DE1929355B2 - Thiopeptin-Antibiotika und deren Verwendung in Futtermittelzusätzen - Google Patents

Description

einen Schmelz- oder Zersetzungspunkt zwischen etwa 219° C und etwa 222"C, eine optische Drehung [a] f? von —80° (c—\, in Chloroform),

einen Rf-Wert von 0,!9 in einem Lösungsmittelsystem aus Chloroform und Methanol im Volumenverhältnis 10:1, ein charakteristisches Ultraviolettabsorptionsspektrum gemäß F i g. 4, ein charakteristisches Infrarotabsorptionsspektrum gemäß F i g. 7,

eine Löslichkeit in Dioxan, Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Pyridin, Chloroform und 3 η Salzsäure, eine geringe Löslichkeit in Methanol, Aceton und Äthylacetat und eine Unlöslichkeit in Äther, Benzol, n-Hexan, Petroläther und Wasser und eine Aminosäurezusammensetzung bei Hydrolyse mit 6 π Salzsäure bei 110°C während 24 Stunden, bezogen auf 2 Mol Alanin, von 039 Mol Threonin, 1,03 Mol Valin und 0,97 Mol Cystein.

4. Thiopeptinantibiotikakorhplex, erhältlich durch Kultivieren von Streptomyces tateyamensis ATCC 21389 in einem üblichen Nährmedium und Extrahierung des durch Filtration der Kulturbrühe erhaltenen Mycelkuchens mit Aceton.

5. Thiopeptin-Mycelkuchen, erhältlich durch Kultivieren von Streptomyces tateyan.ensis ATCC 21389 in einem Üblichen Nährmedium und Filtration der Kulturbrühe.

6. Verwendung von Antibiotika Thiopeptin Ai, Thiopeptin A₃, Thiopeptin B, von Thiopeptin Antibiotika-Komplex und/oder von Thiopeptin-Mycelkuchen in Futtermittelzusätzen.

Die Erfindung betrifft die neuen Antibiotika Thiopeptin Ai, Thiopeptin Aj, Thiopeptin B, einen neuen Thiopeptin-Antibiotika-Komplex und einen neuen Thiopeptin-Mycelkuchen mit einer antibakteriellen Aktivität gegenüber einer Vielzahl von Mikro- Organismen sowie deren Verwendung in Futtermittel-Zusätzen,

Es sind bereits zahlreiche Antibiotika im Handel, die als Futtermittelzusätze verwendet werden, wie z. B. Flavomycin, Tylosin, Siomycin und Thiostrepton, von denen Flavomycin eines der bekanntesten ist. Weitere Antibiotika, die als Futtermittelzusätze verwendet werden, sind Siomycin, Peptiomycin, Sulfomycin, Thermothiocin und Sporangiomycin (vgl. »The Journal

of Antibiotics«, Band XXHl (1970). S, 113-119).

Voraussetzung für die Eignung eines Antibiotikums als Futtermittelzusatz ist jedoch ein ausgeprägter Effekt auf die Gewichtszunahme des Tieres, dem es verabreicht wird, während es gleichzeitig nicht in der Humanmedizin verwendet werden darf, keine Kreuzresistanzprobleme bestehen sollen und das Antibiotikum vom Magen- und Darmtrakt kaum oder überhaupt nicht resorbiert werden darf. Diese Kombination von Eigenschaften wiru jedoch von keinem der bisher auf dem Markt befindlichen Antibiotika erfüllt. So weist beispielsweise Flavomycin nur eine unzureichende Aktivität gegenüber Mycoplasma, das für Geflügel und Schweine pathogen ist, auf, während Tylosin zwar eine ausreichende Aktivität gegenüber Mycoplasma besitzt, bei seiner Verwendung treten jedoch Kreuzresistanzprobleme gegenüber anderen Antibiotika, wie z.B. Erythromycin, auf, während beispielsweise Siomycin und Thiostrepton bei ihrer Verwendung als Futterzusatz einen derart geringen Effekt ergeben, daß sie in der Praxis nicht eingesetzt werden. Andere der obengenannten Antibiotika haben wiederum den Nachteil, daß sie vom Magen- und Darmtrakt des Tieres, dem sie verabreicht werden, in unerwünschter Weist-resorbiert werden, so daß im Fleisch und ?n den Organen des geschlachteten Tieres unzulässig hohe Rückstände an diesen Antibiotika enthalten sind.

Aufgabe der Erfindung war es daher, neue, als Futtermittelzusatz verwendbare Antibiotika zu entwickeln, welche die Nachteile der bisher bekannten Antibiotika nicht besitzen und die Forderungen, die an ihre Eigenschaften gestellt werden, besser erfüllen als die bisher Ln der Praxis eingesetzten Antibiotika.

Es wurde nun gefunden, daß diese Aufgabe gelöst werden kaiin mit den Antibiotika Thiopeptin Ai, A3 und B sowie dem entsprechenden Thiopeptin-Antibiotika-Komplex und Thiopeptin-Mycelkuchen, wie sie in den vorstehenden Patentansprüchen 1 bis 5 charakterisiert sind.

Die erfin dungsgemäßen Antibiotika, nachfolgend der Einfachheit halber als »Thiopeptin(e)« bezeichnet, werden gebildet von einem neuen Mikroorganismus der Gattung Streptomyces tateyamensis, der aus einer Bodenprobe isoliert wurde, die in Tateyama, Toyama Prefecture, Japan, entnommen wurde. Das erfindungsgemäBe Thiopeptin wird durch Kultivieren dieses Mikroorganismus Streptomyces tateyamensis ATCC 21389 (Proben der hinterlegten Kultur können nach Maßgabe der geltenden Rechtsvorschriften von der Hinterlegungsstelle bezogen werden) in einem üblichen Nährmedium gewonnen und in Futtermittelzusätzen verwendet Es bietet gegenüber den bisher verwendeten bekannten Antibiotika die folgenden Vorteile: es treten keine Kreuzresistenzprobleme gegenüber anderen Antibiotika auf, es wird vom Magen- und Darmtrakt des Tieres, dem es verabreicht, kaum oder überhaupt nicht resorbiert und es weist eine deutlich verbesserte Aktivität gegenüber Mycoplasma, das insbesondere für Geflügel und Schweine pathogen ist, auf. Es ruft bei den Tieren, denen es als Zusatz zu den Futterrationen beigemischt wird, ein wesentlich beschleunigtes Wachstum hervor, ohne daß irgendwelche unerwünschten Nebeneffekte bei diesen Tieren auftreten. Darüber hinaus wird es innerhalb kurzer Zeit nach der Verabreichung praktisch vollständig von den Tieren wieder ausgeschieden, so diü die Resorption durch den Magersund Darmtrakt minimal ist. Ferner bewirken sie, daß das Futter, dem sie zugesetzt werden, wesentlich besser ausgenutzt wird als bei Verwendung der bekannten Futtermittelzusätze,

Die Morphologie einer Streptomyces tateyamensis-Kultur wurde mikroskopisch auf Bennet's-Agar beob- achtet. Dabei zeigte sich, daß die Mycelfäden dieser Kultur dick und gerade sind und Büschel bilden. Das Konidium mit der glatten Oberfläche ist verhältnismäßig groß und länglich-rund. Es sind aber auch einige ' rechteckige Konidien zu beobachten.

