JPS60156388A - Ｄνａおよびその用途 - Google Patents
Ｄνａおよびその用途Info
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- JPS60156388A JPS60156388A JP59013968A JP1396884A JPS60156388A JP S60156388 A JPS60156388 A JP S60156388A JP 59013968 A JP59013968 A JP 59013968A JP 1396884 A JP1396884 A JP 1396884A JP S60156388 A JPS60156388 A JP S60156388A
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- dna
- producing
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
- C12P17/182—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、５′−イノシン酸脱水酵素遺伝子を有するＤ
ＮＡ 、それが組み込まれたベクター、そのベクターで
形質転換せしめたバチルス属菌、およびその形質転換株
を培養するグアノシンの製造法に関する。
ＮＡ 、それが組み込まれたベクター、そのベクターで
形質転換せしめたバチルス属菌、およびその形質転換株
を培養するグアノシンの製造法に関する。
グアノシンは呈味性を有する５′−グアニμ酸の合成原
料として重要な物質でＬＪ）、これを安価かつ大量に製
造することは、工業上きわめて意義深いことである。従
来、発酵法によるグアノシンの製造法に関しては、アデ
ニン要求性変異株に、ヌクレオチド水スホリヲーゼ欠損
性、ＧＭＰレダクターゼ欠損性、アデニン・アデノシン
耐性などの性質の付与された変異株が用いられてきた。
料として重要な物質でＬＪ）、これを安価かつ大量に製
造することは、工業上きわめて意義深いことである。従
来、発酵法によるグアノシンの製造法に関しては、アデ
ニン要求性変異株に、ヌクレオチド水スホリヲーゼ欠損
性、ＧＭＰレダクターゼ欠損性、アデニン・アデノシン
耐性などの性質の付与された変異株が用いられてきた。
本発明者らはこのようなグアノシンの製造法において、
菌株の合理的な育成法を見出すべく鋭意研究を重ねた結
果、バチルス属に属するイノシンおよび（または）グア
ノシン生産呻會、グアノシンまたは（および）キサント
シン生産能を有する微生物の５′−イノシン酸脱水素酵
素遺伝子領域の組み込まれたベクター ＤＮＡで形質転
換せしめることによって、グアノシンの蓄積量が著しく
増大することを認め、この知見にもとすいてさらに研究
を進めて本発明を完成した。
菌株の合理的な育成法を見出すべく鋭意研究を重ねた結
果、バチルス属に属するイノシンおよび（または）グア
ノシン生産呻會、グアノシンまたは（および）キサント
シン生産能を有する微生物の５′−イノシン酸脱水素酵
素遺伝子領域の組み込まれたベクター ＤＮＡで形質転
換せしめることによって、グアノシンの蓄積量が著しく
増大することを認め、この知見にもとすいてさらに研究
を進めて本発明を完成した。
すなわち、本発明は、（１） ５’−イノシン酸脱水素
酵素遺伝子を有し、２．９キロベースベア離れたＨｉｎ
ｄ ＭＥの切断点を有するｎ ｙ Ａ＠ （２） グア
ノシンまたは（および）キサントシン生産能を有するバ
チルス属菌の染色体ＤＮＡから得られた上記第（１）項
のＤＮＡ、（３） 上記第（２）項のＤＮＡが組み込ま
れたベクター、（４）上記第（３）項のベクターで形質
転換されたバチルス属菌、（５）上記第（３）項のベク
ターで形質転換されたグアノシン生産能を有する上記第
（４）項のバチルス属菌、および（６）グアノＶ７また
は（および）キサントシン生産能を有するバチルス属菌
の染色体ＤＮＡから得られた５′−イノシン酸脱水素酵
素遺伝子領域が組み込まれたベクターで形質転換された
グアノシン生産能を有するバチルス属菌を培地に培養し
、培養物中にグアノシンを生成蓄積せしめ、これを採取
することを特徴とするグアノシンの製造法である。
酵素遺伝子を有し、２．９キロベースベア離れたＨｉｎ
ｄ ＭＥの切断点を有するｎ ｙ Ａ＠ （２） グア
ノシンまたは（および）キサントシン生産能を有するバ
チルス属菌の染色体ＤＮＡから得られた上記第（１）項
のＤＮＡ、（３） 上記第（２）項のＤＮＡが組み込ま
れたベクター、（４）上記第（３）項のベクターで形質
転換されたバチルス属菌、（５）上記第（３）項のベク
ターで形質転換されたグアノシン生産能を有する上記第
（４）項のバチルス属菌、および（６）グアノＶ７また
は（および）キサントシン生産能を有するバチルス属菌
の染色体ＤＮＡから得られた５′−イノシン酸脱水素酵
素遺伝子領域が組み込まれたベクターで形質転換された
グアノシン生産能を有するバチルス属菌を培地に培養し
、培養物中にグアノシンを生成蓄積せしめ、これを採取
することを特徴とするグアノシンの製造法である。
本発明のＤＮＡは、５′−イノシン酸脱水素酵素遺伝子
を有する微生物から得られる。この供与菌としては、通
常、グアノシンまたは（および）キサントシン生産能を
有する微生物が用いられるが、該物質の生産能を有さな
い微生物であっても、当該微生物の５′−イノシン酸脱
水素酵素が、プリン糸゛物質によるフィードバック制御
から全面または部分的に解除されている場合には、本発
明のＤＭＡの供与菌として用いることができる。たとえ
ば、供与菌の例としては、グアノシンまたは（および）
このようなバチルス属菌の具体例としては、バチルス・
ズブチリヌ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｅ）
ＮＡ−６０１１（工Ｆｏ １４１８９．ｒＰｉＲＭＢＰ
−２９１）、バチルス・身ブチリス ＮＡ−６０１２（
工ＦＯ１４１９０，ＦＥＲＭ ＢＰ−２９２）が挙げら
れる。
を有する微生物から得られる。この供与菌としては、通
常、グアノシンまたは（および）キサントシン生産能を
有する微生物が用いられるが、該物質の生産能を有さな
い微生物であっても、当該微生物の５′−イノシン酸脱
水素酵素が、プリン糸゛物質によるフィードバック制御
から全面または部分的に解除されている場合には、本発
明のＤＭＡの供与菌として用いることができる。たとえ
ば、供与菌の例としては、グアノシンまたは（および）
このようなバチルス属菌の具体例としては、バチルス・
ズブチリヌ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｅ）
ＮＡ−６０１１（工Ｆｏ １４１８９．ｒＰｉＲＭＢＰ
−２９１）、バチルス・身ブチリス ＮＡ−６０１２（
工ＦＯ１４１９０，ＦＥＲＭ ＢＰ−２９２）が挙げら
れる。
供与菌からの染色体ＤＮＡの調製法としては、公知の方
法、たとえばフェノールを用いて染色体ＤＮＡを抽出す
る方法が用いられる。
法、たとえばフェノールを用いて染色体ＤＮＡを抽出す
る方法が用いられる。
供与菌から得られた染色体ＤＮＡは、制限酵素を用いて
切り「シ、５′−イノシン酸脱水素酵素遺伝子を有し、
２．９キロベースベア離れたμｍｎｄ、 ＩＩＩの切断
点を有するＤＨｋ断片を調製する。このようなりＮＡ断
片の調製には、各種文献類（例えば、ＴＡＫＡ’ＲＡ
ＲＥＡＧ］１ｌｉＮＴＳ ＦＯ’ＲＧＩＥＴ工ＣＥＨＧ
ＩＮＥＥＲＩ−ＮＧ ＲＥＳＥＡＲＣＪ宝酒造株式会社
発行）等に記載されているものの中から適宜選択された
制限酵素を使用することが出来る。
切り「シ、５′−イノシン酸脱水素酵素遺伝子を有し、
２．９キロベースベア離れたμｍｎｄ、 ＩＩＩの切断
点を有するＤＨｋ断片を調製する。このようなりＮＡ断
片の調製には、各種文献類（例えば、ＴＡＫＡ’ＲＡ
ＲＥＡＧ］１ｌｉＮＴＳ ＦＯ’ＲＧＩＥＴ工ＣＥＨＧ
ＩＮＥＥＲＩ−ＮＧ ＲＥＳＥＡＲＣＪ宝酒造株式会社
発行）等に記載されているものの中から適宜選択された
制限酵素を使用することが出来る。
次に、このようにして得られた５′−イノシン酸脱水素
酵素遺伝子領域を含む染色体ＤＮＡ断片１２ベクターＩ
）ＮＡにネ１人之叔する。ベクターＤＮＡとしては、ｐ
ＴＴ Ｂ １１０ （Ｊ、ＢａＣｔｅｒｌｏｌ、。
酵素遺伝子領域を含む染色体ＤＮＡ断片１２ベクターＩ
）ＮＡにネ１人之叔する。ベクターＤＮＡとしては、ｐ
ＴＴ Ｂ １１０ （Ｊ、ＢａＣｔｅｒｌｏｌ、。
１３４．３１８ （１９７８））、ｐＴ１２７、ｐｃ１
９４、ｐ Ｃ２２１（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 ４ｃａ
ｄ。
