FI95135B - Menetelmä polynukleotidien valmistamiseksi - Google Patents

Description

95135

Menetelmä polynukleotidien valmistamiseksi Förfarande för framställning av polynukleotider

Kyseinen keksintö koskee parannettua menetelmää polynukleotidien (homo- ja kopolynukleotidien) saamiseksi sekä mainittujen komplekseja. Eri polynukleotidejä on valmistettu olemassa olevien menettelyiden mukaan, mutta toistaiseksi useimmat saaduista tuotteista ovat yleensä ollet pyrogeenisiä tai enemmän tai vähemmän myrkyllisiä johtuen tiettyjen epäpuhtauksien tai aineiden ilmaantumisesta mukaan haluttuihin tuotteisiin johtavissa valmistusvaiheissa. Nämä yhdisteet soveltuvat apuaineiksi eri terapeuttisiin sovellutuksiin sekä eritoten syövän hoitoon, tiettyjen bakteeri- tai virusperäisten sairauksien hoitoon sekä rokotteissa käytettäväksi.

Yleensä ottaen polynukleotidejä saadaan jonkin polynukleotidi-fosforylaasin vaikuttaessa tarkoituksenmukaiseen polynukleoti-dimonomeeriin. Mahdolliset eri monomeerit, kuten ADP, CDP, GCP, IDP ja UDP, saadaan myös tunnettujen menettelyiden mukaan. Polynukleotidifosforylaasi saadaan myös tunnettujen menettelyiden avulla jostain bakteeriviljelmästä lähtien, jolloin kasvatusta seuraten sanotun viljelmän bakteereihin tuotetaan lyysi, jota seuraa lyysissä saadun polynukleotidi-fosforylaasin uuttaminen mutkikkaasta kasvualustasta, jossa saattaa esiintyä eri entsyymejä, kuten kinaaseja, fosfataase-ja, nukleaaseja, diesteraaseja jne., jotka kaikki ovat kilpailevia tekijöitä, kun jatkovaiheena valittuna nukleotidimono-meeriä polymeroidaan polynukleotidifosforylaasilla. Erilaisten epätoivottavien entsyymien läsnäolo johtaa epätoivottaviin rinnakkaisreaktioihin sekä polymeroitavan monomeerin että tuotetun polymeerin osittaiseen hajoamiseen.

Näistä syistä molemmat täten saaduista polynukleotideistä ovat ominaisuuksissaan puutteellisia joko myrkyllisyytensä tai pyrogeenisten ominaisuuksiensa tai molempien osalta. Vaikka saattaa olla mahdollista valmistaa hyväksyttävän puhtausasteen omaava polynukleotidifosforylaasi pienessä mittakaavassa 2 95135 analyysitarkoituksiin tai rajoitettujen tieteellisiä kokeita varten, tähän ei päästä helposti hyväksyttävin kustannuksin teollisia prosessointimenettelyitä käytettäessä.

Tämän keksinnön mukaan on todettu mahdolliseksi saada teollisesti hyväksyttävissä olosuhteissa oleellisesti puhtaita homopolymeerejä tai kopolymeerejä tai polynukleotidi- tai sukulaisanalogikomplekseja käyttämällä polymeroivana aineena erilaisilla aiemmin julkistetuilla menetelmillä saatujen polynukleotidifosforylaasivalmisteiden menetelmillä saatujen polynukleotidifosforylaasivalmisteiden asemesta erittäin puhdasta entsyymiä, joka ei sisällä epätoivottaviin reaktioihin johtavia epäpuhtauksia. Nukleotidien sukulaisanalogeja ovat esimerkiksi ADP:n 6-hydroksialkyylijohdannaiset tai UDP:n 5-halogeeni- tai 5-hydroksyyli- tai 5-metyylijohdannaiset.

Erityisesti on todettu, että jotain bakteerikantaa viljelemällä ja tuottamalla lyysi näin saatuun viljelmään saatu kasvu-alustaseos tulisi käyttää toisiaan seuraten kolmessa kolonnissa, jolloin niistä ensimmäinen sisältää ioninvaihtohartsia kuten DEAE-Sephacel®-hartsia tai vastaavaa, toinen kolonnin sisältää hydrofobista hartsia kuten fenyyli-Sepharose®-hartsia tai vastaavaa ja kolmas kolonni sisältää molekyyliseulan kuten Sephacryl R® S300 tai Sephadex®200 tai muu vastaava.