Streptomyces tateyamensis ATCC 21389 hat die folgenden Kulturmerkmale, wenn es auf den nachfolgend genannten Medien 10 bis 14 Tage lang bei 3O⁰C wachsen gelassen wird. Lediglich bei der Gelatinestichkultur wurde eine Ausnahme hinsichtlich des Wachstums gemacht, in dem die Beobachtung nach 20tägiger Aufbewahrung bei Zimmertemperatur durchgeführt wurde.

Czapek's Agar:

^₀ schwaches Wachstum, farblos; kein Luftmycel; kein

lösliches Pigment

Stärfce-Ammonium-Agar:

reichliches Wachstum, gelblich-braun am Rand, weiß im Zentrum; Luftmycel, dick, bräunlich-weiß, pulverig, kein lösliches Pigment

Bemerkung: Die Stärke wird lebhaft hydrolysiert Glucose-Asparagin-Agar:

flaches Wachstum, dunkelbraun; Luftmycel, sich ausbreitend, weiß, pulverförmig; kein lösliches

Pigment

Calciummaiat-Agar:

flaches Wachstum, schwach braun; Luftmycel, weiß, pulverförmig; kein lösliches Pigment

Tyrosin-Agar:

schwaches braunes Wachstum; Luftmycel, sich ausbreitend, schwach bräunlich-weiß, pulverförmig; kein lösliches Pigment.

Bouillon-Agar:

schlechtes Wachstum, farblos; kein Luftmycel; kein lösliches Pigment

Bennett's Agar:

schwaches braunes Wachstum; Luftmycel, schwach gräulich-weiß, pulverförmig, sich ausbreitend; kein lösliches Pigment.

Bemerkung: Ziemlich schlechtes Wachstum bei 37* C

so Gelatinestich:

schwaches Wachstum; kein Luftmycel; kein lösliches Pigment Bemerkung: Geringe Verflüssigung.

Glucose-Czapek's Lösung:

kleine weiße Kolonien ausgefällt; kein Luftmycel;

kein lösliches Pigment

Bemerkung: Keine Nitrite werden gebildet. Glucose-Bouillon:

ω schwache graue Kolonien wachsen auf der Oberfläche; kein Luftmycel; kein lösliches Pigment. Bemerkung: Der pH-Wert wechselt leicht zum sauren Bereich.

Milch:

schwache graue Kolonien wachsen auf der Oberfläche: kein Luftmycel; kein lösliches Pigment. Bemerkung: Peptonisation und Koagulation negativ.

Kartoffelplug:

schwaches braunes Wachstum, runzelig; kein Luftmycel; kein lösliches Pigment.

Cellulose:

kein Wachstum.

Die Kohlenstoffverwendung von Streptomyces tateyamensis wurde nach der von Pridham und Gottlieb beschriebenen Methode bestimmt. In der nachfolgenden Tabelle sind die Ergebnisse des Kohlenstoffverwendungs-Versuchs wiedergegeben. Die darin zur Bezeichnung des Wachstums angewandten Symbole haben die folgenden Bedeutungen:

( + ) = wahrscheinlich Verwendung (-) = Verwendung fraglich

Tabelle I

Kohlenstoffverwendungs-Übersicht für Streptomyces tateyamensis

Arabinose ( + )

Fructose ( —)

Glucose ( + )

Inosit (-)

Lactose (+)

Mannit (-)

Mannose (-)

Raffinose (-)

Rhamnose (-)

Salicin ( —)

Sucrose (+)

Trehalose (-)

Xylose (-)

35

Hinsichtlich der Herstellung von Thiopeptin sei darauf hingewiesen, daß dieses nicht nur aus Streptomyces tateyamensis, sondern auch aus Mutanten, die durch Mutationsmittel, wie Röntgenstrahlen, Ultraviolett-Bestrahlung, Behandlung mit Phagen und Stickstofflost aus diesem Mikroorganismus erhalten werden können, gewonnen werden kann.

Thiopeptin kann durch Züchtung von Streptomyces tateyamensis in einem wäßrigen Nährmedium unter -15 submersen aeroben Bedingungen erzeugt werden. Das zur Züchtung von Streptomaces tateyamensis brauchbare Nährmedium zur Herstellung von Thiopeptin enthält sowohl eine Kohlenstoffquelle, beispielsweise ein assimilierbares Kohlehydrat als auch eine Stickstoffquelle, beispielsweise eine assimilierbare Stickstoffverbindung oder ein proteinhaltiges Material. Beispiele für brauchbare. Kohlenstoffquellen sind Stärke, Glucose. Sucrose und Glycerin. Beispiele für brauchbare Stickstoffquellen sind Fleischextrakt Pepton, Glutin- ss mehl Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Maisquellwasser, trockene Hefe, Hefeextrakt, Ammoniumsulfat Natriumnitrat Casaminosäure und Harnstoff. Es können auch Kombinationen dieser Kohlenstoff- und/oder Stickstoffquellen in vorteilhafter Weise verwendet werden. Anorganische Salze, die zur Bildung von Ionen befähigt sind, wie Kalium, Natrium, Calcium, Phosphat und Sulfat können dem Kulturmedium zugesetzt werden. Spurenelemente, wie Magnesium, Mangan, Zink und Eisen, können ebenfalls dem Kulturmedium zugefügt werden. Derartige Spurenmetaüe können als Verunreinigungen beiläufig mit der Zugabe der Bestandteile des Mediums geliefert werden. Es ist deshalb darauf hinzuweisen, daß die Zugabe von solchen Spurenmetallen oder anorganischen Salzen effektiv erfolgt, wenn der das Antibiotikum produzierende Mikroorganismus sie als Komponente des Kulturmediums benötigt, Vitamine, wie Inosit, Vitamin B^. Isoascorbinsäure und Biotin, können dem für die Züchtung verwendeten Medium ebenfalls zugesetzt werden.

Zur Gewinnung einer möglichst hohen Ausbeute an Thiopeptin aus dem vorstehend beschriebenen Medium ist die Verwendung von Schwefelverbindungen organischer oder anorganischer Art bevorzugt. Beispiele für solche Schwefelverbindungen sind N-Acetyl-DL-methionin, Methionin, 2-Naphthol-6,8-disulfonsäure, Natriumsulfosaiicyiat, Natriumcetylsulfat, Taurin, Thionin, Methylorange und Natriumsulfat. Die bevorzugten Schwefelverbindungen sind N-Acetyl-DL-methionin und Natriumsulfat. Aus wirtschaftlichen Gründen wird jedoch Natriumsulfat bevorzugt verwendet.

