FR2478096A1 - Lactones physiologiquement actives presentant des proprietes immunopotentialisatrices et anti-inflammatoires, leur procede de production et les compositions pharmaceutiques les renfermant - Google Patents

Abstract

CES COMPOSES DENOMMES EBELACTONES PRESENTENT LA FORMULE GENERALE: (CF DESSIN DANS BOPI) DANS LAQUELLE R EST UN GROUPE METHYL OU ETHYL. LEUR PROCEDE D'OBTENTION CONSISTE A CULTIVER UNE SOUCHE PRODUCTRICE D'EBELACTONES STREPTOMYCES MG7-G1 (FERM-P5363 OU ATCC 31820) EN CONDITIONS AEROBIES, DANS UN MILIEU DE CULTURE CONTENANT DES SOURCES DE CARBONE ET D'AZOTE ASSIMILABLES PENDANT UNE DUREE SUFFISANTE POUR PRODUIRE ET ACCUMULER L'EBELACTONE DANS LE MILIEU DE CULTURE.

Description

1. La présente invention concerne de nouveaux compos6s

physiologiquement actifs présentant des propriétés immuno-

potentialisatrices et anti-inflammatoires, d6nommé6s Ebelac-

tone A et Ebelactone B, ainsi que leur procédé de produc-

tion et leur utilisation comme stimulateurs de défense im- munitaires et comme agents anti-inflammatoires chez les

animaux et l'homme.

De nombreuses souches du genre Streptomyces produisent des substances thérapeutiquement utiles, telles que les antibiotiques. On connaît des substances utiles comme

stimulateurs de défense immunitaire ou immuno-potentialisa-

teur ou comme agents anti-inflammatoires, mais il existe toujours un besoin d'agents plus efficaces utiles pour le traitement th6rapeutique de diff6rentes maladies chez les

animaux vivants, y compris chez l'homme.

La demanderesse a effectué des recherches intensives

afin de produire et d'obtenir de nouveaux composés physio-

logiquement actifs. Elle a découvert que, quand on isole une nouvelle souche du genre Streptmes d'un échantillon de sol venant du terrain de l'Université de Rissho, Kumagaya City, Préfecture de Saitama, Japon, cette souche étant dénommée, au laboratoire, Streptomyces MG7-G1, et qu'on

la cultive dans un milieu de culture en conditions a4robi-

ques, on produit et on accumule dans la culture de nou-

velles substances qui présentent une activit6 inhibitrice

vis-à-vis de l'estérase et de l'aminopeptidase formylm6-

thionine. Elle a réussi A isoler ces substances du milieu

de culture et à les purifier. Les études chimiques, phy-

siques et biologiques de ces substances isolées ont con-

firmé que chacune d'entre elles constituait un nouveau

composé de faible toxicité, distingable des autres com-

posés connus. Ces composés ont 6té dénommés respectivement Ebelactone A et Ebelactone B; ils ont les structures

chimiques et les propri6tés décrites ci-après.

L'invention concerne donc tout d'abord les nouveaux composés Ebelactone, choisis parmi l'Ebelactone A et l'Ebelactone B qui présentent la formule générale:

CH CH CH CH CH

Ij3 I13 I3 13 13

R-CH- H-CH-CH -C=CH-CH-C-CH-CH-CH-CH -CH

0 C - OH 2 3

dans laquelle R est un groupe méthyl pour l'Ebelactone A et un groupe éthyl pour l'Ebelactone B. Sauf autrement précis6, le terme ébelactone désignera donc l'6belactone A ou l'fbelactone B ou un mélange de ces deux compos6s et l'invention concerne ces produits sous forme de solution dilu6e, de concentrat brut, de solide

brut ou de solide purifié.

Des recherches ont également été effectuées sur l'ap-

plication de l'ébelactone en tant que médicament et la demanderesse a découvert que ce produit est non seulement actif pour augmenter la r6ponse immunitaire cellulaire chez

les animaux vivants mais l'est aussi pour empêcher les in-

flaumations chez ces mêmes animaux. L'avenir de l'&bélactone est donc prometteur pour des applications thérapeutiques nombreuses et variées, par utilisation par exemple dans le domaine du traitement immunologique des tumeurs et comme produit augmentant l'activit6 des agents anti- tumeurs tels

que les bléomycines.