９４、ｐ Ｃ２２１（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 ４ｃａ
ｄ。
など既知のものは無論のこと、その他の新たに分離され
たシ合成され゛たものであっても、）くチ〜ヌ属州菌の
ベクターＤＮＡとして使用することが可能なものであれ
ば、いずれも用いることができる。
たシ合成され゛たものであっても、）くチ〜ヌ属州菌の
ベクターＤＮＡとして使用することが可能なものであれ
ば、いずれも用いることができる。
ベクターＤＭＡは、前述の染色体ＤＮＡ断片ｔ−調製し
たときと同様な制限酵素を用いて切断される。
たときと同様な制限酵素を用いて切断される。
このようにして得られた５′−イノシン酸脱水素酵素遺
伝子領域を含む染色体ＤＮＡ断片と、切断されたベクタ
ーＤＮＡとを連結させる方法は、通常のＤＮＡリガーゼ
を用いる方法（Ｐｒｏｃ 、 ｌＦｈ彷ト林鉄、胆、、
Ｕ、Ｓ、Ａ、、 ５７．１４２６ （１９６７））、
ターミナルｔランスフエラーセ法（Ｐｒｏａ 、１１ａ
ｔｌユ。
伝子領域を含む染色体ＤＮＡ断片と、切断されたベクタ
ーＤＮＡとを連結させる方法は、通常のＤＮＡリガーゼ
を用いる方法（Ｐｒｏｃ 、 ｌＦｈ彷ト林鉄、胆、、
Ｕ、Ｓ、Ａ、、 ５７．１４２６ （１９６７））、
ターミナルｔランスフエラーセ法（Ｐｒｏａ 、１１ａ
ｔｌユ。
Ａｃａｄ、 ８ｃｉ、Ｕ、８．Ａｏ、 ６９，２９０４
（１９７２））、Ｔ４リガーゼを用いるフラッシュエ
ンド曙結による方法〔有機合成化学、□、１１０ （１
９７２））などが用いられる。
（１９７２））、Ｔ４リガーゼを用いるフラッシュエ
ンド曙結による方法〔有機合成化学、□、１１０ （１
９７２））などが用いられる。
上記の方法によシ、５′−イノシン酸脱水素酵素遺伝子
領域を組み込まれたベクターＤＮＡが、バチルス属に属
する細菌の形質転換に用いられる。
領域を組み込まれたベクターＤＮＡが、バチルス属に属
する細菌の形質転換に用いられる。
このような受容菌には、５′−イノシン酸脱水素酵素の
欠失したキサンチン要求性変異株を用いれば、目的とす
る形質転換株を選択する際に好都合である。この受容菌
の例としては、バチルス・ズブチリスＲＮ−６３株（工
ＦＯ１４３０７，ＦＥＲＭ−ｐ ７ダ／θ ）が挙げら
れる。
欠失したキサンチン要求性変異株を用いれば、目的とす
る形質転換株を選択する際に好都合である。この受容菌
の例としては、バチルス・ズブチリスＲＮ−６３株（工
ＦＯ１４３０７，ＦＥＲＭ−ｐ ７ダ／θ ）が挙げら
れる。
組み換えＤＭＡを受容菌に導入するには、例えば、Ｍｏ
１． Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、 １６８ 、ｌｌｉ （
１９７９）に記載されているような通常の形質転換法が
用いられる。
１． Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、 １６８ 、ｌｌｉ （
１９７９）に記載されているような通常の形質転換法が
用いられる。
５′−イノシン酸脱水素酵素遺伝子領域の組み込まれた
ベクターＤＮＡを保有する形質転換株の選択には、例え
ば、受容菌として、キサンチン要求性変異株を用いて、
キサンチンを含有しない培地に生育しうるような菌株を
選別すればよい。また、供試するベクターＤＮＡが抗生
物質耐性などの選択マーカーを有する場合には、上記の
選別用培地に当該抗生物質を添加する等の方法を用いれ
ば、目的とする形質転換株の選択がより一層容易となる
。
ベクターＤＮＡを保有する形質転換株の選択には、例え
ば、受容菌として、キサンチン要求性変異株を用いて、
キサンチンを含有しない培地に生育しうるような菌株を
選別すればよい。また、供試するベクターＤＮＡが抗生
物質耐性などの選択マーカーを有する場合には、上記の
選別用培地に当該抗生物質を添加する等の方法を用いれ
ば、目的とする形質転換株の選択がより一層容易となる
。
このようにして得られた５′−イノシン酸脱水素酵素遺
伝子領域の組み込まれたベクターＤＮＡは、その保有株
から、該組み換えＤＮＡを抽出して、他のグアノシン生
産菌に導入した）、あるいは、抽出された組み換えＤＮ
Ａから５′−イノシン酸脱水素酵素遺伝子領域を含むＤ
ＮＡ断片を調製後、これを他のベクターＤＮＡに連結し
て、グアノシン生産菌に導入して用いることができる。
伝子領域の組み込まれたベクターＤＮＡは、その保有株
から、該組み換えＤＮＡを抽出して、他のグアノシン生
産菌に導入した）、あるいは、抽出された組み換えＤＮ
Ａから５′−イノシン酸脱水素酵素遺伝子領域を含むＤ
ＮＡ断片を調製後、これを他のベクターＤＮＡに連結し
て、グアノシン生産菌に導入して用いることができる。
また、当然のことながら、大腸菌などバチルス属に属す
る測菌以外の宿主−ベクター系を用いて５′−イノシン
酸脱水素酵素遺伝子領域をクローニングした後、得られ
た組み換えＤＮＡから当該遺伝子領域を含むＤＮＡ断片
を調製し、これをバチルス属に属する細菌用のベクター
ＤＮＡに連結して、グアノシン生産菌に導入することも
可能である。
る測菌以外の宿主−ベクター系を用いて５′−イノシン
酸脱水素酵素遺伝子領域をクローニングした後、得られ
た組み換えＤＮＡから当該遺伝子領域を含むＤＮＡ断片
を調製し、これをバチルス属に属する細菌用のベクター
ＤＮＡに連結して、グアノシン生産菌に導入することも
可能である。
このようなグアノシン生産菌の例としては、前述したバ
チルス・ズブチリスＨＡ−６０１１株、バチルス・ズブ
チリスＨＡ−６０１２株が挙げられる。
チルス・ズブチリスＨＡ−６０１１株、バチルス・ズブ
チリスＨＡ−６０１２株が挙げられる。
かくして得られる形質転換株の例としては、ＮＡ−６０
１１株を形質転換して得られる／くチルス・ズブチリス
ＴＦＩＩ（工ＦＯ１４３１２，ＦＥＲＭ Ｐ−７γ／２
）、ＨＡ−６０１２株を形質転換して得られるバチル
ス・ズブチリスＴＦ２１（工Ｆ０ １４３１３．ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−７グ／３）が挙げられる。これら形質転換株は
、導入されたプラスミドの遺伝的特性が発現されるため
に、形質転換前にくらべて、クロラムフェニコールに対
する耐性度が高く、５′−イノシン酸脱水素酵素活性が
高く、グアノシン生産能が増大されるが、その他の菌学
的性質は変らない。
１１株を形質転換して得られる／くチルス・ズブチリス
ＴＦＩＩ（工ＦＯ１４３１２，ＦＥＲＭ Ｐ−７γ／２
）、ＨＡ−６０１２株を形質転換して得られるバチル
ス・ズブチリスＴＦ２１（工Ｆ０ １４３１３．ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−７グ／３）が挙げられる。これら形質転換株は
、導入されたプラスミドの遺伝的特性が発現されるため
に、形質転換前にくらべて、クロラムフェニコールに対
する耐性度が高く、５′−イノシン酸脱水素酵素活性が
高く、グアノシン生産能が増大されるが、その他の菌学
的性質は変らない。
上記のＨＡ−６（１１１およびＮＡ−６０１２株は、バ
チルス・ズブチリスｌ＆１１５（工Ｆ０１４１８７）を
親株として誘導されたグアノシン生産菌であり、第１表
の菌学的性質を有する。
チルス・ズブチリスｌ＆１１５（工Ｆ０１４１８７）を
親株として誘導されたグアノシン生産菌であり、第１表
の菌学的性質を有する。
第１表
上記の菌学的性質をＲ，Ｅ、 Ｂｕｃｈａｎａｎおよび
Ｎ。
Ｎ。
Ｅ、 Ｇｉｂｂｏｎｓ ｍの「パージズ・マニュアル・
オプ・デターミナテイプ・バクテリオロジ−（Ｂｅｒｇ
ｙ’ｅＭａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖ
ｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第８版、１９７４年」
にしたがって検案の結果、バチルス・ズブチリスに属す
る微生物であると同定され、形質転換株であるＴＦｉ１
株およびＴＦ２１株も同様の菌学的性質を示す。
オプ・デターミナテイプ・バクテリオロジ−（Ｂｅｒｇ
ｙ’ｅＭａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖ
ｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第８版、１９７４年」
にしたがって検案の結果、バチルス・ズブチリスに属す
る微生物であると同定され、形質転換株であるＴＦｉ１
株およびＴＦ２１株も同様の菌学的性質を示す。
なお、本明細書において、工ＦＯ誉号は財団法人発酵研
究所（ＩＦＯ，大阪府大阪市淀川区十三への受託番号を
、またＦＥＲＭ ＢＰ番号はブタベスト条約に基づ（Ｆ
Ｒ工への受託番号をそれぞれ示す。
究所（ＩＦＯ，大阪府大阪市淀川区十三への受託番号を