Optimale Ausbeuten an Thiopeptin werden erhalten, wenn die Züchtung bei einer Temperatur durchgeführt wird, die ein zufriedenstellendes Wachstum des Mikroorganismus zur Folge hat und zwischen etwa 24⁰C und etwa 37° C, vorzugsweise zwischen etwa 27° C und etwa 32°C, liegt, wobei die Züchtungsdauer etwa 2 bis etwa 6 Tage beträgt.

Nachdem die Züchtung durchgeführt worden ist, kann eine Vielzahl von Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Thiopeptin angewendet werden. Geeignete Verfahren sind beispielsweise die Lösungsmittelextraktion, die Chromatographie und die Kristallisation aus Lösungsmitteln.

Nach einem bevorzugten Gewinnungsverfahren wird das Thiopeptin aus der gesamten Fermentationsbrühe dadurch gewonnen, daß der Mycelkuchen nach konventionellen Verfahren, z. B. durch Filtration oder Zentrifugieren, abgetrennt und dann einer Extraktion mittels eines geeigneten organischen Lösungsmittels, wie Aceton oder Methanol, unterworfen wird.

Aceton ist das bevorzugte Extraktions-Lösungsmittel. Der erhaltene Extrakt kann nach üblichen Verfahren konzentriert werden, wobei ein Rückstand erhalten wird, der wiederum einer Extraktion mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel wie Äthylacetat oder Chloroform unterworfen wird. Eine unreine kristalline Masse von Thiopeptin kann dadurch erhalten werden, daß der erhaltene Extrakt zu einem Rückstand konzentriert wird, der dann auf Zimmertemperatur abgekühlt wird. Die unreine kristalline Masse von Thiopeptin kann auch dadurch erhalten werden, daß der erhaltene Extrakt zu einem Rückstand konzentriert wird, der dann wiederum in einem organischen Lösungsmittel wie η-Hexan oder Petroläther gelöst wird, um dann eine Fällung zu bewirken.

Es sei darauf hingewiesen, daß Thiopeptin ein Komplex ist, der aus einem Hauptfaktor und zwei Nebenfaktoren besteht Die Bestimmung wurde durch Analyse mittels Dünnschicht-Chromatographie der unreinen kristallinen Thiopeptinmasse durchgeführt wobei als Entwicklungsmittel ein Lösungsmittelsystem aus Chloroform und Methanol (10:1 bezogen auf das Volumen) verwendet wurde. Von den drei Komponenten wurden willkürlich die zwei Nebenkomponenten als Thiopeptin Ai und Thiopeptin A₃ und die Hauptkomponente als Thiopeptin B bezeichnet Aus dieser Dünnschicht-Chromatogramm-Analyse, die in Fig. 1 wiedergegeben ist wurden die Rf-Werte der drei Faktoren wie folgt bestimmt:

Tabelle II

Rf-Werte der Thiopeptin-Komponenten

Komponenten

Thiopeptin Ai
Thiopeptin A3
Thiopeptin B

Rf-Werte

0,78
0,60
0,19

Diese den Thiopeptinantibiotika-Komplex bildenden Komponenten können dadurch voneinander getrennt werden, daß die unreine kristalline Zubereitung, die wie vorstehend beschrieben erhalten wurde, in einem geeigneten organischen Lösungsmittel wie Chloroform gelöst und die Lösung dann der Kolonnenchromatographie mit einem geeigneten organischen Lösungsmittelsystem unterworfen wird, wobei Chloroform und Methanol bevorzugt verwendet werden. Die drei Komponenten können in Form der Felder der drei absorbierten Bänder identifiziert werden, die in der Silica-Gel-Kolonne erscheinen. Die Isolierung der beiden Thiopeptin Α-Komponenten kann unter Verwendung von Chloroform und Methanol in einem Volumenverhältnis von etwa 20 : 1 bis etwa 50 : I durchgeführt werden. Um die zwei Thiopeptin A-Komponenten voneinander zu trennen, ist eine Änderung des Lösungsmittelsystems nicht erforderlich. Die Komponenten können dabei in die einzelnen Thiopeptin-Komponenten aufgetrennt werden, indem die erscheinenden Bänder kontinuierlich unter Verwendung des gleichen Lösungsmittelsystems entwickelt werden. Nach der Eluierung der Thiopeptin A-Komponenten kann eine Änderung des Volumenverhältnisses des genannten Lösungsmittelsystems zur Eluierung der Thiopeptin B-Komponente führen. Das bevorzugte Volumenverhältnis liegt bei etwa 4:1 bis etwa 9:1. Obwohl, wie oben angegeben wurde, die zuerst erfolgende Eluierung der zwei Thiopeptin A-Komponenten bevorzugt durchgeführt wird, ist auch eine Umkehrung der Eluiemngs-Reihenfolge möglich.

Die beiden Thiopeptin Α-Komponenten können voneinander dadurch getrennt werden, daß die Eluate in Fraktionen aufgeteilt und dann die Rf-Werte dieser Fraktionen bestimmt werden. Alle Thiopeptin A-Verbindungen können äurch Konzentrationen der abgetrennten Fraktionen und anschließendes Auflösen des Konzentrates in Aceton kristallisiert werden. Im Gegensatz zu diesen beiden Α-Komponenten bildet die B-Komponente kein kristallines Material bei Durchführung des gleichen Verfahrens. Diese Fraktion wird wiederum in einer Kieselsäure-Kolonne Chromatographien, wobei Chloroform und Methanol als Lösungsmittelsystem (vorzugsweise in einem Volumenverhältnis von 50:1 bis 20:1) verwendet werden. Die Kristallisation von Thiopeptin B kann dadurch durchgeführt werden, daß das erhaltene Eluat zu einem Rückstand eingeengt wird, der dann in warmem Aceton aufgelöst wird Die Kristallisation kann durch Abkühlen der Lösung auf unter 10⁰C bewirkt werdea

Die folgenden Beispiele erläutern die Herstellung einer Impfkultur, die Bildung von Thiopeptin und die Isolierung der Thiopeptin-Komponenten.

Beispiel i Herstellung einer Impfkultur

Das Inokulum, das zur Herstellung der Impfkultur verwendet werden solL wurde durch 4tägiges Wachstum von Streptomyces tateyamensis ATCC 21389 auf einer Agar-Platte bei 30⁰C erhalten. Die Impfkultur kann dadurch hergestellt werden, daß das erzeugte Inokulum in eine Bennett's-Agar-Schrägkultur überimpft wird und diese Agar-Kultur dann 7 Tage lang bei 30°C bebrütet wird. Diese Impfkultur wurde für das nachstehend beschriebene Fermentationsverfahren verwendet.

