FI69868B - Foerfarande foer enzymatisk framstaellning av ett dubbelstraengat rna anvaendbart som if-inducerare - Google Patents
Foerfarande foer enzymatisk framstaellning av ett dubbelstraengat rna anvaendbart som if-inducerare Download PDFInfo
- Publication number
- FI69868B FI69868B FI792346A FI792346A FI69868B FI 69868 B FI69868 B FI 69868B FI 792346 A FI792346 A FI 792346A FI 792346 A FI792346 A FI 792346A FI 69868 B FI69868 B FI 69868B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- rna
- minutes
- solution
- cells
- added
- Prior art date
Links
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 85
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 52
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 35
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 claims description 31
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 claims description 31
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 28
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 27
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 239000000411 inducer Substances 0.000 claims description 22
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 18
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 17
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 claims description 16
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 14
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 12
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 12
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 12
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 11
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 claims description 9
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 7
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 7
- UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N Coenzym Q(11) Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(O)=O)C(O)C1O UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229930183912 Cytidylic acid Natural products 0.000 claims description 5
- 241000191938 Micrococcus luteus Species 0.000 claims description 5
- DJJCXFVJDGTHFX-UHFFFAOYSA-N Uridinemonophosphate Natural products OC1C(O)C(COP(O)(O)=O)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DJJCXFVJDGTHFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- FOGRQMPFHUHIGU-UHFFFAOYSA-N Uridylic acid Natural products OC1C(OP(O)(O)=O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 FOGRQMPFHUHIGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 claims description 5
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims description 5
- 229950006790 adenosine phosphate Drugs 0.000 claims description 5
- IERHLVCPSMICTF-XVFCMESISA-N cytidine 5'-monophosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 IERHLVCPSMICTF-XVFCMESISA-N 0.000 claims description 5
- IERHLVCPSMICTF-UHFFFAOYSA-N cytidine monophosphate Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(COP(O)(O)=O)O1 IERHLVCPSMICTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N guanosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N 0.000 claims description 5
- 235000013928 guanylic acid Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000004226 guanylic acid Substances 0.000 claims description 5
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 claims description 5
- DJJCXFVJDGTHFX-XVFCMESISA-N uridine 5'-monophosphate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DJJCXFVJDGTHFX-XVFCMESISA-N 0.000 claims description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 4
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 4
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 69
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 54
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 38
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 38
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 26
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 20
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 20
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 20
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 12
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 11
- 108091036414 Polyinosinic:polycytidylic acid Proteins 0.000 description 10
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 10
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 10
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 10
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 10
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 9
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 9
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 9
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 8
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 8
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 8
- PUZPDOWCWNUUKD-UHFFFAOYSA-M sodium fluoride Chemical compound [F-].[Na+] PUZPDOWCWNUUKD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 7
- WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethoxybenzenecarbothioamide Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(N)=S WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LMWMTSCFTPQVCJ-UHFFFAOYSA-N 2-methylphenol;phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1.CC1=CC=CC=C1O LMWMTSCFTPQVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 6
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 6
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 6
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 6
- RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N m-cresol Chemical compound CC1=CC=CC(O)=C1 RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 6
- 229950008679 protamine sulfate Drugs 0.000 description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 6
- 229960002385 streptomycin sulfate Drugs 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 5
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 5
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 5
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- -1 ribonucleoside triphosphates Chemical class 0.000 description 4
- 239000011775 sodium fluoride Substances 0.000 description 4
- 235000013024 sodium fluoride Nutrition 0.000 description 4
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 4
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 4
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 4
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZNQVEEAIQZEUHB-UHFFFAOYSA-N 2-ethoxyethanol Chemical compound CCOCCO ZNQVEEAIQZEUHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000005725 8-Hydroxyquinoline Substances 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 3
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 3
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 3
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 239000002799 interferon inducing agent Substances 0.000 description 3
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 3
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 3
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 3
- 229960003540 oxyquinoline Drugs 0.000 description 3
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 3
- MCJGNVYPOGVAJF-UHFFFAOYSA-N quinolin-8-ol Chemical compound C1=CN=C2C(O)=CC=CC2=C1 MCJGNVYPOGVAJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 3
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- QTWJRLJHJPIABL-UHFFFAOYSA-N 2-methylphenol;3-methylphenol;4-methylphenol Chemical compound CC1=CC=C(O)C=C1.CC1=CC=CC(O)=C1.CC1=CC=CC=C1O QTWJRLJHJPIABL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FVVDKUPCWXUVNP-UHFFFAOYSA-M Aminosalicylate sodium anhydrous Chemical compound [Na+].NC1=CC=C(C([O-])=O)C(O)=C1 FVVDKUPCWXUVNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 2
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102100029683 Ribonuclease T2 Human genes 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N actinomycin D Natural products CC1OC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)NC4C(=O)NC(C(N5CCCC5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)C(C(C)C)C(=O)OC4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007059 acute toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000403 acute toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 229930003836 cresol Natural products 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- DMBHHRLKUKUOEG-UHFFFAOYSA-N diphenylamine Chemical compound C=1C=CC=CC=1NC1=CC=CC=C1 DMBHHRLKUKUOEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 2
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 2
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 2
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 2
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 108090000446 ribonuclease T(2) Proteins 0.000 description 2
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- WRROLJSGZKCWGR-UHFFFAOYSA-N 3-(4-aminobutylamino)propylazanium;chloride Chemical compound Cl.NCCCCNCCCN WRROLJSGZKCWGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- IUHIYZTXXICRQD-UHFFFAOYSA-N CCO.CC1=CC=CC=C1O Chemical compound CCO.CC1=CC=CC=C1O IUHIYZTXXICRQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010008909 Chronic Hepatitis Diseases 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 206010019755 Hepatitis chronic active Diseases 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-IMJSIDKUSA-N L-1,4-dithiothreitol Chemical compound SC[C@H](O)[C@@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- CQGRLHBOVUGVEA-UHFFFAOYSA-N OOOOOOOOOOOOOOO Chemical compound OOOOOOOOOOOOOOO CQGRLHBOVUGVEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108010046983 Ribonuclease T1 Proteins 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 1
- RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N actinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 238000005904 alkaline hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001668 ameliorated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 229960000640 dactinomycin Drugs 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 210000001840 diploid cell Anatomy 0.000 description 1
- RAGZEDHHTPQLAI-UHFFFAOYSA-L disodium;2',4',5',7'-tetraiodo-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-3',6'-diolate Chemical compound [Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(I)=C([O-])C(I)=C1OC1=C(I)C([O-])=C(I)C=C21 RAGZEDHHTPQLAI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N dodecyl hydrogen sulfate Chemical compound CCCCCCCCCCCCOS(O)(=O)=O MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940043264 dodecyl sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 210000003953 foreskin Anatomy 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000003677 hemocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940000351 hemocyte Drugs 0.000 description 1
- 231100000086 high toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 231100001231 less toxic Toxicity 0.000 description 1
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- LCNBIHVSOPXFMR-UHFFFAOYSA-N n'-(3-aminopropyl)butane-1,4-diamine;hydron;trichloride Chemical compound Cl.Cl.Cl.NCCCCNCCCN LCNBIHVSOPXFMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009965 odorless effect Effects 0.000 description 1
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000009967 tasteless effect Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12N9/1247—DNA-directed RNA polymerase (2.7.7.6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/30—Nucleotides
- C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/814—Enzyme separation or purification
- Y10S435/815—Enzyme separation or purification by sorption
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/814—Enzyme separation or purification
- Y10S435/816—Enzyme separation or purification by solubility
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/948—Microorganisms using viruses or cell lines
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
[«ST·i ΓΒ1 m,KUULUTUSJULKAlSU ^QO^O
1 UTLÄGGNINGSSKRIFT D^Ö°Ö ® (45) Patentti myönnetty (51) Kv.lk.*/int.Cl.* C 12 P 19/3^+ // A 61 K 45/02 SUOMI—’FINLAND (21) Patenttihakemus— Patentansökning 792346 (22) Hakemispäivä — Ansökningsdag 26.07 · 79 (23) Alkupäivä — Giltighetsdag 26.07-79 (41) Tullut julkiseksi — Blivit offentllg 29.01 .80
Patentti- ja rekisterihallitus Nähtäväksipanon ja kuul.julkaisun pvm. - 31.12.85
Patent- och registerstyrelsen Ansökan utlagd och utl.skriftcn publicerad (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus—Begärd prioritet 28.07-78 Japani-Japan(JP) 92212/78 (71) The Green Cross Corporation, 1-47» Chuo-1-chome, Joto-ku, Osaka,
Japan i-Japan(JP) (72) Hirofumi Arimura, Toyonaka-shi, Masanori Nagai , Kyoto,
Takeshi Yamauchi, Osaka, Tsutomu Kitakawa, Neyagawa-shi ,
Tadakazu Suyama, Kyoto, Japani-Japan(JP) (7^) Oy Kolster Ab (5*0 Menetelmä I F-i ndusoi jana käyttökelpoisen kaks i sä ike i sen RNA:n valmistamiseksi entsymaattisesti - Förfarande för enzymatisk framstä11 ning av ett dubbelsträngat RNA användbart som IF--i nducerare
Keksintö koskee menetelmää interferonia indusoivan kaksi-säikeisen RNA:n valmistamiseksi entsymaattisesti.
Interferoni (tästä lähtien käytetään nimitystä IF) on aine, jolla on virustenvastaista aktiivisuutta, ja on hyvin tunnettua, että eläinten solut tuottavat sitä erilaisten kiihokeaineiden, kuten virusten ja nukleiinihappojen vaikutuksesta Tsunatare Kishida: (Biology of Interferon, julkaisija Kinokuniya Shoten, 1971) .
Äskettäin on osoitettu, että IFrllä on kasvaintenvastaista aktiivisuutta osteogeenista sarkomaa vastaan, joka on pahanlaatuinen kasvain (International Workshop on Inteferon in the treatment of cancer, New York, 1975). On myös ehdotettu, että krooninen aktiivinen maksatulehdus, joka on vaikeasti käsiteltävä heptitis B, voidaan myös parantaa suurilla IF-annoksilla (The New England Journal of Medicine, 295, (10), 517-522).
2 6 9 8 6 8
Koska IF on, kuten edellä mainittiin, korkean biologisen aktiivisuuden omaava aine, on viime aikoina yritetty parantaa sen massatuotantomenetelmää esimerkiksi indusoimalla ja tuottamalla sitä ihmisten valkosoluista, ihmisen varhai sinmsol uista jne.
Toisaalta, koska IF:llä on lajispesifisyys isäntä-soluja vastaan, on ihmisten tautien käsittelyyn käytettävä IF tuotettava ihmisestä peräisin olevien solujen avulla. Ihmisen solujen käyttö teollisessa mittakaavassa on siten hidastanut tätä teknistä kehitystä.
Edellä olevasta menetelmästä poiketen, jossa tuotetaan ekso-geenista IF:ää in vitro, on viime aikoina kiinnitetty huomiota toiseen näkökohtaan, nimittäin IF-indusoijaan, joka indusoi ja lisää endogeenista IF:ää in vivo. Lääkkeenä käytettävän IF-indusoijän saamiseksi on valittavana erilaisia menetelmiä. Esimerkkejä tähän asti tunnetuista erilaisista IF-indusoijista ovat erilaiset virukset, nukleiinihapot, polysakkaridit, mikro-organismiuutteet ym.
Näistä ovat erittäin mielenkiintoisia korkean aktiivisuutensa vuoksi nukleiinihapot. Nukleiinihappojen IF-indusointikyky, joka on aikaisemmin osoitettu, on koottu taulukkoon 1.