、またＦＥＲＭ ＢＰ番号はブタベスト条約に基づ（Ｆ
Ｒ工への受託番号をそれぞれ示す。
このように形質転換して得られたグアノシン生産菌の培
養には、従来のグアノシン生産菌の培養方法と同様の方
法が用いられる。すなわち、培地としては、炭素源、窒
素源、金属イオン類の１１かに、必要に応じて、アミノ
酸、核酸、ビタミン類などの栄養源を含有する培地が用
いられる。例えば、炭素源としては、グルコース、シュ
ークロース、マルトース、澱粉、澱粉糖化液、糖蜜など
が用いられる。窒素源としては、ペプトン、コーン・ヌ
ティープ・リカー、大豆粉、酵母、尿素などの有機窒素
源のほかに、硫酸、硝酸、塩酸、炭酸などのアンモニウ
ム塩や、アンモニアガス、アンモニア水などの無機窒素
源が、それぞれ単独もしくは混合して用いられる。その
他の栄養源としては、菌の生育に必要な各種の無機塩類
、アミノ酸類、ビタミン類などが適宜選択の上、それぞ
れ単独もしくは混合して用いられる。アデニン源として
は、アデニン、アデノシン、アデニル酸、核酸はもとよ
り、それらを含有する微生物菌体やそれらの抽出物など
が用いられる。さらに、培地には、必要に応じて、シリ
コンオイル、ポリアルキレングリコールエーテルなどの
消泡剤や界面活性剤などを添加することができる。
養には、従来のグアノシン生産菌の培養方法と同様の方
法が用いられる。すなわち、培地としては、炭素源、窒
素源、金属イオン類の１１かに、必要に応じて、アミノ
酸、核酸、ビタミン類などの栄養源を含有する培地が用
いられる。例えば、炭素源としては、グルコース、シュ
ークロース、マルトース、澱粉、澱粉糖化液、糖蜜など
が用いられる。窒素源としては、ペプトン、コーン・ヌ
ティープ・リカー、大豆粉、酵母、尿素などの有機窒素
源のほかに、硫酸、硝酸、塩酸、炭酸などのアンモニウ
ム塩や、アンモニアガス、アンモニア水などの無機窒素
源が、それぞれ単独もしくは混合して用いられる。その
他の栄養源としては、菌の生育に必要な各種の無機塩類
、アミノ酸類、ビタミン類などが適宜選択の上、それぞ
れ単独もしくは混合して用いられる。アデニン源として
は、アデニン、アデノシン、アデニル酸、核酸はもとよ
り、それらを含有する微生物菌体やそれらの抽出物など
が用いられる。さらに、培地には、必要に応じて、シリ
コンオイル、ポリアルキレングリコールエーテルなどの
消泡剤や界面活性剤などを添加することができる。
培養は、通常、嵌没あるいは通気攪拌深部培養などの好
気的条件下に行われる。培地のｐＨは、通常、４ないし
９の範囲が好ましい。培養中にｐＨの変動が観察される
場合は、これを好ましい範囲に修正するために、硫酸、
伏酸力／ｌ／Ｓ／ウム、水酸化ナトリウム、アンモニア
ガス、アンモニア水などを適宜添加してもよい。培養温
度は、通常、２０℃力いし４５℃の範囲から、使用され
る微生物の生育およびグアノシンの蓄積に好適な温度が
選択される。培養は実質的にグアノシンの蓄積量が最大
になるまで行われるが、通常２４時間ない−し１４４時
間の培養で目的を達することができる。
気的条件下に行われる。培地のｐＨは、通常、４ないし
９の範囲が好ましい。培養中にｐＨの変動が観察される
場合は、これを好ましい範囲に修正するために、硫酸、
伏酸力／ｌ／Ｓ／ウム、水酸化ナトリウム、アンモニア
ガス、アンモニア水などを適宜添加してもよい。培養温
度は、通常、２０℃力いし４５℃の範囲から、使用され
る微生物の生育およびグアノシンの蓄積に好適な温度が
選択される。培養は実質的にグアノシンの蓄積量が最大
になるまで行われるが、通常２４時間ない−し１４４時
間の培養で目的を達することができる。
培養物からグアノシンを分離・採取するには、すでに公
知にされている通常の精製手段、例えば沈殿法、イオン
交換樹脂や活性炭によるクロマトグラフィー法などの分
離精製法が用いられる。
知にされている通常の精製手段、例えば沈殿法、イオン
交換樹脂や活性炭によるクロマトグラフィー法などの分
離精製法が用いられる。
本発明の製造法によると、形質転換される前の菌株を用
いる場合に比較し、グアノシンの生産性を高めることが
できる。
いる場合に比較し、グアノシンの生産性を高めることが
できる。
以下に、実施例会士チ会号骨をもって本発明をさらに具
体的に説明する。
体的に説明する。
実施例１
１）染色体ＤＮＡの調製
グアノシンを生産する能力を有するバチルス・ズブチリ
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ） ＮＡ−６
０ｉ２（ＩＦｏ １４１９０．ＦＥＲＭ ＢＰ−２９２
）をＣ培地（グルコース５ｆｌ／１．クエン酸ナトリウ
ム０．５グ／４．ポリペプトン５ｆ／（１，酵母エキス
５〕／１３ 、 （ＮＨ４）２８０４１ ｆ／（１、に
２ＨＰＯ４７９／６ 、 ＫＨ２ＰＯ４３９／ｅ 、
ｙｔｇＳｏ４−．７）（２゜Ｏ，２ｆ／ｌ 、ｐＨ７，
０）に接種して、３７℃で一夜培養し、培養液１４の菌
体から、フェノールを用いる染色体ＤＮＡ抽出法（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ。
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ） ＮＡ−６
０ｉ２（ＩＦｏ １４１９０．ＦＥＲＭ ＢＰ−２９２
）をＣ培地（グルコース５ｆｌ／１．クエン酸ナトリウ
ム０．５グ／４．ポリペプトン５ｆ／（１，酵母エキス
５〕／１３ 、 （ＮＨ４）２８０４１ ｆ／（１、に
２ＨＰＯ４７９／６ 、 ＫＨ２ＰＯ４３９／ｅ 、
ｙｔｇＳｏ４−．７）（２゜Ｏ，２ｆ／ｌ 、ｐＨ７，
０）に接種して、３７℃で一夜培養し、培養液１４の菌
体から、フェノールを用いる染色体ＤＮＡ抽出法（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ。
Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ 、 ７２．６１９ （１９
６３））によって、最終８．０ｑの染色体ＤＮＡを得た
。
６３））によって、最終８．０ｑの染色体ＤＮＡを得た
。
ｉｉ ）染色体ＤＮＡのｐＢＲ３２２への挿入以後の実
験に於ける制限酵素の切断条件は、特ニ断シのない限り
、「モレキュツー・クローニング」（書名＋ Ｔ、 Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａＬＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏ
ｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ＋
ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ＋ 東大出版会発イ〒、１９８２年、９８頁〜
１０３頁）に記載の方法に従って行った。
験に於ける制限酵素の切断条件は、特ニ断シのない限り
、「モレキュツー・クローニング」（書名＋ Ｔ、 Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａＬＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏ
ｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ＋
ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ＋ 東大出版会発イ〒、１９８２年、９８頁〜
１０３頁）に記載の方法に従って行った。
上記１）項で得た染色体ＤＮＡ３μｇに制限酵素Ｐｓｔ
工にッポンジーン製）を３７”Ｃ，６０分間作用式せＤ
ＮＡ鎖を切断した。酵素を失活させた後、酢酸アンモニ
ウムを終濃度が２．５Ｍとなるように加え、更に２倍容
の冷アルコールを加えて、−７０℃に冷却後、ＤＮＡの
沈澱を遠心分離した後、該ＤＮＡ沈澱に３５μｔの滅菌
水を加え溶解させた。一方、これとは別に、ＥＫ系のプ
ラスミドＴ）ＢＲ３２２の１μｇ を制限酵素す己−■
で切断し、上述と同様の操作によってＤＮＡを遠心分離
し、３５μｔの滅菌水に溶解した。このようにして得ら
れた染色体ＤＮＡの切断片とｐＢＲ３２２Ｄ １１ Ａ
の切断片を混合し、６６ｍＭ）リス塩酸’ＩＩＭｍｉ液
（ｐＨ７，５人６ 、６ ｍＭ ＭｇＣｌ２．１０ｍＭ
ジチオスライド−μ、６６（ｊａ訓・ＩＡＴＰを含む緩
衝液中で、Ｔ４〕１−ジ由来のＤＮＡリガーゼにッポン
ジーン製）を用いて連結反応を行った。
工にッポンジーン製）を３７”Ｃ，６０分間作用式せＤ
ＮＡ鎖を切断した。酵素を失活させた後、酢酸アンモニ
ウムを終濃度が２．５Ｍとなるように加え、更に２倍容
の冷アルコールを加えて、−７０℃に冷却後、ＤＮＡの
沈澱を遠心分離した後、該ＤＮＡ沈澱に３５μｔの滅菌