Beispiel 2
Bildung von Thiopeptin

A. Fermentation

1. Eine Impfkultur von Streptomyces tateyamensis, wie sie in Beispiel 1 erhalten wurde, wurde auf ein steriles Medium überimpft, das in 100 ml Wasser die folgenden Bestandteile enthielt:

is --i—tc^i-ix-i— ι\αι iiMiwaicii nt»	2,0%
Baumwollsamenmehl	1,0%
Maisquellwasser	0,3%
Calciumcarbonat	2,18%
Kaliumdihydrogenphosphat	12H2O 1,43%
Dinatriumhydrogenphosphat ■

Die geimpfte Brühe wurde 2 Tage lang bei 30°C inkubiert. Diese Kultur wurde dann in einen 30-1-Fermentationsapparat aus rostfreiem Stahl gegeben, der 201 des erwähnten Mediums enthielt. Der sterile Fer-

jo mentationsapparat wurde 48 Std. lang bei 3O⁰C inkubiert, wobei 201 sterile Luft pro Minute durchgeleitet wurden. Es wurde auf einem Rotationsschüttelapparat mit 300 UpM gearbeitet.

2. Die Fermentation wurde unter den gleichen

r> Bedingungen und nach dem gleichen Verfahren wie im Abschnitt 1 beschrieben durchgeführt, wobei jedoch ein steriles Medium verwendet wurde, das in 100 ml Wasser die folgenden Komponenten enthielt:

Kartoffelstärke	4,0%
Baumwollsamenmehl	2,0%
Maisquellwasser	1,0%
Trockene Hefe	1,0%
Calciumcarbonat	0,3%
Kaliumdihydrogenphosphat	2,18%
Dinatriumhydrogenphos	1,43%
phat ■ 12H2O
N-Acetyl-DL-methionin	0,17%

3. Die Fermentation wurde wiederum unter den gleichen Bedingungen und nach der gleichen Verfahrensweise wie im obigen Abschnitt 1 durchgeführt, wobei jedoch ein Medium verwendet wurde, das in ICO ml Wasser die folgenden Komponenten enthielt:

Kartoffelstärke	2.0%
Baumwollsamenmehl	2,0%
Maisquellwasser	1,0%
Trockene Hefe	1,0%
Calciumcarbonat	03%
Kaliumdihydrogenphosphat	2,18%
Dinatriumhydrogenphosphat ·	12H2O 1,43%
Natriumsulfat	0,5%

B. Gewinnung von Thiopeptin

1. Die Gewinnung von Thiopeptin wurde dadurch erzielt, daß die Kuiturbrühe filtriert und 1,8 kg des

erhaltenen Mycelkuchens mit 7 I eines Gemisches aus Chloroform und Methanol (2:1, bezogen auf das Volumen) extrahiert wurden, wobei das Gemisch aus 50⁰C erwärmt wurde. Dieses Extraktionsverfahren wurde dreimal wiederholt, und die vereinigten Extrakte wurden filtriert. Dann wurde das Filtrat zur Trockne eingeengt und der Rückstand wurde in 200 ml Chloroform jelöst. Bei Zugabe von 200 ml Benzol bildete sich ein Niederschlag, der durch Filtration aus dem Lösungsgemisch entfernt wurde. Der durch Einengen des erhaltenen Filtrats zurückgebliebene Rückstand wurde in der etwa zehnfachen Menge n-Hexan gelöst, um ein kristallines Material, bestehend aus den drei Thiopeptin-Komponenten, zu bilden.

2. Thiopeptin wurde erhalten durch Filtration der Kultur-Flüssigkeit und durch Extraktion des so erhaltenen Mycelkuchens mit Aceton. Der Acetonextrakt wurde zu einem Rückstand konzentriert, der wiederum mit Äthylacetat extrahiert wurde. Das rohe kristalline Thiopeptin wurde dadurch erhalten, daß der erhaltene Extrakt eingeengt und das Produkt abgekühlt wurde.

Beispiel 3
Isolierung des Thiopeptin A-Komplexes

Das rohe Thiopeptin wurde in einer Silicagel-Kolonne Chromatographien, wobei ein Lösungsmittelsystem aus Chloroform und Methanol (50 :1, bezogen auf das Volumen) verwendet wurde. Das Eluat wurde zur Trockne eingedampft, und der Thiopeptin A-Komplex wurde als braunes Pulver erhalten, indem das Konzentrat in Aceton gelöst und das Gemisch auf unter Zimmertemperatur abgekühlt wurde.

Beispiel 4
Isolierung von Thiopeptin Ai

Das in Beispiel 3 erhaltene unreine Pulver wurde in einer Silicagel-Chromatographiekolonne absorbiert. Nachdem mit Chloroform gewaschen worden war, wurde mit einem Chloroform-Methanol-Lösungsmittelsystem im Volumenverhältnis 50:1 eluiert. Das Eluat wurde zu einem Rückstand eingeengt, der in Aceton gelöst wurde. Wenn die Lösung unter Abkühlen stehengelassen wurde, kristallisierte das Thiopeptin Ai aus. Es wurde durch Filtration gesammelt.

Beispiel 5
Isolierung von Thiopeptin A3

Das Thiopeptin A3 wurde nach dem gleichen Verfahren kristallisiert, das in Beispiel 4 angewandt wurde.

Beispiel 6
Isolierung von Thiopeptin B

Nachdem der Thiopeptin Α-Komplex mit einem 50 :! Lösungsmittelsystem e'uiert worden war, wurde das Volumenverhältnis des gleichen LöP'Tigsmittelsystems geändert, um das absorbierte Band von Thiopeptin B zu entwickeln. Es wurde ein Volumenverhältnis von 3:1 angewandt. Thiopeptin B wurde dadurch gewonnen, daß das erhaltene Eluat zu einem Rückstand eingeengt wurde, der in Chloroform gelöst und nochmals Chromatographien wurde in einer Kolonne unter Verwendung von Kieselsäure. Als Lösungsmittelsystem wurde Chloroform : Methanol (50:1, bezogen auf das Volumen) verwendet Das kristalline Thiopeptin B, das durch Einengen des Eluats zu einem Rückstand erhalten wurde, wurde in Aceton gelöst. Die Lösung wurde auf weniger als 10⁰C abgekühlt, um eine Auskristallisation zu bewirken. Das erhaltene Thiopeptin B wurde durch Filtration gesammelt.