Taulukko 1
Nukleiinihapon laji IF-indusointikyky 1
Isännän solujen suhteen homologiset nukleiinihapot -
Isännän solujen suhteen hetero- logiset nukleiinihapot +
Isännän solujen suhteen hetero-loginen DNA
Isännän solujen suhteen hete.ro- loginen RNÄ f
Isännän solujen suhteen heterolo- ginen yksisäikeinen RNA +
Isännän solujen suhteen hetero- loginen kaksisäikeinen RNA +++
Isännän solujen suhteen homologinen DNA
Isännän solujen suhteen homologinen yksisäikeinen RNA
- ei ole, - epävarma, + huomattava ja +-*-+ erittäin vahva 69868 3
Isaacs'in et ai. olettamuksen mukaan (Nature 197, 564 (1963), Lancet 11, 113 (1963)), on pidetty välttämättömänä, että nukleiinihappo, joka indusoi IF:ää, on heterologinen isäntäsolujen suhteen. Nukleiinihappojen käyttöön mahdollisina IF-indusoijina ei erityisemmin kiinnitetty huomiota ennen kuin havaittiin, että isännän solujen suhteen heterologisella kaksisäikeisellä RNA:lla oli vahva IF-indusointikyky. Viime aikoina on siten tehty yrityksiä tuottaa kaksisäikeistä RNA:ta faageilla tartutetuista sienistä, E. colista ja muista bakteereista. Suunnilleen samoihin aikoihin on synteettisellä kaksisäikeisellä RNA:lla, Poly I:C:llä havaittu olevan vahvaa IF-indusointikykyä, ja nykyisin varsinkin isäntä-solujen suhteen heterologisen kaksisäikeisen RNA:n tiedetään olevan muiden nukleiinihappojen ohella tehokas IF-indusoija. Isäntäsolujen suhteen heterologisella RNArlla tiedetään kuitenkin vahvan IF-in-dusointikyvyn ohella olevan heterologisuudesta johtuen sivuvaikutuksia, eikä sitä voida myrkyllisyyden vuoksi käyttää kliinisesti lääkkeeksi, joten sitä ei nykyisin käytännöllisesti katsoen käytetä lainkaan erilaisten tautien hoitoon.
Kuten edellä mainittiin, oli olemassa yleinen ajatus, että on olennaista, että nukleiinihappotyyppisen IF-indusoijän tulee olla isännän solujen suhteen heterologinen nukleiinihappo, ja näiden nukleiinihappojen joukosta yritettiin tuloksetta löytää sellainen, jonka myrkyllisyys olisi alhainen. Nukleiinihappotyyppisen IF-indusoijän IF-indusointiaktiivisuuden kasvuun liittyi aina myrkyllisyyden lisääntyminen.
Tästä syystä tämän keksijät muuttivat tutkimuksen suuntaa ja lähtivät jälleen tutkimaan isännän solujen suhteen homologisia nukleiinihappoja, jota tutkimusta oli pidetty turhana, koska näiltä puuttui täysin IF-indusointiaktiivisuus. Lähdettiin siten etsimään ja valitsemaan sellaisia korkean IF-indusointiaktiivisuuden omaavia nukleiinihappoja, joilla oli alhainen myrkyllisyys.
Edellä olevaan tarkoitukseen yritettiin valita isännän solujen suhteen homologinen IF-indusoija kemiallisesti modifioimalla ihmisen kudoksista uutettua RNA:ta (JP-patenttijulkaisu 2008/75). Näin saatu aine oli kuitenkin erittäin heikko IF-indusoija eikä siten tullut kysymykseen lääkkeenä käytettävänä IF-indusoijana, vaikka sen myrkyllisyys olikin alhainen.
4 69868
Edellä olevasta jatkaen keksijät suorittivat lisää seulon-tatyötä isännän solujen suhteen homologisten nukleiinihappojen kesken, jolloin ne sovelsivat ajatusta, että koska isännän solujen suhteen heterologisella kaksisäikeisellä RNA:11a oli toistaiseksi paras IF-indusointikyky ja samalla korkea myrkyllisyys, niin vastaavasti homologinen kaksisäikeinen RNA oli sopiva kokeiltavaksi. Näin ollen tehtiin yritys syntetisoida kaksisäikeinen RNA käyttämällä ihmisen DNA:ta templaattina. Tulokseksi saatiin odottamatta, että mainitulla aineella on niin alhainen myrkyllisyys ja hyvä IF-indusointiaktiivisuus, ettei sellaista ollut aikaisemmin havaittu, ja siten tämä aine sopii käytettäväksi lääkkeenä.
Keksintö koskee menetelmää IF-indusoijana käyttökelpoisen kaksisäikeisen RNA:n valmistamiseksi entsymaattisesti, jolloin kaksisäikeisen osan osuus molekyylissä on vähintään noin 4 1, molekyylipaino on pääasiassa 11-13 s ilmaistuna sedimentaatioker-toimena ja mitattuna sakkaroosi-Liheysgradienttison trifugoinnilla, emäskoostumus on 27,0-37,5 % adenyy1ihappoa, 20,6-24,7 % guanyyli-happoa, 16,8-24,3 % sytidyylihappoa ja 27,8-32,7 % uridyylihappoa, kellumistiheys Cs2SO^:ssä on 1,635-1,640 , terminen denaturointi (Tm) SSC:n (Standard Saline Citrate) 0,1-kertaisessa konsentraa-tiossa on 71°C, UV-absorptiospektri on oleellisesti kuviossa 2 kuvattu, terminen denaturointi on oleellisesti kuviossa 3 kuvattu ja absorbanssisuhde 25-90°C:ssa on oleellisesti kuviossa 4 kuvattu. Menetelmälle on tunnusomaista, että 1) ATP, GTP, CTP ja UTP saatetaan reagoimaan keskenään ihmisen istukasta peräisin olevan natiivin humaani-DNA:n ollessa läsnä templaattina, jolloin reaktio suoritetaan katalyyttisesti käyttäen organismin Micrococcus lysodeikticus tai Echerichia coli aktiivista RNA-polymeraasia 2-4 tuntia 20-40°C:ssa, tris-HCl-pus-kurissa, pH-arvossa 7,0-8,0 RNA:n muodostamiseksi, minkä jälkeen reaktio keskeytetään, 2) muodostettua RNA:ta käsitellään sen vapauttamiseksi proteiinista , 3) vaiheesta (2) saatu RNA väkevöidään 4) saatu RNA sentrifugoidaan CsCl-alustalla ja saostetaan etanollila, 5) vaiheesta (4) saatu sentrifugoitu RNA liuotetaan sopivaan suolaliuokseen pH-arvossa 6,5-7,5, 5 69868 6) vaiheesta (5) saatu RNA kuumennetaan 70-100°C:ssa, minkä jälkeen jäähdytetään nopeasti huoneenlämpötilaan tai sen alapuolelle, ja 7) vaiheesta (6) saatua RNA:ta lämpökäsitellään kuumentamalla 70-100°C:ssa, minkä jälkeen jäähdytetään asteittain huoneenlämpötilaan .
Tässä keksinnössä määritelty natiivi humaani-DNA saadaan ihmisen istukasta tunnetulla tavalla, erityisesti varsinkin uuttamalla fenolilla, vedellä kyllästetyllä fenolilla tai puskuriliuoksella kyllästetyllä fenolilla.
Sitä voidaan puhdistaa Parish'in et ai. (j.H. Parish ja K.S. Kirby: Biochem. Biophys. Acta, x29, 554 (1966)) ja Kirby'n et ai. (K.S. Kirby ja E.A. Cook, Biochem. J., 104, 254 (1967)) kuvaamalla menetelmällä. Menetelmässä jäädytetty ihmisen istukka homogenisoidaan -20°C:ssa 6-%:isen natrium-p-aminosalisylaatin ja fenolikresoliseoksen läsnäollessa nukleiinihapon uuttamiseksi ja proteiinien poistamiseksi. Fenoli-kresoliseoksen sentrifugoinnin jälkeen saatu supernatantti deproteinisoidaan vielä kerran. Nukleiinihappo saostetaan kerran sentrifugoimalla saadusta supernatant ista. Sakka liuotetaan alhaisen ionipitoisuuden omaavaan liuokseen, johon sitten RNA:n saostamiseksi lisätään korkeaan konsentraatioon asti natriumkloridia. RNA poistetaan sentrifu-goimalla, ja jäljelle jäänyt RNA ja vahvasti aggregoitunut DNA poistetaan. Glykogeeni poistetaan ultrasentrifugin avulla. Superna-tantista saostetaan DNA, joka sitten liuotetaan alhaisen ionipitoisuuden omaavaan liuokseen. Tämä liuos dialysoidaan tislattua vettä vastaan, ja dialysaatti lyofilisoidaan, jolloin saadaan lyofilisoitua natiivia DNA:ta.
Näin saatua natiivia DNA:ta käytetään templaattina poly-meroitaessa ribonukleosiditrifosfaatteja RNA-polymeraasin katalyyttisen vaikutuksen avulla RNA:n syntetisoimiseksi. RNA-polymeraasilla tarkoitetaan tavallisesti DNA-riippuvaista RNA-polymeraasia, ja se on entsyymi, joka katalysoi RNA-synteesiä ribonukleosiditri-fosfaattien polymeroituessa diesterisidosten välityksellä käyttäen DNA:ta templaattina. Tällä entsyymillä on tavallisesti templaatti-spesifisyys, ts. vain samasta lähteestä peräisin olevan DNA on 6 69868 entsyymin aktiivinen templaatti. Tässä keksinnössä käytetyn aktiivisen RNA-polymeraasin tulee kuitenkin olla alhaisen templaat-tispesifisyyden omaava entsyymi, so. sen tulee pystyä käyttämään humaani-DNA:ta mallina RNA-synteesissä. Ilmaisu "aktiivinen RNA-polymeraasi", jota käytetään sekä selityksessä että patenttivaatimuksissa, tarkoittaa edellä kuvattua entsyymiä. Tähän sopivia yleisesti saatavia entsyymejä ovat bakteerista Micrococcus lysodeikticus ja Escherichia coli saadut entsyymit.
Aktiivisen RNA-polymeraasin eristäminen ja puhdistaminen bakteerista Micrococcus lysodeikticus voidaan suorittaa esimerkiksi modifioimalla alkuperäistä Nakamoto 'n et ai. (J. Biol. Chem., 239, 167 (1964)) menetelmää liittämällä siihen osa Weiss'in (Methods Enzymol,, 12, 559 (1968)) parannetusta menetelmästä. Menetelmä suoritetaan seuraavasti: solut kootaan niiden kasvun myöhäisessä logaritmisessa vaiheessa ja säilytetään jäätyneinä ennen käyttöä, ne pestään ja lysoidaan lysotsyymillä käyttöön otettaessa. Tähän raakauutteeseen lisätään streptomysiinisulfaat-tia nukleoproteiinikompleksin konsentroimiseksi. RNA-polymeraasi eluoidaan kompleksista lisäämällä fosfaattipuskuria ja sitten lisätään jälleen streptomysiinisulfaattia pelkästään nukleiinihapon selektiiviseksi saostamiseksi. Tämä sakka erotetaan sentri-fugoimalla, ja solukalvo- ja ribosomifraktiot poistetaan käyttäen ultrasentrifugia. Lisätään protamiinisulfaattia, jolloin saadaan protamiini-RNA-polymeraasikompleksi, josta RNA-polymeraasi eluoidaan fosfaattipuskurilla. Näin saatu RNA-polymeraasi saatetaan jälleen reagoimaan protamiinisulfaatin kanssa kompleksin muodostamiseksi, josta se jälleen eluoidaan fosfaattipuskurilla, ja eluaatil-le suoritetaan ammoniumsulfaattifraktiointi. 30-50 %:isesti kyllästetyllä liuoksella saostunut fraktio otetaan talteen, ja sitä käsitellään kationinvaihtajalla puhtaan RNA-polymeraasin saamiseksi. Näin saadulla RNA-polymeraasilla on aktiivisuus 50-10 000 yksikköä/mg proteiinia (yksikön määritelmä: Methods Enzymol., 12, 559 (1968)).
Tämän jälkeen suoritetaan RNA-synteesi RNA-polymeraasin avulla käyttäen alkuperäistä humaani-DNA:ta templaattina. RNA-synteesin reaktioseos sisältää substraattina 4-40 yks./ml RNA-po-lymeraasia (yksiöt mainittu edellä), 100-1000 yug/ml DNA:ta, 7 69868 0,2-2 mmoolia/1 ATP:tä, GTP:tä, CTP:tä ja UTP:tä (kutakin niistä) ja 1,4 mmoolia/1 MnC^ia, 0-4 mmoolia/1 spermidiinihydrokloridia ja 0,01-0,1 moolia/1 tris-HCl-puskuria (pH 7,0-8,0). Reaktiolämpötila on 20-40°C ja reaktioaika 1-10 tuntia. Hyviä saantoja saadaan 2-4 tunnin reaktioajalla. Reaktio päätetään jäähdyttämällä jäillä ja lisäkäsittelyt, kuten DNA:n hajottaminen DNAasilla (deoksiri-bonukleaasi) , proteiinien poistaminen fenolikäsittelyllä, puhdistaminen dialyysillä jne. , suoritetaan Gumport'in et ai. (Biochemistry 8, 3168 (1969) esittämällä menetelmällä. Sitten dialysaatti konsentroidaan ultrasuodatuksella, ja konsentraatti sentrifugoidaan CsCl-alustalla Glinsin'in et ai. (Biochemistry 13, 2633 (1974)) menetelmällä RNA:n eristämiseksi. Näin eristetty RNA puhdistetaan edelleen saostamalla se etanolilla, ja puhdistetulle tuotteelle suoritetaan sitten lämpökäsittely.