水を加え溶解させた。一方、これとは別に、ＥＫ系のプ
ラスミドＴ）ＢＲ３２２の１μｇ を制限酵素す己−■
で切断し、上述と同様の操作によってＤＮＡを遠心分離
し、３５μｔの滅菌水に溶解した。このようにして得ら
れた染色体ＤＮＡの切断片とｐＢＲ３２２Ｄ １１ Ａ
の切断片を混合し、６６ｍＭ）リス塩酸’ＩＩＭｍｉ液
（ｐＨ７，５人６ 、６ ｍＭ ＭｇＣｌ２．１０ｍＭ
ジチオスライド−μ、６６（ｊａ訓・ＩＡＴＰを含む緩
衝液中で、Ｔ４〕１−ジ由来のＤＮＡリガーゼにッポン
ジーン製）を用いて連結反応を行った。
１１１）組み換えプラスミドＤＮＡによるエシェリヒア
・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ）のキサ
ンチン要求性株の形質転換 栄養要求性株の取得の際に用いられる通常の方法（レプ
リカ・プレート法）によって、エシェリヒア・コリＣ６
００株より、キサンチン要求性株ｚシ、 ！Ｊ ヒフ
・：ｉすＸ−８９５（ＩＦＯ１４３０８゜ＦＥＲＭ Ｐ
−７ダ／／）を取得した。
・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ）のキサ
ンチン要求性株の形質転換 栄養要求性株の取得の際に用いられる通常の方法（レプ
リカ・プレート法）によって、エシェリヒア・コリＣ６
００株より、キサンチン要求性株ｚシ、 ！Ｊ ヒフ
・：ｉすＸ−８９５（ＩＦＯ１４３０８゜ＦＥＲＭ Ｐ
−７ダ／／）を取得した。
組み換えプラスミドによる該菌株の形質転換はコンピテ
ントセルを用いる方法（Ｓ、Ｎ、 Ｃｏｈｅｎｅｔ ａ
ｌ、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、
＋ Ｕ、Ｓ、Ａ ＋６９．２１１０ （１９７２））に
よった。
ントセルを用いる方法（Ｓ、Ｎ、 Ｃｏｈｅｎｅｔ ａ
ｌ、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、
＋ Ｕ、Ｓ、Ａ ＋６９．２１１０ （１９７２））に
よった。
すなわち、エシェリヒア・コリＸ−８９５株をＬ培地（
バクトドリプトン１０ｆ！／ｌ、酵母エキス５ｙ／ｌ＋
塩化ナトリウム５ｙ／ｌ）に培養し、集菌洗浄後、氷冷
した塩化カルシウム溶液を加えコンピテントなセ／ｌ／
を調製した。このコンピテント・セルの懸濁液に上述（
ｉ）項で作製したＤＭＡ溶液を加えてプラスミドＤＮＡ
を取り込ませ、形質転換を行った。
バクトドリプトン１０ｆ！／ｌ、酵母エキス５ｙ／ｌ＋
塩化ナトリウム５ｙ／ｌ）に培養し、集菌洗浄後、氷冷
した塩化カルシウム溶液を加えコンピテントなセ／ｌ／
を調製した。このコンピテント・セルの懸濁液に上述（
ｉ）項で作製したＤＭＡ溶液を加えてプラスミドＤＮＡ
を取り込ませ、形質転換を行った。
次に、この形質転換株を含む懸濁液の０．１ｍｌをテト
ラサイタリン１５μｇ／ｍｌを含むＭ−９ＣＭ寒天培地
（Ｈａ２ＨＰＯ４６ｆ ／ｌ 、 ＫＨ２ＰＯ４３ｙ／
ｌｓ塩化ナトリウム０．５）／ １１塩化アンモニウム
１ｆ／ｌ、硫６１１マグネシウム１ ｍＭ ＋塩化力／
Ｉ／Ｖウム１ｍＭ＋グ〜コース２ｙ／ｌ＋カザミノ酸２
ノ／ ｔ ｒ寒天１５ノ／ｚ、ｐＨ７，２）の平板上に
塗床して３７℃で１日培養した。寒天平板培地上に生じ
たコロニーから、形質転換株エシェリヒア・コリＴＥＸ
−１１７株（テＦラサイクリン耐性を獲得し、かつ、キ
サンチン要求性を消失している。）を取得した。
ラサイタリン１５μｇ／ｍｌを含むＭ−９ＣＭ寒天培地
（Ｈａ２ＨＰＯ４６ｆ ／ｌ 、 ＫＨ２ＰＯ４３ｙ／
ｌｓ塩化ナトリウム０．５）／ １１塩化アンモニウム
１ｆ／ｌ、硫６１１マグネシウム１ ｍＭ ＋塩化力／
Ｉ／Ｖウム１ｍＭ＋グ〜コース２ｙ／ｌ＋カザミノ酸２
ノ／ ｔ ｒ寒天１５ノ／ｚ、ｐＨ７，２）の平板上に
塗床して３７℃で１日培養した。寒天平板培地上に生じ
たコロニーから、形質転換株エシェリヒア・コリＴＥＸ
−１１７株（テＦラサイクリン耐性を獲得し、かつ、キ
サンチン要求性を消失している。）を取得した。
＋Ｖ）形質転換株からのプラスミドの抽出形質転換株Ｔ
１１ｉＸ−１１７からの組み換えプラスミドの抽出は、
前記の「モレキュツー・クローニング」第８６〜９３頁
に記載の方法に従った。
１１ｉＸ−１１７からの組み換えプラスミドの抽出は、
前記の「モレキュツー・クローニング」第８６〜９３頁
に記載の方法に従った。
すなわち、エシェリヒア・コリＴａｘ−１１７を前記の
Ｌ培地に接種しプラスミドを増幅させるためにクロヲム
フェニコーρを添加して、−夜培養後集菌沈浄した。洗
浄菌体にリゾチームを加え、更に１％ラウリ／ｌ’硫酸
ナトリウムを含む０．２Ｎ上澄液を得た。上澄液に０．
６容のインプロバノ−／Ｉ／を加えプラスミドＤＮＡを
沈澱させ、′エタノーμで洗浄した後ＴＥ緩衝液（１０
ｍＭ）リス塩酸緩衝液、ｉｍＭ ＥＤＴＡ 、ｐＨ８，
０）に溶解した。これに比重が１．６０となるように塩
化セシウムを加え、終濃度が６００μｇ、／ｍｌとなる
ようにエチジウムブロマイドを加えた。ベックマン超検
出すれるプラスミドのバンドを取り、ｎ−ゲタノーμを
用いてエチジウムブロマイドを抽出除去した後、ＴＥ緩
衝液に透析して３００ｇ／の培養液から約２００μｇ相
当の組み換えプラスミドを得、これをｐＥＸ＋１７と命
名した。
Ｌ培地に接種しプラスミドを増幅させるためにクロヲム
フェニコーρを添加して、−夜培養後集菌沈浄した。洗
浄菌体にリゾチームを加え、更に１％ラウリ／ｌ’硫酸
ナトリウムを含む０．２Ｎ上澄液を得た。上澄液に０．
６容のインプロバノ−／Ｉ／を加えプラスミドＤＮＡを
沈澱させ、′エタノーμで洗浄した後ＴＥ緩衝液（１０
ｍＭ）リス塩酸緩衝液、ｉｍＭ ＥＤＴＡ 、ｐＨ８，
０）に溶解した。これに比重が１．６０となるように塩
化セシウムを加え、終濃度が６００μｇ、／ｍｌとなる
ようにエチジウムブロマイドを加えた。ベックマン超検
出すれるプラスミドのバンドを取り、ｎ−ゲタノーμを
用いてエチジウムブロマイドを抽出除去した後、ＴＥ緩
衝液に透析して３００ｇ／の培養液から約２００μｇ相
当の組み換えプラスミドを得、これをｐＥＸ＋１７と命
名した。
ｐＥＸ１１７を種々の制限酵素で切断し、入−ファージ
のＨｌｎｄ 、 ＩＩ分解物にッポンジーン製）−一■
■−■−−−−曇□− の分子量を基準にしてアガロ−スゲ〃電気泳動のパター
ンから、第１図に示すような制限酵素切断地図を得た。
のＨｌｎｄ 、 ＩＩ分解物にッポンジーン製）−一■
■−■−−−−曇□− の分子量を基準にしてアガロ−スゲ〃電気泳動のパター
ンから、第１図に示すような制限酵素切断地図を得た。
ｐＥＸ１１７は、ｐＢＲ３２２のＰｓｔ エサイトに約
６．４キロベースのＤＮＡ断片が挿入された組み換えプ
ラスミドである。
６．４キロベースのＤＮＡ断片が挿入された組み換えプ
ラスミドである。
実施例２
１）３ｆｉｇＯｐＥＸ ｌ ｌ ７を制限酵素Ｈｉｎｄ
ｍで部分分解し、一方ｐＢＲ３２２をμｍＱ Ｉｕで
完全分解して、実施例１− ｉｉ ）項に記載した方法
に従って両者を混合し、Ｔ４由来のＤＮＡリガーゼで連
結反応を行った。次に、このＤＮＡ溶液を用いて実施例
１−…）項に記載した方法でエシェリヒア・コリＸ−８
９５株を形質転換して、テトラサイクリン耐性を獲得し
、かつキサンチン要求性の消失している形質転換株エシ
ェリヒア・コリＴＥＸ−１４７株を得た。該形質転換株
から、実施例１−＋ｖ）項に示した方法でプラスミドを
抽出し、約２２０μｇの組換えプラスミドを得、これを
ｐＥＸ１４７と命名した。ｐＥＸｉ４７（７）制限酵素
切断地図を第２図に示した。ｐＥＸ １４７はｐＢＲ３
２２のシＬ■■サイトに２．９キロベースのＤＮＡ断片
が挿入された組換えプラスミドである。
ｍで部分分解し、一方ｐＢＲ３２２をμｍＱ Ｉｕで
完全分解して、実施例１− ｉｉ ）項に記載した方法
に従って両者を混合し、Ｔ４由来のＤＮＡリガーゼで連
結反応を行った。次に、このＤＮＡ溶液を用いて実施例
１−…）項に記載した方法でエシェリヒア・コリＸ−８
９５株を形質転換して、テトラサイクリン耐性を獲得し
、かつキサンチン要求性の消失している形質転換株エシ
ェリヒア・コリＴＥＸ−１４７株を得た。該形質転換株
から、実施例１−＋ｖ）項に示した方法でプラスミドを
抽出し、約２２０μｇの組換えプラスミドを得、これを
ｐＥＸ１４７と命名した。ｐＥＸｉ４７（７）制限酵素
切断地図を第２図に示した。ｐＥＸ １４７はｐＢＲ３
２２のシＬ■■サイトに２．９キロベースのＤＮＡ断片
が挿入された組換えプラスミドである。
ｉｉ）約２００μｇの組換えプラスミドｐＥＸ１４７を
制限酵素Ｈ１ｎｔｉ ＩＩＩで部分分解し、ロウ・メル
ティング・ポイント・アガロース（Ｂｅｔｌｌｅｅｄａ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を
