SU933001A3 - Способ получени синтетической двунитчатой РНК, обладающей интерферониндуцирующей активностью - Google Patents

Description

39 ловемеской ДНК посредством каталитического дейтви  активной полиме . р.азы РНК дл  получени  РНК с последующим отжигом получающейс  РНК нагревом при 70-100 С и постепенным охдаждением до комнатной температуры или ниже дл  образовани  между ее молекулами двунитчатых зон. Естественную человеческую ДНК по лучают с помощью экстракции из тканей человеческого тела обычным известным способом, в частности экстракцией с фенолом, сфенолом, насыщенным водой, или с фенолом, насыщен ным буферным раствором. , Например, ДНК выдел етс  из че (ловеческой плаценты в соответствии ; со способом Пэриша. Замороженную при человеческую плаценту гомо генизируют в присутствии 60 р-аминосалицилата натри  и фенол-крезольной смеси дл  осуществлени  экстракции нуклеиновой кислоты и депротеини зиции. Депротеинизаци  всплывающей на поверхность жидкости, полученной после центрифугировани  с фенолкрезо льной смесью, проводитс  еще раз. Ну леинова  кислота выпадает в осадок после цинтрифугировани  из всплывающей на поверхность жидкости. Осадок раствор ют в слабом ионном растворе и добавл ют высококонцентрированный хлористый натрий дл  высаливани  РНК. После удалени  РНК с помощью центрифугировани  удал ют остаток РН и высокоагрегированную ДНК. Затем с помощью ультрацентрифуги удал ют гли коген. Полученную из всплывшей фракции ДНК осаждают и раствор ют в слабом ионном растворе. Этот раствор диализируют с дистиллированндй во ,дои, а диализат подвергают лиофилизации дл  получени  в качестве лиофи лизированного продукта естественной ДНК. Полученна  таким образом ДНК используетс  в качестве матрицы дл  по лимеразации рибонуклеоидных трифосфатов при каталитическом действии полимеразы РНК дл  синтезировани  РН РНК-полимераза означает обычно зависимую от ДИК полимеразу РНК и  вл етс  ферментом, катализирующим- реакцию синтеза РНЦ посредством полимеризации рибонуклеоидных трифосфатов через двойную эфирную св зь q ис пользованием ДНК в качестве матрицы. Этот фермент специфичен, т.е. в ка1 честве .матрицы действует лишь ДНК, экстрагированна  из того же источника , что и фермент. Однако используема  в качестве фермента активна  полимераза РНК обладает низкой специфичностью матрицы, так что дл  синтеза РНК возможно использование в качестве матрицы человеческой ДНК. Дл  выделени  и очистки активной полимеразы РНК, например, в случае, когда она получена из Micrococcus lysodeikticus используетс  оригинальный способ Накамото, модифицированный частью усовершенствованного способа Вейсса. Дл  этогр клетки собирают на последней -логарифмической фазе их роста, хран т до использовани  в замороженном состо нии,а при использовайии промывают и лиофилизируют . К этому экстракту добавл ют экстракт сульфата стрептомицина дл - концентрации комплекса нуклеиновых кислот и нуклеопоотеинов. а после элюировани  полимеразы РНК из этого комплекса посредством добавки фосфатного буферного раствора вновь добавл ют сульфат стрептимицина дл  выпадени  в осадок избирательно лишь нуклеиновой кислоты. Этот осадок удал ют центрифугированием , а мембранные компоненты и рибосомную фракцию удал ют на ультрацентрифуге . Затем добавл ют сульфат протамина дл  образовани  комплекса протамин-полимераза РНК, и полимераза РНК элюируетс  из этого комплекса с помощБЮ фосфатного буферного раствора. Элюированна  таким образом полимераза РНК реагирует с сульфатом протамина дл  создани  , еще одного комплекса, вновь элюируетс  из комплекса с фосфатным буферным раствором, а элюат подвергаетс  фракционированию с сульфатом аммиака . Фракцию, осажденную с насыщением 30-50, собирают и обрабатывают с катионитом дл  получени  очищенной полимеразы РНК. Активность полученной таким путем полимеразы РНКв диапазоне 50-10 000 ед/мг протеина . Затем осуществл ют синтез РНК с использованием полимеразы РНК и человеческой ДНК а качестве матрицы. Смесь реактантов дл  синтеза РНК содержит ед/мл полимеразы РНК, 100-1000 мкг/мл ДНК, 0,2-2 мМ АТР, GTP,CTP и VTP соответственно в качестве основы, мМ MnClg 0- мМ гипохлорида спермидина и 0,01-0,1 М три-НС (рН 7,0-8,0).Температура ре акции ZO-itO C, врем  реакции 1-10 ч Хорошие результаты получают при про должительности реакции ч. Завершаетс  реакци  охлаждением и дополнительными этапами обработки: де гидрированием полимеразы ДНК с помощью дезоксирибонуклеазы, удалени  протеинов с помощью обработки в феноле , очисткой с помощью диализа. Затем диализат концентрируют посредством ультрафильтрации,а концент рат центрифугируют в CsCl в cooтвeт ВИИ со способом Глизина дл  выделен РНК. Полученную таким путем РНК очи щают осаждением с этанолом, а полученный прс5дукт подвергают последующей реакции температурной обработки . Эта реакци , целью которой  вл е с  получение двунитчатой РНК, проводитс  в соответствии с методом Робинсона и др. Реакцию выполн ют таким образом, что РНК раствор етс  в двойной концентрированной SSC стандартном солевом цитрате, 0,15 М. NaCl, 0,015 М цитрата натри ) при величине рН 6,5-7,5,получившийс  pa вор нагревают до 70-100°С, затем температура постепенно понижаетс  до комнатной дл  окончани  реакции . В данном случае желательны нагрев раствора до 70-100 С на 3 10 мин, быстрое охлаждение до комнатной температуры, затем повторный на,грев до 70-10ОС, после чего раствор вновь постепенно остывает до комнатной температуры. На этом этапе желательно долгое врем  поддерживать температуру между высокой и комнатной. По завершении реакции РНК восстанавливаетс  с помощью осаждени  из этилового спирта или подобным образом, полученный осадок центрифигируют и промывают,, затем раствор ют в водном растворе хлористого натри  с малой концентрацией , подвергают диализу в воде при низкой температуре на прот жении 10-30 ч, при необходимости стериализуют фильтрацией, затем подвергают лиофилизации дл  получени  препарата. Полученный таким образом индуктор интерферона в виде двунитчатой РНК, синтезированной с естественной человеческой ДНК в качестве матрицы ,- белого цвета, без запаха, безвкусный, содержит по крайней не ре примерно % (нормально 10-15) двунитчатых частей в молекуле. Указанный индуктор интерферона в виде двунитчатой РНК обладает следущими физическими и химическими свойствами. Молекул рный вес. Седиментационный коэффициент определ ют по градиенту плотности сахарозы при центрифугировании ( е роторе при 38000 об/мин, 3,5 ч) с использованием в качестве стандарта рибосомной РНК L-клетки мыши. В образец входит 11-13 компонентов. Растворимость. Растворим в дистиллированной воде, в буферном растворе 0,01 М три-НС ( 7,5),.