Näin saadun RNA:n lämpökäsittely sen saamiseksi kaksisäikei-seksi suoritetaan Robinson'in et ai (J. Biol. Chem., 239, 2944 (1964)) esittämällä menetelmällä RNA liuotetaan SSC:n kaksinkertaiseen konenstraatioon (standardi-suola-sitraattiliuos, 0,15-mNaCl, 0,01-5-m natriumsitraatti), jonka pH on 6,5-7,5 ja saatua liuosta kuumennetaan 70-100°C:ssa, sitten lämpötila vähitellen alennetaan huoneenlämpötilaan reaktion päättämiseksi. Tässä tapauksessa on edullista kuumentaa 70-100°C:ssa 3-10 minuuttia ja sitten nopeasti jäähdyttää huoneenlämpötilaan, sitten jälleen kuumentaa samaan lämpötilaan ja jäähdyttää asteittain huoneenlämpötilaan. Lämpökäsittelyssä on myös edullista pitää liuosta jonkin aikaa korkean lämpötilan ja huoneenlämpötilan välisessä lämpötilassa. Reaktion päätyttyä RNA saadaan saostamalla etanolilla tms., sentrifugoimal-la ja pesemällä sakka, liuottamalla se uudelleen laimeaan natrium-kloridin vesiliuokseen ja dialysoimalla vettä vastaan alhaisessa lämpötilassa 10-30 tunnin ajan ja tarvittaessa steriilisuodatta-malla ja sitten lyofilisoimalla.
Näin saatu natiivia humaani-DNA:ta templaattina käyttäen syntetisoitu kaksisäikeinen RNA interferoni-indusoija on väriltään valkeata, se on mautonta ja hajutonta ja sen molekyylissä on vähintään 4 %, normaalisti 10-15 % kaksisäikeisiä osia, ja sillä on seuraavassa esitetyt fysikaaliset ja kemialliset ominaisuudet. Näytteet saatiin toistamalla esimerkin 1 menetelmä.
8 69868
Kaksisäikeistä RNArta sisältävän interferoni-indusoijän fysikaaliset ja kemialliset ominaisuudet ilmenevät liitteenä olevista piirroksista.
Kuviossa 1 on esitetty näytteen sedimentaatiomalli sak- karoositiheysgradienttisentrifugoinnissa. Radioaktiivisuus (dpm) mitattiin esimerkin 1 kohdassa (3) saadusta näytteestä, 14 jossa normaalin ATP:n sijasta käytettiin (8-- C)ATPitä (5 juCi/ml) .
Kuviossa 2 on näytteen ultravioletti-absorptiospektri.
Kuviossa 3 on esitetty RNAasi-resistentin RNA:n lämpö-denaturointikäyrä. Lämpödenaturointi mitattiin samanlaisella radioaktiivisella näytteellä kuin edellä, jota näytettä kuumennettiin erilaisiin lämpötiloihin ja käsiteltiin RNAasilla.
Kuviossa 4 on esitetty absorbanssisuhteet aaltopituudella 260 nm,so. eri lämpötiloissa mitattujen absorbanssien suhde 25°C:ssa mitattuun.
(1) Molekyylipaino
Sedimentaatiokerroin määritettiin sakkaroositiheysgra-dienttisentrifugoinnilla (5-20 % Spinco SW 50, 1 rotor, 38 000 r/min, 3,5 tuntia) käyttäen standardina hiiren L-solu ribosomi-RNA:ta.
Näyte koostui pääasiassa ll-13s komponenteista (kuvio 1).
(2) Liukoisuus
Liukenee tislattuun veteen, 0,01-m tris-HCl-puskuriin (pH 7,5), SSC:n (loc. cit.) kaksinkertaiseen konsentraatioon, SSC:n 0,1-kertaiseen konsentraatioon (pH 7,0). Liukenematon etanoliin ja asetoniin.
(3) Ultravioletti-absorptiospektri Näytteen vesiliuoksella (0,02 mg/ml) oli tyypillinen nukleiinihappojen ultravioletti-absorptiospektri (kuvio 2). Maksi-mi-absorbanssi oli 260 nm:ssä ja minimi 230 nm:ssä.
(4) Värireaktiot
Se oli positiivinen orsinolikokeessa, negatiivinen di-fenyyliamiinikokeessa ja indolikokeessa, ja sen värireaktiot olivat tunnusomaisia RNArlle.
(5) Saostusreaktiot Näytteen vesiliuokseen (0,5 mg/ml lisättiin kaksinkertainen tilavuusmäärä etanolia ja seoksen annettiin seistä yli tunnin ajan -20°C:ssa. Saatiin lähes 100 %:n saostuminen. Kun näyt- 9 69868 teen vesiliuokseen (0,1 mg/ml) lisättiin puoli tilavuutta kylmää 50-%:ista TCA:ta (trikloorietikkahappo), saatiin 80-90 % RNA:sta sakkana, joka voitiin suodattaa Millipore-suodattimella. (0,45 yum) .
(6) Hajoaminen ribonukleaasin vaikutuksesta Näyte liuotettiin SSC:n kaksinkertaiseen konsentraatioon (pH 7.0) ja käsiteltiin härän haimaribonukleaasilla (10 ,ug/ml) ja ribonukleaasi-T^:llä (1 /am/ml) 37°C:ssa 30 minuuttia. Noin 11-13 % näytteestä jäi hajoamatta. Toinen näyte liuotettiin SSC:n 0,3-kertaiseen konsentraatioon (pH 7,0) kuumennettiin ja jäähdytettiin nopeasti ja käsiteltiin ribonukleaasilla samoin kuin edellä SSC:n kaksinkertaisessa konsentraatiossa. Tällöin jäi 2-3 % hajoamatta.
(7) Hajoaminen deoksiribonukleaasin vaikutuksesta Näyte liuotettiin 0,01-m tris-HCl-puskuriin (pH 7,4), ja liuosta käsiteltiin deoksiribonukleaasilla (50 yug/ml) 37°C:ssa 30 minuuttia, jolloin tulokseksi saatiin, että TCA-liukenematto-man fraktion osuus oli sama kuin ennen käsittelyä ja ettei absor-banssissa 260 nm;ssä ollut mitään eroa ennen käsittelyä ja sen jälkeen.
(8) Herkkyys alkalisen hydrolyysin suhteen Näyte liuotettiin 0,3-n kaliumhydroksidiliuokseen, ja liuosta kuumennettin 37°C:ssa 18 tuntia. Näyte hydrolysoitui täydellisesti. Hydrolysaatin ohutkerroskromatografia-analyysi osoitti sen sisältävän ainoastaan adenyylihappoa, guanyylihappoa, sytidyylihappoa ja uridyylihappoa (9) Emäskoostumus
Emäskoostumuksen analyysi suoritettiin ohutkerroskromatograf isesti kohdassa (8) saadusta aikaiihydrolysaatista. Analyysi osoitti nukleotidien moolisuhteiden olevan seuraavat: 27,0-30,5 % adenyylihappoa, 20,6-24,7 guanyylihappoa, 16,8-24,3 % sytidyylihappoa ja 27,8-32,7 % uridyylihappoa.
(10) Kellumistiheys Cs2S04:ssä Näytteen kellumistiheys Cs2S04: llä mitattiin ultrasentri-fugissa (Spinco SW 50, 1 rotor, 31 500 r/min, 72 tuntia) ja se oli 1,635-1,640.
10 69868 (11) Tm (RNAasi-resistentin RNA:n lämpödenaturointi) Näyte liuotettiin SSC:n 0,1-kertaiseen konsentraatioon (pH 7,0) ja Tm (sulamislämpötila) määritettiin C. Colby'n ja D.H. Duesberg'in (Nature, 222, 940 (1969)) menetelmällä. Tm oli 71°C (kuvio 3).
(12) Absorbanssin lisääntyminen lämpötilan noustessa Näyte liuotettiin SSC:n 0,1-kertaiseen konsentraatioon (pH 7,0) ja absorbanssin (260 nm) kasvu lämpötilan nousun funktiona määritettiin. Lämpötila-alueella 25-90°C havaittiin noin 20 %:n kasvu (kuvio 4).
(13) Puhtaus Näytteen puhtaus määritettiin seuraavasti:
Proteiinimäärä määritettiin Folin-Lowry-menetelmällä ja DNA määritettiin Mizuno'n et ai. modifioimalla SST-menetelmällä ("General Method of Separation and Quantitative Analysis of Nucleic Acid", s. 23, toimittaneet Uzitane et al., julkaisija Tokyo University Publication (1969)). Tulokseksi saatiin, ettei epäpuhtautena ollut proteiinia eikä DNA:ta.
(14) Elektronimikroskooppihavainnot
Elektronimikroskooppitutkimus suoritettiin Kleinschmidt'in et ai. (J. Molec. Biol. 10, 282 (1964)) menetelmällä, ja se osoitti useimpien RNA-molekyylien olevan lineaarisia ja pituudeltaan noin 0,1-3 /a .
Keksinnön mukaisesti saatua kaksisäikeistä RNA:ta, jolla on edellä kuvatut fysikaaliset ja kemialliset ominaisuudet, voidaan käyttää IF-indusoijana, koska sillä on IF-indusointikyky ja lisäksi erittäin alhainen myrkyllisyys, kuten jäljempänä olevista kokeellisen osan esimerkeistä ilmenee.
Valmistettaessa lääkepreparaatteja voidaan aktiivista ainetta sisältävään liuokseen ennen edellä kuvattua lyofilisoin-tia lisätä erilaisia stabilointiaineita, kuten ihmisalbumiinia, mannitolia jen., liukenemista edistäviä aineita, kuten glysiiniä, ja täyteaineita, kuten sorbitolia tms. Näin valmistettu lääke-preparaatti liuotetaan ennen käyttöä suolaliuokseen, steriloituun veteen, steriloituun isotoniseen injektioimiseen sopivaan liuokseen tms., ja annetaan potilaalle IF-indusoijana injektiona suonensisäisesti, lihaksensisäiesti tai ihonalaisesti.
11 69868
Tehokkaana annoksena pidetään annosta 1 /ig-2 mg kehon paino-kg:a kohti vrkrssa, mutta annosta voidaan haluttaessa lisätä .
Keksinnön mukaisesti saatu tuote on tehokas lääke myös raakatilassa, so. seoksena yksisäikeisen RNA:n kanssa, ja jo 4 % kaksisäikeistä RNA:ta tekee sen riittävän tehokkaaksi.
Keksinnön mukaisen valmisteen biologisia ominaisuuksia kuvataan yksityiskohtaisesti koe-esimerkeissä.
Koe-esimerkki 1
Viruksenvastainen aktiivisuus in vitro
Viruksenvastainen aktiivisuus määritettiin mittaamalla virussaanto Billiau'n et ai. (Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 132, 790 (1969)) menetelmästä osaksi muunnetulla menetelmällä. 50 ml:n £ viljelypullossa olevaan solujen yksikerrokseen (2,5-3,0 x 10 solua/pullo) lisättiin 0, 0,1, 1, 10 ja 50 yug/ml indusoija-näyt-teitä (valmistettu keksinnön mukaisesti ja kontrollina Poly I:C), 4 50 /ug/ml DEAE-desktraania (molekyylipaino 50 x 10 , tuottaja: Pharmacia, Ruotsi) ja 3 ml Eagle'n minimi-olennaista-väliainetta (josta tästä lähtien käytetään nimitystä Eagle MEM), joka sisälsi lisänä 0,5 % vasikansikiöseerumia, ja pulloa sisältöineen inku-boitiin 37°C:ssa 20 tuntia. Inkuboinnin jälkeen Eagle EM, joka sisälsi indusoijaa, poistettiin, solut pestiin kolme kertaa Hanks'n suolaliuoksella, sitten niihin lisättiin Vesicular stomatitis-virusta (V.S.V.), jonka infektiokyky oli 2-3 plakkia muodostavaa yksikköä/solu (p.f,u)/solu. Virukset saivat adsorboitua 37°C:ssa tunnin ajan. Adsorbtion jälkeen solut pestiin vapaan V.S.Vin poistamiseksi kolme kertaa 5 ml ja ylläpitoväliainetta (Eagle MEM + 1 % vasikansikiöseerumia) lisättiin. Inkuboitiin 20 tuntia 37°C:ssa, solut koottiin -30°C:ssa, jäädytyssulatus toistettiin kaksi kertaa, sitten solut lingottiin (2000 r)min, 10 min). Päällä olevan nesteen V.S.V.-tiitteri määritettiin plak-kikokeella FL-soluviljelmillä. Kontrollina oli ilman indusoijaa olevalla Eagle MEM-väliaineella (joka sisälsi DEAE-dekstraania ja seerumia) käsiteltyjen solujen saanto.