Des essais ont été effectués pour rechercher si l'ib&-

lactone pouvait inhiber l'activité enzymatique d'une est6-

rase pour dégrader l'acétate de p-nitro-phényl et l'acti-

vité enzymatique d'une formyl-méthionine aminopeptidase pour dégrader le N-formylméthionine-i-naphtylamide et il

s'est révélé, comme on le démontrera ci-après, que l'&bélac-

tone possédait en combinaison une activité anti-estérase

et une activité anti-formyl-méthionine amino-peptidase.

Tant l'6bélactone A que l'6bélactone B, représent&s par les formules ciaprès, pr6sentent cette double activité enzymatique. Eb6élactone A CH CH CH H 23 3 13f39 1 311 J

CH -CH-CH-CH-CH -C=CH-IH-C-CH- -CH

2 8 I CHCH 2CH 3

1 1 5 6 7 1 111213 14

O=C - 0 0 -OH

Ebélactone B CH CH CH CH CH

2' 1' 2 3 3 39 1 311 3

CH 3-CH2-CH-CH-CH-CH 2-C=CH-CH-C-CH-CH-CH-CH2-CH3

1 4 5 6 7 8 il 10 t 12 13 14

0=C- 0 O OH

Les ébélactones A et B sont généralement obtenus sous forme de cristaux incolores en cultivant, dans un milieu

de culture, une souche productrice d'ébélactone, en ex-

trayant le filtrat de bouillon de culture obtenu avec un solvant organique non miscible à l'eau, en fractionnant l'extrait organique par chromatographie sur gel de silice ou de toute façon convenable puis en concentrant les fractions actives contenant l'ébélactone et en isolant par chromatographie les ébélactones A et B. Les propriétés physico- chimiques de 1'ébélactone sont

indiquées ci-après.

L'ébélactone A est un composé neutre, incolore et

cristallin; il a un point de fusion de 860C et une rota-

tion optique spécifique _20 221 ( c = 1, méthanol).

Le poids moléculaire, déterminé par spectrométrie de masse, est de 338 et l'analyse élémentaire donne C 70,97, H 10,20, 0 19,07 et correspond aux valeurs théoriques de la formule C20H3404. Le spectre ultraviolet de l'6bélactone A fait

apparaître un pic d'absorption à MeOH 291 nm (ú 311).

A max

Le spectre d'absorption infrarouge de l'ébélactone A pas-

tillé dans du bromure de sodium fait apparaitre des pics d'absorption caractéristiques à 3500, 2950, 1825, 1695, 1460, 1385, 1125, 980 et 870 cm -1 Le spectre d'absorption

en résonnance magnétique nucléaire proton ( Sppm) de l'é-

bélactone dans le deutérochloroforme fait apparaitre des pics à 1,38 (2CH3), 3,29 (CH de C-2), 3,88 (CH de C-3), 0,87 (4-CH3)-_1,99 (CH de C-4), _ 1,7 et 2,35 (CH2 de C-5), 1,73 (6-CH3), 5,04 (CH de C-7), 1,12 (8-CH3), 3,59 (CH de C-8), 1,10 (10-CH3), 2,86 (CH de C-10), 3,50 (CH de C-11), 3, 03 (11-OH), 0,79 (12-CH3),-1,41 (CH de C-12),-1,71

(CH2 de C-13) et 0,87 (CH3 de C-14).

L'ébélactone B est également un compos6 neutre, inco-

lore et cristallin avec un point de fusion de 770 C et une

rotation optique spécifique (a 26 - 203 (c = 1, méthanol).