Sanotusta kolmannesta kolonnista saatava tuote käsittää oleellisesti vain - mutta ei yksinomaan - polynukleotidifosforylaa-sia sekä hivenmääriä aineita, joilla ei ole vaikutusta polyme-rointiprosessin jatkovaiheisiin.

Haluttaessa valmistaa homopolymeeri saatu polynukleotidifosfo-rylaasia käytetään valitun monomeerin polymerointiin tavallisten lisäaineiden läsnäollessa.

Haluttaessa valmistaa kopolymeeri valittu monomeeri korvataan seoksella, jossa on sopivassa suhteessa valittuja monomeerejä. Sanottu kopolymeeri merkitään lyhenteellä Poly A/Poly U.

li 3 95135

Haluttaessa valmistaa kompleksi kyseinen polymerointi suoritetaan kullakin sopivista monomeereistä ja saatavat homopolymee-rit sekoitetaan sopivassa suhteessa natriumkloridin läsnäollessa ja saostetaan etanolilla.

Keksinnön erään keskeisen piirteen mukaan valitun monomeerin tai valitun monomeeriseoksen polymerointi suoritetaan tavanomaisista poikkeavista olosuhteissa. Nimenomaan käytettävät pitoisuudet ovat huomattavasti korkeammat kuin tavanomaiset arvot (noin 30 - - noin 100-kertaiset, edullisesti 50-kertai-set) ja polymerointi suoritetaan lisäämällä kontrolloidulla tavalla magnesiumkloridia, jolloin pH-arvo pidetään välillä 7,4 - 8,6 ja polymerointi kestää noin 3-6 päivää.

Saatavien polymeerien tai kopolymeerien molekyylipaino sijoittuu alueella, jolta saadaan noin 250 000 - noin 1 500 000 molekyylipainon omaavia komplekseja, jolloin polymeroitumisno-peus on tasainen ja polymerointituotteen saanto jopa 90-95 %.

Keksintö on paremmin ymmärrettävissä seuraavan, viittä perättäistä vaihetta koskevan kuvauksen avulla, jolloin lähdetään alkuperäisestä bakteeriviljelmästä (tässä E.coli. jolloin muutkin bakteerit soveltuvat käytettäviksi) ja saadaan Poly A/ Poly U-kompleksi.

Vaihe 1: E.coli-kannan B 1/5 kasvatus.

Viljelmää säilytetään vinopinnoilla ympäristön lämpötilassa. Kasvualusta sisältää litraa kohden 10 g natriumkloridia, 10 g Trypicase-valmistetta ja 5 g hiivauutetta. Alustaa steriloidaan 45 minuutin ajan 110°C:ssa, minkä jälkeen lisätään erik-• seen steriloitua glukoosiliuosta pitoisuuteen 2 g/litra. Esi-viljelmät valmistetaan 10 ml:aan kasvualustaa, minkä jälkeen valmistetaan 200 ml:n kasvualustaerä 10 litran viljelmää varten.

95135 4

Viljelmän sekoitusnopeus on 470 kierr./min ja sitä ilmaistaan 8 litralla ilmaa/min. Soluluvun kahdentumisaika on 600 nm:n aallonpituudella mitattuna 30 minuuttia ja bakteerit kerätään talteen, kun optinen tiheys 600 nm:ssä on 6. Saadaan noin 8 g bakteereita litrasta viljelmää. Fermentaatio-pH pidetään arvossa 6,5 - 6,8 2 N ammoniumhydroksidiliuosta lisäämällä. Ellei viljelmää käytetä välittömästi edelleen, sitä säilytetään -20°C:ssa.