ι > Die so erhaltenen Thiopeptin-Komponenten besitzen alle im wesentlichen gleiche chemische und physikalische Eigenschaften. Diese Thiopeptin-Komponenien sind jeweils löslich in Dioxan, DimethylsulfoxiJ. Dimethylformamid, Pyridin, Chloroform und 3 η

2n Salzsäure; wenig löslich in Methanol, Aceton und Äthylacetat; unlöslich in Äther, Benzol. n-Hexan. Petroläther und Wasser. Sie zeigen eine positive Reaktion im Permanganat-Test und eine negative Reaktion im Ninhydrin-, Biuret-, Fehling-, Ferrichlorid-, Ehrlich- und Dragendorff-Test. Die Thiopeptin-Komponenten sind alle stabil bei 60°C für einen Zeitraum von einer Stunde bei einem pH-Wert von etwa 2,0 bis etwa 8,0. Die folgenden chemischen und physikalischen Eigenschaften von Thiopeptin Ai.

Thiopeptin Aj und Thiopeptin B werden zusätzlich genannt.

Thiopeptin Ai

Thiopeptin Ai ist eine schwach gelbe kristalline Substanz mit einem Schmelz- oder Zersetzungspunkt zwischen etwa 223° C und etwa 226° C. Die optische Drehung dieser Substanz ist: [λ] ¹J= -71° (c=\,0. in Chloroform). Es hat das Molekulargewicht 1637, bestimmt nach der Dampfdruckmethode. Die folgenden

w Werte für die Elementaranalyse wurden gefunden:

C = 49,38; H = 4,93;N = 14,22;S = ll,72⁽'>

Das Ultraviolettabsorptionsspektrum von Thiopeptin Ai in Methanol zeigt Vorsprünge bei 230 bis 250 nm,

■4i 295 nm und 305 nm, wie aus F i g. 2 ersichtlich ist. Aus Fig.5 ist ersichtlich, daß das Infrarotspektrum in Nujol Absorptionsbanden bei den folgenden Wellenzahlen zeigt: 3400, 3330, 3150, 1718, 1655, 1585, 1508, 1492,1338,1305, 1275, 1245,1205,1160. 1135, 1123. 1113.

1092, 1065, 1028, 1002, 973, 950, 923, 893, 850, 820, 805, 765, 723 cm-'. Es wurde festgestellt, daß das mit 6 η Salzsäure bei 100° C hydrolysierte Thiopeptin Ai als Aminosäurekomponenten beispielsweise Valin, Cystein, Threonin und Alanin enthält, was durch den Ninhydrin-Test festgestellt wurde.

Thiopeptin A3

Thiopeptin A₃ ist eine schwach gelbe kristalline Substanz mit einem Schmelz- oder Zersetzungspunkt zwischen etwa 232° C und etwa 236° C Es zeigt die folgende optische Drehung: [<%]£=-10,8° (c=l, in Chloroform). Das Molekulargewicht dieser Substanz beträgt 1972, bestimmt nach der Dampfdruckmethode.

Bei der Elementaranalyse wurden die folgenden Werte "efunden:

C=48,45; H=5,ll; N = 14,46; S=12,09%.

F i g. 3 zeigt ein Ultraviolettabsorpnonsspektrum dieser Substanz in Methanol, wot»ei Vorspränge bei 235 bis 255 n-n, 285 bis 300 nm und 302 bis 310 nm erscheinen. Fig.6 zeigt das Infrarotabsorptionsspektrum in Nujol mit Banden bei 3386, 3320. 1725, 1655, 1583, 1518. 1490, !305, 1210, 1160, 1130, 1115, 1090, 1070, 1028, 1000. 945, 920. 890, 860, 765, 720, 710 cm-'.

Thiopeptin B

Thiopeptin B ist eine Hauptkomponente einer schwach gelben kristallinen Substanz, die einen Schmelz- oder Zersetzungspunkt zwischen etwa 219°C und etwa 222°C hat. Die optische Drehung beträgt: [α]« = -80° (c= 1, in Chloroform). Das Molekulargewicht beträfet 1942, bestimmt nach der Dampfdruck methode. Bei der Elementaranalyse wurden die folgenden Werte erhalten:

C = 48,73; H =4,87; N = !4,30; S= 11,04%.

Das Ultravi.olettabsorptionsspektrum von Thiopeptin B in Methanol ist in Fig.4 dargeste'lt und zeigt Vorsprünge bei 230 nm bis 250 nm, 295 und 305 nm. Fig. 7 zeigt das Infrarotabsorptionsspektrum dieser Fraktion in Nujol; es weist maximale Absorptionsbanden bei den folgenden Wellenzahlen auf: 3400, 3300, 3160, 1735, 1685, 1660, 1650. 1640, 1585, 1510, 1485, 1335, 1305, 1270. 1250, 1240, 1205. 1165. 1130, 1120, 1110, 1095, 1070, 1025. 1005, 975, 950. 9J0, 895, 820, 765, 725, 705 cm-'.

Die antibiotische Wirksamkeit von Thiopeptin Ai, Thiopeptin A3 und Thiopeptin B wurde untersucht. Bei diesen Versuchen, deren Ergebnise in Tabelle III zusammengestellt sind, wurde die Aktivität der Verbindungen ausgedrückt als die minimale Hemmkonzentration (MIC). Die MIC wurde nach der üblichen Agar-Verdünnungsmethode gegenüber einer Vielzahl von Mikroorganismen bestimmt. Die MIC-Werte werden angegeben als die Konzentration der Verbindung in μg/ml, welche das Wachstum des Mikroorganismus verhinderte.

Tabelle III

MIC der Thiopeptin-Komponenten

Mikroorganismus:

Thiopeptin
A₁

Thiopeptin
A₃

Thiopeptin
B

Staphylococcus 0,10 0,25 0,10

aureus 209 P

Bacillus subtilis 0,10 0,25 0,05

Bacillus megaterium 0,10 0,25 0,05

Sarcina lutea 0,05 0,06 0,025

Corynebacterium 0,05 0,25 0,01

xerosis

Escherichia coli > 100,0 > 100,0 > 100,0

Proteus vulgaris > 100,0 > 100,0 > 100,0

Pseudomonas > 100,0 > 100,0 > 100,0

aeruginosa t

Mycobacterium > 100,0 8,0 50,0

SP-607
Mycobacterium phlei 50,0 32,0 50,0

Um zu zeigen, daß die minimale Hemmkonzentration (MIQ der erfindungsgemäßen Thiopeptine gegenüber Mycoplasma besser ist als diejenige von Flavomycin, wurden weitere Vergleichsversuche durchgeführt Materialien und Verfahren

Die minimale Hemmkonzentration (MIC) der Thiopeptine und von Flavomycin gegenüber drei ) Stämmen von Mycoplasma von Hühnern wurde unter Verwendung eines normalen Agar-Vercunnungsver fahren bestimmt.