D

Le poids moléculaire est de 352, déterminé par spectrom6-

trie de masse, et l'analyse élémentaire donne C 71,72,

H 10,31, 0 18,37 % ce qui coïncide avec les valeurs théo-

riques de la formule C21H3604. Le spectre d'absorption ultraviolet de l'ébélactone B fait apparaître un pic

d'absorption A OH e291 nm ( 479). Le spectre d'ab-

dimax.,.. -

sorption infrarouge de l'ébélactone B pastille dans du bro-

mure de potassium fait apparaître des pics d'absorption ca-

ractéristiques à 3500, 2960, 1825, 1700, 1465, 1390, 1125, -1

1000, 970 et 870 cm. Le spectre d'absorption en r6son-

nance magnétique nucléaire proton (Ippm) de l'ébélactone B dans le deutéro-chloroforme fait apparaître des pics à 1,06 (CH3 de C-2'), 1,86 (CH2 de C-1'), 3,20 (CH de C-2), 3,92 (CH de C-3), 0,86 (4-CH3), 2 (CH de C-4),- 1,86 et 2,38 (CH2 de C-5), 1,73 (6-CH 3), 5,04 (CH de C-7), 1,12 (8-CH3), 3,58 (CH de C-8), 1,10 (10-CH3), 2,86 (CH de C-10), 3,51 (CH de C-l/), 3,04 (11-OH), 0,78 (12-CH3), -1%,43 (CH de C-12),-_1,73 (CH2 de C13) et 0,87 (CH3 de

C-14).

L'invention a également pour objet un procéd6 de pro-

duction d'6bélactone qui consiste à cultiver une souche

productrice d'ébélactone du genre Streptomyces en condi-

tions aérobies dans un milieu de culture contenant des sources de carbone et d'azote assimilables pendant un temps suffisant pour produire et accumuler l'ébélactone

dans le milieu de culture. Ce procédé peut de plus com-

porter une étape de récupération de l'6bélactone obtenu.

Avantageusement, le procéd6 de production de l'6bélac-

tone A consiste à cultiver une souche productrice d'é-

b6élactone A du genre Streptomyces en conditions a6robies dans un milieu de culture contenant des sources de carbone

et d'azote assimilables pendant un temps suffisant pour pro-

duire et accumuler 1'éb6élactone A dans le milieu de cul-

ture. Le proc6dé de production de l'61ébélactone B consiste à cultiver une souche productrice d'ébélactone B du genre Streptomyces en conditions aérobies dans un milieu de

culture contenant des sources de carbone et d'azote as-

similables pendant un temps suffisant pour produire et accumuler l'ébélactone B dans le milieu de culture. Le procédé comporte en outre une étape de récupération de l'ébélactone A et de l'ébélactone B, soit séparément

soit sous forme d'un mélange, sous forme brute ou purifiée.

Comme exemple de souche productrice d'ébélactone on peut mentionner une souche du genre Streptomyces qui a été isolée par les inventeurs à partir d'un échantillon de sol prélevé sur le terrain de l'Université de Rissho, Kumiagaya City, Préfecture de Saitama, Japon, et qui est dénommée

souche Streptomyces MG7-G1.

Cette souche MG7-G1 a les propriétés microbiologiques suivantes: 1 Morphologie microscopique La souche MG7-G1 produit des myceliums de substrats

ramifiés. Deshyphes aériens relativement longs et recti-

flexibles se développent à partir du mycélium de substrat.

On n'observe pas de branchement en spirales ou verticille.

Les hyphes aériens murs portent une chaîne de 10 spores

ou plus. Les dimensions des spores vont de 0,6 à 0,8 mi-

cron de large sur 0,8 à 1,2 micron de long. Au micros-

cope électronique, la surface des spores est lisse.

2 - Caractéristiques de culture sur différents milieux.

Sauf autrement mentionné, les standards de couleur indi-

qués entre parenthèses ci-après sont basés sur les stan-

dards du Color Harmony Manual de la Container Corporation

of America.

(1) Sur milieu agar sucrose-nitrate (incubé à 27 C): croissance incolore à jaune pâle (2 ec, biscuit) à brun

jaunAtre pâle (2 gc, bambou) avec hyphes aériens de cou-

leur blanebrunâtre (3 ec, beige clair) à gris brunâtre

(3 ig, brun beige). Pas de pigment diffusable.

(2) Sur milieu agar glucose-asparagine (incubé à 27 C) croissance incolore à jaune pâle et brun jaunâtre (2 nl, brun voilé) avec hyphes aériens de couleur blanc brunâtre A gris brunâtre brillant (3 ml, gris castor) et gris brillant (2 fe, gris voilé). Après une incubation d'environ 14 jours, il se produit un pigment diffusable faiblement teinté de brun. (3) Sur milieu agar glycérine-asparagine (milieu

ISP-5 incubé A 27 C): croissance jaune pale à brun jau-

nâtre pâle (2 ie tan moutarde clair) à brun jaune grisâtre (2 li, brun voilé) et brun foncé (3 nl, brun foncé) sur

laquelle se forment des hyphes aériens de couleur blanc-

grisâtre (2 dc, naturel) A gris brillant (2 te, gris voilé) et gris brun (3 ig, brun beige). Après environ 10 jours

d'incubation, il se produit un pigment diffusable légôre-

ment teinté de brun.