Vaihe 2: bakteerilyysi.

puskuri A 5 x 10~2 M Tris-HCl, pH 7,9 (25°C), joka sisältää 2 x 10"3 M EDTA, 0,233 M NaCl (13,63 g/litra) ja 5 % glyserolia (50 ml/litra) puskuri B 10“2 M Tris-HCl, pH 7,9, joka sisältää 10“4 M EDTA, 0,2 M NaCl ja 5 % glyserolia - 165 g bakteereita varten (20 litran viljelmä)

Juuri ennen käyttöä 400 ml:aan puskuria A lisätään 0,4 ml di-tiotreitolia (DTTrtä) 0,1 m (15,4 mg/ml) huoneen lämpötilassa ja sitten 28 μΐ merkaptoetanolia, 45 mg lysotsyymiä ja 14 mg fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (PMSF) liuotettuna 4 ml:aan . etanolia. Jäähdytetyt bakteerit (165 g) lietetään tähän kasvu alustaan sekoittimessa (loppulämpötila noin 10°C), minkä jälkeen saadun suspension annetaan lämmetä 15°C:seen samalla silloin tällöin sekoittaen (kesto noin 20 minuuttia), ja tämän jälkeen lisätään 272 mg natriumdeoksikolaattia samalla sekoittaen ja sitten 4 mg deoksiribonukleaasia (DNA-aasia). Lyysi-seos jätetään seisomaan 20 minuutiksi, jon aikana sitä sekoitetaan silloin tällöin ja lämpötila pidetään 20°C:ssa. Seokseen lisätään 400 ml puskuria B sekä 0,4 ml 0,1 M DDT-liuosta samalla sekoittaen, minkä jälkeen suspensiota sentrifugoidaan 16 000 x g:ssa (10 000 kierr./min Sorvall-sentrifugissa) tunnin ajan 5°C:ssa.

Il 5 95135 DNA-aasi 50 679 Dornase-yksikköä/mg. lysotsyymi 25 000 yksikköä/mg.

Sentrifugoinnista saatu supernatantti (noin 900 ml) laimennettiin litraksi lisäämällä tislattua vettä ja proteiini saostettiin lisäämällä 4°C:ssa 280 g ammoniumsulfaattia (45 %:n kyllästysaste) samalla sekoittaen ja jättämällä seos sitten seisomaan 4°C:seen 2 tunniksi. Proteiini otettiin talteen sentrifugoimalla 16 000 x g:ssa 5°C:ssa 30 minuutin ajan. Saostuma (supematantit heitettiin pois) liuotettiin 150 ml:aan 10"2 M Tris-HCl-puskuria, pH 7,8, minkä jälkeen liuosta sentrifugoitiin 20 minuutin ajan 16 000 x g:ssa ei-liukoisen aineksen poistamiseksi. Supernatantteja dialysoi-tiin 4 vaihtoerää liuosta vastaan, joka käsitti 2 litran erinä 5 x 10"2 M Tris-HCl-puskuria, pH 7,8, yli 18 tunnin ajan 4°C lämpötilassa, minkä jälkeen liuosta sentrifugoitiin tunnin ajan 16 000 x g:ssä ei-liukoisen aineksen poistamiseksi.

300 ml, pH 7,8, johtokyky < 7,0 ms.

Vaihe 3: E.coli B 1/5 polynukleotidifosforylaasin (PNP-aasin) puhdistus 1. Edellä saadut supematantit käytettiin kolonnissa, jossa oli 280 ml DEAE-Sephacel-valmistetta, ja jonka mitat olivat 40 x 3 cm ja jota oli tasapainotettu 0,1 M Tris-HCl-puskuril-la, pH 7,4, 4°C:ssa, jolloin kolonnia eluoitiin gradientilla 1 litrassa 0,1 M Tris-HCl-puskuria, pH 7,4, 1 litraan 0,1 M Tris-HCl-puskuria, pH 7,4, jossa 0,4 M natriumkloridia, keräten 10 ml:n fraktioita. Eluoitava diesteraasiaktiivisuuden tuottama piikki edeltää polynukleotidifosforylaasiaktiivisuu-' den toista piikkiä, jonka tuottavat fraktiot 105-125 eluentti-pitoisuudessa 0,21 M NaCl, 0,1 M Tris-HCl.

Tilavuus 210 ml, 107 yksikköä/ml, kokonaisaktiivisuus 22 470.

