JPH01230519A - ポリ硫酸化ヘパリンの用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 マウス、牛、鳥、猿及びヒトにおける多くの悪性リンパ
性白血病新生物は、レトロウィルスにより引き起こされ
る。特にヒトにおける後天性免疫欠如（ＡＩＤＳ　）は
、レトロウィルスであるＨｌ”ｖ’ｆ（ヒト免疫欠如ウ
ィルス）により引き起こされる。

ヒト及び他の哨乳動物における前記の免疫感染の予防及
び治療上の化学療法のためのスタートは、例えば逆転写
酵素の抑制物質による及び／又は宿主細胞におけるレト
ロウィルスの結合の抑制物質によるウィルス増殖の抑制
である。

市販のヘパリンは、試験管内でＨＩＶ−自己複製の選択
的抑制剤であるが（Ａｎｔｉｖｉｒａｌ　Ｒｅｓ。

７．１９８７年３６１頁）、抗ウイルス治療には適しな
い。なぜならばこれは血液凝固を抑制する作用を有し、
出血を誘発しうるからである。

さらに市販のヘパリンは、シュミット−ルピンＤ（ＳＲ
−Ｄ）−１（ルス、鳥レトロウィルスの逆転写酵素を抑
制することが示された（西独時開！１６０１１３６号明
細書）。しかしヘパリンのこの抑制作用は、ＨＩＶ　Ｉ
の逆転写酵素については確認されていない（Ａｎｔｉｖ
ｉｒａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　。

７　（１９８７）３６１、ヘパリン及び関連ポリサッカ
ライドの構造及び活性についてのニューヨーク会議のア
ブストラフ）　１９Ａ、ならびに後記の第１表に示す若
干の研究参照）。

本発明の対象は、ポリ硫酸化ヘパリンを用いて、レトロ
ウィルスによる疾患の予防及び治療用の医薬を製造する
方法である。

ポリ硫酸化ヘパリンは、任意の遊離の水酸基及びアミノ
基において追加的に硫酸化されており、硫黄含量は少な
くとも１２．５％である。本発明により用いられるポリ
硫酸化ヘパリンは、好ましくは１６〜１５％特に１３．
５〜１５％の硫黄含量を有する。１６％以上の硫黄含量
を有するポリ硫酸化ヘパリンは、実際上製造できない。

ポリ硫酸化ヘパリンはそれ自体として、又は生理学的に
容認される塩基とのその塩の形で使用できる。塩として
は、特にＮａ塩、Ｃａ塩及びＭｇ塩があげられる。有機
塩基例えばジエチルアミン、トリエチルアミン又はトリ
エタノールアミンとの塩も用いられる。本明細書におい
て用いられる「ポリ硫酸化ヘパリン」の表現は、塩をも
包含する。

ポリ硫酸化されたヘパリンは、１００００〜４００００
ダルトンの範囲の分子量を有する天然産のヘパリンであ
ってよい。天然産のヘパリンを亜硝酸塩により（Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１５巻１９７６年３９６２頁）、
酵素により（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｊ　。

１０８巻１９６８年６４７頁）、尺は硫酸及びクロルス
ルホン酸からの混合物により（フランス特許２５３８４
０４号）処理することによって、より小さい分子量を有
するヘパリンが得られる。１０００以下の分子量を有す
るポリ硫酸化ヘパリンは、レトロウィルスの駆除のため
にはあまり適しない。最も適するものは、約２０００〜
２００００の分子量を有するポリ硫酸化ヘパリンである
。そのほか２０００〜９００００分子量全９０００リ硫
酸化ヘパリンは、これを経口的に投与できる点で特に有
利である。

ポリ硫酸化ヘパリンの製造のためには、出発物質として
分別されていないヘパリン（ＵＦＨ）ならびに亜硝酸塩
−切断により得られた種々の低分子量ヘパリン−断片が
用いられた（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ　ｔｒｙ１５巻１９７
６年６９６２頁）。

種々のヘパリンのポリ硫酸化は、好ましくは溶剤として
のピリジン中でクロルスルホン酸を用いて行われる。こ
のためには、アルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩と
して存在するヘパリンを、下記のようにしてその対応す
るピリジニウム塩に変えなければならない。

ヘパリン−ピリジニウム塩の製造： 分別されていないヘパリン１０ｇ又は脱型台された低分
子量ヘパリン１０，９を、水１００＋＋＋ＪＫ溶Ｍし、
カチオン交換体（例えばダウエックスＭＳＣ−１）　５
０ｍｌを入れたカラム上に乗せ、水で溶離する。溶離液
中では対応す砧離ヘパリン酸が生成する。次いでこのも
のをピリジン約３０ｍ／でｐＨ７に中和したのち、親油
性化する。

ヘパリン−ピリジニウム塩が約１１７得られる。

前記方法により製造された種々のヘパリンのピリジニウ
ム塩は、ポリ硫酸化のために用いられる出発材料である
。その際硫酸化度は、用（・られるクロルスルホン酸の
ｆｔＫ依存する。下記実施例により種々のポリ硫酸化ヘ
パリンの製造について詳細に説明する。

ＵＦＨのポリ硫酸化： ヘパリン−ピリジニウム塩１０ｇを、窒素を導入しなが
らピリジン５０ｍ１中に攪拌混合し、５０℃に加温した
。別に久ロルスルホン酸２０ｍ１　（’ｌ　ｍｌ／　ｊ
ｊヘパリン−ピリジニウム塩）を、したのち、ピリジン
−クロル硫酸混合物を、用意したヘパリン懸濁液中に激
しく攪拌しながら加えた。次いで５０°Ｃでさらに６０
分間攪拌し、室温に冷却した。

粒状沈殿を戸別し、メタノールで洗浄し、０゜５％Ｎａ
Ｃ１溶液１００ｍ１中に溶解し、エタノール６００　ｍ
ｌで沈殿させた。得られた沈殿を水に溶解し、このピリ
ジン−ヘパリンをカチオン交換体ダウエックスＭＳＣ−
１の８Ｑｍｌを通して再び遊離ヘハリン酸に変えた。次
いでこのものを１０　Ｎ−ＮａＯＨでｐＨ７となし、６
倍容量のエタノールで沈殿させた。この沈降物を水１０
０ｍ１に溶解し、濾過して凍結乾燥した。収量は１０．
８ｇで、得られた生成物（Ａ）は１４２０００ダルトン
の分子量（茜）及び１４．８％の硫黄含量を有していた
。

同様にして、下記の特性を有する生成物が型造された。

Ｂ、　（謂）＝８２０００．硫黄含量１４．９％（分子
量７７００ダルトンのへ）＜リンから）ｃ、　（万）＝
５６０００、硫黄含量１４．１％（分子（ｔ５１０００
ダルトンのへ〕＜リンから）Ｄ、　（刀）＝４３０００
、硫黄含量１６．６％（分子ｉ［８０００ダルトンのへ
）（リンから）Ｅ、　（苫）＝２８００．硫黄含量１４
．７％（分子量２５００ダルトンのへ）くリンから）こ
れらの生成物Ａ　−Ｅは、ヘノ（リン又は低分子量ヘパ
リンに比して血液凝固抑制作用が無視できるものであっ
た。

これらのポリ硫酸化ヘパリンは、天然へ）＜リン又はそ
れから得られた低分子量へノ（リンと比較して逆転写酵
素に対してはるかに高い抑制能を示した。

これらのことは、下記の試験により明らかにすることが
できる。

１、　ＨＩＶ　１からの逆転写酵素を用いる酵素試験：
下記のモデル系において、本質的に）・ンゼンらの方法
（Ｊ、　Ｂｉｏｔ、　Ｃｈｅｍ、　２６２巻１９８７年
１２３９５）により、抑制物質の存在下に逆転写酵素の
活性を測定した。

この酵素試験は５０μｌの全容量を有し、そして次の成
分を含有する。ｐＨ７，８のトリス−ＨＣｌ　５０　ｍ
Ｍ　、　ＫＣＩ　８０　ｍＭ　、　ＭｇＣ１，８ｍＭ及
びＤＴＴ　１　ｒｒＭ　ｏこの系はマトリックスとして
合成重合体ポリ（ｒＡ）／オリゴ（ａ’ｒ）ｔｓ　＜ペ
ーリンガー・マンノ・イム製）を１１ｎ９／ｍｔの濃度
で含有する。このマトリックスは、１００〜２００個の
ヌクレオチドの長さを有する合成ＲＮＡから成り、これ
には１５個のヌクレオチドの長さを有する短いＤＮＡ−
プライマーが結合している。このＤＮＡ−プライマーは
、逆転写酵素を開始位置として利用する。この試験にお
ける基質としては、トリチウム標識チミジントリホスフ
ェート（３Ｈ−ｄＴＴＰ、比活性４７Ｃｉ／ミリモル）
が１００μＣ１／　ｍｌの濃度で用いられる。酵素反応
は逆転写酵素の添加により開始され、そして３７℃で１
２０分間行われる。この反応は０．５　Ｍ−ＥＤＴＡ溶
液５μｌの添加により終了する。

次いで合成りＮＡを、アニオン交換体に取込まれなかっ
た”Ｈ−ｄＴＴＰ分子を結合させることにより分離する
。このためには、全試験混合物を６×６ｃ１ｎの大きさ
のＤＥＡＥ紙上にピペットで加えててエタノール中で１
回洗浄する。

交換体に結合したＤＮＡを赤外線ランプで乾燥し、次い
で液体シンチレーションカウンターにより測定する。非
特異的背景（対照）としては、前記の方法において逆転
写酵素の不在においてＤＥＡＥ　Ｐ紙に結合した放射能
をカウントした。この対照は約１００　ｃｐｍ　（約１
％・）で、測定結果に対して無視できる。被験物質を０
．９％ＮａＣ１溶液に溶解しく　１　ｍｙ／ｍｅ　）　
、蒸留水で各試験において５０μｊｉ　／ｍｌ又は５μ
ｉ　／ｍｌの最終濃度になるように希釈する。

潜在抑制物質の存在下の逆転写酵素の活性は、抑制物質
無添加の活性の％とじて示され、あるいはある物質の抑
制作用は１００％マイナス活性％として定義される。実
験濃度における各化合物の抑制作用を、第１表に示す。

第　　１　　表 非分別ヘパリン　　１３５００　　１２　　　　　０低
分子量ヘパリン　　　７７００　　１２　　　　　　０
低分子量ヘパリン　　　３８００　　１２　　　　　　
０Ａ　　　　　　　　　　　１４１００　　　１４．８
　　　　９８Ｂ　　　　　　　　　　　　８６００　　
　１４．９　　　　９７Ｃ５６００１４，１１００ Ｄ　　　　　　　　　　　　４３００　　　１３．６　
　　　９０Ｅ　　　　　　　　　　　　２８００　　　
１４．７　　　　９３■、細胞毒試験： 新規物質の毒性の評価は、Ｌ９２９細胞へのその毒性作
用に基づ（。この細胞毒試験は下記のように行った。

（１）新鮮なトリプシン消化した指数的増殖状態にある
Ｌ９２９細胞（ＡＴＣ’Ｃ／１６ＣＣＩ　１　）　５　
Ｘ　１０３個を含有する培養液１００μｌを、９６穴−
平底培養板の大中にピペットで加えた。この板をふ化器
中で３７℃で１夜保温した。ふ化器中の空気はＣＯ２５
容量％を含有する。

培養液は、５６℃で６０分間熱的に不活性化した牛胎児
血清５０ｍ１のＥａｒｌｅの塩を含有スルＭＥＭ（最小
必須培ｍ）５００　ｍｌ、　Ｌ−グルタミ７５ｍ１＜２
００ミリモル）、１００Ｘ非必須アミノ酸２．５　ｍｌ
、　　ｐＨ７，２のＩＭ−Ｈｅｐｅｓ緩衝液６緩衝液６
ゲｌタマイシン５００μ１（５０〜／　ｍｅ　）を含有
する。

（２）翌日、被験物質含有試料液１００μｌを被験物質
５００μｇ／ｍｌ培養液の最終濃度で、コンフルエント
な細胞培養液に添加し、１連２回ずつ滴定した。そのほ
か培養板には、細胞対照（被験物質溶液で処理されてい
ない細搬を加えた。次いで培養板を、ＣＯ２５容量％を
空気の雰囲気中で３７℃で４８時間保温した。

（３）被験物質溶液で処理された培養において生存した
細胞の％数を、クリスタルバイオレット染色により測定
した。このためには試験板の排水溝により穴から液体を
除去し、各人にクリスタルバイオレット溶液５０μｌを
ピペットで加える。

クリスタルバイオレット溶液は下記の組成を有する。

３．７５ｇ　　り！Ｊスタルハイオレット１．７５．ｌ
ｉｔ　　　ＮａＣ１ １６１，５ｍｌ　無水エタノール ４５．２　ｒｎ１５７％ホルムアルデヒド液水を加えて
全量５００　ｍｌとなし、このものをミリボアーフィル
ターでの濾過及 びイオン交換により精製する。

このクリスタルバイオレット溶液を穴の中に２０分間放
置したのち、同様に排水溝・から除去した。次いで細胞
と結合しなかった染料を除去するため、板を各人につき
３００μｌの水でそれぞれ５回洗浄した。細胞と結合し
た染料を、各人につき１００μｌの試薬溶液（エタノー
ル５０％、氷酢酸０．１％及び水４９９％）を加えて細
胞から抽出した。

（４）板を５分間抽出することにより、各穴中で均一に
染色された溶液が得られた。生存細胞を調べるために、
個々の穴中の染色液の抽出物を５４０　ｎｍで測定した
。

この試験において、新規物質は５００μｇ／　ｍｌの濃
度までＬ９２９細胞に対して細胞毒を示さなかった。

ポリ硫酸化ヘパリンは、常法により経口的に又は非経口
的に（皮下、静脈内、筋肉内又は腹腔内）、あるいはス
プレーとして投与できる。

用量は患者の年令、状態及び体重ならびに投与様式に依
存する。通常は毎日の有効物質の用−ｉは、経口投与で
１０〜１０ｏｏｍ９／ｋｇ体重、そして非経口投与で約
０．１〜１０ｍ９／ｋｇ体重である。

新規化合物は普通のガレヌス剤形で固体又は液体として
、例えば錠剤、薄膜錠剤、カプセル、散剤、顆粒、糖衣
錠又は溶液として使用できる。

その際有効物質は、普通のガレヌス助剤例えば錠剤結合
剤、増量剤、保存剤、錠剤崩壊剤、流動調節剤、軟化剤
、湿潤剤、分散剤、乳化剤、溶剤、遅延剤、抗酸化剤及
び／又は噴射ガスを用いて加工できる（ズツカーら著フ
ァーマソオイテイテイツシエ・テヒノロギー１９８８年
参照）。

実施例１ 生成物Ａ（硫黄含有１４．８％、（ＭＷ）　ｊ　４２０
ｎ、ｆｆ）５０．９を水５０００ｍ／に溶解し、この溶
液を０．１Ｎ−苛性ソーダ液でｐＨ６，５となす。

塩化ナトリウムを加えて溶液を血液等張液にする。この
溶液をそれぞれ５　ｍｌずつアンプルに充填して滅菌す
る。

同様にして、生成物Ｂ（硫黄含量１４．９％、（＞Ａｗ
）８２ｏＯ）、生成物Ｃ’　（１４，１％、５６ｏ　ｏ
Ａ　）、生成物Ｄ（１３，６％、４３ｏ　ｏ７）及び生
成物Ｅ（１４，７％、２８００．／）を含有するアンプ
ルを製造する。

実施例２ 常法により下記の組成を有する錠剤を製造する。

２５０ｍ９　　生成物Ａ １２０ｍ９　乳糖 ６０■　　セルロース ５ｍｔ）　　　ステアリン酸マグネシウム５２〜　　と
うもろこし殿粉 １５■　　ポリビニルピロリドン

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ポリ硫酸化ヘパリンを用いて、レトロウイルスによる疾
   患の予防及び治療用の医薬を製造する方法。