двойном концентрированном растворе SSG, в растворе SSC с концентрацией О,Т (рН 7,0) и т.д. Нерастворим в этаноле и ацетоне. Спектр ультрафиолетового поглощени . 0,02 мг/мл водного раствора.образца дают спектр ультрафиолетового поглощени , типичный дл  нуклеиновой кислоты. Максимум поглотительной способности приходитс  на 2бО нм, а минимум - на 230 нм. Цветова  реакци . Реакци  положи тельна при проверке орсинолом и отрицательна дл  дифениламина и индо- ла, соответствует характеристике цветовой реакции РНК. Реакци  осаждени . К 0,5 мг/мл водного раствора образца добавл ют раствор этанола двукратного объема и дают отсто тьс  в течение более чем одного часа при -20 С. В осадок выпадает почти 100% материала. Дабавление доловины об.ъема охлажденно-й 505;$-ной тел (трихлоруксусной кислоты ) к-0,1 мг/мл водного раствора образца переводит в -нерастворимую форму 80-90 РНК-ТСА, которую можно собрать с помощью фильтра (0,5 мкм). Дегидрирование рибонуклеазой. Образец раствор ют в двойном концентрированном растворе SSC (рН 7,0) и подвергают обработке вместе с бычьей рибонуклеазой поджелудочной железы (10 мкг/мл) и рибонуклеазой -Т(1 мкг/мл) в течение 30 мин при . В результате примерно 11-13 образца остаютс  непоглощенными. С другой стороны, образец раствор ют в растворе SSC (рН 7,0) с концеитрэ цией 0,3, нагревают , затем быстро охлаждают и обрабатывают вместе с упом нутой выше рибонуклеазой после перенесени раствора в раствор SSC двойной концентрации. В результате непоглощенными остаютс  2-3. Поглощение дезоксирибонуклеазой. Образец раствор ют в 0,01 М буферно го раствора три-НС (рН 7,) и обра батывают с дезоксирибонуклеазой (50 мкг/м ) при в течение 30 мин. Полученна  в результате пр порци  нерастворимой фракции ТСА та же, что и при указанной выше обрабо ке, причем увеличение поглотительной способности при 2бО им не заметно , ни до ни после обработки. Чувствительность к щелочному гид ролизу. Образец раствор ют в 0,3 М гидроокиси кали  и выдерживают при 37 в течение 18 ч. Образец гидролизуетс  полностью. Анализ продукта гидролиза с помощью тонкослойной хооматографии показывает лишь отдельные п тна адениловой кислоты , амидиновой кислоты, цитидиноаой кислоты Иуридиноврй кислоты. Состав, Анализ состава выполн ют с помощью тонкослойной хроматографии на продукте щелочного гидйолиза . В результате анализа установлено , что мол рное отношение каж дого нуклеотида находитс  в диапазо не 27,,О-30,5 адениловой кислоты, 20,6-24,7% амидиновой кислоты, Т6,8 2,3 цитидиновой кислоты, и 27,832 ,7 уридиновой кислоты. ,.Плотность на всплывание образца в « . Плотность на всплывание образца в . измер ют с помощью ультрацентрифуги (Spinco SW 50,1 ротор, 31500 об/мин 72 ч). Она равна 16351640 . . Термическа  денатураци  рибонукл азы - стойкость РНК. Образец раство р ют в растворе SSC (рН 7,0) концентрации 0,1, температуру плавлен /( определ ют в соответствии со способом К. Колби и Д, Г, Дьюсберга, Она оказал ась равной 71С, Спектральна  поглотительна  способность увеличиваетс  с повышением температуры. Образец раствор ют в р створе SSC (рН 7,0) с концентрацией 0,1, затем определ ют увеличение поглощени  при 2бО нм при повышении температуры. Наблюдаютс  возрастание примерно на 20% в диапазоне | температур 25-90 С. Чистота. Оценку чистоты образца выполн ют следующим образом. Количество протеина определ ют по методу Фолина-Лоуни, а количество ДНК - по SST-методу, модифицироiванному Мицуно и др. Загр знений протеина и ДНК не наблюдаетс . Наблюдени  под электронным микроскопом . Наблюдени  под электронным микроскопом показывают, что большинство молекул РНК  вл ютс  линейными , длина их 0,1-3 мкм. Двунитчата  РНК, обладающа  описанными выше физическими и химическими свойствами, может быть использована в качестве интерферона по той причине, что она индуцирует интерферон и обладает чрезвычайно малой токсичностью. При изготовлении различных медицинских препаратов-стабилизаторов, среди которых могут быть человеческий альбумин,, маннитол и. др. , агенты повышенной растворимости , глицин и такие вещества, как сорбитол - могут быть добавлены к раствору до проведени  лиофилизации, причем раствор уже.содержит активный материал. При использовании изготовленный таким образом медицинский препарат раствор ют (в физиологическом растворе, стериализованной воде, стерилизованном изотоническом растворе дл  инъекций t т.д.) и назначают пациентам в качестве индуктора интерферона посредством внутривенных, мышечных или подкожных инъекций. Эффективна  доза от 1 до 2 мг на килограмм веса тела в день, при необходимости доза может быть увеличена , Препарат эффективен в качестве лекарства даже в неочищенном виде, т.е. в смешанном состо нии с однонитчатой РНК, достаточно эффективны k% или более двунитчатой РНК. Биологические свойства препарата подробно описаны в примерах 1-7. Пример 1.Противовирусную активность определ ют измерением вирусной производительности в соответс1вии с частично модифицированным методом. Т.