用いてゲル電気泳動を行い、２．９キロベーヌのＤＮＡ
の電気泳動距離に相当する部分のアガロース・ゲルを切
り取った。次いで前記の「モレキュラー・クローニング
」１７０頁に記載された方法に従って、該アガロース・
ゲル切片からＤＮＡの抽出を行い、に挿入された２、９
キロベースのＤＮＡであることを確認した。
制限酵素Ｈ１ｎｔｉ ＩＩＩで部分分解し、ロウ・メル
ティング・ポイント・アガロース（Ｂｅｔｌｌｅｅｄａ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を
用いてゲル電気泳動を行い、２．９キロベーヌのＤＮＡ
の電気泳動距離に相当する部分のアガロース・ゲルを切
り取った。次いで前記の「モレキュラー・クローニング
」１７０頁に記載された方法に従って、該アガロース・
ゲル切片からＤＮＡの抽出を行い、に挿入された２、９
キロベースのＤＮＡであることを確認した。
実施例３
１）５′−イノシン酸脱水素酵素遺伝子のＢＳ系ベクタ
ー（ｐ１９４）への挿入 ３μｇ のｐＥｘｌｌ、７を制限酵素１（１ｎｄ ｍで
部分分解し、一方、これとは別に枯草菌を宿主とするプ
ラスミドｐｃ１９４の１μｇをＨｉｎｄ ｍで完全分解
して、実施例１− ｉｉ ）に記載した方法に従って両
者を混合してＴ４由来のＤＮＡ リガーゼを用いて連結
反応を行った。
ー（ｐ１９４）への挿入 ３μｇ のｐＥｘｌｌ、７を制限酵素１（１ｎｄ ｍで
部分分解し、一方、これとは別に枯草菌を宿主とするプ
ラスミドｐｃ１９４の１μｇをＨｉｎｄ ｍで完全分解
して、実施例１− ｉｉ ）に記載した方法に従って両
者を混合してＴ４由来のＤＮＡ リガーゼを用いて連結
反応を行った。
ｉ）組み換えプラスミドＤＮＡによるバチルス・ズブチ
リス・キサンチン要求株の形質転換通常の栄養要求性株
の取得法を用いて、バチルス・ズブチリスＭニー１１４
株（遺伝的特性はｔｒｐｃ２＋ １ｅｕ８ ＋ ｒ−＋
ｍ−）からキサンチン要求性株バチｐス・ズブチリス
ＲＮ−６３株（工Ｉｉ’０１４３０７、ＦＥＲ’Ｍ ｐ
−、；＞り／θ）を取得した。
リス・キサンチン要求株の形質転換通常の栄養要求性株
の取得法を用いて、バチルス・ズブチリスＭニー１１４
株（遺伝的特性はｔｒｐｃ２＋ １ｅｕ８ ＋ ｒ−＋
ｍ−）からキサンチン要求性株バチｐス・ズブチリス
ＲＮ−６３株（工Ｉｉ’０１４３０７、ＦＥＲ’Ｍ ｐ
−、；＞り／θ）を取得した。
次に、上記１）項で調製したＤＮＡ溶液を用いてバチル
ス・ズブチリスＲＮ−６３を形質転換し、クロラムフェ
ニコーμに耐性な形質転換株を得た。
ス・ズブチリスＲＮ−６３を形質転換し、クロラムフェ
ニコーμに耐性な形質転換株を得た。
形質転換は該要求株のプロトブラストにポリエチレング
リコールを作用させてＤＮＡを取り込ませる方法（８，
Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｂ、Ｈ，Ｃｏｈｅｎ ｓ叫、」朋
、Ｇ肥畦、、す８，１１１ （１９７９））によった。
リコールを作用させてＤＮＡを取り込ませる方法（８，
Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｂ、Ｈ，Ｃｏｈｅｎ ｓ叫、」朋
、Ｇ肥畦、、す８，１１１ （１９７９））によった。
上述の形質転換操作の結果、１０μｇ／ｙｘｌのクロラ
ムフェニコールを含む再生用培地に生育した形質転換株
を、１０μｇ、／ｌｘｌのクロラムフエニコー／Ｌ／を
含むＭ −９ＣＭＴＬ培地（Ｍ−９ＣＭ培地に各々５０
μｇ ／ ＃！ｔのトリプトファンおよびロイシンを補
足した培地）の寒天平板にレプリカし、３７℃で１日培
養後に生じたコロニーから、形質転換株バチルス・ズブ
チリスＴＸ−１２１を得た。
ムフェニコールを含む再生用培地に生育した形質転換株
を、１０μｇ、／ｌｘｌのクロラムフエニコー／Ｌ／を
含むＭ −９ＣＭＴＬ培地（Ｍ−９ＣＭ培地に各々５０
μｇ ／ ＃！ｔのトリプトファンおよびロイシンを補
足した培地）の寒天平板にレプリカし、３７℃で１日培
養後に生じたコロニーから、形質転換株バチルス・ズブ
チリスＴＸ−１２１を得た。
バチルス・ズブチリスＴＸ−１２１株は、クロラムフヱ
ニコー〃に耐性でかつキサンチン要求性が相補された形
質転換株である。
ニコー〃に耐性でかつキサンチン要求性が相補された形
質転換株である。
１１１）形質転換株からのプラスミドの抽出バチルス・
ズブチリスＴＸ−１２１株を前記のＬ培地３０゛０ｔｘ
ｌを用いて培養し、得られた培養物から、実施例１−１
ｖ）項に記載した方法により、約１００μｇ相当のプラ
スミドを得た。このプラスミドをｐＢＸ ｌ ２ ｉと
命名した。組み換えプラスミドｐＢＸ １２１の制限酵
素切断地図は第３図に示した通シであって、挿入断片の
大きさは約２．９キロベースである。
ズブチリスＴＸ−１２１株を前記のＬ培地３０゛０ｔｘ
ｌを用いて培養し、得られた培養物から、実施例１−１
ｖ）項に記載した方法により、約１００μｇ相当のプラ
スミドを得た。このプラスミドをｐＢＸ ｌ ２ ｉと
命名した。組み換えプラスミドｐＢＸ １２１の制限酵
素切断地図は第３図に示した通シであって、挿入断片の
大きさは約２．９キロベースである。
実施例４
バチルス・ズブチリスの形質転換株を用いてのグアノシ
ンの生産 バチルス・ズブチリスＮ Ａ−６０１２（工Ｆ ０１４
１９０、ＦＥＲＭ ＢＰ−２９２）を実施例３−ｉ）項
に記載した方法に従って、ｐ ：ａ ｘ １２１を用い
て形質転換し、形質転換株を含む懸濁液を１０μＶ／１
のクロフムブエニコ−ｆｉ／を含む再生用培地に塗抹し
て３７℃で５日間培養し、生じたコロニーカラクロラム
フェニコー〜に耐性な形質転換株バチルス・ズブチリス
ＴＦ２１株（工ＦＯ１４３１３、ＦＥＲＭ Ｐ−７ダ／
３）を取得した。
ンの生産 バチルス・ズブチリスＮ Ａ−６０１２（工Ｆ ０１４
１９０、ＦＥＲＭ ＢＰ−２９２）を実施例３−ｉ）項
に記載した方法に従って、ｐ ：ａ ｘ １２１を用い
て形質転換し、形質転換株を含む懸濁液を１０μＶ／１
のクロフムブエニコ−ｆｉ／を含む再生用培地に塗抹し
て３７℃で５日間培養し、生じたコロニーカラクロラム
フェニコー〜に耐性な形質転換株バチルス・ズブチリス
ＴＦ２１株（工ＦＯ１４３１３、ＦＥＲＭ Ｐ−７ダ／
３）を取得した。
次に第２表に示す棟培地２０ｍ１を含む２００ｇ／容三
角フラスコに、バチルス・ズブチリスＴＦ−・２１株の
一白金耳を接種し、３７℃で１８時間振婚しその１ ｔ
ｘｔを第２表の主発酵培地２０ｔｘｌを含む２００ｇ／
容ヒダ付フラスコに接種し、回転式振盪機上で３７℃４
日間培養したところ、培養液中にグアノシンが１８ 、
０ ｑ／ｌｓｌの割合で蓄積されていた。
角フラスコに、バチルス・ズブチリスＴＦ−・２１株の
一白金耳を接種し、３７℃で１８時間振婚しその１ ｔ
ｘｔを第２表の主発酵培地２０ｔｘｌを含む２００ｇ／
容ヒダ付フラスコに接種し、回転式振盪機上で３７℃４
日間培養したところ、培養液中にグアノシンが１８ 、
０ ｑ／ｌｓｌの割合で蓄積されていた。
約５０個のフラスコを用いて同様の培養を行い同質の培
養液１ｔを得た。これを水酸化ナトリウムでｐＨ１１に
してグアノシン結晶を溶解させた後、遠心分離によって
菌体を除去し、得られた上清液を中和、冷却してグアノ
シンを析出せしめ、粗結晶を得た。次いで、これを７０
０ｍ１の熱水に溶解し、活性炭を用いて脱色し、冷所に
てグアノシンを析出せしめ、グアノシンの精結晶１４．
５ノを得た。該精結晶のグアノシンの純度は９３％であ
った。なお、組み換えプラスミドｐ Ｂ Ｘ１２１を保
持していないバチルス・ズブチリスＮＡ−６０１２を上
記と同一の条件で培養したところ、１４り／薄ｔの割合
でグアノシンが蓄積されていた。
養液１ｔを得た。これを水酸化ナトリウムでｐＨ１１に
してグアノシン結晶を溶解させた後、遠心分離によって
菌体を除去し、得られた上清液を中和、冷却してグアノ
シンを析出せしめ、粗結晶を得た。次いで、これを７０
０ｍ１の熱水に溶解し、活性炭を用いて脱色し、冷所に
てグアノシンを析出せしめ、グアノシンの精結晶１４．
５ノを得た。該精結晶のグアノシンの純度は９３％であ
った。なお、組み換えプラスミドｐ Ｂ Ｘ１２１を保
持していないバチルス・ズブチリスＮＡ−６０１２を上
記と同一の条件で培養したところ、１４り／薄ｔの割合
でグアノシンが蓄積されていた。
（以下８白）
第２表
実施例５
バチルス・ズブチリスＮＡ−６０１１（工Ｆ０１４１８
９、ＦＥＲＭ ＢＰ−２９１）を実施例３− ｉｉ ）
項に記載した方法に従って、ｐＢＸｉ２１を用いて形質
転換し、クロラムフェニコール耐性を獲得した形質転換
株バチルス・ズブチリスＴＦ−１１株（工ＦＯ１４３１
２，ＦＥＲＭ Ｐ−？ゲ／’２）を取得した。これを実
施例４と同様の条件で培養したところ、１６− Ｏｑ／