Tässä käsitellyt solut olivat kahdenlaisia vakiintuneita solulinjoja ihmisen vesikalvo FL-soluista ja kaniinin munuais RK-13-soluista, sekä ihmisen sikiön esinahkadiploidisoluista 12 69868 (HFS-solut) ja ihmisen sikiö munuais-HK-soluista- HFS-solut saatiin firmasta Flow Laboratiories Inc. (Flow-7000 cell) ja niille suoritettiin 25-27 läpikulkua. HK-solujen heteroploidi-solut olivat alunperin keksijöiden viljelemiä ja niille suoritettiin 130 läpikulkua.
Näitä soluja kasvatettiin Eagle MEM-väliaineessa, jossa oli 10 % vasikkasikiÖseerumia, 100 yks./ml G-penisilliiniä, 100 ^ig/ml streptomysiinisulfaattia ja 60 ,ug/ml kanamysiiniä. Virukset ympättiin ja soluja viljeltiin ylläpitoväliaineessa, jonka seerumimäärä oli alennettu 1 %:iin. Soluja viljeltiin CC^inkubaattorissa (5 % CC^) ·
Kontrollina käytetty Poly I:C saatiin firmasta Miles Laboratories (U.S.A.). Se liuotettiin fosfaattipuskuriin (pH 7,0) 2,5 mg/ml ja säilytettiin -30°C:ssa. Ennen käyttöä se laimennettiin.
Tulokset on esitetty taulukossa 2, josta nähdään, että vaikka solujen välillä on vähäisiä eroja, niin keksinnön mukaisella valmisteella on lähes sama viruksenvastainen aktiivisuus kuin Poly I:C:llä.
69868 13
C_)C— vo CO CM CMC— C— LO -=T CO C— COPOOJCM
ooooooooooooooo
IrHrHrHrHrHrHrHrHrHrHrHrHrHrH
MXXXXXXXXXXXX***
>1 LO OO LO -=T LO LO LO LO CO CM rH Cfi H OOCM
rH ^ *-- ·“»«» ,v“ O r— ,—I e— i—i co ™
CU
' K _________________ «•“•s
r—I
e \ ' 3 m s i '3 t— .zr rocMt— f— lo -=r ro c^- cocm cm
OrHOOOOOOOOOOOOOOO
JJ (OrHi—IrHr-IrHrHr-li—liHr-HiHr—liHr-<rH
G 3 ,Ο-χχχχχχχχχχχχχχχ (ö m _
en RLOrHnrcocMLOiOrH-^LOrHLOLOCocM
ij jj CMfoc— -=r i i <—i ro 3 3 u g
•H
> .6 CM -Q :0
oi X
I I Ϊ | _1_______________ft 3 (Ö E"1 > —- (0 e -3 e tn \ o C3 T3
3- O
3
O S
•H (0
ti Ή rH rH -H
C c0 |.. Αί C3 fö oOrHOOOO»—iOOOOrHOO a: "O 3 r-H LO i—I LO rH LO (ö
H4J rH
0 3 &, en cp 3 en Ό 3 3 0 3 M Ai __I I 1 I__1111__1111 ή
Oj * 3
O 3 7? ro H
« j o a: oi m 3 ™ ^ S x 2 .i 2 S J 1 5 g W -H -H a: 14
Koe-esimerkki 2 69868 IF-indusointi in vitro IF-indusointiaktiivisuus kokeiltiin lisäämällä keksinnön mukaista valmistetta viljeltyihin soluihin. Koe suoritettiin Vilcek'in et ai. (PB-266, 670 (1976)) kuvaamalla superinduktiomene-telmällä. 2 ml Eagle MEM-väliainetta (ilman seerumia), joka sisälsi 5-50 pg/ml indusoijaa ja 100 pg/ml sykloheksaimidiä (Nakarai Chemicals Co.), lisättiin 6 cm läpimittaiseen muoviseen petrimaljaan muodostetulle HFS-solujen yksisolukerrokselle, ja soluja inkuboitiin 37°C:ssa 5 tuntia.
Sitten väliaineeseen lisättiin 0,5 ml aktinomysiini-D:tä (valmistaja: Becton Dickinson Co.), jolloin lopulliseksi konsentraa-tioksi tuli 1 pg/ml. Inkubointia jatkettiin 37°C:ssa tunnin ajan. Kaikkiaan 6 tunnin inkuboinnin jälkeen solut pestiin 5 kertaa Hanks'in suolaliuoksella, ja niihin lisättiin 5 ml Eagle MEM-väliainetta, jossa oli lisänä 0,5 % seerumia. 20 tunnin inkuboinnin jälkeen 37°C:ssa väliaine sentrifugoitiin (1000 r/min, 5 min)., ja päällä olevasta nesteestä, joka sisälsi IF:n, määritettiin IF-titteri käyttäen FL-soluja.
IF-titteri määritettiin modifioidulla Vilcek'in et ai.
(J. gen. Virol. 2, 648 (1969)) menetelmällä. 6 cm läpimittaisissa muovisissa petrimaljoissa olevat soluviljelmien yksisolukerrokset pestiin, ja niihin ympättiin Eagle-MEM-väliaineessa, joka sisälsi 0,5 % vasikansikiöseerumia, olevat IF-näytteet kaksinkertaisena sarjalaimennuksena, ja näytteitä inkuboitiin 37°C:ssa 20 tuntia. Solulevyjen pesun jälkeen niille vietiin noin 100 p.f.u./levy V.S.Vttä ja muodostuneet plakit laskettiin 2-3 vuorokauden inkuboinnin jälkeen. IF-tiitteri ilmaistiin kontrolloilla, jolle oli ympätty Eagle MEM-väliainetta näytteen sijasta, saadun plakkiluvun suhteen 50-%risesti vähentyneen plakkiluvun saaneen näytteen laimennusten luvun käänteisarvolla. Ihmissolujen IF-näytteen tiitteri määritettiin samanaikaisesti määrittämällä ihmisen leukosyyttistandar-din IF ja muuttamalla se kansainvälisiksi yksiköiksi (KY). Kontrollina käytettiin Poly I:C:tä.
Tulokset nähdään taulukossa 3. Keksinnön mukaisella valmisteella on parempi selvästi parempi IF-indusointiaktiivisuus kuin Poly I.C.:1lä.
15 , , vv , 69868
Taulukko 3
Indusoijan konsentraatio Tiitteri KY/ml
(pg/ml) Keksinnön Poly I : C
mukainen valmiste 0 <10 <10 5 200 50 50 350 80
Koe-esimerkki 3 IF-indusointi in vivo 2,0-2,5 kg painoiset urosrotat saivat suonensisäisesti 10 tai 100 μg/kg keksinnön mukaista valmistetta tai kontrolliksi Poly I:C:tä, ja niistä otettiin verinäyte juuri ennen injektiota ja 1, 2, 4, 8, 11 ja 24 tuntia injektion jälkeen.
Annettujen indusoijien IF-indusointiaktiivisuus määritettiin määrittämällä IF-pitoisuus seerumista. IF-titrausmenetelmä oli samankaltainen kuin edellä kuvattu Vilcek'in et ai. menetelmä, siinä käytettiin kuitenkin FL-solujen sijasta RK-13-soluja.
Tulokset nähdään taulukossa 4. Tuloksista ilmenee, että keksinnön mukaisella valmisteella on in vivo yhtä hyvä tai parempi IF-indusointiaktiivisuus kuin Poly I:C:llä.
16 69868
hO
h \ öOooooooo
3 CM LOO O O LOCO
c\j o o cn rH
o co cm o
rH
o --------- 0 >> > h u 0 cö
01 bO -H
^ λ; \ I to
(0 to O O O O O O O CD
H 3 CM CO O O O O vo ΛΙ
g H LO LO OJ rH
H O rH C
P ^ <U
φ ·ο <U o 10 >
P
rH Ό g----- β
. <U
to 'Γ> X 3
>i M
Jai 1¾ Ο \ Ό Λί K to lO o o o o o o 03 ,¾ Ή 3. CO O O O LO Ol d P CO LO ο ΓΟ f\) <0 rH Q) φ Ο CT\ LO 1-1 3 +J -P O 1-1 (Ö -P 10 H 'd
En :d H c p ε 13 · M >___|____3 C .
s - 3 « X to ^ d h ·£ S \ LO O o o cj o o 5 to OJ CO o LO Οι Ό -Γ
d 3 H OJ CO Ol H
:θ cm 5
Co 0 C h ,
•H \H
CO P
V CD
® 40
- SU---------H
H
4-1
Cm
H
<tS (Ö O H OJ 3- OO H 1 -T K
•H-P I—I OVi 0) to -P 0 c c d c Eh «3 69868
Keksinnön mukaisella indusoijalla tuotetun IF:n ominaisuudet tutkittiin isäntäsolulajien spesifisyyden, tartutusvirusten ei-spesifisyyden, trypsiinikäsittelyn herkkyyden, RNAasikäsittelyn ja pH 2-käsittelyn epäherkkyyden suhteen ja ultrasentrifugikäsit-telyllä (100 000 x g, 3 tuntia). Näin osoitettiin, että kyseessä oli todellakin IF.
Koe-esimerkki 4
Myrkyllisyyskoe
Keksinnön mukaisen valmisteen ja kontrollina Poly I:C:n vaikutus viljeltyjen solujen lisääntymiseen tutkittiin. 5 ml:n viljelypulloihin pantiin 4 ml ihmisen vesikalvo-FL-solususpensiota 4 (60 x 10 solua/4 ml) viljelyväliaineessa ja samalla kuhunkin pulloon lisättiin 1 ml Eagle MEM-väliainetta, joka sisälsi 5, 50 ja 250 pg/ml (nämä laimennettiin lopullisesti 5-kertaisesti) keksinnön mukaista valmistetta. Soluja viljeltiin paikallaan 37°C:ssa 6 vrk.
2, 4 ja 6 vrk:n viljelyn jälkeen otettiin kustakin ryhmästä 2 pulloa, solut pestiin fosfaattipuskurilla kelluvien solujen poistamiseksi .
Jäljelle jääneet solut irrotettiin lasipinnasta laskemista varten etyleenidiamiinitetraetikkahapon (EDTA) (0,02 %) ja trypsii-nin (0,25 %) avulla. Elävät solut laskettiin käyttäen erytrosiini B-värjäystä ja hemosyyttimittaria.
Taulukossa 5 olevista tuloksista nähdään, että Poly I:C on jossain määrin myrkyllistä vielä 1 yig/ml konsentraatiossa, huomattavan myrkyllistä 10 |ig/ml konsentraatiossa ja tasolla 50 ug/ml ei havaittu juuri lainkaan solujen lisääntymistä. Sensijaan keksinnön mukainen valmiste ei ollut lainkaan myrkyllistä konsentraatiossa 10 yg/ml ja sen alle, ja solujen lisääntyminen oli vain lievästi vähentynyt konsentraatiossa 50 pg/ml verrattuna kontrolliin.
Edellä esitetyistä kokeista ilmenee, että keksinnön mukainen IF-idusoija, jonka viruksenvastainen aktiivisuus on suunnilleen sama tai korkeampi kuin Poly I:C:llä, on siihen verrattuna vähemmän myrkyllinen.
18
Taulukko 5 6 9 8 6 8
Lisätyn indu- Viljely- Eevien solujen lukumäärä * soijan aika, x 10 solua/pullo) ______ konsentraatio , ‘TTT ! “ ’ ΓΊ vrk Keksinnön mukai- n , T „
nen valmiste Poly 1 : C
0 62 62 0 2 112 112 ,, 1 168 16 8 yg/ml _______ 6 273 273 0 62 62 χ 2 126 88 , , 4 18j 133 yg/ml __1_____ 6 2 86> 219 0 62 ' 62 1Q 2 109 5^ , η 4 17 li 71 6 279 114 0 62 62 ___i- en 2 99 37 , 4 154 45 yg/ml _'_____ 6 2 4'i7 83
Elävien solujen lukumäärä on kahdesta pullosta saadun tuloksen keskiarvo.
19 69868
Koe-esimerkki 5
Akuutti myrkyllisyys
Keksinnön mukaisen valmisteeen akuutti myrkyllisyys kokeiltiin Lichied'in ja Wilcoxon'in (Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 90, 99 (1949)) menetelmällä käyttäen C^^BL-uroshiiriä.
Tulokset osoittivat, ettei yksikään hiiri kuollut valmisteen intraperitoneaalisella annoksella 50 mg/kg tai intravenöösil-lä annoksella 25 mg/kg kehon painoa.
Subkutaanisti annettuna LD(.g oli hiirillä vähintään 50 mg/kg ja intravenöösisti vähintään 25 mg/kg.
Seuraavissa esimerkeissä kuvataan interferoni-indusoijan vamistusta. Keksinnön perusajatuksena on, että lämpökäsittelemäl-lä RNA-polymeraasin avulla, jonka templaattispesifisyys on alhainen alkuperäistä humaani-DNA:ta mallina käyttäen syntetisoidaan kaksisäikeistä RNA:ta. Esimerkeissä käytetyt %:t tarkoittavat liuotettujen aineiden paino/tilavuus (p/vol) tai tilavuus/ti-lavuus-%:eja (vol/vol) yksikköpainoina tai yksikkötilavuuksina liuoksen tilavuudesta.
Esimerkki 1 (1) Ihmisen istukka-DNA:n eristäminen ja puhdistus
Synnytyksen yhteydessä saatu istukka jäähdytettiin välittömästi ja säilytettiin -20°C:ssa. Ennen käyttöä se rikottiin 60 g:n palasiksi, joihin lisättiin 15 tilavuusosaa 6-%:ista nat-rium-p-aminosalisylaattia ja 15 tilavuusosaa fenoli-kresoliseosta (koostumus: fenolia 500 g, m-kresolia 70 ml, vettä 55 ml ja 8-hydroksikinoliinia 0,5 g) ja saatu seos homogenisoitiin huoneenlämpötilassa sekoittimella maksmikierrosluvulla minuutin ajan. Saatua suspensiota sekoitettiin huoneenlämpötilassa 20 minuuttia, sitten se sentrifuguoitiin (6000 x g) 5°C:ssa 30 minuuttia denaturoidun proteiinin ja fenolin poistamiseksi. Supernatanttiin lisättiin natriumkloridia, niin että sen loppukonsentraatioksi tuli 3 % (p/vol) ja jälleen puoli tilavuutta fenolikresoliseosta super-natantin määrästä. Seosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 20 mi-nuutia sitten se sentrifugoitiin (8000 x g) 5°C:ssa 10 minuuttia.
Supernatanttiin lisättiin kaksi tilavuutta jäähdytettyä etanoli-kresoli-seosta (tilavuussuhde 9:1) ja seosta sekoitettiin 20 6 9 8 6 8 hiljalleen, jolloin muodostui sakka. Säikeinen sakka koottiin lasisauvan avulla, ja jäljelle jäänyt neste sai seistä tunnin ajan 2°C:ssa, sitten loput sakasta poistettiin sentrifugoimalla. Yhdistetty sakka pestiin hyvin riittävällä määrällä 75-%:ista etanolia, joka sisälsi 2 % natriumasetaattia, sitten sakka liuotettiin täydellisesti 200 ml:aan 0,1-m natriumasetaattia, joka sisälsi 5 millimoolia/1 natriumfluoridia. Sitten liuokseen lisättiin natriumkloridia lopulliseen konsentraatioon 3-m. Liuos sai seistä -2 - -5°C:ssa 15 tuntia, sitten se sentrifugoitiin (12 000 x g) 5°C:ssa 10 minuuttia. Supernatanttiin lisättiin sekoittaen yhtä suuri tilavuusmäärä etyylisellosolvia, jolloin saatiin valkea säikeinen sakka. Seoksen annettiin seistä 20 minuuttia jäähauteessa, sitten säikeinen sakka erotettiin lasisau-valla,dispergoitiin ja liuotettiin huoneenlämpötilassa 300 ml:aan 3-m natriumasetaattipuskuria (pH 6,0), joka sisälsi 5 mmoolia/1 natriumfluoridia. Kun liukeneminen oli lähes täydellinen, liuos sentrifugoitiin (2000 x g) 5°C:ssa 10 minuuttia jäljelle jääneen RNA:n ja vahvasti aggregoituneen DNA:n poistamiseksi sakkana.
Supernatanttiin lisättiin yhtä suuri tilavuusmäärä kylmää etyylisellosolvia, ja seos sai seistä jäähauteessa 20 minuuttia. Säikeinen sakka koottiin lasisauvan avulla ja dispergoitiin ja liuotettiin huoneenlämpötilassa 200 mlraan 0,1-m natriumasetaattipuskuria (pH 6,0), joka sisälsi 5 mmoolia/1 natriumfluoridia. Kun liukeneminen oli lähes täydellinen, liuos sentrifugoitiin (60 000 x g) 5°C:ssa 90 minuuttia glykogeenin poistamiseksi sakkana.
Supernatanttiin lisättiin natriumasetaattia lopullisen konsentraation saamiseksi 0,3-molaariseksi, ja sitten siihen sekoitettiin yhtä suuri tilavuusmäärä jäähdytettyä etyylisellosolvia. 20 minuutin seisotuksen jälkeen jäähauteessa säikeinen sakka koottiin lasisauvan avulla ja liuotettiin 16 ml:aan 0,1-m natriumasetaattipuskuria (pH 6,0), joka sisälsi 5 mmoolia/1 natriumfluoridia.
Kun sakka oli liuennut, liuos siirrettiin dialyysiputkeen ja dialysoitiin 48 tuntia 2-5°C:ssa tislattua vettä (200 ml) vastaan, jolloin ulkopuolinen liuos vaihdettiin viisi kertaa. Dialy-saatti sentrifugoitiin liukenemattoman aineen poistamiseksi ja DNA-pi- 69868 toisuus määritettiin mittaamalla laimennetusta supernatantista absorbanssi 260 nmrssä
Pitoisuus laskettiin absorbanssista sen perusteella, että 1 mg/ml DNA:ta sisältävän liuoksen absorbanssi 260 nm:ssä on 20.
10 ml:n lasipulloihin pantiin kuhunkin 6,5 mg DNA:ta sisältävä liuos, joka lyofilisoitiin. Edellä kuvatulla menetelmällä saatiin kaikkiaan 40 mg ihmisen DNA:ta. Valmistetun DNA-tuotteen puhtauden määrittämiseksi sen sisältämä proteiini määritettiin Lowry'n et ai (J. Biol. Chem., 193, 265 (1951)) parannetun menetelmän mukaan, ja RNA-määrä määritettiin Mizuno’n (Shigeki Mizune: "General Method of Isolation Quantitative Analysis of Nucleic Acid", s. 23; toimittaneet Ujitani et ai., julkaisija Tokyo University Publication (1969)), menetelmällä, joka on Schmidt-Thannhauser-Schneider-mene-telmän "DNA.RNA Fractional Quantitative Analysis" parannettu menetelmä. Proteiinimäärä oli ihmisistukkaalbumiinina laskettuna 0,4 % ja RNA-määrä oli 4,8 % koko nukleotidista.
(2) RNA-polymeraasin puhdistaminen
Micrococcus lysodeikticusta viljeltiin fermenttorissa ravin-toliemessä ja otettiin talteen, kun sen kasvu oli myöhäisessä logaritmisessa vaiheessa; sitä säilytettiin jäädytettynä -20°C:ssa. 400 g jäädytettyjä soluja dispergoitiin 2 litraan 0,01-m tris-HCl-puskuria (pH 8,0), dispersio sentrifugoitiin ja pestyt solut koottiin.
Ne dispergoitiin 0,01-m tris-HCl-puskuriin (pH 8,0), joka sisälsi 0,2-m sakkaroosia, jolloin dispersion lopullinen tilavuus oli 2 1.
Tähän suspensioon lisättiin 600 mg kananmunavalkuaislysotsyymiä, ja suspensiota inkuboitiin 30°C:ssa. 15 minuutin inkuboinnin jälkeen siihen lisättiin 6 ml 0,l-MgC^-liuosta ja inkubointia jatkettiin 45 minuuttia soluseinämien hajottamiseksi. Sitten lisättiin 18 ml 0,1-m MgCl2~liuosta ja 2400 ml jäävettä. Seosta sekoitettiin voimakkaasti jäähauteessa. Kaikki seuraavat työvaiheet suoritettiin jää-hauteessa. 10 minuutin kuluttua lisättiin 600 ml 10-%:ista (p/vol) streptomysiinisulfaattia ja sitten jälleen 10 minuutin kuluttua saatu sakka sentrifugoitiin (20 000 x g) 5°C:ssa 10 minuuttia. Saatu sakka suspendoitiin 800 ml:aan 0,01-m tris-HCl-puskuria (pH 8,0), joka sisälsi 0,2-m sakkaroosia, 0,1 % streptomysiinisulfaattia ja 0,00025-m MgC^· 10 minuutin kuluttua suspensio sentrifugoitiin (20 000 g) 22 6 9 8 6 8 5°C:ssa 10 minuuttia. Sakka homogenisoitiin Potter-Elvejhem'in teflon homogeenisaattorissa 720 ml:ssa liuosta, joka oli valmistettu sekoittamalla 8 ml 1-m kaliumfosfaattipuskuria (pH 7,5), 8 ml Q/l-m MgCl^-liuosta ja 80 ml 2-m sakkaroosiliuosta ja laimentamalla seos tislatulla vedellä 720 mlrksi. Homogenisaattiin lisättiin 32 ml 1-m kaliumfosfaattipuskuria (pH 7,5) ja 10 minuuttia myöhemmin 70 ml 10-%:ista streptomysiinisulfaattiliuosta.
10 minuutin sekoittamisen jälkeen sakka erotettiin sentrifugoi-malla (30 000 x g) 5°C:ssa 30 minuuttia, ja supernatantti sentri-fugoitiin vielä (105 000 x g) 5°C:ssa 2 tuntia membraanikomponent-tien ja ribosomifraktion poistamiseksi.
Ultrasentrifugoinnilla saatuun supernatanttiin (800 ml) lisättiin 110 ml 1-m kaliumfosfaattipuskuria (pH 7,5) ja sitten 160 ml 2,5-%:ista neutraloimatonta protamiinisulfaattia RNA-poly-meraasin saostamiseksi protamiinisulfaattikompleksina. 10 minuutin sekoittamisen jälkeen sakka erotettiin sentrifugoimalla (20 000 x g) 5°C:ssa 10 minuuttia. Sakka homogenisoitiin 180 ml:ssa 0,2-m kaliumfosfaattipuskuria (pH 7,5), joka sisälsi 0,2-m sakkaroosia, RNA-polymeraasin eluoimiseksi. 10 minuutin sekoittamisen jälkeen suspensio sentrifugoitiin (30 000 x g) 5°C:ssa 10 minuuttia. Supernatanttiin lisättiin 3560 ml 0,l-%:ista neutraloimatonta protamiinisulfaattiliuosta, jolloin jälleen saatiin RNA saos-tettua kompleksina protamiinisulfaatin kanssa. 10 minuutin sekoittamisen jälkeen suspensio sentrifugoitiin (20 000 x g) 5°C:ssa 15 minuuttia. Sakka homogenisoitiin 50 ml:ssa 0,14-m kaliumfosfaattipuskuria (pH 7,5), joka sisälsi 0,5-m sakkaroosia, ja homogeni-saatti sentrifugoitiin (30 000 x g) 5°C:ssa 10 minuuttia. Saatu sakka homogenisoitiin 30 ml:ssa 0,2-m kaliumfosfaattipuskuria (pH 7,5), joka sisälsi 0,2-m sakkaroosia, RNA-polymeraasin eluoimiseksi. 10 minuutin sekoittamisen jälkeen suspensio sentrifugoitiin (30 000 x g) 5°C:ssa 15 minuuttia. Päällä olevaan nesteeseen (30 ml) lisättiin 7,27 g ammoniumsulfaattia, jolloin neste oli ammoniumsulfaatin suhteen 40-%:isesti kyllästettyä. 15 minuuttia ammoniumsulfaattilisäyksestä suspensio sentrifugoitiin (30 000 x g) 5°C:ssa 10 minuuttia. Sakka liuotettiin 5 ml:aan 0,02-m tris-HCl-puskuria (pH 7,5), joka sisälsi 0,3-m ammoniumsul-faattia, ja liuokseen lisättiin yhtä suuri tilavuusmäärä glyserolia. Liuos laimennettiin 2t5-kertaiseen tilavuuteen 0,01-m tris-HCl-pus-kurilla (pH 7,5) ja laskettiin ribonukleaasien poistamiseksi lasi- 23 69868 suotimella olevan CM-selluloosapylvään lävitse, joka oli valmistettu 2,4 g:sta CM-selluloosaa. Pylväs pestiin 0,01-m tris-HCl-puskurilla (pH 7,5), joka sisälsi 20 % glyserolia ja 0,06-m ammo-niumsulfaattia, ja eluaatti laskettiin CM-selluloosapylvään lävitse, joka oli valmistettu 0,8 g:sta CM-selluloosaa.
Pylvään pesun jälkeen yhdistettyyn eluaattiin lisättiin 22,2 g ammoniumsulfaattia. 15 minuutin kuluttua saatu sakka erotettiin sentrifugoimalla (30 000 x g) 5°C:ssa 15 minuuttia ja liuotettiin 4 ml:aan 0,02-m tris-HCl-puskuria (pH 7,5), joka sisälsi 0,3-m ammoniumsulfaattia, ja liuokseen lisättiin yhtä suuri tilavuusmäärä glyserolia. Säilytys ennen käyttöä tapahtui -70°C:ssa.
400 g:sta jäädytettyjä soluja saatiin 43 mg RNA-polymeraasi-valmistetta, jonka ominaisaktiivisuus oli 190 yksikköä/proteiini-mg (kokonaisaktiivisuus 8 200 yksikköä) ja jonka 280:260 nm absorbanssi-suhde oli 1,55.
Entsyymiaktiivisuuden yksikkö on määritelty siksi määräksi, 14 joka katalysoi 10 minuutin inkuboinnin aikana 1 moolin C-ATP:tä TCA-liukenemattomaksi aineeksi.
(3) RNA:n synteesi, eristäminen ja puhdistaminen RNA-synteesissä käytetyt reagenssit olivat samat kuin Weiss'in (Methods Enzymol., 12, 559 (1968)) käyttämät. Jokainen reagenssi liuotettiin 0,1-m tris-HCl-puskuriin (pH 7,5) seuraavan taulukon 6 mukaisesti.
Taulukko 6 RNA-synteesisysteemin reagenssit, kokonaismäärä 500 ml
Reagenssi Konsentraatio Kokonaismäärä
Puhdistettu RNA-polymeraasi 20 yks./ml 10 000 yks.
Ihmisen istukka-DNA 200 pg/ml 100 mg ATP 0,4-mmolaarinen 200 pmoolia CTP 0,4-mmolaarinen 200 μπιοοίϊη UTP 0,4-mmolaarinen 200 pmoolia GTP 0,4-mmolaarinen 200 ^moolia
MnCl^ 2,5-mmolaarinen 1250 pmoolia
Neutraloimaton spermidiini- trihydrokloridi 2-mmolaarinen 1000 yimoolia
Tris-HCl-puskuri (pH 7,5) 0,1-m 50 mmoolia 24 69868 Nämä reagenssit sekoitettiin hyvin ja seosta inkuboitiin 3 tuntia 30°C:ssa vesihauteessa. Sitten reaktioseos jäähdytettin jäähauteessa reaktion päättämiseksi ja kuumennettiin 5 minuuttia 65°C:ssa RNA-polymeraasin aktivoimiseksi. Reaktioseos jäähdytettiin noin 37°C:een vesijohtovedessä, sitten siihen lisättiin 56 ml 0,1-m MgC^-liuosta liuoksen saamiseksi 10-mmolaariseksi. Lisättiin vielä 5,6 mg DNAasia (joka ei sisältänyt ribonukleaasia), ja seosta inkuboitiin 37°C:ssa 30 minuuttia DNA:n hajottamiseksi.
Reaktioseosta kuumennettiin DNAasin inaktivoimiseksi 3 minuuttia 100°C:ssa, sitten seos jäähdytettiin huoneen lämpötilaan vesijohtovedessä. Siihen lisättiin 560 ml kaksinkertaisen väkevyyden omaavaa SSC:tä (pH 7,0) ja 1120 ml fenoli-kresoliseosta (koostumus: fenolia 500 g, m-kresolia 70 ml, vettä 55 ml, 8-hydroksikinoliinia 0,5 g(. Reaktioseosta ravistettiin huoneen lämpötilassa 5 minuuttia, sitten se sentrifugoitiin (5000 x g) 5°C:ssa 10 minuuttia. Superna-tantti erotettiin fenolikerroksen päältä ja denaturoituun proteiini-kerrokseen lisättiin jälleen puoli tilavuutta fenoli-kresoliseosta ia seosta ravisteltiin huoneen lämpötilassa 5 minuuttia.
Sentrifugoimalla saatu supernatantti dialysoitiin kaksinkertaisen konsentraation omaavaa SSC-liuosta (pH 7,0) (2 1) vastaan, joka sisälsi 0,05 % dodekyylisulfaattia (käytetään tästä lähtien nimitystä SDS) tunnin ajan huoneen lämpötilassa, ja sitten ulkopuolinen liuos vaihdettiin ja dialysoitiin jälleen tunnin ajan. Ulkopuolinen liuos korvattiin 5 litralla 0,01-kertaisen väkevyyden omaavaa SSC:tä (pH 7,0), ja dialyysiä jatkettiin yön yli 2-5°C:ssa. Dialysaatti (890 ml) ultrasuodatettiin käyttäen onttokuitumembraani-suodatinta, jolloin saatiin 19 ml konsentraattia.
19 ml:aan ultrasuodatettua konsentraattia lisättiin 19 g CsCl:ää, ja liuoksen tilavuus säädettiin 26 ml:ksi lisäämällä 0,01-m tris-HCl-puskuria (pH 7,5), joka sisälsi CsCl:ää 1 g/ml puskuriliuosta. Liuos (26 ml) kaadettiin 7,8 ml:aan 5,7-m CsCl-liuos-ta (pH 6,5), joka sisälsi 0,1-m EDTA:ta, ja sitten lisättiin 1,3 ml 0,1-m tris-HCl-puskuria (pH 7,5) ja sentrifugoitiin. Sentrifugointi suoritettiin 27 000 r/min (Spinco SW rotor, 130 000 x g) 15°C:ssa 15 tuntia.
Supernatantti poistettiin ja pohjalla oleva RNA liuotettiin 3 ml:aan 0,01-m tris-HCl-puskuria (pH 7,5). Saatu liuos jäähdy- 69868 tettiin jäähauteessa, siihen lisättiin kaksi tilavuusosaa jäähdytettyä etanolia ja sen annettiin seistä -20°C:ssa tunnin ajan.
Sitten saatu sakka koottiin alhaisella nopeudella sentrifugoimalla. Supernatantti poistettiin, ja sakka liuotettiin uudelleen 0,01-m tris-HCl-puskuriin (pH 7,5).
Puhdistettua RNA:ta saatiin 8,5 mg. RNA:n määrä laskettiin kaavasta A260 = 22 jossa A260 on 1 mg/ml RNA:ta sisältävän liuoksen absorbanssi 260 rarussä.
Kun lisättiin 50 % TCA:ta, niin noin 80 % puhdasta RNArta saostui TCA-liukenemattomana fraktiona. Puhdistetun RNA:n sedimen-taatiokerroin mitattuna sakkaroosi-tiheysgradienttisentrifugoimalla käyttäen standardina hiiren L-solu ribosomi-RNA:ta, oli noin 12 s.
(4) RNA:n lämpökäsittely 3 mg puhdistettua RNA:ta liuotettiin 4,8 ml:aan 0,01-m tris-HCl-puskuria (pH 7,5), ja liuokseen lisättiin 1,2 ml SSC:n 10-ker-taista konsentraatiota (pH 7,0), joten RNA:n konsentraatio 2-ker-taisessa SSC-konsentraatiossa tuli olemaan 500 ug/ml. Saatu liuos pantiin tulpalla varustettuun lasiseen koeputkeen, ja sitä kuumennettiin 100°C:ssa 5 minuuttia, se jäähdytettiin nopeasti jäähauteessa ja vietiin sitten 85°C:n vesihauteeseen. Vesihauteen lämpötilaa laskettiin vähitellen 65°C:een 2 tunnin aikana, ja reaktion annettiin jatkua 65°C:ssa 4 tuntia. Sitten vesihauteen kuumennus lopetettiin, ja näyte sai vähitellen jäähtyä yön yli huoneen lämpötilaan.
Lämpökäsitellyn RNA:n sedimentaatiokerroin määritettiin sakka-roosi-tiheysgradienttisentrifugimenetelmällä. Saatiin piikki 12 s:n kohdalla, joten tulos oli lähes sama kuin ennen lämpökäsittelyä. Kuitenkin voitiin havaita myös pieni piikki kohdassa yli 28 s.
Lämpökäsitellyn RNA:n ribonukleaasi-kestävyys (RNA-RNA-hybridin määrä; kaksisäikeisen RNA:n määrä) määritettiin Gumport'in et ai. menetelmällä. 30 pg lämpökäsiteltyä RNA:ta käsiteltiin 30 pg:lla härän haimaribonukleaasia ja 3 pg:lla ribonukleaasi-T^:tä 2-kertaisessa SSC-konsentraatiossa (pH 7,0) 37°C:ssa 30 minuuttia, jolloin milli-pore-suodattimella (0,45 ym) saatiin 13,3 % TCA-liukenematonta 26 6 9 8 6 8 fraktiota, joka ei ollut hajonnut. Toisaalta kun 30 jjg:lla näytettä, jota oli kuumennettu 0,3-kertaisessa SSC-konsentraatiossa 100°C:ssa 5 minuuttia, jäähdytetty jäähauteessa, suoritettiin ribonukleaasikäsittely 2-kertaisessa SSC-konsentraatiossa edellä kuvatulla tavalla, niin saatiin 2,3 % TCA-liukenematonta (hajoamatonta) fraktiota suodattimena.
Lämpökäsitelty RNA otettiin talteen etanolisaostuksella tavanomaisella menetelmällä (Parish & Kirby, Biochim. Biophys. Acta, 129, 554 (1966)). Sakka dialysoitiin tislattua vettä vastaan, dialysaat-ti steriloitiin suodattamalla, täytettiin pulloihin ja lyofilisoi-tiin. Saadulla IF-indusoijavalmisteella oli edellä koe-esimerkeissä 1-5 esitetyt fysikaaliset, kemialliset ja biologiset ominaisuudet.
Esimerkki 2 (1) Ihmisen istukka-DNA:n eristäminen ja puhdistus Käytettiin samaa puhdistusmenetelmää kuin esimerkissä 1.
(2) E. coli RNA-polymeraasin puhdistus E. coli K-12 kantaa viljeltiin ravintoliuoksessa fermenttorissa, solut otettiin talteen kasvun myöhäisessä logaritmisessa vaiheessa ja säilytettiin -20°C:ssa. 250 g soluja suspendoitiin 750 ml:aan Grinding-puskuria (0,05-m tris-HCl, pH 7,9, joka sisältää 5 % (vol/vol) glyserolia, 2 mmoolia/1 EDTA:ta, 0,1 mmoolia/1 ditio-treitolia, 1 mmoolia/1 2-merkaptoetanolia, 0,233 mooli/1 NaCl, 130 pg/ml kananmunanvalkuaislysotsyymiä ja 23 pg/ml fenyylimetaani-sulfonyylifluoridia), ja suspensio sai seistä 8°C:ssa 20 minuuttia. Sitten siihen lisättiin 0,0125 tilavuusosaa 4-%:ista DOC:ia (nat-riumdeoksikolaatti), ja seosta sekoitettiin 30 sekuntia. 20 minuutin seisotuksen jälkeen sitä sekoitettiin jälleen 30 sekuntia. Sitten seokseen lisättiin 1000 ml TGED + 0,2-m NaCl (TGED on 0,01-m tris-HCl-puskuri (pH 7,9), joka sisältää 5 % (vol/vol) glyserolia, 0,1 mmoolia/1 EDTA:ta ja 0,1 mmoolia/1 ditiotreitolia; TGED + 0,2-m NaCl tarkoittaa TGED:tä, joka sisältää 0,2 moolia/1 NaCl) ja sitä sekoitettiin 5 minuuttia voimakkaasti. Suspensio sentrifugoitiin (10 000 x g) 4°C:ssa 45 minuuttia. Supernatanttiin lisättiin 0,075 tilavuutta 5-%:ista Polymin P:tä (Fluka A.G., Sveitsi) (pH 7,9). 5 minuutin kuluttua sakka koottiin sentrifugoimalla (6000 x g) 4°C:ssa 15 minuuttia. Sakka homogenisoitiin TGED + 0,5-m NaCl:ssä 69868 (TGED, joka sisältää 0,5 moolia/1 NaCl) ja homogenisaattia sekoitettiin 4°C:ssa 10 minuuttia. Homogenisaatti sentrifugoitiin (6000 x g) 4°C:ssa 30 minuuttia. Sakka homogenisoitiin TGED + 1,0-m NaClrssä (TGED, joka sisältää 1,0 moolia/1 NaCl) ja sitä sekoitettiin 4°C:ssa 10 minuuttia. Homogenisaatti sentrifugoitiin (6000 x g) 4°C:ssa 30 minuuttia. Saatuun supernatanttiin lisättiin ammonium-sulfaattia 35 g/100 ml, ja seosta sekoitettiin 4°C:ssa 30 minuuttia. Sitten suspensio sentrifugoitiin (10 000 x g) 4°C:ssa 45 minuuttia.
Saatu sakka liuotettiin 700 mlraan TGED:tä.
Liuos laskettiin RNA-polymeraasin adsorboimiseksi vasikan-kateenkorva-DNA-agaroosi-pylvään (2,6 x 15 cm) lävitse, joka oli valmistettu Schallar'in et ai. (Eur. J. Biochem., 26, 474 (1971)) menetelmällä. Pylväs pestiin 500 ml :11a TGED : 0,15-m NaCl (TGED, joka sisältää 0,15 moolia/1 NaCl) ja sitten 500 ml:11a TGED + 0,3-m NaCl (TGED, joka sisältää 0,3 moolia/1 NaCl). Sitten 500 ml TGED + 1,2-m NaCl (TGED, joka sisältää 1,2 moolia/1 NaCl) johdettiin pylvään lävitse RNA-polymeraasin eluoimiseksi. Eluaattiin lisättiin ammoniumsulfaattia 35 g/100 ml, ja seosta sekoitettiin 4°C:ssa 30 minuuttia. Muodostunut suspensio sentrifugoitiin (10 000 x g) 4°C:ssa 30 minuuttia. Saatu sakka liuotettiin 7 ml:aan TGED + 0,5-m NaCl + 30 % glyserolia (TGED + 0,5-m NaCl, jossa oli 30 % glyserolia 5 %:n sijasta). Liuos jaettiin 2-3 yhtä suureksi osaksi ja geelisuodatet-tiin Bio Gel A 5 m pylväässä (polyakryyliamidigeeli, Biogel Co., U.S.A.) (2 x 110 cm) joka oli tasapainotettu TGED + 0,5-m NaCl:llä.
Eluointi suoritettiin TGED + 0,5-m NaCl:llä. RNA-polymeraasiaktii-visuutta omaavat eluaattifraktiot koottiin ja niitä käytettiin RNA-synteesiin.
Saadun RNA-polymeraasin ominaisaktiivisuus oli 320 yks./mg proteiinia. Se määritettiin Burgess'in (J. Biol. Chem., 244, 6160) menetelmällä käyttäen vasikan kateenkorva-DNA:ta mallina.
Entsyymiaktiviteettiyksikkö on määritelty määräksi, joka kata-14 lysoi 1 moolin C-ATP:tä TCA-liukenemattomaksi aineeksi 10 minuutissa .
280 nm:n ja 260 nm:n absorbanssisuhde (A280/A260) oli 1,86.
250 g:sta jäädytettyjä soluja saadun RNA-polymeraasin kokonaisaktii-visuus oli 30 000 yksikköä ja kokonaisproteiinimäärä oli 96 mg.
(3) RNA:n synteesi, eristäminen ja puhdistaminen RNA-synteesissä käytetyt reagenssit on esitetty taulukossa 7.
Kukin reagenssi liuotettiin 0,04-m tris-HCl-puskuriin (pH 7,9).
28 6 9 8 6 8
Taulukko 7 RNA-synteesin reagenssit, kokonaismäärä 150 ml Reagenssi Konsentraatio Kokonaismäärä RNA-polymeraasi 20 yks./ml 3000 yks.
Ihmisen istukka-DNA 200 pg/ml 30 mg ATP 0,6-mmolaarinen 90 pmoolia CTP 0,6-mmolaarinen 90 pmoolia GTP 0,6-mmolaarinen 90 pmoolia UTP 0,6-mmolaarinen 90 yimoolia KC1 50-mmolaarinen 7,5 mmoolia
MnC^ 1-mmolaarinen 150 pmoolia
MgCl2 4-mmolaarinen 600 pmoolia 2-merkaptoetanoli 0,5-mmolaarinen 75 pmoolia
Tris-HCl-puskuri, pH 7,9 0,04-m 6 mmoolia
Edellä luetellut reagenssit sekoitettiin hyvin, ja seosta inkuboitiin 37°C:ssa 3 tuntia. Sitten reaktioseos jäähdytettiin jäähauteessa reaktion päättämiseksi ja sitä kuumennettiin sitten 5 minuuttia 65°C:ssa RNA-polymeraasin inaktivoimiseksi.
Reaktioseos jäähdytettiin noin 37°C:een vesijohtovedellä, sitten siihen lisättiin 16,7 ml 0,1-m MgC^-liuosta, jolloin liuoksen pitoisuudeksi tuli 10 mmoolia/1. Lisättiin 1,7 mg deoksiribo-nukleaasia (joka ei sisältänyt ribonukleaasia) ja seosta inkuboitiin 37°C:ssa 30 minuuttia DNA:n hajottamiseksi.
Reaktioseosta kuumennettiin 100°C:ssa 3 minuuttia deoksiri-bonukleaasin inaktivoimiseksi, sitten seos jäähdytettiin huoneen lämpötilaan vesijohtovedellä. Sitten seokseen lisättiin kaksinkertaisen konsentraation omaavaa SSC:tä (pH 7,0) ja 340 ml fenoli-kresoli-seosta (koostumus: fenolia 500 g, m-kresolia 70 ml, vettä 55 ml, 8-hydroksikinoliinia 0,5 g). Reaktioseosta ravisteltiin huoneen lämpötilassa 5 minuuttia, sitten se lingottiin (5000 x g) 5 C:ssa 10 minuuttia. Supernatantti erotettiin fenolikerrokses- 29 6 9 8 6 8 ta ja denaturoidun proteiinin kerroksesta ja lisättiin puoli tilavuutta edellä olevaa fenoli-kresoli-seosta ja seosta ravisteltiin 5 minuuttia huoneenlämpötilassa.
Emulsio sentrifugoitiin, ja supernatantti dialysoitiin huoneenlämpötilassa tunnin aikana 5 litraa vastaan kaksinkertaisen kon-sentraation omaavaa SSC:tä (pH 7,5), joka sisälsi 0,05 % SDS:ää ja ulkoisen liuoksen vaihtamisen jälkeen dialysoitiin jälleen tunnin ajan. Ulkoinen liuos korvattiin sitten 5 litralla 0,01-kertaisen konsentraation omaavaa SSC:tä (pH 7,0) ja dialyysi sai jatkua yön yli 2-5°C:ssa. Dialysaatti (310 ml) ultrasuodatettiin onttokuitu-membraanisuotimella, jolloin saatiin konsentraattia 19 ml.
19 ml:aan ultrasuodatettua konsentraattia lisättiin 19 g CsCl:ää. Liuoksen kokonaistilavuus säädettiin 26 ml:ksi lisäämällä 0,01-m tris-HCl-puskuria (pH 7,5), joka sisälsi CsCl:ää 1 g/ml puskuriliuosta. Liuos (26 ml) kaadettiin 7,8 ml:aan 5,7-m CsCl-liuosta (pH 6,5), joka sisälsi 0,1-m EDTA:ta, ja sitten päälle kaadettiin 1,3 ml 0,1-m tris-HCl-puskuria (pH 7,5), ja seos sentrifugoitiin. (Spinco SW 27 rotor) (130 000 x g) 27 000 r/min 15°C:ssa 15 tuntia.
Sentrifugoinnin jälkeen supernatantti poistettiin, ja RNA:ta sisältävä kirkas kuula liuotettiin 3 ml:aan 0,01-m tris-HCl-pusku-ria (pH 7,5). Liuos jäähdytettiin jäähauteessa, siihen lisättiin kaksi tilavuutta etanolia ja sen annettiin seistä tunnin ajan -20°C:ssa. Sitten sakka koottiin sentrifugoimalla alhaisella nopeudella. Supernatantti poistettiin ja sakka liuotettiin uudelleen 0,01-m tris-HCl-puskuriin (pH 7,5).
Puhdistetun RNA:n saanto oli 9,0 mg laskettuna kaavasta A260 = 22 jossa A260 on 1 mg/ml sisältävän RNA-liuoksen absorbanssi 260 nm:ssä.
Kun lisättiin 50 % TCA:ta, niin noin 90 % puhdistetusta RNA:sta saostui TCA-liukenemattomana fraktiona. Puhdistetun RNA:n sedimentaatiokerroin mitattiin sakkaroosi-tiheysgradienttisentri-fugaation avulla käyttäen standardina hiiren L-solu ribosomi-RNA:ta, ja sedimentaatiokerroin oli noin 11 s.
(4) RNA:n lämpökäsittely 3 mg puhdistettua RNA:ta liuotettiin 12,0 ml:aan 0,01-m tris-HCl-puskuria (pH 7,5) ja liuokseen lisättiin 3,0 ml 10-kertaista SSC-konsentraatiota (pH 7,0), joten RNA:n pitoisuus 2-kertaisessa SSC-konsentraatiossa tuli olemaan 200 pg/ml. Saatu liuos pantiin 30 69868 tulpalla varustettuun koeputkeen, ja sitä kuumennettiin 100°C:ssa 5 minuuttia, se jäähdytettin sitten nopeasti jäähauteessa ja sitä kuumennettiin sitten vesihauteessa 85°C:ssa. Vesihauteen lämpötila alennettiin asteittain 65°C:een 2 tunnin kuluessa, ja reaktio sai edelleen jatkua 65°C:ssa 4 tuntia. Sitten vesihauteen kuumennus lopetettiin ja seos sai vähitellen yön yli jäähtyä huoneen lämpötilaan .
Lämpökäsitellyn RNA:n sedimentaatiokerroin määritettiin sakka-roositiheysgradienttisentrifugointimenetelmällä. Tulokseksi saatiin piikki kohdassa 11 s, joten ei voitu havaita juuri minkäänlaista eroa lämpökäsittelemättömään näytteeseen verrattuna. Kuitenkin alueella yli 28 s voitiin havaita pieni piikki.
Lämpökäsitellyn RNA:n ribonukleaasikestävyys (RNA-RNA-hybridin määrä; kaksisäikeisen RNA:n määrä) määritettiin Gumport’in et ai. menetelmällä. 30 ug lämpökäsiteltyä RNA:ta käsiteltiin 3 0 pg:lla härän haimaribonukleaasia ja 3 pg : 11a ribonukleaasi-T^ : tä 2-kertai-sessa SSC-konsentraatiossa (pH 7,0) 37°C:ssa 30 minuuttia, jolloin saatiin millipore-suotimelle (0,45 pm) 12,0 % TCA-liukenematonta fraktiota, joka ei ollut hajonnut. Toisaalta 30 pg:n näytteestä, jota kuumennettiin 0,3-kertaisessa SSC-konsentraatiossa 100°C:ssa 5 minuuttia ja jäähdytettiin nopeasti jäähauteessa, saatiin edellä esitetyssä ribonukleaasikäsittelyssä suotimelle 3,3 % TCA-liukene-matonta fraktiota, joka ei ollut hajonnut.
Lämpökäsitelty RNA otettiin talteen etanolisaostuksella tavanomaisella tavalla (Parish & Kirby, Biochim. Biophys. Acta, 129, 554 (1966)). Sakka dialysoitiin tislattua vettä vastaan, steriili-suodatettiin, täytettiin pulloihin ja dialysoitiin. Näin saadun puhdistetun RNA:n emäskoostumus oli seuraava: 27,3 % adenyylihappoa, 21,5 % guanyylihappoa, 18,5 % sytidyylihappoa ja 32,7 % uridyyli-happoa.
Claims (2)
- 31 69868 Patenttivaatimus Menetelmä IF-indusoijana käyttökelpoisen kaksisäikeisen RNA:n valmistamiseksi entsymaattisesti, jolloin kaksisäikeisen osan osuus molekyylissä on vähintään noin 4 %, molekyylipaino on pääasiassa 11-13 s ilmaistuna sedimentaatiokertoimena ja mitattuna sakkaroosi-tiheysgradienttisentrifugoinnilla, emäskoostumus on 27,0 - 37,5 % adenyylihappoa, 20,6 - 24,7 % guanyylihappoa, 16,8 - 24,3 % sytidyy-lihappoa ja 27,8 - 32,7 % uridyylihappoa, kellumistiheys Cs2^°4:ss^ on 1,635 - 1,640, terminen denaturointi (Tm) SSC:n (Standard Saline Citrate) 0,1-kertaisessa konsentraatiossa on 71°C, UV-absorptiospekt-ri on oleellisesti kuviossa 2 kuvattu, terminen denaturointi on oleellisesti kuviossa 3 kuvattu ja absorbanssisuhde 25-90°C:ssa on oleellisesti kuviossa 4 kuvattu, tunnettu siitä, että
- 1. ATP, GTP, CTP ja UTP saatetaan reagoimaan keskenään ihmisen istukasta peräisin olevan natiivin humaani-DNA:n ollessa läsnä tem-plaattina, jolloin reaktio suoritetaan katalyyttisesti käyttäen organismin Micrococcus lysodeikticus tai Escherichia coli aktiivista RNA-polymeraasia 2-4 tuntia 20-40°C:ssa, tris-HCl-puskurissa, pH-arvossa 7,0-8,0 RNA:n muodostamiseksi, minkä jälkeen reaktio keskeytetään , 2. muodostettua RNA:ta käsitellään sen vapauttamiseksi proteiinista , 3. vaiheesta (2) saatu RNA väkevöidään, 4. saatu RNA sentrifugoidaan CsCl-alustalla ja saostetaan etanolilla , 5. vaiheesta (4) saatu sentrifugoitu RNA liuotetaan sopivaan suolaliuokseen pH-arvossa 6,5-7,5, 6. vaiheesta (5) saatu RNA kuumennetaan 70-100°C:ssa, minkä jälkeen jäähdytetään nopeasti huoneenlämpötilaan tai sen alapuolelle, ja 7. vaiheesta (6) saatua RNArta lämpökäsitellään kuumentamalla 70-100°C:ssa, minkä jälkeen jäähdytetään asteittain huoneenlämpötilaan .
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9221278A JPS5519239A (en) | 1978-07-28 | 1978-07-28 | Interferon-producing attractant |
| JP9221278 | 1978-07-28 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI792346A7 FI792346A7 (fi) | 1980-01-29 |
| FI69868B true FI69868B (fi) | 1985-12-31 |
| FI69868C FI69868C (fi) | 1986-05-26 |
Family
ID=14048130
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI792346A FI69868C (fi) | 1978-07-28 | 1979-07-26 | Foerfarande foer enzymatisk framstaellning av ett dubbelstraengat rna anvaendbart som if-inducerare |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4313938A (fi) |
| JP (1) | JPS5519239A (fi) |
| AT (1) | AT370131B (fi) |
| CA (1) | CA1136562A (fi) |
| CH (1) | CH651317A5 (fi) |
| DE (1) | DE2930604C2 (fi) |
| ES (1) | ES482856A1 (fi) |
| FI (1) | FI69868C (fi) |
| FR (1) | FR2433535A1 (fi) |
| GB (1) | GB2027033B (fi) |
| IT (1) | IT1117755B (fi) |
| SE (1) | SE7906425L (fi) |
| SU (1) | SU933001A3 (fi) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6835557B1 (en) | 1980-01-08 | 2004-12-28 | Biogen, Inc. | DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human interferon-like polypeptides |
| US4530901A (en) * | 1980-01-08 | 1985-07-23 | Biogen N.V. | Recombinant DNA molecules and their use in producing human interferon-like polypeptides |
| CA1341604C (en) | 1980-04-03 | 2010-05-04 | Biogen N.V. | Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing human fibroblast interferon-like polypeptides |
| JPS58209990A (ja) * | 1982-05-27 | 1983-12-07 | Kazutomo Imahori | アデノシン一リン酸のアデノシン三リン酸への変換方法 |
| US7220854B1 (en) | 1982-06-23 | 2007-05-22 | Enzo Life Sciences, Inc. C/O Enzo Biochem, Inc. | Sugar moiety labeled nucleotide, and an oligo- or polynucleotide, and other compositions comprising such sugar moiety labeled nucleotides |
| CA1223831A (en) | 1982-06-23 | 1987-07-07 | Dean Engelhardt | Modified nucleotides, methods of preparing and utilizing and compositions containing the same |
| DE3308932A1 (de) * | 1983-03-12 | 1984-09-13 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur abtrennung von ribonukleinsaeuren aus einer loesung, die desoxyribonukleinsaeuren enthaelt |
| US5091374A (en) * | 1987-07-17 | 1992-02-25 | Hem Research Inc. | Double-stranded RNA correction of abnormalities in circulating immune complexes and monocyte function |
| JPH04507083A (ja) * | 1989-05-19 | 1992-12-10 | ヘム・リサーチ・インコーポレーテッド | 規定された構造の短い治療用ｄｓＲＮＡ |
| US5194245A (en) * | 1990-05-25 | 1993-03-16 | Hem Research Inc. | Diagnosis of viral hepatitis |
| GB9108085D0 (en) * | 1991-04-16 | 1991-06-05 | Scras | Complexes of polyadenylic acid with polyuridylic acid |
| RU2302464C2 (ru) * | 2003-11-12 | 2007-07-10 | Николай Борисович Бажутин | Способ получения двуспиральной рибонуклеиновой кислоты |
| MY188100A (en) * | 2013-11-28 | 2021-11-18 | Bavarian Nordic As | Compositions and methods vectors for inducing an enhanced immune response using poxvirus vectors |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3819482A (en) * | 1972-05-08 | 1974-06-25 | J Semancik | Method of preparing high yields of double-stranded ribonucleic acid |
| US4082613A (en) * | 1976-04-23 | 1978-04-04 | The Regents Of The University Of Minnesota | Process for the production of insulin by genetically transformed fungal cells |
-
1978
- 1978-07-28 JP JP9221278A patent/JPS5519239A/ja active Granted
-
1979
- 1979-07-18 US US06/058,361 patent/US4313938A/en not_active Expired - Lifetime
- 1979-07-25 GB GB7925890A patent/GB2027033B/en not_active Expired
- 1979-07-26 SU SU792793202A patent/SU933001A3/ru active
- 1979-07-26 CA CA000332619A patent/CA1136562A/en not_active Expired
- 1979-07-26 AT AT0517079A patent/AT370131B/de not_active IP Right Cessation
- 1979-07-26 FI FI792346A patent/FI69868C/fi not_active IP Right Cessation
- 1979-07-26 ES ES482856A patent/ES482856A1/es not_active Expired
- 1979-07-27 DE DE2930604A patent/DE2930604C2/de not_active Expired
- 1979-07-27 SE SE7906425A patent/SE7906425L/xx not_active Application Discontinuation
- 1979-07-27 FR FR7919442A patent/FR2433535A1/fr active Granted
- 1979-07-27 CH CH6964/79A patent/CH651317A5/de not_active IP Right Cessation
- 1979-07-27 IT IT49883/79A patent/IT1117755B/it active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA1136562A (en) | 1982-11-30 |
| AT370131B (de) | 1983-03-10 |
| FI792346A7 (fi) | 1980-01-29 |
| FR2433535A1 (fr) | 1980-03-14 |
| ATA517079A (de) | 1982-07-15 |
| FI69868C (fi) | 1986-05-26 |
| DE2930604C2 (de) | 1984-08-02 |
| JPS5648520B2 (fi) | 1981-11-16 |
| DE2930604A1 (de) | 1980-02-07 |
| GB2027033A (en) | 1980-02-13 |
| CH651317A5 (de) | 1985-09-13 |
| US4313938A (en) | 1982-02-02 |
| ES482856A1 (es) | 1980-04-01 |
| FR2433535B1 (fi) | 1982-10-08 |
| SE7906425L (sv) | 1980-01-29 |
| GB2027033B (en) | 1982-11-17 |
| IT7949883A0 (it) | 1979-07-27 |
| IT1117755B (it) | 1986-02-24 |
| JPS5519239A (en) | 1980-02-09 |
| SU933001A3 (ru) | 1982-05-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI69868B (fi) | Foerfarande foer enzymatisk framstaellning av ett dubbelstraengat rna anvaendbart som if-inducerare | |
| FI85027B (fi) | Foerfarande foer extrahering av ett protein som utgoers av hepatit b -ytantigen eller alfa-1-antitrypsin ur supernatant och rening av detta protein. | |
| US4276282A (en) | Interferon and preparations containing interferon | |
| CA1240265A (en) | Lyophilized hepatitis b vaccine | |
| KR920006349B1 (ko) | 미생물을 이용한 α- 및 β-인터페론의 제조방법 | |
| Artman et al. | Chromosomal RNA: an artifact of preparation? | |
| Faulkner et al. | Studies on protein and nucleic acid metabolism in virus-infected mammalian cells. 2. The isolation, crystallization and chemical characterization of mouse encephalomyocarditis virus | |
| EA022841B1 (ru) | Получение гетерологичных полипептидов в микроводорослях, внеклеточные микроводорослевые тельца, композиции и способы их получения и применения | |
| Yamagami et al. | Biochemistry of the developing rat brain: VII. Changes in the ribosomal system and nuclear RNA's | |
| US4124702A (en) | Polynucleotides active as inducers of interferon production in living animal cells | |
| FI72143C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av maenniskointerferon. | |
| SU1423002A3 (ru) | Способ получени белка,понижающего содержание холестерина в крови млекопитающих животных | |
| Wang et al. | First demonstration of an inhibitory activity of milk proteins against human immunodeficiency virus-1 reverse transcriptase and the effect of succinylation | |
| Carter et al. | The recognition of viral RNA by mammalian ribosomes: an effect of interferon | |
| Ove et al. | Separable DNA polymerase activities in host liver and Morris hepatomas | |
| Green et al. | Inhibition of mumps virus multiplication by a synthetic polypeptide | |
| US3629235A (en) | Process for isolating an interferon inducer and the product per se | |
| US6331403B1 (en) | Use of mCRP to slow cell growth and to promote maturation of cells | |
| Klee et al. | Comparative study of different preparations of yeast soluble ribonucleic acid | |
| US3660564A (en) | Interferon induction | |
| Smith-Kielland | The effect of mitomycin C on deoxyribonucleic acid and messenger ribonucleic acid in Escherichia coli | |
| EP0125892B1 (en) | Islets-activating protein derivatives | |
| IL29066A (en) | Pharmaceutical preparations containing multi-chain poly-nucleotides to encourage interferon production in humans, animals or cell cultures | |
| US7109173B1 (en) | Transport of nucleotides, oligonucleotides and polynucleotides into the cytoplasm and nucleus of cells by peptides | |
| RU2319502C1 (ru) | РАСТВОР ДЛЯ ИНЪЕКЦИЙ, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pSX50, КОДИРУЮЩАЯ СИНТЕЗ РЕКОМБИНАНТНОГО ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО АЛЬФА-2b ИНТЕРФЕРОНА, ШТАММ Escherichia coli SX50 - ПРОМЫШЛЕННЫЙ ШТАММ-ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО АЛЬФА-2b ИНТЕРФЕРОНА И СПОСОБ ПРОМЫШЛЕННОГО ПОЛУЧЕНИЯ ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА-2b |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM | Patent lapsed |
Owner name: THE GREEN CROSS CORP |