е. 0,0; 1,0; 10 и 50 мкг/мл образцов индуктора интерферона (препарат по насто щему изобретению и Poly 1:С в качестве контрол ), 50-мкг/мл декстрана ДЕАЕ (молекул рна  масса 50x10) и 3 мл минимальной среды фирмы Игл (далее упоминаемой как МЕМИгл) , дополненных 0,5% утробной тел чьей сыворотки, добавл ют к однослойным клеткам (2,5-3x10 клеток/колбу) в 50-мл колбы дл  выращивани  культур, затем выдерживают при 37°С в течение 20 ч. После ин инкубационного периода среду Игл MEM содержащую возбудитель интерферона, удал ют и клетки трижды промывают сол ным раствором Хенкса, затем добавл ют вирусы Vesicular stomatitis (V.S.V.) с кратностью инфекции от 2 до 3 бл шкообразующих единиц на клетку . Вирусы адсорбируют при в течение 1 ч. После адсорбции дл  удалени  свободных вирусов V.S.V. клетки промывают п ть раз и добавл ют 5 мл новой содержащей среды (среда MEM Игл, содержаща  1 утробной тел чьей сыворотки). После инкубационного периода, продолжающегос  20 ч при 3/ С, клетки охлаждают в холодильнике при . Охлаждение и оттаивание повтор ют дважды, затем клетки направл ют на центрифугу (2000 об/мин, на 10 мин). Титр вирусов во всплывшем веществе определ ют с помощью анализа культур клеток FL. Вирусы с клеток, обработанных средой MEM Игл без возбудител  интер ферона (с содержанием сыворотки или ДЕАЕ - декстрана), используют как контрольные. Использованные клетки относ тс  к двум разновидност м установленных . клеточных линий человеческих амниотических клеток FL и клеток почки кролика RK-13i а также человеческих зародышевых диплоидных клеток крайней плоти (HFS) и человеческих зародыше , вых почечных клеток НК. Гетероплоидные клетки клеток НК первоначально рассаживались примерно 130 раз. Эти клетки выращивают в среде MEM Игл,дополненной 10 утробной тел чьей сыворотки, 100 мкг/мл пенициллина G, 100 мкг/мл сульфата стрепто|мицина и 60 мкг/мл канамицина. По за вершении инкубации виоусов клетки культивируют в среде, в которой количество сыворотки уменьшено до 1. Клетки культивируют в инкубаторе с содержанием С0„( СО) . Используемое в качестве контрольного вещества Poly 1:С, расмотренное в фосфатном буферном растворе .pH /,0} с концентрацией 2,5 мг/мл, хранилось при -30 С, а при использовании разжижалось. Результаты приведены в табл. 1, откуда видно, что хот  между клеткрми-есть небольшое различие, противовирусна  активность препарата та же, что и у Poly 1:С. Таблица 1 - бл шкообразующа  единица, П р и м е р 2 . Активность индуцировани  интерферона провер ют добавкой предлагаемого препарата к культивированным клеткам. Этот тест проводитс  с использованием метода Вилцека , при этом 2 мл среды MEM Игл (без -сыворотки), содержащей 5- 50 мкг/мл возбудител  интерферона и 100 мкг/мл циклогемиксида, добавл ют к клеткам HFS, образовавшим онослой в пластиковой чашке Петри .диаметрсм 6 мм. Клетки выдерживают в термостате в течение 5 ч при 37 С. К среде добавл ют 0,5 мл актиномици-, на.с тем, чтобы окончательна  концентраци  стала равной 1 мкг/мл. За тем продолжают в течение 1 ч при 37 инкубацию. После полного завершени  инкубации клетки промывают сол ным раствором Хенкса п ть раз, затем добавл ют 5 мг MEM Игл с 0,5% сыворотки . После 20 ч инкубации при 37С сбреду собирают и центрифигиру ют (1000 об/мин) в течение 5 мин дл получени  псплывшего вещества, содержащего интерферон. Тест на интер ферон провод т с использованием кле ток PL. Тест на интерферон провод т по модифицированному методу Вилцека. М ,онослойные клеточные культуры в пл тиковой чашке Петри промывают и при вивают двум разведенным в два раза образцам интерферона в среде MEM Игл, содержащей утробную тел чью сы воротку, затем помещают в термостат на 20 ц при . После промывки клеточных слоев их подвергают действию примерно 100 на чашу виру сов y.S.V., а полученные пластинки подсмитыЁают после двух- или трехднейной инкубации. Титр интерферона выражают как величину, обратную чис лу разбавлени  образца, уменьшавшего число бл шек на 501 от контрол ного, на которое была нанесена сред НЕМ Игл вместо образца. Титр образц интерферона человеческих клеток опр дел ют одновременным определен ем стандартного человеческого лейкоцитарного интерферона дл  преобразова ни  в международные единицы (1 U). качестве контрольного используют Poly 1:С. Предлагаемый препарат про вл ет большую активность индуцировани  ин терферона по сравнению с Poly 1:С, П р и м е р 3. Действие интерфер на в живом организме.. Кроликам-самцам весом 2„0-2,5 кг . провод т внутривенную инъекцию 10100 мкг/кг препарата или Poly 1:С в качестве контрольного средства. Непосредственно до инъекции, а также после, 1, 2, k, 8, 11 и 2 ч после инъекции у кроликов берут кровь. Активность индуцировани  интерферона определ ют анализом содержани  интерферона в полученной сыворотка . Метод Т|1тровани  интерферона аналогичен упом нутому методу Вилцека и др. за тем исключением что вместо «клеток FL используют клетки RK-13 Предлагаемый препарат про вл ет активность индуцировани  интерферона в живом.организме, равную или превышающую активность Poly 1:С. Пример. Тест на токсичность . Изучаетс  эффект предлагаемого препарата и РоГу1:С в качестве контрольного средства на культивированных клетках.При этом в колбу 5 мл одновременно помещают j мл суспензии человеческих амниотических клеток FL (60 X Ю клеток на мл), а также 1 мл среды MEM Игл, содержащей 5,50 и 250 мкг/мл (растворенных окончательно в 5 раз) препарата. Клетки культивируют при в течение 6 дней.. После 2, и 6 дней культивации отбирают по две колбы из каждой группы , дл  удалени  плавающих клеток их промывают фосфатным буферным раствором . Оставшиес  клетки отдел ют от стекл нной поверхности с помощью 0,02 этилендиамин-тетрацетата (ЕДТА) и трипсина (0,25%) дл  подсчета их числа. Затем число жизнеспособных клеток подсчитывают с помощью окращивающего вещества эритроцина б и гемоцитомера . Контрольный препарат Poly 1:С до некоторой степени токсичен даже при концентрации 1 мкг/мл, при 10 мкг/мл токсичность существенно заметна, а при 50 мкг/мл размножение клеток не наблюдалось. В противоположность контрольному получаемый препарат не обнаруживает токсичности при концентрации 10 мкг/мл или меньше, размножение клеток подавл етс  лишь очень незначительно даже при концентрации 50 мкг/мл. . Из приведенных экспериментов видно, что полученный препарат  вл етс  средством возбуждени  интерферона, обладает противовирусной активностью , примерно равной или превышающей активность Poly 1:С, и в сравнении с ним  вл етс  менее токсичным. П р и м е р 5. Острую токсичность полученного препарата провер ют, использу  самцов мыши (UjBL, в соответствии с методом .