l fHl II

N»-H ft II I Φ'-Ν I N» N» I cö^N I I, ·Η I

S CO ft I CM I I I tiOft I CO >> I ft ft I CM CO

fn SM l^'-Hr-vl n_-- ft I ---CO I n-^ rH I ^ ^ ft

οδϋ lift.Hl IN» I I M I IN» 1 I OH

ftcöO lOOrHI ON» I ΟΦΙ ON» lOdN» I ft I ι I d N» l I Ö I IÄI IW ΙΙΦΝ»

ΓΟ-H > i>ftN»i >CC5 I > O I > Φ I > ft P

d w I co I d I_co d_; co ft i_co ΰ_j co ι φ j

I ·Η I ·Η I ·Η I ι -H J

id I rH I ι—I I ι—I I ft -PI-HIOIO '2' 1 '2 N> co -P id ι d Idio I d φ ·Η O I CÖ I CÖ I CÖ I f-l ft I Cti

Ρ S d ι Ρ ip I p I t>0 d IP

•H :cÖ ·Η ι Φ ι Φ 1 2 1 ·Η ·Η I Φ ,¾ P ft I S I S I S I ft ft IS _j -1-1--1-1--1- II III I 1 I I I I I I -—' I I ι ! I I O r-. I I I Ο ·Η I Φ II 1 iti I ft Id -HI ril I ι—I rH I ÖI I φ I I 1 O-H d I P-rH I d I Ν» ι dr-v I ft 0)^

d rH -H I I N> ι Φ ft I N» N» ι CÖ ft 1 '. *H <H

Ό Ν»·Η I CM N» ι W)r—I I CO CO I ft r—I I CM CO rH I

NiSB I — d I ^ N» I ^ Xi I —' N» I N» I

,0 co cö I I *H I 1¾ I I Φ I IN» I I o N>

ι O ft I O d ι OÄI O co ι o Ö p I

-1-1-1-1---1-H

II II I ι

II II I I

Il II I · II II ll

Il II II

II II I UN I

I II I I I CO CO I td ι I I CM I I CM ffi W I NO ι

05 I I te CO co I I »d O-O—Ο ι O I

ι ι o id Id ι y\ ι co o n ii · ι ι id ι o—o—ο ι / \ ι id ι Id · ο ι ι id ι o—o n ι ι o—o o ii ι ι O I II Ed ι Id I II I ι CM ι ι μι ι td ο ι ι id cm ι id ι

IO I O I I \ / I O ^ IO I

II I I CM I \/ I n—' CM I I ι

-ν I CM I CMtd I I CMtd I CM I

I o\ I Ed · I td ο I I Ed Ο ι Ed I

lXg\ I U I ο I I I O I lo I

ft d x-1-1-1-H-7-1-Λ

CO Φ ft I ι—I I CM I CO I J- I UN I

(jqgJilPO ICO ICOICO ICO I

_ι_!_ ι_!_ ι -I

22 5 8 9 2 3

Pilli I I I

d till I I I

W till I I I

•H -P I I I I I I I

:d β I com I OCO itHON I I UNOO I J- I

•H > O I ^ *> | *· | »» r· | I·'»- I r I

•H >> I O- ro I ojj- I COJ- I OO NO I OnnO I 00 UN I

-P Λ rH H I j- l>- I Ό O- I INnO I CO CM liO I J-J- I

CÖ :π3 H I ι—I CM I I—! CM I H CM I rH CM I H (\l I H CM I

X C I I I I I I I

•H I I I I I I I

ft flj -P I I I [ I I I

H *1-3 rf W I I I I I I I

C P> .y I CM Cn I J· CN I ΟΙΛ IVOO I UNOO I UNCO I

(SO I O d I O-OvJ I CnCM I CN.CU I Cn. CO I [>CM I CM | •h > d S ι .J- co I j-m I j-ro I j-m i j-m i j-m i

w a ,r5 I I I I I I I

I I I I I I -— I

I I—·co I unco I mo mo i coco i oo c\j i I it\H I +i I j-ιλ I I—I cm I aim icmcm i