１ｔｔｌの割合でグアノシンが蓄積されていた。次いで
、実施例４に記載した方法に従ってグアノシンの精製を
行い、１ｔの培養液から、純度９１％のグアノシン精結
晶を１３．ｌｙ得た。なお、組み換えプラスミドｐＢＸ
１２１を保持していないバチルス・ズブチリスＮＡ−６
０１１を上記と同一の条件で培養したところ、グアノシ
ンの蓄積量は５ 、 ＯＮｌ／ｌｌｌであった。
９、ＦＥＲＭ ＢＰ−２９１）を実施例３− ｉｉ ）
項に記載した方法に従って、ｐＢＸｉ２１を用いて形質
転換し、クロラムフェニコール耐性を獲得した形質転換
株バチルス・ズブチリスＴＦ−１１株（工ＦＯ１４３１
２，ＦＥＲＭ Ｐ−？ゲ／’２）を取得した。これを実
施例４と同様の条件で培養したところ、１６− Ｏｑ／
１ｔｔｌの割合でグアノシンが蓄積されていた。次いで
、実施例４に記載した方法に従ってグアノシンの精製を
行い、１ｔの培養液から、純度９１％のグアノシン精結
晶を１３．ｌｙ得た。なお、組み換えプラスミドｐＢＸ
１２１を保持していないバチルス・ズブチリスＮＡ−６
０１１を上記と同一の条件で培養したところ、グアノシ
ンの蓄積量は５ 、 ＯＮｌ／ｌｌｌであった。
実施例６
形質転換株の５′−イノシン酸脱水素酵素活性バチルス
・ズブチリスＴＸ−１２１株をＭＥＡ培地（ポリペプト
ン１０ｆ／ｌ、酵母ｘキス５ｙｉｔ、塩化ナトリウム５
）／１．グルタミン酸ソーダ５ｙ／ｌ＋硫酸マグネシウ
ム０．５ｆ／ｌ。
・ズブチリスＴＸ−１２１株をＭＥＡ培地（ポリペプト
ン１０ｆ／ｌ、酵母ｘキス５ｙｉｔ、塩化ナトリウム５
）／１．グルタミン酸ソーダ５ｙ／ｌ＋硫酸マグネシウ
ム０．５ｆ／ｌ。
塩化カルシウム０．１ｙ／ｌ＋グｔレコース５０ｆ／！
−、ｐＨ７，２）に接種して、３７℃で一夜培養後、集
菌、洗浄し、 Ｖ／ＩＯ容量の５ｍＭグ〜タチオン（還
元型）を含む０．０５Ｍ燐酸緩衝液液に対して一夜透析
して粗酵素液を調製した。該粗酵素液を用いて、Ｂ、
Ｍａｇａｓａｎｉｋ の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｌ ＋ Ｐ、ｌ ０６−１１
０ ＋ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ＋ Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ（＋９６３））に従って、５′−イノシン酸脱水
素酵素活性を測定したところ、０．０２ユニツト／ｑ蛋
白質の酵素活性が得られた。同様にして、組み換えプラ
スミドを保持していない宿主菌バチルス・ズブチリスＲ
Ｎ−６３の５′−イノシン酸脱水素酵素活性を測定した
ところ、該菌は全く酵素活性を示さなかった。
−、ｐＨ７，２）に接種して、３７℃で一夜培養後、集
菌、洗浄し、 Ｖ／ＩＯ容量の５ｍＭグ〜タチオン（還
元型）を含む０．０５Ｍ燐酸緩衝液液に対して一夜透析
して粗酵素液を調製した。該粗酵素液を用いて、Ｂ、
Ｍａｇａｓａｎｉｋ の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｌ ＋ Ｐ、ｌ ０６−１１
０ ＋ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ＋ Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ（＋９６３））に従って、５′−イノシン酸脱水
素酵素活性を測定したところ、０．０２ユニツト／ｑ蛋
白質の酵素活性が得られた。同様にして、組み換えプラ
スミドを保持していない宿主菌バチルス・ズブチリスＲ
Ｎ−６３の５′−イノシン酸脱水素酵素活性を測定した
ところ、該菌は全く酵素活性を示さなかった。
第１図は実施例で得られた組み換えプラスミドｐＥＸ１
１７、第２図は同じく組み換えプラスミドｐＥＸ１４７
．．２ 第３図は同じくプラスミドｐＢＸの制限酵素切
断地図を示す。図中、括弘ν内の数字は塩基対数（キロ
ペースペア）を示し、第１図の※Ｈ１ｎｄ ｍ （３、
９） 、※Ｈｉｎｄ ｍ （５，１５）。 また第２図および第３図の※Ｈｉｎｄ ＩＩＩ（１，４
） 。 ※Ｈ１ｎｄｌＩ（２，６５）は各々どちらか一方にＨｌ
ｎｄ ｍの切断点が存在しているが、決定されていない
ことを示す。 手続補正書（自発） 昭和５９年９り所日 特許庁長官殿 昭和５９年特許願第１３９６８号 ２ 発明の名称 ＤＮＡおよびその用途 ３ 補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 大阪市東区道修町２丁目２７番地名称 （２９３
） 武田薬品工業株式会社代表者 倉 体 育 四 部 ４代理人 ５、 補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ６、 補正の内容 明細塵の第２８頁第１７行の後に、 「実施例７ バチルス ズブチリスＮＡ−６０１２株をＮＴＧ処理し
てバチルス ズブチリスＮＡ−７８２１（Ｉ ＦＯＩ
４３６８．ＦＥＲＭ’ ＢＰ−６”Ｉ ８）を得た。木
ＮＡ−７８２１株の染色体ＤＮＡを制限酵素Ｐｓｔｌで
切断してプラスミドｐＢＲ３２２につなぎ、エシェリヒ
ア コリＸ−８９５（ＩＦｏ １／１３０８ ）のキサ
ンチン要求性を相補するプラスミドｐＥＸＩ＋７’を得
た。次に、実施例３の方法に準じて、ｐＥＸＩ＋７’を
ｉ−Ｉ匡ｄＩＵで部分分解してプラスミドｌ）ＣＩ ９
４につなぎ、５′−イノシン酸脱水素酵素遺伝子を含む
２．９キロベースのＤＮＡ断片の挿入されたプラスミド
ｐＢＸ１２１′を得た。次に、このプラスミドを用いて
、実施例４の方法に準じて、バチルス・ズブチリスＮＡ
−６１２８（ＩＦＯＩ４３７３．ＦＥＲＭ’ ＢＰ−６
１７）を形質転換した（ＮＡ−６１２８株はバチルス
ズブチリスＮＡ−６０１１をＮＴＧ処理して得た）。か
くして得られた形質転換株ＮＡ−６１２８（ＦＢＸ １
２１’ ）をグルコース１０％、硫酸アンモニウム２％
、尿素１％、グルタミン酸ソーダ１％、コーンステープ
リカー２％、ＲＮＡ０．２％、塩化カルシウム０．５％
、硫酸マグネシウム０２％、塩化カリウム０．０５％、
硫酸マンガン２．５ｍｇ／ｌ、炭酸カルシウム３％から
なる培地で、３７℃、３日間振盪培養したきころ、２０
ｍｇ／ｍｌのグアノシンが蓄積された。一方、プラスミ
Ｉ；’ｐＢＸ ］ ２ ］’ を保有しないバチルス・
ズブチリスＮΔ−６１２８を上記と同一条件下に培養し
たところ、７ｍｇ／ｍｌのグアノシンが蓄積されたにす
ぎなかった。」 を挿入する。 ７、添付書類の目録 微生物受託証謄本 ２通 以上 手 続 補 正 書 （自発） 昭和６０年 １ 月？日 特許庁長官殿 ■、小事件表示 昭和 ５９年特許願第 １３９６８ 号２、発明の名称 ＤＮＡおよびその用途 ３、補正をする者 事件との関係 持許出願人 住 所 大阪市東区道修町２丁目２７番地名 称（２９
３）武田薬品工業株式会社代表者 倉 林 育 四 部 ４、代理人 住 所 大阪市淀用区十三本町２丁目１７番８５号５、
補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄。 ６、補正の内容 １〕明細書第１２頁第１３行の１示す。」の後に１なお
、バチルス ズブチリスＲＮ−６８（Ｆｐ：ＲＭ Ｐ−
７４１０）、エシェリヒア コリ ＸＸ−８９５（ＦＥ
ＲＰ−７４１１）、バチルスズブチリスＴＦ−１ｌ（Ｆ
’ＥＲＭ Ｐ−７４ｔ２Ｊおよびバチルス ズブチリス
ＴＦ −２１（Ｉｉ”ＥＲＭＰ−７４１３）については
、該寄託がブタペスト条約に基づく寄託に切り換えられ
て、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−７４１０はＦ’ＥＲＭ Ｂ
Ｐ−６１３として、Ｆ”ＥＲＭ Ｐ−７４１１はＦ’Ｅ
ＲＭＢＰ−６１４として、Ｆ’ｇＲＭ Ｐ−７４’１２
はＦｆ（ＲＭ ＢＰ−６１５として、またＴｉ”ＦｉＲ
ＭＰ−７４１８はＦＢＲＭ ＢＰ−６１６としてそれぞ
れＦ’ＲＴに保管されている。」を挿入する。 ２）同＠第１７頁第４行の「ＰＥＲＭ Ｐ−７４１１」
をｌ’−Ｆ’ＥＲＭ ＢＰ−６１４Ｊに訂ｉＥする。 ３）同書第２２頁第７行の「ＦＦ、ＲＭ Ｐ−７４１０
」を「ＦＥＲＭ ＢＰ−６１３Ｊに訂正する。 ４）同書第２４頁第８行の［ＦＥＲＭ Ｐ〜７４１３」
を［Ｆ、ＥＲＭ ＢＰ−６１６Ｊに訂正する。 ５）同書第２７頁第４〜５行の［ＦＥＲＭ Ｐ−７’４
１２Ｊを「ＦＥＲＭ ＢＰ−６１５４に打面する。 ７、添付書類の目録 原寄託についての受託証謄本 ４通 以 −１ニ
１７、第２図は同じく組み換えプラスミドｐＥＸ１４７
．．２ 第３図は同じくプラスミドｐＢＸの制限酵素切
断地図を示す。図中、括弘ν内の数字は塩基対数（キロ
ペースペア）を示し、第１図の※Ｈ１ｎｄ ｍ （３、
９） 、※Ｈｉｎｄ ｍ （５，１５）。 また第２図および第３図の※Ｈｉｎｄ ＩＩＩ（１，４