Лидича и Вилкоксона. Результат показал, что от внутрибрюшного введени  препарата на уровне 50 мг/кг веса тела или при внутривенном вливании на уровне 25 мг/кг гибели мышей не было. Дл  мышей доза подкожном введении препарата - не менее 50 мг/кг, при внутривенном введении не меньше 25 мг/кг. Получение синтетической двунитча той РНК по сн етс  следующими примерами . П р и м е р 6. Выделение и очищение ДНК человеческой плаценты. Плаценту, замороженную непосредственно после родов и хранившуюс  при , измельчают на куски до 60 г, к ней добавл ют 15 объемов 6%-ного раствора аминосалицилата и 15 объемов смеси фенола с крезолом (состав: фенол 500 г, м-крезол 70 мл вода 55 мл и 8-гидроксилхинолин 0,5 Полученную смесь гомогенизируют при комнатной температуре в течение од - ной минуты в смесителе при максимал ных оборотах. Полученную таким образом суспензию размешивают при комнатной температуре в течение 20 мин затем центрифугируют в течение 30 ми при и 6000 X g дл  удалени  дена турированного протеина и фенола. К всплывшей жидкости добавл ют хлористый натрий с тем, чтобы его конечна  концентраци  стала равна 3 а также половину объема всплывшей смеси фенол-крезола. Смесь размешивают при комнатной температуре в течение 20 мин, затем центрифугиру ют в течение 10 мин при 5 С и 8000 X g. К - всплывшей жидкости добавл ют два объема охлажденной этиловой спиртово-крезольной смеси (объемное отношение 9:1) и осторожно смешивают дл  образовани ,осадка. После того , как волокнистый осадок намотают на стекл нный стержень, оставшуюс  жидкость отстаивают 1 ч при , затем оставшийс  осадок восстанавливают центрифугированием ,Общий осадок тщательно промывают в достаточном объеме 75 -ного этилового спирта с содержанием 2% ацетата .натри  и полностью раствор ют в .200 мл 0.1 М ацетата натри , содержащего 5 мМ фторида натри . К этому раствору добавл етс  хлористый натрий с конечной концентрацией 3 М. Этот раствор отстаивают в течение 15 ч при (-2) -(-5)с и центрифугируют 1C мин при и 12000 X g. К всплывшей жидкости добавл ют водный объем охлажденной этилцеллюЛОЗЫ и осторожно смешивают до получени  белого волокнистого осадка. После отстаивани  в вод ной бане при О с в течение 20 мин волокнистый осадок извлекают с помощью стекл нного стержн , диспергируют и раствор ют при комнатной температуре в 300 мл 3 М буферного раствора ацетата натри  (рН 6,0), содержащего 5 мМ фторида натри . Когда растворение почти полностью завершитс , раствор центрифугируют при 5 С в течение 10 мин при 2000 X g дл  удалени  остаточной PWK и сильно агрегированной ДНК в качестве осадка. К всплывшему веществу добавл ют равный объем охлажденной этилцеллюлозы , и смесь отстаивают в течение 20 мин в вод ной бане при . Полученный волокнистый осадок наматывают на стекл нный стержень, диспергируют и раствор ют при комнатной температуре в 200 мл 0,1 М буферного раствора ацетата натри  (рН 6,0), содержащего 5 мМ фторида натри . Koi- pa растворение завершитс  почти полностью , раствор центрифугируют в течение 90 мин при и 60000 X ig дл  удалени  гликогена как осадка. К всплывшему веществу добавл ют ацетат натри  с конечной концентрацией О , 3 М и смешивают с равным объемом охлажденной этилцеллюлозы. После отстаивани  в течение 20 мин в вод ной бане при волокнистый осадок собирают , с помощью стекл нной палочки и раствор ют в 16 мл 0,1 М буферного раствора ацетата натри  (рН 6,0), содержащего 5 мМ фторида натри . По завершении растворени  раствор передают в диализный трубопровод и диализуют в течение tS ч при с 200 мл дистиллированной воды, п тикратно ., смен   внешний раствор. Диализат центрифугируют дл  удалени  нерастворимых материалов и определ ют концентрацию ДНК посредством из мерени  коэффициента поглотительной способности при 2бО им разведенного всплывшего на поверхность вещества . Расчет концентрации ведут с учетом того, что коэффициент спектральной поглотительной способности при 260 нм 1 мг/мл ДНК равен 20. Растворы с содержанием 6,5 мг ДН помещают в пробирки 10 мл и подвергают лиофилизации. После проведени  указанных процедур получают в сумме iiO кг че юаемеской ДНК, Дл  оценки мистоть} препарата ДНК определ ют количество протеина по усовершенствованному методу Лоури, Количество РНК определ ют по методу Мицуно. Протеина было Q,k% в виде альбумина человеческой плаценты. РНК было Ц,8% от общего числа нуклеотидов. Очищение полимеразы РНК. На питательном бульоне выращивают Microcx)eCUS lysodeiktiois с использованием Jar Fermenter. По достижении последней логарифмической стадии роста их собирают и хран т -при . kOQ г замороженных клеток диспергируют в 2 л 0,0t М буферного раствора три-НС1 и центрифугируют, чтобы co6f рать промытые клетки, которые затем диспергируют в 0,01 М буферном растворе три-НС1 (рН 8,0), содержащем -0,2 М сахарозы, дл  получени  конечного объема 2 л. К этой суспензии добавл ют 600 мг белого лизоцима куриных  иц, и суспензию выдерживают в термостате при . После 15 мин инкубации добавл ют 6 мл 0,1 М MgClg и выдерживают в термостате еще 5 мин дл  разрушени  стен клеток. Затем добавл ют 18 мл 0,1 М MgCla. и мл воды, охлажденной до . Смесь энергично перемешивают. Все процедуры провод т в вод ной бане при 0°С. Через 10 мин добавл ют 600 мл 10%-ного сульфата стрептомици на, а еще через 10 мин полученный осадок центрифугируют в течение 10 мин при и 20000 X g. ПЬлученный осадок суспендируют в ВОО мл 0,01 М буферного раствора три-НС1 (рН 8,0), содержащего 0,2 М сахарозы , 0,1% сульфата стрептомицина и 0,00035 М MgCl . Через 10 мин раствор центрифугируют при в течение 10 мин при 20000 X gjc Осадок гомогенизируют в 720 мл {Раствора, приготовленного смешиванием В мл 1 М буферного раствора фосфата кали  (рН 7,5)jB мл 0,1 М MgCl2.