K |·»»»|*«*«|»ν#.|*.»·. I r r I .. c- I

•h loom I mm ι coco i mm i roro ι com i

10 I I I I I I I

^ I πσ> IJ-CJN I OUN I CM ON 00 ph I NO O l\OsO I

>. Λί-Ρ'ΟΟΟ- I ÖIN IJ-CM I CO Cn- CO ON I UNOO I UNvO I

H tEi ΙΛ id I * · I «- «- I »- «- | l r r* I I

d d d I \β\0 I nOnO I 0-0- I UnUn |>-ΙΜ l O- [M I O-O- I

d I—I W I I I I I I I

d I J-O I UN ON I UN.J- I VO OO I—I I O- H I 0-00 I

I \0 O I o cm I 0-00 I O On O I O-nO I O- O I

O I·-*- I r *- 1 » r I»-·- |«-#- I c- r- I

I HH I CM I—I I H CM I OCO I J-i I J-J- I

I NO NO I nOnO I OnO I nO Un I vQnO I nO nO I

-1-1-I" I "1-1-1

• I ON I O- I O- I UN I O'-' I ^ I

ft I m I CM ICO I O I I—I · |. I

• I CM I CM I H I rH I rH “η I CM ·η I

rHO II II II I I lid I o fi I

ί O IO- IUN lUN I PO I O K I rH K I

w ι ro I cm I co I ο i ow i w i

I CM I CM IH I rH I H I I

-1-1-1-1 -----------1-1-1

lellii I I I

So IUN I ο ΙΟ I O IO IUN I

$ -P ION ION I CM I ON ION ION I

-1-1-1-1-1-1-1

I I I I I I I I

•H -H I I I I I I |

I—I Ö ·Η I I I I I I I I I I I

>»·Η S III III -HI I '—' I ·Η ·—' I

Ο Ή -H I I .H I I I I I I I -H I I d I I I I -H | I ,—I .rH | B w .p i cm ra^ i cm.h'-' i c\i n<N i μ κ ι ιμ-ΗγΗ im >»rH i

POP Ι^-"ΛΡΗ I'—'tn-H I^-'^ItH I Jm ä'' I '-'H |>, i^>,o I

0 S^i IIOrHII-bcirHIIOrHI •'Ρ·Η·ΗΙΙ>>>> I I ft S I

«H O O IO-P>,lOO>>IO-P>>l CM OHH I O SM IOO-P I

1 ¢-1 I II<D>J||.P>*II3>»I iwO>>i>>ii-P^j ι f p d ι rO -p > l>BPI>OP>l>rQ-PI > I M >, >> I > d Φ I > ft d l p co icoidicoidicoidi wQii öp ι μ i £ icoift i

—---I_I_I_I_1_‘ ι_-I

I ·Η I ·Η I -H I ·Η I I I

I O I ι—! I ι—I I i—I I ι—I I I -P I I ·Η I

H I rl IO IO IO I O low IOW I

owp id id id ι d ι d d 'do ι ω ή ο id id ico ι d id> id> ι

ft S d I -P l-p l-p I -P 1 -PO. I I

•h :d ·η id ι a> id ι ο ι d ·ρ ι φ ·η ι

3d ft rH IB I B IB I B I B rH I B rH I

--------1 -I - I-1-1-1 - —i

I I I I I I II I I

ι ι ι ι ι ι ι ο ι iii ι

I II I Ο -Η ι I II ·Η I ' ' I £*> >> I ο d I

3d I -P Idlll-PrH Id '-'Ι I p ·Ρ ·Ρ I ft >» ΙΡΦΙ I

O-Hd iBd'-'Idt»» I rQ I ·Η I J-OHrHIdW Ift ft^ |

P rH -P I 1 -rH -rH I I t>> I I -P rH I ~ O >> >, I I >4 I I -p *P I

TO >»·Ρ I CM W rH I CM -P ICMWOI (\IH S >> I H dl I I rH rH rH I

ί^ΟΒ I — >» I —' CD |W^J>»I n-" 3d d ft I |N->>>> I

Ä 10 (d Iioioll-H ΙΙΟΡ>Ι I -P d d I I -P -P I I ί>» >» I

I O ft ft I O W lOP>dl OOP B I OHH IO ft-P I

-1-1-1-1-1-(-1

I I I I I I I

I I I I I I I

23 5 89 2 3

till I III

1 >s I I I I II I

•H x I I I I 11 I

>:crt ICMJ- l\DN I CO CVI O' ICO l Jr Ρ01Γ\ I \Q\Q^± I

•r_4 g I rv j r·» »n | e·· c- *s | | r' c' | c«* rs *- | •H ^ O I IXO I USvO I CSNOO H I QO (XOS I XpJ- Us I tXpf pj- '