6 95135 2. Tähän liuokseen lisättiin samalla sekoittaen 28 g ammonium-sulfaattia, jolloin pitoisuudeksi sen suhteen tuli 0,5 M, minkä jälkeen liuos panostettiin kolonniin, joka sisälsi 60 ml fenyyli-Sepharose-valmistetta, ja jonka mitat olivat 19 x 2 cm ja jota oli tasapainostettu liuoksella, jossa oli 0,5 M ammo-niumsulfaattia ja 0,05 M Tris-HCl:ää, pH 7,4. Kolonnia pestiin noin 20 ml :11a liuosta, jossa oli 0,5 M ammoniumsulfaattia ja 0,1 M Tris-HCl:ää, pH 7,4, minkä jälkeen sitä eluoitiin 4°C:ssa käänteisgradientilla 250 ml:sta 0,4 M Tris-HCl:ää, pH 7,8, ja 0,1 M ammoniumsulfaattia, pitoisuuteen 3 x 10-3 M Tris-HCl:ää, pH 7,8. Kerättiin noin 10 ml:n fraktioita, ja aktiivisuutta sisältävät fraktiot yhdistettiin.

Tilavuus 55 ml, 355 yksikköä/ml, kokonaisaktiivisuus 19 525.

3. Proteiinin saostamiseksi lisättiin ammoniumsulfaattia (20 g) (55 %:n kyllästysaste) samalla sekoittaen, minkä jälkeen saostunut proteiini jätettiin seisomaan 4°C:een tunniksi ja sentrifugoitiin sitten 15 minuutin ajan 16 000 x g:ssä.

Saatu saostuma liuotettiin minimimäärään liuosta, jossa oli 0,1 M natriumkloridia ja 0,05 M Tris-HCl:ää, pH 7,4 (noin 10 ml), ja liuos panostettiin kolonniin, jossa oli 350 ml Sephacryl S300-valmistetta, ja jonka mitat olivat 50 x 3 cm ja jota oli tasapainotettu liuoksella, jossa oli 0,1 M natriumkloridia ja 0,05 M Tris-HCl:ää, pH 7,4, minkä jälkeen entsyymi eluoitiin samaa puskuria käyttäen (noin 10 ml:n fraktioita), ja yhdistettiin aktiivisuutta sisältävät fraktiot (13-17).

Tilavuus 60 ml, 312,5 yksikköä/ml, kokonaisaktiivisuus 18 750. 540 yksikköä, aallonpituudessa 280 nm.

Entsyymi saostettiin lisäämällä 26 g ammoniumsulfaattia (65 %:n kyllästysaste) ja saatua suspensiota säilytettiin -30°C:ssa.

11 v 95135

Vaihe 4 ·. Polymeerien valmistaminen.

100 g ADP-NA2:ta (tai 100 g UDP-Na3:a) liuotetaan noin 600 ml:aan vettä, ja saatu liuos lisätään seu-raaviin: 200 ml M Tris-HCl, pH 8,3 250 ml M ammoniumasetaatti 20 ml O, IM EDTA, pH 8,0 100 ml M magnesiumkloridi 2 litran reaktiokolvissa. Tilavuus täytettiin 2 litraksi vedellä ja pH säädettiin 8,6:ksi huoneen lämpötilassa lisäämällä 5 N ammoniumhydroksidiliuosta. Liuospinta peitettiin tolueenikerroksella. Käytettävien nukleosididifosfaattien ei tule sisältää kontaminoituvia metalleja kuten Fe3+ tai Cu2+.

Erä edeltävää seosta (80 ml) lisättiin 200 yksikköön entsyymiä ja 2 ml:aan aiemmin valmistettua Poly-A:ta (tai Poly-U:ta) pohjusteena, ja inkuboitiin liuosta 37°C:ssa 2 tunnin ajan, minkä jälkeen se siirrettiin 37°C:ssa pidettyyn pääkasvatus-erään. Neljän tunnin kuluttua lisättiin vielä 300 yksikköä entsyymiä ja jatkettiin inkubointia. pH laski 24 tunnin kuluessa noin 8,3 reen ja sitä pidettiin mainitusta ajankohdasta eteenpäin arvossa 8,0 - 8,3 5N ammoniumhydroksidiliuosta lisäämällä.