） 。 ※Ｈ１ｎｄｌＩ（２，６５）は各々どちらか一方にＨｌ
ｎｄ ｍの切断点が存在しているが、決定されていない
ことを示す。 手続補正書（自発） 昭和５９年９り所日 特許庁長官殿 昭和５９年特許願第１３９６８号 ２ 発明の名称 ＤＮＡおよびその用途 ３ 補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 大阪市東区道修町２丁目２７番地名称 （２９３
） 武田薬品工業株式会社代表者 倉 体 育 四 部 ４代理人 ５、 補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ６、 補正の内容 明細塵の第２８頁第１７行の後に、 「実施例７ バチルス ズブチリスＮＡ−６０１２株をＮＴＧ処理し
てバチルス ズブチリスＮＡ−７８２１（Ｉ ＦＯＩ
４３６８．ＦＥＲＭ’ ＢＰ−６”Ｉ ８）を得た。木
ＮＡ−７８２１株の染色体ＤＮＡを制限酵素Ｐｓｔｌで
切断してプラスミドｐＢＲ３２２につなぎ、エシェリヒ
ア コリＸ−８９５（ＩＦｏ １／１３０８ ）のキサ
ンチン要求性を相補するプラスミドｐＥＸＩ＋７’を得
た。次に、実施例３の方法に準じて、ｐＥＸＩ＋７’を
ｉ−Ｉ匡ｄＩＵで部分分解してプラスミドｌ）ＣＩ ９
４につなぎ、５′−イノシン酸脱水素酵素遺伝子を含む
２．９キロベースのＤＮＡ断片の挿入されたプラスミド
ｐＢＸ１２１′を得た。次に、このプラスミドを用いて
、実施例４の方法に準じて、バチルス・ズブチリスＮＡ
−６１２８（ＩＦＯＩ４３７３．ＦＥＲＭ’ ＢＰ−６
１７）を形質転換した（ＮＡ−６１２８株はバチルス
ズブチリスＮＡ−６０１１をＮＴＧ処理して得た）。か
くして得られた形質転換株ＮＡ−６１２８（ＦＢＸ １
２１’ ）をグルコース１０％、硫酸アンモニウム２％
、尿素１％、グルタミン酸ソーダ１％、コーンステープ
リカー２％、ＲＮＡ０．２％、塩化カルシウム０．５％
、硫酸マグネシウム０２％、塩化カリウム０．０５％、
硫酸マンガン２．５ｍｇ／ｌ、炭酸カルシウム３％から
なる培地で、３７℃、３日間振盪培養したきころ、２０
ｍｇ／ｍｌのグアノシンが蓄積された。一方、プラスミ
Ｉ；’ｐＢＸ ］ ２ ］’ を保有しないバチルス・
ズブチリスＮΔ−６１２８を上記と同一条件下に培養し
たところ、７ｍｇ／ｍｌのグアノシンが蓄積されたにす
ぎなかった。」 を挿入する。 ７、添付書類の目録 微生物受託証謄本 ２通 以上 手 続 補 正 書 （自発） 昭和６０年 １ 月？日 特許庁長官殿 ■、小事件表示 昭和 ５９年特許願第 １３９６８ 号２、発明の名称 ＤＮＡおよびその用途 ３、補正をする者 事件との関係 持許出願人 住 所 大阪市東区道修町２丁目２７番地名 称（２９
３）武田薬品工業株式会社代表者 倉 林 育 四 部 ４、代理人 住 所 大阪市淀用区十三本町２丁目１７番８５号５、
補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄。 ６、補正の内容 １〕明細書第１２頁第１３行の１示す。」の後に１なお
、バチルス ズブチリスＲＮ−６８（Ｆｐ：ＲＭ Ｐ−
７４１０）、エシェリヒア コリ ＸＸ−８９５（ＦＥ
ＲＰ−７４１１）、バチルスズブチリスＴＦ−１ｌ（Ｆ
’ＥＲＭ Ｐ−７４ｔ２Ｊおよびバチルス ズブチリス
ＴＦ −２１（Ｉｉ”ＥＲＭＰ−７４１３）については
、該寄託がブタペスト条約に基づく寄託に切り換えられ
て、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−７４１０はＦ’ＥＲＭ Ｂ
Ｐ−６１３として、Ｆ”ＥＲＭ Ｐ−７４１１はＦ’Ｅ
ＲＭＢＰ−６１４として、Ｆ’ｇＲＭ Ｐ−７４’１２
はＦｆ（ＲＭ ＢＰ−６１５として、またＴｉ”ＦｉＲ
ＭＰ−７４１８はＦＢＲＭ ＢＰ−６１６としてそれぞ
れＦ’ＲＴに保管されている。」を挿入する。 ２）同＠第１７頁第４行の「ＰＥＲＭ Ｐ−７４１１」
をｌ’−Ｆ’ＥＲＭ ＢＰ−６１４Ｊに訂ｉＥする。 ３）同書第２２頁第７行の「ＦＦ、ＲＭ Ｐ−７４１０
」を「ＦＥＲＭ ＢＰ−６１３Ｊに訂正する。 ４）同書第２４頁第８行の［ＦＥＲＭ Ｐ〜７４１３」
を［Ｆ、ＥＲＭ ＢＰ−６１６Ｊに訂正する。 ５）同書第２７頁第４〜５行の［ＦＥＲＭ Ｐ−７’４
１２Ｊを「ＦＥＲＭ ＢＰ−６１５４に打面する。 ７、添付書類の目録 原寄託についての受託証謄本 ４通 以 −１ニ
Claims (6)
- （１） ５’−イノシン酸脱水素酵素遺伝子を肴し、２
．９キロベースペア離れたＨｌｎｄ ｍの切断点を有す
るＤＮＡ０ - （２）グアノシンまたは（および）キサントシン生産能
を有するバチルス属菌の染色体ＤＮＡから得られた特許
請求の範囲第（１）項記載のＩＩＮＡ。 - （３）特許請求の範囲第（２）項記載のＤＮＡが組み込
まれたベクター。 - （４）特許請求の範囲第（３）項記載のベクターで形質
転換されたバチルス属菌。 - （５）特許請求の範囲第（３）項記載のベクターで形質
転換されたグアノシン生産能を有する特許請求の範囲第
（４）項記載のバチルス属菌。 - （６）グアノシンまたは（および）キサントシン生産能
を有するバチルス属菌の染色体ＤＮＡから得られた５′
−イノシン酸脱水素酵素遺伝子領域が組み込まれたベク
ターで形質転換されたグアノシン生産能を有するバチル
ス属菌を培地に培養し、培養物中にグアノシンを生成蓄
積せしめ、これを採取することを特徴とするグアノシン
の製造法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59013968A JPH0630583B2 (ja) | 1984-01-27 | 1984-01-27 | Ｄνａおよびその用途 |
| US06/671,482 US4749650A (en) | 1984-01-27 | 1984-11-14 | Bacillus containing a 5'inosinate dehydrocenase gene |
| ES537637A ES8602134A1 (es) | 1984-01-27 | 1984-11-14 | Un metodo de producir guanosina |
| EP84308264A EP0151341B1 (en) | 1984-01-27 | 1984-11-28 | Dna and its use |
| DE8484308264T DE3476422D1 (en) | 1984-01-27 | 1984-11-28 | Dna and its use |
| AT84308264T ATE40405T1 (de) | 1984-01-27 | 1984-11-28 | Dns und ihre verwendung. |
| KR1019840007786A KR920001378B1 (ko) | 1984-01-27 | 1984-12-08 | Dna 및 그의 이용 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59013968A JPH0630583B2 (ja) | 1984-01-27 | 1984-01-27 | Ｄνａおよびその用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60156388A true JPS60156388A (ja) | 1985-08-16 |
| JPH0630583B2 JPH0630583B2 (ja) | 1994-04-27 |
Family
ID=11848013
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59013968A Expired - Lifetime JPH0630583B2 (ja) | 1984-01-27 | 1984-01-27 | Ｄνａおよびその用途 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4749650A (ja) |
| EP (1) | EP0151341B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0630583B2 (ja) |
| KR (1) | KR920001378B1 (ja) |
| AT (1) | ATE40405T1 (ja) |
| DE (1) | DE3476422D1 (ja) |
| ES (1) | ES8602134A1 (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01174385A (ja) * | 1986-12-26 | 1989-07-10 | Takeda Chem Ind Ltd | Ｄｎａおよびその用途 |