_p Oj .p H I sO X I sO Ό I USp)- Os I pj- m m ΙνβίΛΟ ΙνβνΟΛΙ I

π! ·ηα) fx) I i—I CM I r-l CM I H CM rO I rH CM p)- I H CMj" I HCMU> I

X > I I I I 1' I

•hioi I I I I' I

Cm t> 3 I I I I II I

•h H r-3 cn I I I I I I I

ö X I CM O I USCO I 30* [XUS IQOOO I H [NO I CMCOCVJ I

bO-P -P cd I XCM I XCM I XCMCM I xmm I XCMph I XCMm I

•H ¢:(0 S I pj- m I J- m I J- COCM I j- rOCM I pf mCM I pj- mCM I

cn in > _p: lii i i_i_ i I J-ΙΛ I p)- Us I Us o I UssO I m <j\ I os ο i I mj- I mcM I ho I ooo I mm i mus i ^ I #v r·. J c*« ο | c·* c | **>· r* f r- | cs ·" | I mm I mm i mm i mc\i i mm i mm i

•mI III I III

™ .31 usos I usm 1 0 cm 1 mo 1 000 1 00 1

> >3 -P f pj- US I pj-pj- I 00 O 1 OH I HC\J IOO I

53 en cd I ~ I »- ·- I «- *- I *- »- I *- *- I»-»· I

cö ci I XX I XX I so so I XX I XX I XX '

2 t—I m I I I I 11 I

5 I OJ C— I CM 0 I US US I os so I J- sO I UsoO I

I pj-pj- I pj- X I 00 Us lpf-τΗ I OO CM lpj-Ο I

Γ} I €-. c- |r-r> | »- *· I »- «- I «- »- I *· r. I

I j-J- I pj- m Ipj-pj- I Us US I CM CM I j-J- I

I sQsO I sOsO I sOsO I SO sO I sO sO I sO sO I

-1-1-1-1--1--~1-1

. I'-'* IsO 10 I CM im I H I

p, I · I m I CM IJ· I CM 10 I

• I US T-s I I—I I I—I I H I I—t I I—I I

I—I O I Os cd II II 11 11 II I

HO I Hi I m IsO 100 I CO I Os I

m I '— im I cm I m 1 h i 00 1

I I H I H I I—I I I—1 I I—I I

-1-1-(-1-1-1-1

I lit I III

0¾¾. Ill I III

cc _ 10 10 10 10 10 100 I

gj_3 10- 10 iso im I 00 iis- 1

I III I III

•H -H I I I I 11 I

Η β.Η I II II I 1 .......

>,.H s I ^1 I «-> I II I I ^ I ·Η' - I I

J>> ·η ·Η I I I Ή I I *H ·Η I I ·Η' · I I ·Η ·Η I I C/) ·Η I I ϊ>> -H I

Sw-H I HrlH I I—I 1—I 1—I IJ-tn-H IsOWH I sO H I, (MP in I I

Ch >,!n I '-'rH >> |·^>»>> Ι^ΛΗ I >ϊ I^O>) I I-->0) X--- I

0 33C I I >» >i I I >» £►> ΙΙΟί>» IIOS I I Pi X I I S 0¾ I I

cm a) 0 10 >»-p I Ο -P m 1 O ä >> 1 O S3 to 1 o -ö w 1 0 1 -p rH 1 1 Cm i I I -p c I I ω ^ ιιω-ρ ιιω^ί 11 >,χ ι 1 h ® 1 m-H> i>d)<D 1 > S α> ι >(h 3 I > Cm ω 1 >0 ο 1 >'-/·η s i