Entsyymin kokonaismäärä oli 500 yksikköä, eli 5 yksikköä/g.

Jos polymeroituminen on edennyt alle 15 %:n polymeroitumisas-tetta vastaavasti, entsyymiä voidaan lisätä sopivina ajankohtina nopeuden kasvattamiseksi.

Magnesiumkloridia lisätään 25 ml:aan erinä lisää samalla kiivaasti sekoittaen, kun polymeroitumisaste on noin 30 %, 55 % ja 75 % (kaikkiaan 175 mmol magnesium-ioneja 200 nmol ADP:tä tai UDP:tä kohden), jolloin pH pidetään arvossa 8,0 - 8,3 (37°C:ssa mitattuna). Kolmen, neljän päivän kuluttua polymeroitumisasteen tulisi olla 80 - 90 %.

95135 8

Lisäämällä magnesiumkloridia pienissä erissä vapaan ADP:n (tai UDP:n) ja magnesium-ionin välinen suhde pysyy noin arvossa 2 edellä mainituissa polymeroitumisasteissa.

Inkuboinnin päätyttyä seos sentrifugoidaan saostuneen ammo-nium-magnesiumfosfaatin poistamiseksi ja saatu sakka pestään pienellä määrällä vettä, jolloin yhdistettyjä supernatantti-eriä käytetään kompleksin Poly A/Poly U valmistuksessa.

Polymeroinnin optimiolosuhteet ovat pH 8,0 - pH 8,3, magne-siumkloridin vaiheittainen lisääminen ja riittävä määrä entsyymiä, jotta polymeroitumisnopeus on noin 30 % päivässä.

Inkuboinnin korkeampi pH (8,3 - 8,6) tuottaa pienikokoisempia polymeerejä. Samoin käytettävän magnesium-ionimäärän lisääminen kokonaisuudessaan inkubointia aloitettaessa tuottaa pienikokoisempia polymeerejä.

Vaihe 5: Poly A/Poly U-kompleksin valmistus.

Liuoksien kokonaisnukleotidipitoisuus määritetään hydrolysoimalla inkubointiseos 0,1 N natriumhydroksidiliuoksessa 100°C:ssa 5 minuutin aikana, jolloin käytetään Poly-A:n lOOOx ja Poly-U:n 500x laimennosta (esim. 10 μΐ Poly-A:ta tai 20 μΐ Poly-U:ta 10 ml:ssa 0,1 N natriumhydroksidiliuosta tai suuremmassa tarkassa määrässä, jos välilaimennokset ovat 100 μΐ Poly-A:ta ja 200 μΐ poly-U:ta). Absorbanssit mitataan 260 nm:n aallonpituudella ja molaarisuudet arvioidaan seuraavia arvoja käyttäen.

A260 nm x 10'3 1 M-liuokselle pH 7,0 0,1 N NaOH (hydrolyysi)

Ap 15,0 15,3

Poly A 9,8 15,3

Up 10,0 -7,7

Poly U 9,5 7,7

II

9 95135

Polymeeripitoisuudet määritetään kokonaisnukleotidipitoisuu-desta ja polymeroitumis-%:sta. Sitten lasketaan tilavuudet soikiometriselle suhteella A/U = 1:1. Poly-U:hun lisätään 10 litran reaktiokolvissa 200 ml natriumkloridin 25 % vesi-liuosta ja sitten Poly-A-liuos, minkä jälkeen liuokset sekoitetaan perusteellisesti keskenään (natriumkloridin loppupitoi-suus noin 0,18 M) ja jätetään 4°C:seen vähintään 3 tunniksi.

Sitten lisätään vastaava tilavuus etanolia samalla sekoittaen Poly-A/Poly-U-kompleksin saostamiseksi ja seos jätetään 4^C:een tunniksi. Kompleksi otetaan talteen sentrifugoimal-la Sorvali 3 B-sentrifugissa (1 litran sentrifugipullot) 5000 kierr./min kierrosnopeudella 3 minuutin ajan, minkä jälkeen saostuma pestään 2 litralla 55 %:sta etanolia. Saostuma liuotetaan noin 4 litraan puhdasta vettä ja liuos sentrifugoi-daan mahdollisten ammoniummagnesiumfosfaattijäämien poistamiseksi. Kirkkaisiin supernatanttieriin lisätään 200 ml 25 %:sta natriumkloridiliuosta ja saatu seos jätetään 4°C:seen vähintään 3 tunniksi.