и ВО мл 2 М сахарозы, разбавлением смеси дистиллированной водой до 720 мл с ис пользованием тефлонового гомогенизатора фирмы Поттер-Элвейхем. К этому гомогенату добавл ют 32. мл, М буферного раствора фосфата кали  (рН 7,5) а еще через дес ть минут -.70 мл 10 -ного сульфатастрептомицинИ.Посл 10 мин перемешивани  полученный дсадок отдел ют центрифугированием в течение 30 мин при 5 С и 30000 х g. а полученное в результате всплывшее вещество подвергают дальнейшему центрифугированию при в течение 2 ч при 105000 X g дл  удалени  компонентов мембраны и рибосомной фракции. К ВОО мл полученного при ультрацентрифугоровании всплывшего вещества добавл ют 110 мл 1 М буферного раствора фосфата кали  (рН7,5),а затем 160 мл 2,5%-ного ненейтрализованного сульфата протамина дл  выделени  полимеразы РНК в осадок как комплексно го соединени  с сульфатом протамина. После 10 мин перемешивани  осадок собирают с помощью центрифугировани  в течение 10 мин при 5 С и 20000 х g. Осадок гомогенизируют в IBO мл 0,2 И буферного раствора фосфата натри  (рН 7,5), содержащего 0,2 М сахарозы дл  элюировани  полимеразы РНК. После t0-минутного перемешивани  суспензию центрифугируют в течение. 10 мин при и 30000 х fi. К всплывшему веществу добавл ют ЗЬО мл 0,1%-ного сульфатного раствора ненейтрализованного протамина, и вновь полимераза РНК выпадает в осадок как комплексное соединение с сульфатом протамина. После 10 мин перемешивани  суспензию центрифугируют в течение 15 мин при и 20000 X g. Осадок гомогенизируют в 50 мл 0,1 М буферного раствора фосфата кали  (рН 7,5), содержащего 0,2 М сахарозы , и гомогенат подвергают центрифугированию в течение 10 мин при 5 С и 30000 X g. Собранный осадок гомогенизируют в 30 мл 0,2 М буферного раствора фосфата кали  (рН 7,5), содержащего 0,2 М сахарозы дл  элюировани  полимеразы РНК. После 10 мин :перемешивани  суспензию центрифугирует в течение 15 мин при и 30000 xg.K всплывшему веществу (30 мл ) добавл ют 7,27 г сультата аммиа1 а с тем, чтобы получить 0%-нoe насыщение дл  осуществлени  фракционировани  сульфата аммиака. Спуст  15 мин после добавлени  сульфата аммиака суспензию центрифугируют в течение 10 мин при 5°С и 30000 х g.Осадок раствор ют в 5 мл 0,02 М буферном .растворе три-НС1 (рН 7,5)f содержащем 0,3 М сульфата.аммиака , и добавл ют равный объем глицёролп. Раствор разбавл ют в 2,5 раза. 0,01 М буферным раствором триНС1 (рН 7,5) и пропускают сквозь СМ-целлюлозную колонку в стекл нном 17 фи ьтре, приготовленном с испольэов нием 2,k г СМ-целлюлозы дл  удалени  рибонуклеазы. Колонку промывают 0,01 М буферным раствором тр,и-НС1 (рН 7,5), содержащим 20% глицерол  и 0,06 М сульфата аммиака, и элюат пропускают сквозь колонку СМ-целлюл зы, приготовленной с использованием 0,8 г СМ-целлюлозы. Г1осле промывани  колонки к суммарным 80 мл элюата добавл ют 22,2 сульфата аммиака дл  осуществлени  осаждени  сульфата аммиака. Через 15 мин полученный осадок собирают центрифугированием в течение 15 ми при и 30000 X g, а полученное таким образом осажденное вещество раствор ют в J мл 0,02 М буферного раствора три-НС1 (Н 7,5), содержещего 0,3 М сульфата аммиака, а потом добавл ют равный объем глицерол  и до использовани  хран т при . Из «ОО г замороженных клеток оолучают 3 мг препарата полимеразы РНК с удельной активностью 190 ед-. на мг протеина (суммарна  активност 8200 ед) и отношением спектральной поглотительной способности при 280 : 260 нм 1,55. Одна единица ферментной активнос ти определ етс  как количество, кат лизирующее при введении 1 н моль 1А С - АТР нерастворимый ТСА матери ал в течение 10 мин инкубации. Каждый реактив раствор ют в 0,1 буферного раствора три-НС1 (рН 7,5) В табл. 2 приведены используемые при синтезе РНК реагенты, общее кол чество 500 мл. Таблица 10000 100 м 200 18 ,Пдр }олжение табл. 2 Ненейтрализованный тригидрохлорид спермидина 2 Три-НС, рН 7,5 Указанные выше реагенты тщательно смешивают и 1аыдерживают в термостате в течение 3 м при в вод -ной бане. Затем эту смесь охлаждают в вод ной бане при до окончани  реакции и нагревают в течение 5 мин при 65С дл  инактивации полимеразы РНК. Реакционную смесь охлажл дают примерно до проточной во-, дои, затем к ней добавл ют 5б мл О , 1 М MgCl 2. дл  доведени  раствора до 10 мМ, Затем добавл ют 5,6 мг дезоксирибонуклеазы (без рибонуклеазы ) и помещают в термостат на 30 мин при 37С дл  дегидрировани  ДНК. 8 течение 3 мин реакционную смесь нагревают при дл  инактивации дезоксирибонуклеазы, затем охлаждают проточной водой до комнатной температуры .. После этого к ней добавл ют 5бО мл двойной концентрированной SSC (рН 7,0} и 1120 мл фенол-крезольной смеси (состав: фенола 500 г, t- м-крезола 70 мл, воды 55 мл, 8-гидроксихинолина 0,5 г). В течение 5 мин реакционную смесь встр хивают , затем центрифугируют в течение 10 мин при и 5000 X g. Отделенное от фенольного сло  и сло  денатурированного протеина всплывшее вещество получает добавку половины объема упом нутой выше фенол-крезольной смеси, затем его встр хивают при комнатной температуре в течение 5 мин. Полученное посредством центрифугировани  всплывшее вещество вновь диализируют с 5 М раствора SSC с двойной концентрации (рН 7,0). содержащего 0,05% додецилсульфата натри  (упоминаемого далее как SDS),1ч при комнатной температу|эе и еще 1 ч после замены внешнего раствора. После этого внешний раствор замен ют 5 л 0,01 концентрации SSC (М 7,0) ) ализ продолжают всю ночь при 2-5 С.