(4) Sur milieu agar amidon-sel minéral (milieu ISP-4 incubé à 27C): croissance Jaune pâle & brun jaunâtre pâle (2 ie, tan moutarde clair) A brun jaune (3 li, castor) sur laquelle se forment des hyphes aériens de couleur blanc

brunâtre à gris brillant (2 te, gris voilé) A gris bru-

nâtre (3 ih, gris beige). Après environ 10 jours d'incuba-

tion, il se produit un pigment diffusable légèrement teinté

en brun.

(5) Sur milieu agar tyrosine (milieu ISP-7, incubé A 27'C): croissance bran jaunâtre pâle A brun jaunâtre (2 ni, brun moutarde) sur laquelle se forment des hyphes aériens de couleur gris jaunâtre A gris brillant (2 te, gris voilé). Après environ 5 jours d'incubation, il se

produit un pigment diffusable teinté de brun.

(6) Sur milieu agar natritif (incubé A 270C) croissance brun jaunâtre pâle A brun brillant (3 lg, brun clair) sans formation ou avec peu de formatien d'hyphes aériens teintésde brun. Il se produit un pigment diffusable brun.

(7) Sur milieu agar extrait de malt extrait de levu-

re (milieu ISP-2, incubé A 27C): croissance brun jaunâtre pâle A brun jaunAtre teinté de gris (2 nl, brun voilé) sur laquelle se forment des hyphes aériens de couleur blanc

grisâtre à gris brillant (2 te, gris voilé) et gris bru-

nâtre (2 ih, gris voilé sombre).

(8) Sur milieu agar farine d'avoine (milieu ISP-3, incubé à 27 C): croissance brun jaunatre pâle (2 ie, tan moutarde clair) avec hyphes aériens couleur gris teinté de jaune à gris brillant (2 fe, gris voilé) et gris brunâtre (2 ih, gris voilé foncé). Après environ 21 jours

d'incubation, il se produit un pigment diffusable lég6re-

ment teinté de brun.

(9) Sur milieu agar glycérine-nitrate (incubé à 27 C): croissance jaune pale à brun jaunâtre pâle et brun jaunâtre

(3 li, castor) avec hyphes aériens de couleur blanc gri-

sâtre à gris brillant (2 li, brun voilé et gris (3 ih,

gris beige).

(10) Sur milieu agar amidon (incubé à 27 C): crois-

sance incolore à jaune pâle et brun jaunâtre (2 lg, tan moutarde) sur laquelle se forment des hyphes aériens de

couleur blanc grisâtre à gris brillant (3 fe, gris ar-

gent) et gris brunâtre (3 ih, gris beige). Après environ jours d'incubation il se produit un pigment diffusable

légèrement teinté de brun.

(11) Sur milieu agar malate de calcium (incub6 à 27 C): croissance jaune pale avec hyphes aériens de couleur blanc grisâtre à gris brunâtre (3 ig, brun beige). On n'observe

pas de pigment diffusable.

(12) Sur milieu cellulose (incubé à 27C): croissance

incolore. On n'observe ni hyphes aériens, ni pigment dif-

fusable. (13) Sur milieu gélatine en bâtonnets: Sur milieu gélatine pure (incubé à 20 C): croissance jaune pâle à brun jaunâtre pâle avec formation légère d'hyphes aériens de teinte blanc brunâtre, et production

de pigment brun diffusable. Sur milieu gélatine-peptone-

glucose (incubé à 27 C) croissance brun jaunâtre pale sans hyphes aériens. Production de pigment diffusable

faiblement teinté de brun.

(14) Sur milieu lait écrémé (incubé a 37 C): crois-

sance jaune pâle à brun pâle et brun jaunâtre sans hyphes aériens. Production de pigment diffusable légèrement teinté

de brun.