Teststämme:

'" Mycoplasma gallisepticum PG-31 (ATCC 19 610) isoliert aus Hühner, die an chronischen Atmungskrankheiten leiden;

Mycoplasma gallisepticum IRF

isoliert aus Hühnern, die an chronischen Atmungs '' krankheiten leiden;

Mycoplasma synovieae WVU-1853 (ATCC 25 Γ04) isoliert aus Hühnern, die an Luftsacculitis und Synovitis leiden.

_'o Kulturmedium:

Für die ersten beiden Stämme:

1,47 g PPLO-Brühe (dehydratisiert) wurden in 70 ml destilliertem Wasser gelöst und in an sich

_>-) bekannter Weise sterilisiert. Zu der Lösung wurden

20 ml Pferdeserum, 10 ml getrockneier Bäckerhefeextrakt, hergestellt durch Extraktion von 500 g getrockneter Bäckerhefe mit 1500 ml Wasser, 1 ml lO°/oiges Ampicillin und 0.5 ml lO°/oiges Thallium-

Ki acetat zugegeben.

Für den letzten Stamm:

2,25 g Mycoplasma-Grundbrühe und 1 g Agar wurden in 100 ml destilliertem Wasser gelöst und '' in an sich bekannter Weise sterilisiert. Zu der

Lösung wurden 20 ml Pferdeserum. 1 ml Nicotinamid-adenindinucleotid und 1 ml l%iges L-Cysteinhydrochlorid zugegeben.

Inokulumgröße:

0,01 ml Brühe, die etwa 10⁵ CFU (koloniebildende Einheiten) Mycoplasma/ml enthielten.

Kulturbedingungen:

4> Die Kultur wurde 4 Tage lang bei 37⁰C in einer Atmosphäre durchgeführt, die 10% Kohlendioxid enthielt.

so

₅₅

Ergebnisse:
Tabelle IV

Mycoplasmastämme

MIC (ug/ml)

Thiopeptin B A₃

Flavomycin

M.gallisepticum PG 31	0,39	0,10	>100
M.gallisepticum IRF	0,20	0,10	>100
M^ynoviae WVU-1853	0,78	0,78	>100

Die obigen Versuche zeigen, daß die erfindungsgemäßen Thiopeptine hinsichtlich ihrer Aktivität gegenüber Mycoplasma, das bekanntlich bei Geflügel und Schweinen pathogen, ist, dem Vergleichsprodukt Flavomycin eindeutig überlegen sind, d. h. wenn man die erfindungsgemäßen Thiopeptine enthaltendes Futter

an Geflügel und Schweine verfüttert, wird der Lebensraum des Geflügels oder der Schweine frei von Mycoplasma gehalten.

Das erfindungsgemäße Thiopeptin B weist auch keine Kreuzresistenz gegenüber Penicillin-G, Aminobenzylpenicillin, Streptomycin, Chloramphenicol, Tetracyclin, Leucomycin, Erythromycin und Kanamycin auf. Bei intraperitonealer Verabreichung von 500 mg/kg Thiopeptin B an Mäuse trat zwei Wochen nach der Injektion kein toxisches Symptom auf (vgL »The Journal of Antibiotics«, Band XXIII (1970), Seiten 113 bis 119). Auch gegenüber dem Antibioticum Tylosin, das gegenüber Mycoplasma wirksam ist, ist das erfindungsgemäße Thiopeptin überlegen, weil es keine iCreuzrestistenzen mit anderen Antibiotika, beispielsweise mit Erythromycin, aufweist (vgL die obengenannte Literaturstelle in Verbindung mit »Antibiotics and Chemotherapy«, Band 11 (1961), Seiten 320 bis 327).

Zur Bestimmung der akuten Toxizität der Thiopeptin-Komponenten bei der Maus wurde eine 5%ige Suspension des Antibiotikums in Natriumcarboxymethylccllulose mit destilliertem Wasser verdünnt und intraperitoneal den Mäusen verabreicht DieLDso-Werte von Thiopeptin Ai, Thiopeptin A₃ und Thiopeptin B wurden mit >500, > 250 bzw. >250 mg/kg ermittelt

Das die obigen Eigenschaften aufweisende Thiopeptin kann vorteilhaft als wachstumsfördernder Zjsatz in Tierfutter für beispielsweise Schweine und Geflügel verwendet werden. Für eine solche Verwendung können die als Bestandteil von Tierfutter eingesetzten Thiopeptin-Verbindungen vorzugsweise in weniger reiner Form angewandt werden. Beispielsweise können diese Komponenten auch in Form des getrockneten, rohen Thiopeptin-hahigen Mycelkuchens verwendet werden, der durch Abfiltrieren des Mycels aus dem den Fermenlationsapparat entnommenen Flüssigkeitsgemisch erhalten wurde. Der Thiopeptinhaltige Mycelkuchen kann so trocken als möglich aufbewahrt werden, um seine Aktivität zu bewahren. Wenn er mit geeigneten Mengen an Nährmitteln vermischt wird, sollten diese Nährmittel einen möglichst geringen Wassergehalt besitzen. Es können natürlich auch die drei Thiopeptin-Komponenten alleine oder in Kombination als Zusatzstoffe für Tierfutter verwendet werden. Die Thiopeptin-Komponenten aHeine oder deren Kombination(Komplex) oder die Form des Mycelkuchens können mit den Rationen vermischt werden, die üblicherweise zur Tierfütterung verwendet werden. Der Anteil dieses Antibiotikums, der Tierfutter-Mischungen zugefügt werden kann, kann in weiten Grenzen schwanken in Abhängigkeit u. a. von dem beabsichtigten Wachstum der Tiere, den Eigenschaften des Antibiotikums und den gewünschten Eigenschaften der erhaltenen Mischungen. Wenn das Antibiotikum an Geflügel oder Schweine in Mengen zwischen etwa 0,1 ppm und etwa 100 ppm bzw. zwischen etwa 10 ppm und etwa 500 ppm verfüttert wurde, konnten keine Antibiotikum-Rückstände im Serum oder im Gewebe der untersuchten Tiere festgestellt werden. Wenn auch Spurenmengen der Antibiotikum-Rückstände innerhalb der Analysengrenzen in der Bauchhöhle vorhanden sein könnten, ist doch festzustellen, daß im Hinblick auf die Tatsache, daß die Antibiotikumrückstände nicht im Fleisch der Tiere gefunden werden konnten und feststellbare Mengen von aktiven Antibiotikum-Rückständen im Fleisch der mit den Antibiotikum-Zusätzen gefütterten Tiere schnell verschwanden, wenn die Antibiotikum-Verfütterung einige Tage vor dem Schlachten eingestellt worden war, die Antibiotikum-Rückstände nicht zu irgendwelchen ungewünschten Effekten beim Menschen führea Es sei auch bemerkt, daß diese anübiotischen Zusatzstoffe, wenn sie in den richtigen Mengen den Futter-Rationen beigemischt werden, keine unerwünschten Effekte bei den Tieren hervorrufen und ein erhöhtes bzw. beschleunigtes Wachstum

ίο bewirken.