Диализат (890 мл) подвергают ультрафильтрованию G использованием пустотелого волоконного мембранного фильт ра до сгущени  до 19.мл.

В 19 нл ультрафильтрованного концентрата раствор ют 19 г . Затем общий объем довод т до 26 мл до-ч бавкой 0,01 М буферного раствора триНС1 (рН 7,5), содержащего DjС1 в пропорции 1 г на 1 мл буферного раствора . Этот раствор (2б мл) нанос т на 7,8 мл 5,7 И CgCl (рН 6,5), содержащих 0,1 М ЕДТА, затем нанос т 1,3 м 0,1 М буферного раствора три-НС1 (рЛ 7,5) и все это центрифугируют. Центрифугирование провод т на роторе при 27000 об/мин (130000 х g) в течение 15 м при 15°С.

После центрифугировани  всплывшее вещество удал ют и РНК в виде светлых гранул раствор ют в 30 мл 0,1 М буферного раствора три-НС1 (рН 7,5). Полученный раствор охлаждают в ной бане при .и добавл ют к нему два объема охлажденного этилового .спирта, все это отстаивают 1 ч при -20 С. Затем полученный осадок соби рают с помощью иизкоскоростного центрифугировани . Всплывшее вещество . удал ют и осадок вновь растворйют в 0,01 М буферном растворе три-НС1 (рН 7,5)..

Выход очищенной РНК 8,6 мг в соответствии с расчетом из соотношени  А2бО 22, где А2бО - спектральна  поглотительна  способность при . 260 нм 1 мг/мл раствора РНК.

При добавлении 50 ТСА в осадок выпадает примерно 80% очищенной РНК как нерастворимой фракции ТСА. Седиментационный коэффициент очищенной РНК, который измер ют с помощью градиентного центрифугировани  сахарозной плотности с использованием в качестве стандарта -мьшиной Ь-клеточной рибосомной РНК, равен примерно 12 с.

Отжиг РНК. 3 мг очищенной РНК раствор ют в 4,8 мл 0,01 М буферного раствора три-Не1 (рН 7,5) и добавл ют к раствору 1,2 мл SSC 10-кратной концентрации (рН 7,0) с тем, чтобы концентраци  РНК в двухкратной концентрации SSC стала равной 500 мкг/мл. Полученный та- КИМ образом раствор помещают в стекл нную пробирку с заглушкой, нагревают 5 мин при 10(РС, быстро ожлаждают в вод ной бане при , затем помещают в вод ную баню при 85°С. Температуру вод ной бани постепенно понижают в течение 2 ч до , и рекци  происходит k ч при . Затем отключают нагреватель вод ной бани, и раствор отстаиваетс  ночь с постепенным охлаждением до комнатной температуры.

Седиментационный коэффициент отожженной РНК определ ют методом градиентного центрифугировани  сахарозной плотности. Наблюдаетс  пик при 12 с, причем полученный результат практически не отличаетс  от того, что был получен до отжига, однако наблюдаетс  небольшой новый пик в области примерно 28 с.

Устойчивость рибонуклеазы отожженной РНК (число РНК -гибрида РНК; количество двунитчатых частей) определ ют по методу Гемперта. 30 мкг отожженной РНК обрабатывают вместе с 20 мкг рибонуклеазы бычьей поджелудочной железы и 2 мкг рибонуклеазыjT в растворе SSC двойной концентрации (рН 7,0) в течение 30 мин при , в результате с помощью фильтрата (0,5 мкм) получают 13,3 нерастворимой фракции ТСА без следов дегидрировани ,

С другой стороны, 30 мкг образца, нагретые при в SSC с концентрацией 0,3 и быстро охлажденные в вод ной бане при О С, подвергают рибонуклеазной обработке в SSC двукратной концентрации, как упом нуто выше в результате получают недегидрированных 2,3 нерастворимой фракции ТСА.