Kompleksi saostetaan toistamiseen lisäämällä vastaava tilavuus etanolia samalla sekoittaen, saostuma otetaan sentrifugoimalla talteen, pestään 55 %:lla etanolilla (noin 2 litraa), 75 %:lla etanolilla ja kahdesta 95 %lla etanolilla minkä jälkeen se kuivataan tyhjössä.

Saanto noin 110 - 120 g.

Yleensä ottaen kompleksin saostamiseksi 50 %:lla etanoliliuok-sella läsnä on oltava natriumkloridia (0,15 - 0,02 M). Pesussa ei ole syytä käyttää etanolia, jonka pitoisuus alittaa 55 % (saostunut kompleksi liukenee 50 %:seen etanoliin).

MYRKYLLISYYS

LD50-arvomääritykset suoritettiin käyttäen hiiriä ja rottia sekä i.p- ja i.v.-antoteitä.

10 95135

Kuolemia ei esiintynyt i.v. maksimiannoksella hiirissä eikä rotissa.

Samoin i.p.-annostelu ei aiheuttanut kuolemia rotissa, mutta hiirille todettiin i,p. noin 3 g:n/kg LDS0-arvo.

Tavanomaiset pyrogeenikokeet antoivat kokonaisuudessaan negatiivisen tuloksen.

FARMAKOLOGIA

Koska keksinnön mukaiset polymeerit ja kopolymeerit ovat yleisesti tunnettuja, joskaan niitä ei ole tähän mennessä koskaan saatu teollisessa mittakaavassa riittävän puhtaina, erilaisia farmakologisia kokeita on suoritettu jo useiden vuosien aikana, jolloin tuotenäytteet on otettu erikoistarkoituksiin puhdistetuista tuotteista, joita ei ole ollut todella saatavissa kaupallisesti hyväksyttävin ehdoin.

Keksinnön kiinnostavuuden todentamiseksi viitataan olemassa olevaan kirjallisuuteen sekä esimerkiksi seuraaviin artikkeleihin: 'Immuunijärjestelmän modulointi synteettisten polynukleotidin avulla', A.G.Johnson, Springer-seminaari, Immunopathol. 2 (1979) 149-168, 'Immuunijärjestelmän säätely synteettisten polynukleotidien avulla - I. Apuainevaikutuksen karakterisointi vasta-ainesyn-teesissä', J.R.Schidtke ja A.G.Johnson, J.Immunol. 106 (1971) 1191-1200, 'Muutokset imusolualapopulaatioissa hiirissä, jotka saavat yhden ruiskeen Poly A/Poly U-kompleksia', M.Donner, D.Vallier ja F.Lacour, Ann.Immunol. (Inst pasteur) 128C (1977) 1039-1052, 'Poly A/Poly U-kompleksin vaikutusskaala ja -tapa immuunivas-testimulaatiossa', V.Braun, M.Ishizuka, U.Yajima, D.Webb ja F.Winchurch julkaisussa: Beers, R.F., Braun, W. "Biological Effects of Polynecleotides", New York, Springer-Verlag, 1971, ss. 139-156, 11 95135 * 'Spontaanien rintarauhaskasvaimien alentunut esiintyminen C3H/He-hiirissä niiden hoitoa polyadenylaatti-polyuridylaatilia seuraten', F.Lacour, G.Delage ja C.Chianale, Science 187 (1975) 256-257, 'Poly A/Poly U leikkauksen tukiaineena hoidettaessa spontaania hiiren rintarauhassyöpää', F.Lacour, J.Lacour ja A.Spira Recent Results in Cancer Research. 47 352-256, 'Polyadenyyli-polyuridyylihappo: biologista vastetta muuntavat vaikutukset hiirissä. Jakaantuminen eri elimiin in vivo sekä farmakokinetiikka kaneissa'. F.Lacour, J.Biol. Resp. Modif. 4 (1985) 490-494, 'Faasi-I:n mukainen kliininen toleranssitutkimus polyadenyyli-polyuridyylihaposta syöpäpotilaassa', J.P.Ducret, P.Gaille, H.Sancho-Garnier, J.L.Amiel, M.Michelson, R.G.Hovanessian, J.K.Youn ja F.Lacour J.Biol.Resp.Modif. 4 (1985) 129-133.