PCO ICQIft ICQIÄ ICOIrQ I CO I P3 I CQ I Ä ] CO I I

I I -H II II I I -H I

I C II -H I H I I -P I ·Η I I -P I -H I I -H I H I

+JI-H I O «1 IO I ·Η Cd -P U I -H Cd -P SH I O (/) ΙΟ I

CO -P I £3 CL) I S3 I ι—lcdO)IO)lrHCdO)IO)l£30) I S3 I

φ·Ηθ I cd p» I Cd I >»-P PcH -P I >»P Ρ«·Η -P I td > 1 Cd I

-PSP l-PX. I-P I ί>» <D \ H P I Is Φ X 1—I -P I -P X l-P I

•h :cd ·η ι ω ·η 1 ω ι -p w ·η o cd i -p w ·η o cd ι ο) ·η ι <φ ι

Jbd-PiH I ΒΗ lö I CDcä-PPiQ) 1 Cdcd-P^Q) I SrH lö I

_I _I-1-----1---1-1----1

III I III I I

I ^—. I I I I I I I I I

I I I -H I I X III I I -H I Ό Λί I I ·Η I I I

I rl I ·Η I—I I Cl) CD I ICDpl I CD ι—I I >>Φ I I HH _ I

O-HC I rH >» ΙΘΛ-^ I Cm £>' ' icmI>» I Xl 1 ^ Χ-ηΧηΙ I

ίπ ι—I ·ι—I I !>»!>» I I ·Η ·Η I I -H -H I I -H X I I -Η ·Η I I >» M rH I

Ό >»·Η I H isP I rH ι—I ι—I I J- (OH Isowcn I sO CDH I CMP !s I

>»1>>S ι^-Ρΰ I'—'>*!>> I'-'^S I — r« Jsi |^Λ!>> i1—1 CD Ο >> ι

Pdwcd 110)0) ΙΙΪ>ΐ>> IIO>s IIOO) IIO>>llS-P-PI

I O I & I 0+3 ID IOC-P IOi3rC IOFHtniOIQ)0)l _I_I_!__l_l-1-1

III I III

I I I I I I CM I

ι ι ι ι ι ι m ι

I I I I I I ffi I

I I I US I US I IO I

I I I in I w I I —' I

ι ι I sO I sO I I 53 I

(¾ I I 10 10 I 10 I

ι ι 11 11 ι 53 11 ι

I I IO IO I O I ο I

I I iH II II II II I

I Os li—I I pf- Iso IsOICM I

IM 153 I ^ 1^ I ^ 153 I

I pj- IUS I CM I CM I CM I O I

IO US ι O 153 153 153 I CM I

—--\ 11 Mil m ι 0 10 10 153 ι

I O s, I 53 (Μ- I 53 53 I I ^ I '—' I O I

I 3iiS \ ι O»— O I 0-O II II II II I

•H Cm --1-1-1-1-1-1--------1 ωω·Η ι csj im ipf ius 1 so ix 1 uq B x ipJ- ι pt~ 13- ι pt" ι pi- ipJ- 1 _ι_ι_ι_ι_I_I_ι 1,.

2b 58923

II I I I

I t>> I I I I

•H ^ I I I I

P» :rf S I 00\0 OO I SO rOsQ I I

•HP οι·'·'·' I ·» «. ,. I I

•H I CO ΗΙΛ I OS rs. I CM Us I

-P Cd -p ιΗ H I CM rOO I OI H H I HOi I

Cd ·ι~3 Cd B I H WJ- IrHCvJJ- I CM H I

,ϋ E> I I I I

•HIOI I I I

Cm > p) I I I I

•h to '<-3 to I I I I

£ Ä IHHlrv I O I—100 I OOO I

bO-P -P cd I 00 noro I CO (^(\J I OOCs. I

•h o :cd B IJ- row i J- no cm i noj- i to to > _<- till

----- -.+.-----------i--1--I

I 00 O I NO I Us I—I I

I CO (N I OH I OH I

K I «· ·» i »· *. I »» ·» I

•H I CM C\J I CM OO I noro I

m · 3 I I I I

> ϋ-Ρ l\00 I UssO I O-OS I

>, 01 m U-ΙΛ I CM C\J I s£> no I

r—liljcöcöl·'*' I r r I r r. I

CO I—I to I O-C-s I CNt>- I Ds-X I

Cl I II

CO I Us Us I 00 os I o O I

I sO Os I O CM I no 00 I

Q I r r I f *s #s I

I so Its IsOsO I Us Its I

I sO sO IsOsO IsOsO I

——-1---------1-1-1

• I CM I so I I

P< I I—I I O I I

• I H I H I I

rH O il II I no I

3 O I CO I CM I CO I

co I O I O I I

_IH_M_I__I

0¾¾. till

S I OO I o I

o3 O I no I O- I Os I

ω -P I I 1___ I

-1 I I 1 I I

I ·Η I I I ___ I

•H C -H I I I I Γ-Η I

HH S II I I II I I ·Η I H I

>»·Η -H I O I -- I I *H ·—' I O ID >,!>) I

>s to -H I I—I ·Η ·Η I OO (DH I rH 1¾ >> t>> I

B >> tO I ^ CO rH I s>XH 1^-^0 0^ I

P S I I ,¾ to I I O t>s ll-POO I

OctJO I O O >» I O £ fc>» I Ο ΦϋΌ I

Pt Ή I I I £ id I I <D-P I I B pr-s I

l-H> I > O CD l>CH^i I > ^ Cd -H I

no p W I CO <m K I ra I O I CO I ϋΗ I

-1-1-1-1

II II II I

I £ I I -P I -H I I -P I -H I I -P I -HI

•P I -H I -H Cd -P P I ·Η cd -P P I ·Η flj -P PI

>> CO -P lrHCdQ)l<dlrHcda)IOIrHcdOIQ)l

CD *H O I >>·Ρ Ρ,·Η -p I >»-P fVH -p I ί>>-Ρ P.-H -P I

Pfi£ I I >,I1)\HP I I

·η:ο3·η i-pco.hocdi-pco.ho<di-pco.hocdi

^PH ICDcd-PPCDICDcd-PPCDICDcd-PPCDI

-1-1-1-H

I I II I

ii I I a> I I I I

I I a> I iii I S p-->_ i

·Η I Pi CD I 10^51 I —' CO ·ηΓηΙ I

Ο -H £ I I K · * I Ch On> I I ΛΗΗ I

Pi—I ·Η I Ο ·Η ·Η I I ·Η ·Η I Ο ·Η I

Ό >»·Η I rH to rH ICO OH I|H|D1 S S 1

>> to S I s_/ ^ |W^J>, 11-i^scj pf I

.£ CO ct5 IIO>> IIO>> ΙΙΟΟΦ I

I o dil i o G -p I Opo-o I

_!__I _H-—M

I I I I

I I I I

I I I I

I I I I

I Us I I no I

ι K I Us I K I

I SO IK I o I

I o I SO I O I

K II I o I O I

I O II I o I

II I O II I

I O II I O I

I rH I 00 I rH I

•

C\J I CM I CM I

IK IK IK I

-x I O I O I O I

I O \ 1^ I w I s_r I

I ,i<J K X I I II II I

•H P '-1-1-1-1

to (D ·Η I OO I OS I o I

W S Xi li li I ITS I

________I «_!_I_j

Claims (2)

1. 25 58923 Patenttivaatimus: Menetelmä uusien, terapeuttisesti aktiivisten 3-formyyiu rifamysiini SV:n, 3-formyyli-16,17,18,19,28,29-heksahydro-rifamysiini 3V:n ja 2:;-desasetyyli-3-f ormyylirifamysiini SV:n O-substtuoitujen oksi imi en valmistamiseksi, joiden kaava on Me Me H° ' Me [ qu j] \° 'Y* OH OH °\ Me Me0 *yH. J JL 1 J-CH=NOB k o"!! 0--|J OH Me 0 .jossa R on (C2~C12^~alicyyli ’ hydroksi -alempialkyyli, karboksi-alemp l-alkyyli, karboksi-fenyylialempialkyyli, (C^-C^^-alkenyyli, propar-gyyli, sykloheksyyli, alempialkoksi-alempialkyyli, fenoksi-(C^-C10)--alkyyli, karbometoksi-dekyyli, halogeeni-bentsyyli, difenyylimetyyli, fenyyli-alempialkyyli tai alempialkyyli, joka on substituoitu pyrrolidine- , oiperidino- tai piperatsinoryhmällä, joka on substituoitu me tyyli ryhmällä, on vety tai asetyyli ja pilkkuviivat tarkoittavat vaihtoehtoisia kaksoissidoksia, tunnettu siitä, että 3-for-ayylirifamysi ini SV, 3-f ormyyli-16,17,18,19·, 28,29-heksahydro-rifamysiini SV tai ?5-desasetyyli-3-formyylirifamysiini 3V saatetaan kosketukseen noin ekvimolaarisen määrän kanssa kaavan RONH^ mukai sta 0-subs-tituoitua hydroksyyliamiinia, jossa kaavassa R tarkoittaa samaa kuin eaellä· Pstentkrav: Förfarande för framställning av nya, terapeutiskt aktiva O-substituerade oximer av 3-formylrifamycin SV, 3-forrnyl-l6,17,18,19. -28,29-bexahydro-rifamycin SV och 25-desacetyl-3-formylrifamycin SV Ked foraieln Me Me R1V o* OH Meo
2. 0 CH=NOH ό · "t—1 OH , Me O