| EP1700910A2 (en) | 2005-03-10 | 2006-09-13 | Ajinomoto Co., Inc. | Purine-derived substance-producing Bacillus and a method for producing purine-derived substance therewith |
| WO2007125783A1 (ja) | 2006-04-24 | 2007-11-08 | Ajinomoto Co., Inc. | プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法 |
| WO2007125782A1 (ja) | 2006-04-24 | 2007-11-08 | Ajinomoto Co., Inc. | プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法 |
| US8034767B2 (en) | 2006-12-22 | 2011-10-11 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing purine nucleosides and nucleotides by fermentation using a bacterium belonging to the genus Escherichia or Bacillus |
| US9012182B2 (en) | 2004-03-31 | 2015-04-21 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing purine nucleosides and nucleotides by fermentation using bacterium belonging to the genus Bacillus or Escherichia |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6427477A (en) * | 1987-04-01 | 1989-01-30 | Takeda Chemical Industries Ltd | Dna and use thereof |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU8300282A (en) * | 1981-04-29 | 1982-11-04 | Biogen N.V. | Bacillus cloning vectors and method of expressing foreign dna |
| JPS58175493A (ja) * | 1982-04-08 | 1983-10-14 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるグアノシンの製造法 |
-
1984
- 1984-01-27 JP JP59013968A patent/JPH0630583B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1984-11-14 ES ES537637A patent/ES8602134A1/es not_active Expired
- 1984-11-14 US US06/671,482 patent/US4749650A/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-11-28 DE DE8484308264T patent/DE3476422D1/de not_active Expired
- 1984-11-28 EP EP84308264A patent/EP0151341B1/en not_active Expired
- 1984-11-28 AT AT84308264T patent/ATE40405T1/de not_active IP Right Cessation
- 1984-12-08 KR KR1019840007786A patent/KR920001378B1/ko not_active IP Right Cessation
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01174385A (ja) * | 1986-12-26 | 1989-07-10 | Takeda Chem Ind Ltd | Ｄｎａおよびその用途 |
| US9012182B2 (en) | 2004-03-31 | 2015-04-21 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing purine nucleosides and nucleotides by fermentation using bacterium belonging to the genus Bacillus or Escherichia |
| EP1700910A2 (en) | 2005-03-10 | 2006-09-13 | Ajinomoto Co., Inc. | Purine-derived substance-producing Bacillus and a method for producing purine-derived substance therewith |
| US7326546B2 (en) | 2005-03-10 | 2008-02-05 | Ajinomoto Co., Inc. | Purine-derived substance-producing bacterium and a method for producing purine-derived substance |
| US8298791B2 (en) | 2005-03-10 | 2012-10-30 | Ajinomoto Co., Inc. | Purine-derived substance-producing bacterium and a method for producing purine-derived substance |
| WO2007125783A1 (ja) | 2006-04-24 | 2007-11-08 | Ajinomoto Co., Inc. | プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法 |
| WO2007125782A1 (ja) | 2006-04-24 | 2007-11-08 | Ajinomoto Co., Inc. | プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法 |
| US8409563B2 (en) | 2006-04-24 | 2013-04-02 | Ajinomoto Co., Inc. | Purine-derived substance-producing bacterium and a method for producing a purine-derived substance |
| US8034767B2 (en) | 2006-12-22 | 2011-10-11 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing purine nucleosides and nucleotides by fermentation using a bacterium belonging to the genus Escherichia or Bacillus |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES537637A0 (es) | 1985-11-16 |
| JPH0630583B2 (ja) | 1994-04-27 |
| ATE40405T1 (de) | 1989-02-15 |
| EP0151341B1 (en) | 1989-01-25 |
| US4749650A (en) | 1988-06-07 |
| KR850005496A (ko) | 1985-08-26 |
| ES8602134A1 (es) | 1985-11-16 |
| KR920001378B1 (ko) | 1992-02-11 |
| EP0151341A1 (en) | 1985-08-14 |
| DE3476422D1 (en) | 1989-03-02 |
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