Отожженна  РНК регенерирована с помощью осадка этанола по типовому методу. Осадок диализируют с дистиллированной водой, диализат стериализуют фильтрацией с разделением на пробирки и подвергают лиофи изации.. Полученные таким образом препараты  вл ютс  йндyktopaми интерферона и обладают его физическими, химическими и биологическими свойствами, j П р и М е р 7. Выделение и очищение ДНК человеческой плаценты.

Процесс осуществл ют по тому .же методу, что и в примере 6.

Claims (1)

1. Очищение полимеразы РНК Ercoli. Штамм Е. coll выращивают в питательном бульоне с использованием Jar Fermenter, собирают на последней стадиии логирифмической фазы роста и хран т при . 250 г этих клеток суспендируют в 750 мл буферного раствора Грайндинга (0,05 М буферного раствора три-НС, рН 7,9) содержащего 5 глицерол , 2 мМ ЕДТА 0,1 мМ дитиотреитола, 1 мМ 2-меркаптоэтанола , 0,233MNaCl, 130мкг/м белого лизоцима куриных  иц и 23 мкг/мл фторида фенилметансульфонила ) и отстаивают в .течение 20 мин при . Затем добавл ют 0,0125 объма 4 ДОС (дезоксихолат натри ) и смесь перемешивают 39 с. После отстаивани  в течение 20 мин вновь перемешивают 30 с. Затем 1000 мл ТСЕД + 0,2 М NaCl (ТСЕД 0 ,01 М буферного раствора три-НС1 (рН 7,9) , содержащего 5 глицерола, 0,1 мМ ЕДТА и 0,1 мМ дитиотреитола , ТСЕД + 0,2 М NaCl - ТСЕД с содержанием 0,2 М NaCl ) были добавле ны к раствору и энергично перемешивались в течение 5 мин. Суспензию центрифугируют kS мин при k С и 100.00 X g. К полученному всплывг шему веществу добавл ют 0,075 объема Polymin Р (рН 7,9).Спуст  5 мин полученный осадок собирают центрифугированием в течение 15 мин при С и 6000 X g. Осадок гомогенизируют в ТСЕД + 0,5 М NaCl (ТСЕД с содержанием 0,5 М NaGl), гомогенат перемешивают 10 мин при , а затем центрифугируют 30 мин при 4°С и 6000 X g. Полученный осадок гомогени зируют в ТСЕД + 1,0 М МаСГ (ТСЕД с содержанием 1,0 М NaCl) и перемешива ют при в течение 10 мин. Гомогенат центрифугируют 30 мин при Ц°С и бООО X g.K полученному в результате всплывшему веществу добавл ют сульфат аммиака в пропорции 35 г на 100 мл, все это перемешивают 30 мин при k С. Затем суспензию центрифугиг руют kS мин при и 10000 X g. По лученный осадок раствор ют в 700 мл ТСЕД. Этот раствор пропускают сквозь ко лонку с агарозой и ДНК тел чьей зобной железы (2,6 х 15 см), изготовленную в соответствии с методом Шал лара, дл  поглощени  полимеразы, РНК. Колонку промывают 500 мл ТСЕД+ + 0,15 М NaCl (ТСЕД с содержанием 0,15 М ), затем 500 мл ТСЕД-+ j+0,3 М NaCl (ТСЕД с содержанием 0,3 NaCl).После этого сквозь колонку пропускают 500 мл ТСЕД + Колонку пропускают 500 мл ТСЕД+ + 1,2 М NaCl дл  элюировани  полиме разы РНК. К элюату добавл ют суль- I фат аммиака с пропорции 35 г на 100 мл и перемешивают 30 мин при tfC. Образовавшуюс  супензию подвергают центрифугированию,в течение 30 мин при С и 10000 X g. В результате получен осадок- раствор 7 мл ТСЕД + 0,5 М NaCl + 30% глицерол  (ТСЕД + 0,5 М NaCl за тем отличием, что содержитс  301 глицерол  вместо 5°4). Раствор делитс  на 2-3 равные части , и каждую часть подвергают фильтрованию сквозь гель через колонку с Био Гель А 5 М (Полиакриламидгель), уравновешенную ТСЕД -t- 0,5 М I-IaCl. Элюирование производ т с ТСЕД + +0,5 NaCl, Из элюата извлекают фракции , обладающие активностью полимеразы , РНК, и используют дл  синтеза РНК. Удельна  активность полученной та- КИМ образом полимеразы РНК равна 320 ед/мг протеина при определении по методу Бургесса с использованием в качестве матрицы ДНК зобной железы теленка. Единицу активности фермента определ ют как количество, катализирующее введение 1 н объема k С-АТР в материал нерастворимой в течение 10 мин инкубации. Коэффициент спектральной поглотительной способности между 280 и 2бО нм оказалс  равным 1,86. Суммарна  активность полимеразы РНК, полученной из 250 г замороженных клеток, оказалась равной 30000 ед, а суммарное количество протеина - 96 мг. Синтез, выделение и очистка РНК. Реагенты, предназначенные дл  синте- за РНК, приведены в табл. 3; (всего 150 мл). Каждый реагент раствор лс  в 0,04 Н буферного раствора триНС1 (рН 7,9). т 1 - Т а б л и ц а 3. Полимераза 20 ед/мл 3000 ед НК челове еской пла 200 мкг/мл 23, Продолжение табл. 3 0.5 тоэтанол Т|зи-НС1, М рН 7,9 Указанные реагенты тщательно сме шивают и помещают на 3 м в термостат при 37С. Затем реакционную смесь охлаждают в вод ной бане при дл  окончани  реакции, нагреваю в течение 5 мин при дл  инакти вации полимеразы РНК и охлаждают пр точной водой при(ерно до 37°С, зате добавл ют 16,7 мл 0,1 М MgClj. , что бы довести раствор до 10 . После этого добавл ют 1,7 мг дезоксирибон леазы (без примеси рибонуклеазы) помещают в термостат на 30 мин при 37 С дл  дегидрировани , ДНК. Реакционную смесь нагревают до (100 С в течение 3 мин дл  инактивац дезоксирибонуклеазы, затем охлаждают пробочной водой до комнатной темпера туры. После этого добавл ют 170 мл S -двойной койцентрации (рН 7,0} и мл фенол-крезольной смеси (состав : фенола 500 г, м-крезола 70 мл воды 55 мл, гидроксихинолина 0,5 г) В течение 5 мин реакционную смесь встр хивают при комнатной температуре , затем центрифугируют 10 мин при и 5000 X g. К отделенному от фенольного сло  и сл|э  денатури рованного протеина всплывшему ве- ществу добавл ют половину объема фенол-крезольной смеси и встр хивают при комнатной температуре в течение 5 мин. / Эмульсию центрифугируют и всплыв шее вещество диалйзируют с 5 л . SSC двойной концентрации (рН 7,5), содержащей 0,05% Sre, в течение 1 ч при комнатной температуре, и диализи руют вновь в течение 1 ч после замены внешнего раствора. Затем, внешний раствор замен ют 5 л концентрации 0,01 (рН 7,0) и диализ 01 ведут еще в течение ночи при . Диализат {310 мл) подвергают ультрафильтрации с использованием волоконного мембранного фильтра до получени  19 мл концентрата, В 19 мл концентрата, полученного ультрафильтрации, -раствор ют I19 г . Затем общий объем довод т до 26 мл добавкой 0.01 М 6v(beDного раствора три-НС1 (рН 7,5), содержащего CgCl в пропорции 1 г на 1 мл буферного раствора. Раствор (26 мл) нанос т на 7,8 мл 5,7 М С$С1 (рН 6,5), содержащих 0,1 М ЕДТА, а затем туда нанос т еще 1,3 мл 0,1 М буферного раствора триНС1 (рН 7,5) и центрифугируют. Центрифугирование ведут в роторе в течение 15 ч при и .2700р об/мин (,130000 X g). После центрифугировани  удал ют всплывшее вещество и РНК в чистой грануле раствор ют в 3 мл 0,01 М буферного раствора три-НС1 (рН 7,5). , , .,. Полученный раствор охлаждают ft -- «-- -- д ной бане при ОС, добавл ют два объема охлажденного этилового спирта и дают отсто тьс  при в течение 1 ч. Полученный осадок собирают с помощью низкоскоростнрго центри «фугировани . Всплывшее вещество удал ют , и осадок вновь раствор ют в 0,01 М буферном растворе три-НС1 (рН 7,5). Выход очищенной РНК равен 9,0 мг. При добавлении 501 ТСА в осадок выпало примерно 90% очищенной РНК как нерастворимой фракции ТСА. Седиме«тационный коэффициент очищенной . . замеренный с помощью центрифугировани  дл  определени  градиента плотности сахарозы с кспольаованием рибосомной РНК L-клеток мыши в качестве стандаота равен поимеоно 11 с. Отжиг РНК. 3 мг очищенной РНК р створ ют в 12,0 мл 0,01 М буферного раствора три-НС1 (рН 7,5), добавл ют 3,0 мл SSC с 10-к0атной концентрацией fpH 7,0) т тем, чтобы концентраци  РНК в двукратной концентрации SSC стала равной 200 мкг/мл. Полученный раствор помещают в стекл нную пробирку с пробкой, прогревают 5 мин при . быстро охлаждают в вод ной бане, при , после чего помещают в вод ную баню при 85С. Темперауру вод ной бани постепенно понижают до втечение 2 ч, и при реакци  протекает еще А ч. За-::тем отключают нагреватель вод ной бани, и в течение ночи раствор отстаиваетс , постепенно охлажда сь . до комнатной температуры. Устойчивость рибонуклеазы отожжен ной РНК (количества гибридной РНК-РН число двунитчатой части) определ ют по методу Гемперта и др. 30 мкг отожженной РНК обрабатывают вместе с 20 мкг рибонуклеазы бычьей поджелудо ной железы и 2 мкг рибонуклеазы- 1 в 3SС двукратной концентрации (рН 7,0) при в течение 30 мин, полученна  в результате 12,0% нерастворима  фракци  ТСА бео дегидрировани  была собрана миллиНоровым фильтром (0, мкм) . С другой стороны, 30 мкг образца,нагретых в 33С 0,3 концентрации в течение 5 мин при и быстро охлажденных в вод ной бане, при , подвергнуты рибонукле азной обработке, как упом нутого выше, в результате собрано 3,3% нерастворимой фракций недегидрированной ТСА с помощью фильтра, Отожженна  РНК регенерирована с помощью осажде 1и  этанола в соответствии с типовой процедурой. Осадок диализируют с дистиллированной во дои, диализат стериализуют фильтрацией , раздел ют по ампулам и подвергают лиофилизации, В состав очищенной РНК вход т, % :аденилова  кислота 27,3, амидинова  кислота 21,5, цитидинова  кислота 18,5, уридинрва  кислота 32,7. Предлагаемый способ позвол ет повысить интерферониндуцирующую активность целевого продукта. Формула изобретени  Способ получени  синтетической двунитчатой РНК, обладающей интерферониндуцирующей активностью,путем использовани  человеческой ДНК в качестве матрицы дл  ферментативного синтеза, отлимайщийс   тем, что, с целью повышени  интерферониндуцирующей активности целевого продукта, аденозинтрифосфорную , уридинтрифосфорную, гуанидинт трифосфорную и цитидинтрифосфорную кислоты инкубируют с ДНК из человеческой плаценты в присутствии активной РНК- полимеразы Mictococcus lysodeiktiais или Eseherichia coli в течение 2- ч при t в триссол нокислом буферном растворе при рН 7,0-8,0, образовавшуюс  в результате реакции РНК отдел ют от белка обычным способом, отделенную от бел, ка РНК центрифугируют с использованием CgCl в качестве амортизатора, целевой продукт осаждают этанолом и выдерживают в термостате при t 70100 С, затем быстро охлаждают до комнатной температуры или ниже. Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе 1. Патент Японии ff 2008/75t кл, 113 Е 4, 1975.