Versuche haben gezeigt, daß das erfindungsgemäße Antibiotikum Thiopeptin bei der Verabreichung an Hühner innerhalb von 48 Stunden nach der Verabreichung mit den Exkrementen der Versuchstiere ausgeschieden und von dem Gewebe nicht absorbiert wird. Auch bei der Verabreichung an Schweine tritt eine praktisch vollständige Wiederausscheidung auf.

10 Landrace-Schweine mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 53 kg wurden in zwei Gruppen aufgeteilt Einer Gruppe wurde an 54 aufeinanderfolgenden Tagen eine 500 g des erfindungsgemäßen Thiopeptins pro Tonne Futter enthaltende Futterration verabreicht Die 5 Schweine der Kontrollgruppe erhielten das Basal-Futter. Das Körpergewicht und der Futterverbrauch wurden jede Woche aufgezeichnet Am Ende des Versuchs wurden alle Schweine getötet und ,einer makroskopischen Untersuchung unterzogen. Zur Bestimmung der Rfickgewtnnungsrate von Thiopeptin aus Tiergepebe wurde das Thiopeptin dem Blut, Leber- und Muskel-Homogenaten von Geflügel und Schweinen in einer Menge von 0,02 ug pro g Probe verabreicht bzw. es wurde dem Eigelb und dem Eiweiß in einer Rate von 0,1 μg/g verabreicht Jede dieser Proben wurde gründlich durchgemischt und anschfie ßend einer Extraktion und einer Analyse unterzogen.

Zur Durchführung der Geweberückstandsuntersuchung wurden 10 Hähnchen mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 1,2 kg oral 100 mg Thiopeptin pro Versuchstier in Gelatinekapseln verabreicht Zwei Hähnchen wurden 2,4,8,24 und 48 Stunden nach der Verabreichung getötet Der gesamte Gastrointestinaltrakt mit seinem Inhalt, die Fäkalien und andere wichtige Organe (Blut, Herz, Lungen, Leber, Milz, Nieren, Pankreas und Schlegelmuskel) wurden ge·

•is sammelt und untersucht

Die in beiden Versuchen erhaltenen Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen zusammengefaßt

Tabelle V Thiopeptin-Rückgewinnung (%) aus dem Gewebe Versuchstier Gewebe

Thiopeptin-Rflckftewinnuni (%) bei Vertbreidning ν

SI W/g <M>2|if/g

ewebc Oewebe

ing von

Geflügel

Schweine

Eier

·) NT-Nicht untersucht.

Blut	NT·)	96
Über	NT	102
Muskel	NT	110
Blut	NT	96
Über	NT	%
Muskel	NT	%
Eiweiß	98	NT
Eigelb	63-83	NT

Tabelle VI	Verabreichung einer einzelnen	4Std	nach	8Std.	Thiopeptin-Dosis	48Std
		6,0	Spuren		0
Verteilung von Thiopeptin in Geflügel nach	Thiopeptin-Rückgewinnung (%)
von 100 mg pro Versuchstier	2Std	47.8	20,0	24Std	0
Organ	IU	29,1	55,3	0	0
		18,2	24,5		101,0
Proventriculus-	703	0	0	0	0
Gizzard-Kropf	15.2	0	0	Spuren	0
Dünndarm	23	0	0	984	0
Dickdarm	0	0	0	0	0
Fäkalien	0	0	0	0	0
Blut	0	0	0	0	0
Herz	0	0	0	0	0
Lungen	0	0	0	0	0
Leber	0	101,1	99,8	0	101,0
Muz	0			0
Nieren	0	0
Pankreas	100,2	98,5
Scfalegelmuskel
Gesamt (%)

Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß bei Verabreichung einer einzigen Dosis von Thiopeptin von 100 mg pro Versuchstier innerhalb von 48 Stunden mit den Fäkalien nahezu 100% des verabreichten Thiopeptins wieder ausgeschieden wurden, so daß keine Spur von Thiopeptin in den untersuchten Hauptorganen nachgewiesen werden konnte.

IHe folgenden Beispiele erläutern die Wirkung der Thiopeptin Α-Komponenten und des Thiopeptins B auf das Wachstum und die Futterausnützung bei Geflügel.

Beispiel 7

Hahner wurden zu fünf Gruppen von je 40 Hühner mit jeweOs gleichem Gewicht zusammengestellt Die Einzelgewichte und.der Futterverbrauch pro Gruppe wurden alle zwei Wochen gemessen. Die sechs behandelten Gruppen bestanden aus zwei Kontrollgruppen und vier Versuchsgruppen. Die Kontrollgruppen wurden mit der Basal-Ration gefüttert Die vier Versuchsgruppen wurden mit der Basal-Ration gefüttert, der jeweils 5 g der Thiopeptin A-Komponenten bzw. 20 g Thiopeptin B pro t beigemischt worden waren. Als Thiopeptin Α-Komponenten wurde das in Beispiel 3 erhaltene Produkt verwendet. Das Thiopeptin B war das in Beispiel 6 erhaltene Produkt

Sowohl die Thiopeptin A-K.omponenten als auch das Thiopeptin B alleine waren wirksam hinsichtlich der Forderung des Wachstums und der Erhöhung der Ge wichtszunahme und der Verbesserung der Futterverwertung. Die Versuchsergebnisse lind in den weiter unten folgenden Tabellen VIl und VIII zusammengestellt

Das folgende Beispiel erläutert die Wirkung von Thiopeptin als tCömbmation der Thiopeptin A-Komponenten und des Thiopeptins B und in Form des Mycelkuchens bei der Behandlung von Geflügel.

basis zusammengestellt Die Einzelgewichte und der Futterverbrauch pro Gruppe wurden alle zwei Wochen gemessen. Von den fünf behandelten Gruppen wurde

die eine mit der Basal-Ration alleine als Kontrolle gefüttert Die anderen Gruppen erhielten das Futter mit dem Thiopeptin-Komplex in einer Menge von 2$ g bzw. 10 g pro t der Basal-Ration sowie mit 15 g bzw. 10 g des Mycelkuchens pro t der Basal-Ration.

Die Beimischung der Thiopeptin-Kombination sowie des Mycelkuchens zur Ration führte zu einer Erhöhung der täglichen Gewichtszunahme und einer Verbesserung der Futterverwertung während der Versuchsperiode. Die Ergebnisse sind in der weiter unten folgenden Tabelle IX zusammengestellt

Das folgende Beispiel erläutert die Wirkung von Thiopeptin in Form der Kombination der Thiopeptin-Komponenten bei Schweinen.