3 - Propriétés physiologiques (1) Température de croissance: croit à 20 C, 240C, 27 C, 30 C et 37 C mais non à 50 C quand l'essai est fait à ces températures sur milieu agar asparagine glucose. Il

apparaît que la température optimum de croissance se si-

tue entre 24 C et 30 C.

(2) Liquéfaction de la gélatine. Quand l'incubation est effectuée à 20 C sur milieu à 15 % de gélatine pure

et à 27 C sur milieu gélatine-peptone-glucose, la liqué-

faction s'amorce au bout d'environ 6 jours d'incubation,

dans les deux cas à un degré moyen.

(3) Hydrolyse de l'amidon. Quand l'incubation est ef-

fectuée à 27 C sur milieu agar sel minéral-amidon et à la même température sur milieu agar-amidon, l'hydrolyse

de l'amidon commence effectivement, moyennement ou for-

tement,au bout d'environ 6 jours d'incubation.

(4) Coagulation et peptonisation du lait écrémé (in-

cubé à 37C). La coagulation s'amorce au bout d'environ jours d'incubation et est terminée au bout de 7 jours

d'incubation, et immédiatement suivie de peptonisation.

La peptonisation est terminée au bout de 14 jours d'incu-

bation. Le taux de peptonisation est moyen à fort.

(5) Formation de pigment mélanolde (incubation à 27 C sur bouillon extrait de levure-trypton, milieu ISP-1, incubation à 27 C sur agar fer- extrait de levure-peptone, milieu ISP-6; et incubation à 27 C sur agar tyrosine, milieu ISP-7):

On observe une formation de pigment mélanolde sur mi-

lieu bouillon extrait de levure-trypton et sur milieu tyrosine-agar. La souche MG7-G1 ne croît pas sur le milieu agar fer -extrait de levure peptone, mais elle croît et

produit du pigment mélanolde sur le milieu obtenu en élé-

minant le composant citrate d'ammonium fer du milieu agar

fer - extrait de levure-peptone.

(6) Utilisation de sources de carbone pour la crois-

sance (estimée sur milieu Pridham-Gottlieb, milieu ISP-9

avec incubation à 27 C).

Le glucose est utilisé pour la croissance. Les L-ara-

binose, D-xylose, D-fructose, sucrose, inositol, L-rhamnose, raffinose et D-mannitol ne sont pas utilisés. (7) Dissolution du malate de calcium (incubation à 27 C

sur milieu agar malate de calcium).

Au bout d'environ 6 jours d'incubation, le malate de calcium commence à se dissoudre autour de la croissance et

le degré de dissolution est moyen à fort.

(8) Réduction du nitrate (estimé dans une solution aqueuse de peptone contenant 1 % de nitrate de potassium,

milieu ISP-8, incubation à 270C): négative.

Pour résumer ce qui précède, on peut dire que la souche MG7-GQ1 appartient au genre Streptomyces et est caractérisée par l'absence de verticijes ou spirales sur les hyphes

aériens, ainsi que par la surface lisse des spores.

Il faut de plus noter que, sur différents milieux de culture, la souche MG7-Gi1 donne une croissance colorée en jaune pale à brun jaunâtre pâle et brun jaunâtre avec

des hyphes aériens de couleur blanc grisâtre à gris bril-

lant et gris brunâtre et produit un pigment diffusable légè-

rement teinté en brun et que cette souche présente mue chromogénicité positive, un degré moyen de protéolyse et

un degré moyen à fort d'hydrolyse de l'amidon.

Sur la base des propriétés mentionnées ci-avant on a comparé la souche MG7-GI à d'autres espèces connues de

Streptomyces, en se référant aux descriptions faites dans

les ouvrages suivants: H. Nishimura et al "Journal of Antibiotics" Ser. A, Vol. 10, page 205 (1957); Manuel de Bergy "Determinative Bacteriology", 8ème Edition, page 761 "International Journal of Systematie Bacteriology" Vol. 18,

N 4, page 284 (1968); et Actinomycetes, Vol 2, page 166.

Les caractéristiques de la souche MG7-GI sont très proches

de celles de Streptomyces aburaviensis.