ANNOSTELUMUOTO JA -MÄÄRÄ

Edullinen antotapa on i.v. isotoonista liuosta, joka sisältää 0,01 - 0,1 g vaikuttavaa ainesosaa. Viikottainen ruiske annetaan 6 viikon ajan.

Claims (1)

1. 95135 Patenttivaatimus Menetelmä nukleotidipolymeerien valmistamiseksi, tunnettu siitä, että a) valmistetaan polynukleotidifosforylaasiliuos, joka ei oleellisesti sisällä polymerointiprosessin jatkovaiheisiin vaikuttavia aineita seuraavasti (i) Escherichia coli -bakteerikannan viljelmässä tuotetaan lyysi ja (ii) saatu kasvualustaseos käytetään toisiaan seuraten kolmessa kolonnissa: - ensimmäisessä, jossa ioninvaihtohartsina on N,N-dietyy-liaminoetyyliselluloosaa, - toisessa, joka sisältää hydrofobisen hartsin, joka on fenyyli-Sepharose R, ja - kolmannessa, joka sisältää molekyyliseulana Sephacryl R S300 tai Sephadex R 200 valmistetta, b) valittua nukleotidia käsitellään näin saadulla fosforylaa-silla, mikä käsittää 200 - 750 fosforylaasiyksikön saattamisen reagoimaan liuoksen kanssa, joka sisältää tavanomaiset puskurit sekä pitoisuuden 0,06 - 0,2 mmol/ml valittua mononukleo-tidiä magnesiumkloridin (MgCl2) läsnäollessa, jolloin viimemainittua lisätään polymeroitumisasteen kontrolloimiseksi vaiheittain, 3 päivästä 6 päivään ajan, jona aikana pH pidetään välillä 7,4 - 8,6, ja c) näin saatu polymeeri erotetaan ja pestään, jolloin valinnaisesti niin ikään polymeroidaan jokin toinen valittu nukleotidi edeltävän mukaisissa olosuhteissa, jossa tapauksessa kumpaakin valittua polymeeriä sekoitetaan veteen natriumklo-ridin (NaCl) läsnäollessa, jolloin lopuksi saatu kompleksi saostetaan etanolia lisäämällä. 11 95135 Förfarande för framställning av nukleotidpolymerer, k ä n -netecknat därav, att a) en polynukleotidfosforylaslösning framställs, som inte väsentligen innehäller ämnen som päverkar polymeriseringpro-cessens fortsatta steg (i) i en Echerichia coli-bakteriestams kultur produceras en lys och (ii) den erhällna växtmedieblandningen används successivt i tre kolonner: - i en första, där jonbytarhartsen är N,N-dietylamino-etylcellulosa, - i en andra, som innehäller en hydrofob harts, som är fenyl-Sepharose R, och - i en tredje, som innehäller som molekylscreen en Sephacryl R S300 eller Sephadex R 200 produkt, b) den valda nukleotiden behandlas med den sä erhällna fos-forylasen, som omfattar omsättningen av 200 - 750 fosforyla-senheter med en lösning, som innehäller de sedvanliga buffer-tarna samt en koncentration pä 0,06 - 0,2 mmol/ml av den valda mononukleotiden i närvaro av magnesiumklorid (MgCl2), varvid den sistnämnda tillsätts för att kontrollera polymerisätions-graden stegvis, under en tid av 3 dagar till 6 dagar, under vilken tid pH hälles vid mellan 7,4 - 8,6, och c) den sä erhällna polymeren separeras och tvättas, varvid eventuellt ocksä nägon annan vald nukleotid polymeriseras under ovan nämnda förhällanden, i vilket fall de bäda valda polymererna blandas i vatten i närvaro av natriumklorid (NaCl), varvid slutligen det erhällna komplexet utfälls genom att tillsätta etanol.