Beispiel 9

Schweine wurden zu drei Versuchsgruppen von je 6 Schweinen mit jeweils gleichem Gewicht zusammenso gestellt Die Einzelgewichte und der Futterverbrauch wurden alle zwei Wochen ermittelt Die Versuchs* gruppen erhielten ein Futter, dem alle Thiopeptin-Komponenten if. einer Menge von 20 g bzw. 100 g pro t beigemischt waren. Die Versuchszeit betrug 6 Wochen. > 55 Die Zugabe der Thiopeptin-Komponenten bewirkte eine Verbesserung der täglichen Gewichtszunahme und der Futterverwertung während der 6-Wochen-Periode. Die Versuchsergebnisse sind in Tabelle X zusammengestellt

Beispiel 8

Hühner wurden zu fünf Behandhingsgruppen von jeweils 36 Hühnern mit jeweils gleicher Gewichts-

Tabelle VII	Basal- Ration	Thiopeptin (5 ppm)	A (20 ppm)	1
	36,80	36,80	36,80	f
Durchschnittl. Anfangsgewicht (g)			I Il

	( ..	19	17	29 355	(g)	1933	Tabelle X	(2J5 ppm)	18	(10 ppm)	-V	(100 ppm)	Thiopeptin	B
			(g)	307,7		37,7		37,7		19,75	(5 ppm)	(20 ppm)
Fortsetzung		Tabelle VIII	Gramm verfüttert/	Gramm verfüttert/Gramm Zunahme in 1,97		583,4	Basal-	580,7
	Basal- Thiopeptin A Ration ic _„_» tin nnm|		15 Gramm Zunahme in	0-4 Wochen	DurchschnittL		Ra tion		47,27	37,00	37,00
	(a ppm; i*u ppm;		0—4 Wochen		Anfangsgewicht (kg)	1953		199,0
					DurchschnittL	3493	37,00	344,0		629,16	637,50
	627,08 666,66 659,57	3 DurchschnittL			Endgewicht (kg)	1,89		139
DurchschnittL					Durchschnitti.		614,63		17,67
Endgewicht (g)			Basal-Ration Thiopeptin A+B		Zunahme (kg) in				935
					0-4 Wochen	Basal- Thiopeptin		A + B	2,61	2153	217,79
DurchschnittL			DurchschnittL Anfangsgewicht (g) 37,7		4-6 Wochen	^0" (20 ppm)				37637	382,71
Gewichtszunahme in	201,05 237,85 213,40		DurchschnittL Endgewicht (g) 5493		kg verfüttert/	19,75 19,75	200,85			1,74	1,79
0-2 Wochen (g)	389,23 398,97 409,37		DurchschnittL Gewichtszunahme in		kg Zunahme in		376,78
2-4 Wochen (g)	132 130 1,78		0-2 Wochen (g)		0-6 Wochen	44,42 45,70	1,80
Gramm verfüttert/		Anfangsgewicht (g)	2-4 Wochen (g)
Gramm Zunahme		Durchschnitt!.						Mycelkuchen
in 0—4 Wochen		Endgewicht (g)						(23 ppm)	(10 ppm)
Tabelle IX	ίο DurchschnittL		15.72 15,65			37,7	37,7
			832 9,60		577,1	579,6
		231 2,83
			204,4	199,0
Gewichtszunahme in			334,7	3423
0-2 Wochen	Hierzu 7 Blatt Zeichnungen		138	137
2-4 Wochen

Claims (3)

Patentansprüche:

1. Antibiotikum Thiopeptin A), eine schwach gelbe kristalline Substanz, gekennzeichnet durch

eine Elementaranalyse mit folgenden Werten: C 4938; H 4,93; N 14,22; S 11,72%

ein Molekulargewicht von 1637, bestimmt nach der Dampfdmckmethode, woraus sich die folgende angenäherte Summenformel errechnen IaBt

einen Schmelz- oder Zersetzungspunkt zwischen etwa 223 und etwa 226"C, eine optische Drehung [α] ³i von -71° (c=\, in Chloroform),

einen jW-Wert von 0,78 in einem Lösungsmittelsystern aus Chloroform und Methane! im Volumenverhältnis 10:1, ein charakteristisches Ultraviolettabsorptionsspektrum gemäß F i g. 2, ein charakteristisches Infrarotabsorptionsspektrum gemäß F i g. 5,

eine Löslichkeit in Dioxan, Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Pyridin, Chloroform und 3 η Salzsäure, eine geringe Löslichkeit in Methanol, Aceton und Äthylacetat und eine UnlöslV"i>keit in Äther, Benzol, η-Hexan, Petroläther und Wasser und

eine Arninosäufezusammensetzung bei Hydrolyse mit 6 π Salzsäure be^! 110° C während 24 Stunden, bezogen auf 2 Mol Alanin, von 0,93 Mol Threonin, 1,01 Mol Valin und 0,91 Mol Cystein.

2. Antibiotikum Thiopeptin A₃, eine schwach gelbe kristalline Substanz, gekennzeichnet durch

eine Elementaranalyse mit folgenden Werten: C 48,45; H 5,11; N 14,46; S 12,09%,

ein Molekulargewicht von 1972, bestimmt nach der Dampfdmckmethode, woraus sich die folgende angenäherte Summenformel errechnen läßt:

einen Schmelz- oder Zersetzungspunkt zwischen etwa 232" C und etwa 236" C, eine optische Drehung [<x] 5? von -103° (c-1, in Chloroform),

einen Rf-Wert von 0,60 in einem Lösungsmittelsystem aus Chloroform und Methanol im Volumenverhältnis 10:1, ein charakteristisches Ultraviolettabsorptionsspektrum gemäß F i g. 3, ein charakteristisches Infrarotabsorptionsspektrum gemäß F f f.- 6r

eine Löslichkeit in Dioxan, Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Pyridin, Chloroform und 3 η Salzsäure, eine geringe Löslichkeit in Methanol, Aceton und Äthylacetat und eine Unlöslichkeit in Äther, Benzol, n-Hexan. Petroläther und Wasser und eine Aminosäurezusammensetzung bei Hydro-

lyse mit 6 η Salzsäure bei HO⁰C während 24 Stunde», bezogen auf 2 Mol Alanin, von 0,94 Mol Threonin, 1,01 Mol Valin und 0,98 MoI Cystein.

3. Antibiotikum Thiopeptin B, eine schwach gelbe kristalline Substanz, gekennzeichnet durch

«sine Elementaranalyse mit folgenden Werten: C 48,73; H 4,87; N 14,30; S 11,04%,

ein Molekulargewicht von 1942, bestimmt nach der Dampfdmckmethode, woraus sich die folgende angenäherte Summenformel errechnen läßt: