DE2314478A1

DE2314478A1 - 3-acylhydrazonomethylderivate von rifamycin sv und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE2314478A1
Application number: DE19732314478
Authority: DE
Inventors: Renato Chricchio; Giancarlo Lancini
Original assignee: Lepetit SpA
Current assignee: Gruppo Lepetit SpA
Priority date: 1972-03-27
Filing date: 1973-03-23
Publication date: 1973-10-04
Also published as: NL7304085A; CA999858A; DE2314478B2; SE381257B; IE37817L; NL171360B; JPS5142120B2; AR199720A1; DE2314478C3; AU5342973A; DD104517A5; ES413043A1; FR2182906A1; ZA73939B; HU167316B; JPS495998A; IE37817B1; CH567511A5; AR203839A1; CS168642B2

Description

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DR. JV^. '^!<1. ■' ·■■·■·■· t'-.-i- WOLFF-DR. JUT.. ;..·. -' - ·'·■ L■..*'-

22. März J973

623 FRAHi.'- ,·,,

Unsere Nr. 18 489

Gruppo Lepetit S.p.A. Mailand / Italien

3-Acylhy drazonomethylderivate von Rifamjrcin SV und Verfahren zu ihrer Herstellung

Gegenstand der Erfindung sind neue Derivate von 3-Formylrifamycin SV der allgemeinen Formel I

Me Me

MeO

CH=N-N-X-R.

und deren 25-Desacetyl- und 16,17,18,19,28,29-Hexahydroderivate, wo"bei

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X = -CO-, -CS-, -CCrNH)- oder -SQ₂-

.R_-, = a) ein Alkyl-, Alkoxy-, Aryl- oder Aralkylrest

b) -NRpR-z, wobei Rp und.R^ unabhängig voneinander . - Wasserstoffatome, niedere Alkylrestemit 1 bis

β Kohlenstoffatomen, niedere Alkehylreste mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, Nitrogruppen oder Anilinreste darstellen, oder

c) -CO-NH-N=CH-A oder -CR^)-CO-NH-N=CH-A, wobei R^ ein zweiwertiger aliphatischer, cycloaliphatischer, aromatischer oder heterocyclischer Rest und A der Rifamycin SV Rest . ■ .

Me

MeO

oder dessen entsprechendes 25-Desacety1- oder 16,17,18,19,28,29-Hexähydroderivat .ist, und

R und R^ zusammen mit der benachbarten Gruppe -N-X- auch einen 5- bis 7-gliedrigen heterocyclischen Ring mit einern^ ankondensierten Benzolring darstellen können«

Wenn in der allgemeinen Formel I I)X= -CO-, ist R₁ nicht -

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-J

2) X = (C:Mi)-, ist R₁ nicht -NH₂ und

3) X = -SO₂-, ist R^ nicht p-Tolyl.

Der vorliegend verwendete Ausdruck "Alkylrest" als solcher ocier als Anteil in anderen aufgeführten Substituenten mit einem aliphatischen Teil, wie z.B. im "Alkoxyrest", bezeichnet geradkettige und verzweigte Reste mit höchstens 20 Kohlenstoffatomen.

Diese Alkylreste und Alkylanteile können einen oder mehrere Substituenten, nämlich Halogenatome, Nitro-, Cyan-, Hydroxy-, Alkoxy-, Oxo-, Carboxy-, Carbalkoxy-, Amino-, Acylamino-, Hydroxyamino-, SuIfo-, SuIfamido- oder Thiongruppen enthalten.

Unter den "Arylresten" und "Arylanteilen" in den vorstehend aufgeführten Gruppen sind Benzol- und Naphthalinreste zu verstehen, die im Ring einen oder mehrere Substituenten enthalten können, z.B. Alkyl-, Alkenyl-, Cycloalkyl-, Phenyl-, Amino-, Acylamino-, Hydroxyamino-, Mono- und Dinieder-alky!amino-, Cyan-, Nitro-, Alkoxy-, Methylendioxy-, SuIfo-, Carboxy-, Carbalkoxy-, Carbamyl- oder Sulfonamidgruppen oder Halogenatome.

Die Cycloalkylgruppen enthalten im allgemeinen 3 bis 10 Kohlenstoff atome und können auch Brücken aufweisen oder Spiro-Systeme darstellen..

Der Ausdruck "Aralkylrest" umfaßt auch Alkylreste, die mit mehr"als einem "Arylrest" substituiert sind.

Wenn die Reste R und R₁ zusammen mit der benachbarten Gruppe -N-X- einen 5- bis 7-gliedrigen heterocyclischen Ring mit ankondensiertem Benzolring darstellen und X die Gruppe -CO-bedeutet, kann der heterocyclische Anteil als Substituent eine weitere Oxogruppe tragen.

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231447«-

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der neuen Verbindungen besteht darin, daß man 3-Formy!rifamycin SV, sein 25-Desacetylderivat oder die entsprechende Hexähydroverbindung in einem geeigneten organischen Lösungsmittel mit der etwa äquimolekularen Menge einer Verbindung der allgemeinen Formel

i II

H₂N-N-X-R₅

behandelt, in der R und X die oben angegebene Bedeutung haben und R₁- die gleiche Bedeutung haben kann wie die unter a), b), c) für R^ angegebene und außerdem die Gruppe -CX-NH-NH₂ oder -(R^)-CX-NH-NH₂ darstellen kann, wobei R^ die oben angegebene Bedeutung hat* R und R,- können zusammen auch eine carbocyclische Kette bilden, die mit der benachbarten Gruppe -N-X- einen 5- bis 7-gliedrigen heterocyclischen Ring mit ankondensiertem Benzolkern bildet.

Die Reaktionstemperatur ist im allgemeinen Raumtemperatur; wenn die Reaktionsgeschwindigkeit jedoch gering ist, kann das Gemisch auch auf die Siedetemperatur des Lösungsmittels erhitzt werden.

Wie leicht ersichtlich ist, führt die Verwendung einer Verbindung der allgemeinen Formel II mit 2 Hydrazinfunktionen zu einem Endprodukt,, das ein Azin des 3-Formylrifamycins SV der allgemeinen Formel I darstellt und unter den Absatz c) fällt.

Die neuen Verbindungen stellen gefärbte Feststoffe dar, die aus üblichen organischen Lösungsmitteln, wie niederen Alkanolen, Äthylacetat, Dioxan, Tetrahydrofuran, !Benzol und chlorierten Kohlenwasserstoffen kristallisiert werden können. Ihre Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln hängt offensichtlich von der Beschaffenheit und Größe der

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verschiedenen Substituenten R, R. und X ab. Wenn Säurefunktionen vorhanden sind, sind die Verbindungen auch in Wasser als Salze mit geeigneten Basen löslich, z.B» als Alkalimetallsalze. Die erfindungsgemäßen Verbindungen besitzen bemerkenswerte antibakterielle Wirksamkeit gegenüber grampositiven und gram-negativen Bakterien, insbesondere gegenüber Staphylococcus aureus Stämmen. In diesem Fall beträgt die Mindesthemmkonzentration etwa 0,001 bis etwa 0,05 ug/ml. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind auch wirksam gegenüber Mikroorganismen, die gegenüber anderen bekannten und verbreitet angewandten antibiotischen Substanzen resistent sind.

In verschiedenen repräsentativen Untersuchungen an Mäusen erwiesen sich Dosierungen von etwa 1 mg/kg bis etwa 5 mg/kg, p.o., als hochwirksam für die Hemmung der experimentellen Infektion mit Staphylococcus aureus. In anderen Versuchen stellte man fest, daß repräsentative Verbindungen gemäß der Erfindung in Dosen von etwa 1 bis 5 ug/ml auch gegen Staphylococcus aureus Tour Stamms wirksam sind, die sich gegenüber anderen Rifamycinen als resistent erweisen, die gewöhnlich in der therapeutischen Praxis angewandt werden. Die Toxizität der neuen Verbindungen ist sehr gering und beträgt etwa 250 bis etwa 1500 mg/kg, i.v.

Eine weitere sehr wichtige Eigenschaft der erfindungsgemäßen Verbindungen ist ihre Hemmwirkung auf DN-S-Polymerasen, die für Lymphoblasten aus menschlichem leukäraischen Blut charakteristisch sind, und gegen typische Nucleotidyl-Transferasen (Polymerasen) von Viren, die von der normalen Zelle nicht verwendet werden können. Aus Untersuchungen an repräsentativen Gliedern von Virusgruppen ist "bekannt, daß sie als wesentlichen Teil ihrer Reproduktion Polymerasen in die Wirtszellen tragen oder in ihnen erzeugen. So gibt es Viren, wie z.B. Picornaviren oder Polio-

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viren, die RNS-abhängige RNS-Polymerase erzeugen, während andere Gruppen, wie z.B. Leukämie-Sarkom-Viren eine RNS-abhängige DNS-Polymerase tragen. Die Gegenwart und die außerordentlich wichtige Rolle der RNS-abhängigen DNS-Polymerase (reverse Transcriptase) bei Tumor bildenden RNS-Viren wurde von D. Baltimore, Nature, Bd. 226, S. 1.209 (1970) und von" H.M. Temin u. Mitarb., Nature, Bd. 226, S. 1211 (1970) entdeckt.

Die kürzliche Entdeckung von RNS-abhängigem DNS-Pblymerase-Enzym in RNS-Tumorviren in Tierarten wurde auch von anderen Autoren bestätigt, wie z.B. aus den nachstehend aufgeführten Literaturstellen hervorgeht:

Green u. Mitarb., "Mechanism of carcinogenesis by RNA tumor ' viruses, I. An RNA-dependent DNA-Polymerase in murine sarcoma viruses" (Proc. Nat. Acad. Sei., USA, Bd. 67 _s S. 385-393, 1970). -

Spiegelman u. Mitarb., "Characterization of the products of RNA directed DNA-polymerase in oncogenic RNA viruses^!ί (Nature, London, Bd. 227, S, 563, 1970). -

Hatanaka u. Mitarbt., "DNA polymerase activity associated with RNA tumor viruses" (Proc. Nat, Acad. Sci_e USA₅ BdL 6?_p S. 143, 1970). -

Scolnick u. Mitarb., "DNA synthesis by RNA containing.tumor viruses" (Proc. Nat. Acad. Sei. USA, Bd. 67, S₈ 1034₉ 1970)*

Das Vorliegen von RNS-Viren in einigen Tumoren wird auch durch andere Fakten bestätigt! reverse Transcriptase wurde in Teilchen der Milch von Frauen mit bekannter Brustkrebs-

anamnese und von solchen Frauen, in deren Familie „Brust-

• Nature _s

krebs aufgetreten war, gefunden (ScholH u. Mitarb.₉/Bd. 231» S. 97, 1971), während Priori u. Mitarb, (Nature^ New Biology, Bd. 232., S. 16, 1971) ein als ESP-tbezeichnetes, reverse Transcriptase enthaltendes Virus aus Zellen der Pleu-

231447g

ralflüssigkeit eines Kindes mit Lymphom isolierten und es erfolgreich auf Gewebekulturen züchteten.

Das Vorliegen von RNS-Homologen bei menschlichem Brustkrebs zu Tumorvirus-RNS bei der Mamma der Maus wurde von R. Axel u. Mitarb. (Nature, Bd. 235, S. 32, 1972) durch Molekularhybridisationsversuche demonstriert. Die Möglichkeit eines Virus beim menschlichen Brustkrebs wurde auch durch Elektronenmikroskopie menschlicher Milch gestützt (N.H. Sarkar u. Mitarb., Nature, Bd. 236, S. 103, 1972). Auf RNS gerichtete DNS-Polymerasewirksamkeit und Virus-ähnliche Teilchen wurden auch aus menschlichen Rhabdomyüosarkomzellen isoliert (McAllister u. Mitarb., Nature, New Biol., Bd. 235, S. 3, 1972). Zur Zeit existieren keine sehr wirksamen Arzneimittel zur Behandlung von Viruserkrankungen, da die Stoffwechselerfordernisse für Viren und Zellen gleich sind. Der meistversprechende Weg zur Chemotherapie von Viruserkrankungen ist die Entwicklung geeigneter Chemikalien, die sich in spezifischer Weise mit Viruspolymerasen oder mit von Viren transformierten Zellpolymerasen, aber nicht mit den Polymerasen der Wirtszellen, die die genetische Information der Viren kontrollieren, vereinigen. Spezifische Inhibitoren für Virus- oder durch Viren transformierte Zellenzyme und insbesondere Inhibitoren für Polymerasen von RNS-Tumorviren können eine bedeutende Rolle bei der Bereitstellung von Arzneimitteln zur Behandlung der Leukämie und anderer Krebserkrankungen spielen. Die Hemmwirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen wurde an RNS-abhängiger DNS-Polymerase des endogenen Muridae-Sarkom-Virus und an der DNS-abhängigen DNS-Polymerase-Wirksamkeit gereinigter Enzyme untersucht (poly dA-Tas Matrize). Die Hemmwirkung wurde gemäß den von C. Gurgo u„ Mitarb, in Nature, New Biology, Bd. 229, S. 111, 1971, beschriebenen Methoden getestet.

Die Wirkung der verschiedenen Arzneimittelkonzentrationen auf die Polymerasewirksamkeit wurde anschließend an die
%-dTTP (tritiertes Thymindesoxy/fcribosidtriphosphat)-Einverleibung in die unlösliche Fraktion bestimmt. Ein typisches Beispiel für das experimentelle Verfahren ist nachstehend beschrieben.

Der Virus wurde wie zuvor beschrieben (Green u. Mitarb., Proc. Wat. Acad. Sei. USA, Bd. 67, S. 385^-393, 1970; Rokutanda u. Mitarb., Nature, Bd. 227, S. 1026-1028, 1970) aus durch Muridae-Sarkom-Virus (Moloney-Isolat) veränderten Rattenzellen und.aus durch Muridae-Sarltom-Virus (Harvey-Isolat) veränderten Mäusezellen isoliert und gereinigt. Die Viruspolymerase wurde durch Inkubation des gereinigten Virus mit 0,5 % NP-40 (nonidet Ρ-4θ) in 0,1 molarem NaCl, 0,01 molarem Tris-Puffer (pH 7,6), 0,001 molarer Ä'thylendiamintetraess-igsäure während 5 Minuten bei Raumtemperatur und durch Zonenzentrifugation in von 15 auf 30 % ansteigender Saccharose in 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,4), 2,5 mM MgCl₂, 10 mM Dithiothreit und 5 % Glyzerin während 24 Stunden bei 38 000 UpM in einem Spinco SW 41 Rotor 20- Ms 40fach gereinigt. Die Spitzenfraktionen der Enzymwirksamkeit (13-17) der 22 gesammelten Fraktionen wurden vereinigt und bei -70° C in 30 % Glyzerin aufbewahrt.

Die Enzyaninkubation wurde wie von Green u. Mitarb, in Proc. Nat. Acad. Sei., USA, Bd. 67, S. 385-393, 1970 beschrieben, eine Stunde bei 37° C in 100 ul eines Reaktionsgemisches, das 40 mM Tris-Puffer (pH 8,0), 5 mM Dithiothreit, 30 mM NaCl, 2,5 mM MgCl₂, 0,1 mM dATP, dGTP, dCTP und 10 yd ■%-dTTP (12-18 Ci/Millimol) enthielt, durchgeführt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 150 μΐ 1η Perchlorsäure beendet. Als Träger wurde Kalbthymus-DNS (100 ng) zugesetzt.

¹ 78Al Zellen

-mn Zeilen 309840/1191

Das radioaktive DNS-Produkt wurde wie in den beiden oben angegebenen Literaturstellen beschrieben aufgearbeitet. Die endogene RNS-abhängige DNS-Polymerasewirksamkeit wurde nach der Zugabe von 0,01 % NP-40 zu dem gereinigten Virus zum Zeitpunkt des Versuchs gemessen. Die DNS-Polymerasewirksamkeit der gereinigten Viruspolymerase wurde mit 2 von Poly d(A-T) als Matrize und ohne NP-40 gemessen.

Rifamycinderivate wurden in Dimethylsulfoxid (DMSO) in einer Konzentration von 5 mg/ml gelöst und bei 4° C aufbewahrt. Die Hemmung der endogenen RNS-abhängigen DNS-Polymerasewirksamkeit "wurde dadurch untersucht, daß man das Probegemisch mit 2 ul des in DMSO entsprechend verdünnten Derivats oder 2 μ! DMSO (Kontrolle) versetzte, bevor man es dem aufgebrochenen Virus zusetzte, das 15 bis 30 μg Virusprotein enthielt* Die Enzyminkubation wurde 60 Minuten lang bei 37° G durchgeführt. Die Hemmung des gereinigten Enzyms wurde durch Vorinkubation von 2 μΐ des Derivats oder von DMSO mit 30 ul Enzym (1 bis 2 pg Protein) während 10 Minuten bei 37° C untersucht} dann wurden 70 ul Substratgemisch zugesetzt, und das Gemisch wurde, wie oben beschrieben, weiterinkubiert und aufgearbeitet.

In repräsentativen Versuchen verringerten die erfindungsgemäßen Verbindungen in einer Konzentration von 2-100 ug/ml oder weniger die Einverleibung von H -dTTP auf weniger als 10 %_t als sie in den Kontrollversuchen festgestellt wurde, wodurch die Hemmwirkung auf den Mechanismus der Carcinogenese durch RNS-Tumorviren nach den neuesten biochemischen Erkenntnissen klar gezeigt wurde.

Die Hemmwirkung der reversen Transkriptasen wurde auch durch Versuche an Polymerase aus Muridae-Leukämie-Viren bestätigt. Muridae-Leukämie-Virus-RNS-abhängige DNS-PoIy-

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merase wurde wie von Gallo u. Mitarb, in Nature, New Biology, Bd. 232, S. 141 (1971) beschrieben, aus mit Triton X 100 aufgebrochenen Viren hergestellt. Viren der beiden Arten Rauscher und Moloney wurden zuvor durch Bandenbildung im 1,16 g/ml-Bereich eines Saccharosedichtegradienten nach anfänglicher Zentrifugation bei geringer Geschwindigkeit zur Entfernung von Zellbruchstücken und Schichtenbildung auf Saccharosekonzentrationsgradienten von 6O %

bis 20 % gereinigt. Die Endkonzentration des Viruspräpa-

11 rats betrug 10 Teilchen/ml. Als Matrize wurde endogene 70S RNS verwendet. Es wurde festgestellt, daß Konzentra-

\fnl.
tionen von 50 pg\oder weniger das Enzym wirksam hemmten»

Ähnliche Ergebnisse wurden bei Verwendung von Tumorzellpolymerasen menschlichen Ursprungs erzielt. In diesem Fall wurde die Hemmwirkung auch an Polymerasen normaler Zellen untersucht, um einen selektiven Effekt zu charakterisieren. Repräsentative Rifamycinderivate der Formel I wurden auf ihre Wirkung auf zwei' gereinigte DNS-Polymerasen untersucht, die (I) aus menschlichen normalen (PHA-stimülierten) Blutlymphocyten, (II) aus Lymphoblastzellen (von einem normalen Spender) und (III) aus menschlichen leukämischen Blutlymphoblasten isoliert worden waren«, Es wurden synthetische und/oder native Matrizen verwendet*

Ein typisches Beispiel für das experimentelle Verfahren ist nachstehend beschrieben?

Leukämische Lymphoblasten wurden aus dem peripheren Blut von Patienten mit akuter lymphoeytischer Leukämie (ALL) durch Leukophorese isoliert. Die Zellen wurden gewaschen und die Erythrozyten durch hypotonische Auflösung entfernt Normale Lymphocyten wurden aus dem peripheren Blut von

gesunden Spendern nach der Entfernung der Granulocyten durch Nylon-Säulenchromatographie erhalten» Sie wurden

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231447a

wie vorstehend beschrieben (Gallo u.. Mitarb., Nature, Bd. 228, S. 927, 1970; Gallo u. Mitarb., Science, Bd. 165, S. 400, 1968) 72 Stunden lang mit Phytohämagglutinin (PHA) behandelt, um ihre DNS-Polymerasewirksamkeit zu verstärken.

¥egen des Problems, ausreichende Mengen dieser Zellen zu erhalten, wurde zur Gewinnung weniger gereinigter DNS-PoIymerasen für einige der anfänglichen Untersuchungen zur Gewinnung eines Überblicks eine menschliche "normale" Gewebezellkultur (1788) verwendet. Die interessierenden Verbindungen wurden dann an den stärker gereinigten Enzymen aus den normalen und leukämischen Blutlymphocyten genauer untersucht. Die Gewebezellkulturen wurden von der Associated Biomedic Systems, Inc., erhalten.

DNS-Zellpolymerasen wurden aus normalen Blut-(PHA-stimulierten)-lymphocyten, leukämischen Blutlymphocyten und (1788) Lymphoidzellen durch Homogenisierung in hypotonischer Pufferlösung und nachfolgende Behandlung mit Triton X 100 und/oder starke Salzextraktion des extralysosomalen Pellets extrahiert und gereinigt. Nach der Differentialzentrifugation wurden die Zellextrakte durch Säulenchromatographie über Diäthylaminoäthylcellulose, Phosphocellulose und Sephadex G 200 weiter gereinigt.

Die Untersuchung der DNS-Polymerase wurde in einem Endvolumen von 100 ul durchgeführte Das untersuchte Gemisch enthielt 50 mM Tris-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 8,3, 6,0 mM MgAc, 8,0 mM Dithiothreit und 60 mM NaCl. Die Einstellung des pH-Wertes wurde nach der Zugabe der zuvor in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelösten Inhibitoren durchgeführt. Die Endkonzentration an DMSO betrug 0,5 %, und alle Kontrollproben enthielten diese Menge an DMSO. Im Versuch

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wurde eine Snzymkonzentration verwendet, die die Einverleibung von etwa 1,0 pMol/Std. katalysiert. Das Enzym war in den meisten Fällen 5-Minuten lang mit dem Inhibitor vorinkubiert worden. Die Umsetzung wurde dann durch Zugabe von entweder synthetischer DWS (Poly d (AT) Miles Lab.) und DNS-RNS-Hybrid (Oligo dT.poly'rA), 5 ug/ml, oder nativer Matrize : aktivierte Salm-Sperma-DNS, 50 ug/ml, und endogene 70S Virus-RNS; 10 uCi (%-Methyl)-TTP (New England Nuclear, 18,6 mCi/uMol, lyophilisiert und erneut gelöst in 0,01 m HCl unmittelbar vor der Anwendung) und dATP (8 χ 10 M, mit synthetischer Matrize) oder allen drei Desoxynucleosid-triphosphaten (8 χ 10~^M mit RNS oder DNS als Matrize) eingeleitet. Bei einigen Versuchen wurde das Enzym nicht mit dem Inhibitor vorinkubiert.

In diesen Fällen wurden die Reaktionen durch Zugabe des Enzyms zu dem vollständigen, den Inhibitor enthaltenden Reaktionsgemisch eingeleitet. Zu Beginn der Inkubation und nach 30 Minuten wurden Proben entnommen, die Vorgänge in ihnen durch Zugabe von 2 ml 0,08 m Natriumpyrophosphat unterbrochen, und anschließend wurden diese Proben in 12,5 $iger kalter Trichloressigsäure (TGE) mit Hefe-RNS (400 pg) als Träger ausgefällt. Die Produkte wurden auf einem Milliporenfilter gesammelt, gründlich mit 5 %iger Trichloressigsäure und 1 ml DMSO-Äthanol-0,1 m NaCl (0,5 i 70 ί 29,5) gewaschen, getrocknet und in 2 ml BBS^ (Beckman) und 10 ml Liquifluor (New England Nuclear) in einem Packard-Flüssigkeits-Szintillationszähler gezählt. Es wurde gefunden, daß Konzentrationen von 5 bis 20 ug/ml bei einer synthetischen DNS-Matrize eine 50 ?6ige Hemmung der Leukämie-Polymerase bewirken. Bei einer synthetischen RNS-Matrize (Poly rA.rU) war die Reaktion sogar noch empfindlicher. Repräsentative Untersuchungen, die mit einer nativen Matrize an Polymerase von normalen und Tumorzellen durchgeführt wurden, ergaben eine höhere Empfindlichkeit der Tumorenzyme gegenüber den untersuchten Verbindun-

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gen. Andere biologische Eigenschaften der neuen Rifamycinderivate sind die Hemmung der Pokusbildung bei Zellen der Maus, der Ratte und des Menschen durch den Moloney- und Kirsten-Stamm des Muridae-Sarkom-Virus, die selektive Hemmung der Viruserzeugung durch bereits veränderte Mausund menschliche Zellen, die Auffindung sich zurückbildender Zellen unter Verwendung der durch Muridae-Sarkom-Viren veränderten nichtproduzierenden Maus- und Rattenzellsysteme. Die erfindungsgemäßen Rifamycinverbindungen haben sich außerdem als selektiv toxisch für durch Viren veränderte Zellen von Mäusen, Ratten und Menschen erwiesen, wenn sie auf ihre Kolonie-bildende Fähigkeit untersucht wurden.

In Versuchen zur Ermittlung der Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen, die Fokusbildung durch Moloney-Sarkom-Viren bei BALB/3T3-Gewebekulturen zu hemmen, wird das folgende Verfahren angewandt:

BALB/3T3-Zellkulturen werden in 250 ral-Kunststoffflaschen in einem Wachstumsmedium gezüchtet, das aus Eagle's minimalem essentiellen Medium mit 10 % fötalem Rinderserum besteht. Mit einem Coulter-Zähler werden nach der Suspendierung der Zellen mit Trypsin-Äthylendiamintetraessigsäure und dem Verdünnen mit Wachstumsmedium Zellzählungen durchgeführt. Als Tumorhomogenat wird Moloney-Muridae-Sarkom-Virus verwendet. Man unterwirft es viermal einer Zellpassage in Mausembryozellen der Schweizer Rasse mit hoher Passagezahl und untersucht es auf Fokusbildende Einheiten in den BALB/3T3-Zellen. Bei der Durchführung der Untersuchungen wird eine Modifizierung der von Hartley und Rowe, Proc. Nat. Acad. Sei., Bd. 55, S. 780 (1966) beschriebenen Methode angewandt. Im vorliegenden Fall werden Flaschen mit 1 - 2 χ 10 Zellen in 25 ml des Wachstumsmediuras geimpft und 24 Stunden lang bei 37° G inkubiert. Nach Ent-

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, 14 -

2 314 4 7 Β

fernung der Flüssigkeiten wird das Virus mit einer vorbestimmten Anzahl von Fokus-bildenden Einheiten in 0,5 ml des Wachstumsmediums eingeführt. Dann läßt man es 90 Minuten lang bei 37° C an der Monoschicht der Zellen adsorbieren. Nach dieser Adsorptionsperiode wird eine vorbestimm te Menge, gewöhnlich etwa 5 bis 10 ug/ml einer Rifamycinverbindung ( die zuvor in Dime thy lsulf oxid in einer Konzentration von 1 mg/ml gelöst worden war) in 25 ml des Wachstumsmediums gebracht, und die Kulturen werden in den Inkubator zurückgebracht. Als Kontrolle wird Dirnethylsulfoxid allein im Wachstumsmedium zu einer getrennten Kultur zugesetzt. Nach Jtägiger Inkubation sind die Kulturen flüssig- verändert, und die Foki der veränderten Zellen werden am 7. Tag gezählt.

Auf die gleiche Weise wird das Bläschenstomatitis-Virus, New Jersey Serotyp, untersucht. Methoden zur Vermehrung und Untersuchung dieses Virus wurden von Hackett u. Mi tarb. in Virology, Bd. 31, S« 114 (1967) beschrieben.

Diese Eigenschaften zeigen, daß die erfindungsgemäß©® Verbindungen eine Hemmwirkung auf durch Viren hervorgerufene Tumore bei Tieren besitzen.

Nachfolgend ist die Herstellung einiger repräsentativer erfindungsgemäßer Verbindungen beschrieben.

Zu einer Tetrahydrofuranlösung von 0,01 Molen 3-Pqiwlrifamycin SV oder von dessen 25-Desacetylderivat oder at$m entsprechenden I6,17t18,i9,28,29-Hexah3rdroderivat werfen bei Raumtemperatur 0,01 Mole einer Verbindung der allgemeinen Formel HgN-NR-X-Rc gegeben. Gewöhnlich ist die Umsetzung nach 2 bis 3 Stunden beendet. Falls nach dieser Zeit die

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chroma-tographische Untersuchlang auf einer Kieselsäuregelplatte anzeigt, daß die Umsetzung noch nicht beendet ist, wird das Geraisch 15 bis 45 Minuten unter Rückfluß erhitzt. Das Reaktionsgemisch wird zur Trockene eingedampft und der rohe Feststoff durch Kristallisation aus organischen Lösungsmitteln, .wie Methanol, Äthylacetat ader Chloroform oder durch Säulenchromatographie gereinigt.

In der folgenden Tabelle sind die physikalisch-chemischen Daten einiger Verbindungen der allgemeinen Formel I aufgeführt, die aus 3-Formylrifamycin SV und einem Hydrazinderivat der allgemeinen Formel II hergestellt wurden. Ebenfalls aufgeführt sind die Bedeutungen von R, R^ und X.

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Tabelle 1

Me
Me

CH=N-NR-X-R

CO

OO

Me O

«ο Ausgangshydrazin

X Lösungsmittel für die Kristallisa tion oder Chromato-

¹ Schmelzpunkt oder Zersetzung, C

Aus- Wesentliche Banden im beute ■UV- und sichtbaren % Bereich

max

pi/O

^J1cm

H₀N-HN-C-NH₀

² Ii

H NH,

-CS_IHF

180

70 - 484;343 187*9;339

H₂N-NH-CO-CH₃

H CH,

CO Methanol

174-7

478;334

Aus gangshydrazin

X Lösungsmittel für die Kristallisation oder
Chromato-

graghie

Schmelzpunkt
oder
Zersetzung, C

Aus- Wesentliche Banden im beute UV- und sichtbaren % Bereich

max

¹°^/o 1 cm

H₂-CH₂OH

■^Nc

^Ηί

-CH₂-CH₂

CO Aceton'

188-90 50 480;335 1595271

CO Äthylacetat 253-55 80 490;345; 151;306;255

315

CO Äthylacetat 238 60 480;337; 166;305

CO Äthylacetat 266-70 95 485;343 159;253

CO Methanol

215-7 80

UV-Spektrum v/urde nicht. aufgenommen, weil sich die Verbindung zersetzt

H₂N-NH-CO-CH₂CN

H -CH₂CN CO Methanol 188-90 65 480;333' 186,6;315,3

Ausgangshydrazin

X Lösungsmittel für die Kristallisation oder Chromatographie

Schmelzpunkt oder Zersetzung, C

Aus- Wesentliche Banden in beute UV- und sichtbaren °/o Bereich

max

p1#

■"!cm

OH

HO-N-CH,

COOC₂H₅

CO Benzol

185-7 60 ■ 484;337 150;264

ο
•ο
βο

H₂N-NH-CO-C=(C₆H₅)

CH₂OH

H₂N-NH-CC

HOCH₂

HOCH

H .

HOCH₂

O Benzol

CO Benzol

178-80 90 471;328 137;237

175-8 ■■75__ÄJ4Z_8;334 161; 290,4

H₂N-NH-CO-C

CH₂OH

-H

HOCH,

CO Benzol

181-3 55 476;334 156;275

N)

OO

Aus gangshydrazin

R R

•xr

Lösungsmit-, tel für die' Kristallisation oder Chromatographie Schmelzpunkt
oder
Zersetzung, C

Wesentliche Banden im beute UV- und sichtbaren % Bereich

max 1 cm

H₂N-M-CO-CH₂CH₃
H₂N-NH-CO-CHCCH₃)

«ο H₀N-NH-CO-CH

S \

CH,

H -CH₂-CH₃

H- -CH

CH

CO Tetrachlor- 187-9
kohlenstoff

H -CH(CH^)₂ CO Äthylacetat/ 185-7 ^D Ligroin

CO Äthylacetat/ 185-7 Ligroin

75 480;333 190;331

55 480;333; 188;324

50

■480;335 197;347 ·

CO Äthylacetat/ 177-9 Ligroin 55 480;335 173;306

CH₇,

H₂N-NH-CCKr^VCH₂-CH H

CH,

?^H3

V-CH₀-CH CO A'thylacetat/ 173-5 Ligroin

CH-,

C.

35 480;335 155;276

' H₂N-NH-CO-CCH₂)

CO Äthylacetat/ 158-60 60 480;337 171 Ligroin

Ausgangshydrazin X -Lösungsmittel für die
Kristallisation oder
Chromatographie

Schmelz- Aus- Wesentliche Banden im

punkt beute UV- und sichtbaren

oder .% Bereich

Zerset- . -to/

zung, C \ f /°

■max

1cm

H₂N-NHr-CO-CH₂-

H -(

CO Tetrachlor- 167
kohlenstoff

60 ' 480J335 155;278

to H₀N-NH-CO-co ^

CO Benzol

188

92 490;343

139;286 '

H₂N-NH-CO-CH₂-

CO Äthylacetat. 168 75 480;335 174;293

H₂N-NH-CO-'

CH.

OCH CO . Methanol 192-5 . * 90 49O;341 156,7;283,7

OCH,

OCH^

H₂N-NH-CO-CH-CH₂-^ J>-OH H ' -CH-CH^

NH,

OH Methanol ■ 190 45 480;335 147,6;256,3

NH

Äusgangshydrazin

R R,

Z Lösungsmittel für die Kristallisation oder
Chromatographie

Schmelz- Aus- Wesentliche Banden im

punkt beute UV- und sichtbaren

oder % Bereich

Zerset- ₁₅,i%

zung, C max ^i:b1cm

H₂N-NH-CS-NH-C₂H₅

NH

H₂N-NH-C-NH-NO₂

H -NHC₂H₅

H -NH-NO, CS Tetrachlor- 190-4
kohlenstoff

50 482;344 199,7;401,3

CNH Methanol 185 85 490;347 201,1;363,8

H₂N-NH-C

NH,

CO Methanol 250 35 482;344 178,4j401,2

•° H₀N-NH-C

Br H

Br CO Methanol

260

90 49O;341 166,8;3O2,'I

NH,

H₂N-NH-CO

-Cl

NH.

CO Methanol

190

85 485;341 168,5;289

Ν)'

OO

Ausgangshydrazin

R R, Lösungsmittel für die Kristallisation oder Chromatographie

Schmelz- Aus- Wesentliche Banden im punkt beute UV- und sichtbaren oder % Bereich

Zersetzung , C

max

Hern

H₂N-NH-CS-NH-

H NH /7~\_CH, CS Methanol 225 95 485;347 193,9;365

• H₂N-NH-CO-Ch₂O-CH₂-CH₂OH H ; -CH₂O-CH₂CH₂OH CO Äthylacetat 169-72 40 480;335 153;262

H₂N-NH-CO-

H -NH

CO Methanol

215

95

480;337 191;325

.H₂N-I^-COOCH₂CH₂OH

H₂N-NH-CO-C₆H₅

H -OCH₂CH₂OH

H -C₆H₅ CO Äthylacetat/ 197-200 Ligroin

CO Methanol

4755 333 158;277

205-7 55 485;340 155;295

H₂N-NH-CS-

CH₅

H -NH -

CS Methanol

187-90 55 485;345 170;354

OH

H₂N-NH-CO-

CO- Methanol

204-6 · 30 484;342 180,4;316,1

Ausgangshydrazin

X ' Lösungsmittel für die Kristallisation oder Chromatographie

Schmelzpunkt oder
Zersetzung , C

Ausbeute

Wesentliche Banden im UV- und sichtbaren Bereich

max

Ί cm

OCH,

CO Aceton

208-1O

60

485;343 161,7;315,4

ο H₉N-NH-CS-NH-I

H -HN-NH-

CS Tetrachlor- 21O
kohlenstoff

75

482;344 178,4;344,1

^ HpN-NH-CO-(CHp)oCH,

H₂N-NH-CO-

H₂N-NH-Co-CH₂-CONH-NH₂
H₂N-NH-COCONm-IH₂

HpN-NH-C
ti

C-NH-NHp

M ^d
Q

H
H
H

■"^C11^H23

CO Äthylacetat-Ligroin

CO Äthylacetat

CH₂-CONHN=CHA CO Methanol

-CONHN=CHA

CO Methanol 148-51

130-33

223-5

CONHIT=CHA CO Äthylacetat/ 230
Ligroin

78 480;335 ' 161,5;27O,7

85 488;339 126,3;242,6 65 480;336 155,9;289,7 .30 505;345 142,9;273,1

■68 494}343 134,9ϊ264,8

CO

Ausgangshydrazin

,X Lösungsmittel für die Kristallisation oder Chromatographie

Schmelz- Aus- Wesentliche Banden.im

punkt beute UV- und sichtbaren'

oder % Bereich

Zerset- _ΛοΑ

zung, C * E

max

1cm

Cl

Cl Tetrachlor- 180-4
kohlenstoff

Cl

Cv-H₁-CH₉OCONH op 2 ,

H₂N-M-CO-(CH₂ )₂-CH-C00H H -(CHg)₂-CH CO

· ι

C₆H₅CH₂OCONH

COOH

H₂N-NH-CO'

NH₂■ Cl.

,Cl 28 480;340 131,6;221,7

178-80 , J)O 480;335 152,9;265,6

NH₂ Cl

H₂N-NH-COCH₂-CH₂-CONh-M₂ H -(CH₂)₂-COHN-N=CHA CO Methanol/ 220 ?er$. 30

Ligroin ~ "· "

C 0 Methanol ■170.2s^s₁ 98 488;340 155,2;274,5

496;340 116;218

H₂N-NH-CO-C=(C₆H₅)₂ H -C=(C₆H₅)₂' CO Äthylacetät 180-4

HO

HO 95 480; 336 1,51,5,-271,5

ro

Ca)

QO

R R, 'X Lösungsmit- Schmelz- Aus- Wesentliche Banden im tel für die punkt¹ beute UV- und sichtbaren

% Bereich

Kristallisa- oder

tion oder Zerset-

Chromato- zung, C

graphie max

1cm

H₂N-NH-CS-NH-CH₂-CH=Ch₂ H ^NH-CH₂-CH=CH₂ CS Methanol 265

87 485;345 214;424,7

H₂N-NH-CS-NH

H -NH-CS Methanol 230 Z.ers. 96 485;348 178,1;314,3

Die Mikroanalysenwerte aller aufgeführten Verbindungen stimmen mit den berechneten Werten überein

CO

ca

fe Me

MeO

OH

Me 0

' 231447

Wach dem vorstehend beschriebenen und analogen Verfahren wurden ferner die folgenden Hydrazone von 3-Formylrifamycin SV, 25-Desacetylrifamycin SV und deren Hexahydroderivaten durch Kondensation mit den folgenden Hydrazinderivaten der. allgemeinen Formel

hergestellt.
R

H₂N - NR

)H

NH,

CO

CO CO

309840/1191

OH

NHCOCH, CO

OH OCH,

co

NO,

NO, co

209840/1191

"NO

^0C2^HS

'^C2^H5

OCH

V ^^0CH3 OCH₃.

NO.

CH.

OH

RCT CE.

COOH

S \

-CF.

CO

co

co co

co

308640/1191

^C2^H5

V₀ / ,

O-CH,

Adamantyl

(CH₂)_1O-COOH

CO

co

so.

so

so.

09840/

so, 91'

309840

Ii

II

1 191

II

■ Br

SO NH

NO.

OCH

-NH

NH

NO

-NH-(CH₂) -CH

SO,

SO

so

so.

so

co

CNII

309840/1

191

-NH

Cl

NH

Cl

CH.

NH

Cl

NH

Cl

NH

CH.

NH

-(CH ) -CONIINH

-CHOH-CHOH-CONHNH

CO

CONHNH,

Claims

23H478

Patentansprüche

('T) Rifamycinderivate der allgemeinen Formel I

Me Me

MeO

CH=N-N-X-R,

OH

Me 0

und deren 25-Desacetyl- und 16,17,18,19,28,29-Hexahydroderivate, wobei

X = -CO-, -CS-, -C(:NH)- oder --SO₂-R = H ; "

= a) ein Alkyl-, Alkoxy-, Aryl- oder Aralkylrest

b) -NRqR-Z₃, wobei Rp und R^ unabhängig voneinander Wasserstoffatome, niedere Alkylrestemit 1 bis' 6 Kohlenstoffatomen, niedere Alkenylrestemit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, Nitrogruppen oder Anilinreste sind, oder .

c) -CO-NH-N=CH-A oder -(R^rCO-NH-N^H-A, wobei R^ einen zweiwertigen aliphatischen, cycloaliphatischen, aromatischen oder heterocyclischen

■ Rest und A den Rifamycin SV Rest darstellt

309840/1191

. 23H478

Me Me

MeCOO

MeO

OH

Me 0

oder dessen entsprechendes 25-Desacetyl- und 16, 17,18,19,28,29-Hexahydroderivat, und

R und FL zusammen mit der benachbarten Gruppe -N-X-auch einen 5- bis 7-gliedrigen heterocyclischen Ring mit ankondensiertem Benzolring darstellen können, wobei, wenn X =-C0- oder -CNH-, R₁ nicht die Gruppe -NH₂ oder, wenn X = -SO₂-, R* nicht den p-Tolylrest darstellt.
2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man 3-Formylrifamycin SV oder sein 25-Desacetyl- oder 16,17,18,19,28,29-Hexahydroderivat mit einer Verbindung der allgemeinen

Formel II ·■ '

R I
H₂N - N- - X - R₅

umsetzt, in der R und X die oben angegebene Bedeutung haben, R,- die unter a), b) und c) für R^ angegebene Bedeutung haben und außerdem die Gruppe -CX-NH-NH₂ oder -(R.)-CX-NH-NH₂ darstellen kann, wobei R^ die oben angegebene Bedeutung hat, und R und R₁- zusammen auch eine carbocyclische Kette bilden können, die zusammen mit der benachbarten Gruppe -N-X- einen 3- bis 7-güedri-

309840/1191

gen heterocyclischen Ring mit ankondensiertem Benzolring bildet.
3. Therapeutische Zubereitung, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einer oder mehreren Verbindungen nach Anspruch 1 und übliche Stoffe. '

Für

Gruppo Lepetit S.p.A„ Mailand / Italien

Dr. W. Bell

Rechtsanwalt

309840/1191