On a obtenu un échantillon de culture de Streptomyces aburaviensis et on l'a comparé à la souche MG7-G1. Les r6sultats de la comparaison sont rassemblés dans la

Table I.

TABLE 1

Propri6t6és Forme des hyphes aériens Surface des pores Couleur des hyphes a6riens Couleur de la croissance Pigment diffusable Streptomyces aburaviensis

ISP 5033

MG7-G1

Rectiflexibles Lisse Blanc grisâtre à gris brillant et gris brunâtre Jaune pâle à brun jaunâtre pâle et brun jaunâtre Négatif ou teint6 de brun Rectiflexibles Lisse Blanc grisâtre à gris et gris brunâtre Jaune pale à brun jaunAtre pâle et jaune fonc6

Négatif ou tein-

t6 de brun Chromog6nicité: sur milieu ISP-1 sur milieu ISP-6] sur milieu ISP-7

Hydrolyse de l'ami-

don Coagulation du lait Peptonisation du lait

Liqu6faction de la g6-

latine: sur gélatine pure

sur gélatine-glucose-

peptone R6duction du nitrate

Utilisation de sour-

ces de carbone: Glucose L-arabinose D-xylose D-fructose Sucrose Inositol L-rhamnose D-mannitol + Pas de (+) croissance + + + + + + + + + + + * + Nota: (+) signifie probablement +; - signifie lé6gèrement

+; + signifie probablement -. -

* signifie + dans la description de l'International Journal

of Systematic Bacteriology Il

Comme il ressort de la Table I, la souche HG7-G1.

présente, avec la souche Strep:Smvces aburaviensis ISP 5033 les différences suivantes: 1)la première présente une chromogénicité positive alors que la seconde présente une chromogénicité négative sur milieuxISP I et 7; 2) la pre- miere ne croit pas sur milieu ISP-6 tel que, mais croit sur ce milieu, avec formation de pigment mélanoide, quand on en a retiré le composant citrate d'ammonium fer, alors que la seconde croit sur milieu ISP-6 sans formation de pigment

mélanoïde.

La souche MG 7-G1 présente, avec la souche Strep-

tomyces aburaviensis les différences mentionnées ci-dessus mais les deux souches présentent les mêmes propriétés en de nombreux autres points, ce qui montre qu'il s'agit d'espaces très voisines. La souche Streptomyces G7-G1 a été déposée auprès de l'Organisme officiel japonais "Fermentation

Research Institute" Agency of Industrial Science and Tech-

nology, Tukuba-gun, Préfecture d'Ibaragi, 3apon, sous le numéro de dépôt FERMN-P 5663 le 18 janvier 1980, ainsi qu'à l'American Type Culture Collection, Washington DC, USA

sous le n ATCC 31820.

Il se produit fréquemment des mutations d'actinomy-

cetes que ce soit en conditions artificielles ou spontanées.

L'invention concerne donc l'utilisation de la souche ?7-G1 aussi bien que de ses variants et mutants pour autant qu'ils

produisent l'ébélactone.

L'ébélactone peut être produite par culture aérobie de spores ou mycelia d'une souche productrice d'ébélactone du genre Streptomydes, par exemple la souche Streptomyces H&7-G1 (identifiée sous les références FERM P 5363 ou ATCC

N 31820).

Dans le procédé selon l'invention on inocule une

certaine quantité de spores ou mycelia d'une souche pro-

ductrice d'ébélactone à un milieu de culture convenable contenant des sources assimilables de carbone et d'azote, puis on incube en conditions aérobies, de préférence en conditions aérobies submergées de morte que l'ébélactone

soit produite et accumulée dans le bouillon de culture.

On peut de façon générale utiliser comme milieu de culture les constituants nutritifs habituellement employés pour la

culture des actinomycetes ordinaires.

On peut citer comme sources de carbone utiles,

* des produits disponibles dans le commerce tels que la gly-

cérine, le glucose, le lactose, le sucrose, l'amidon, le maltose, les mélasses et autres hydrates de carbone, les

graisses et huiles, ainsi que les sels d'acides aliphati-

ques inférieurs tels que l'acide malonique, l'acide ma-

léique et similaires. Comme sources d'azote on peut utili-

ser des produits disponibles dans le commerce tels que la

peptone, l'extrait de viande, la farine de graines de co-

ton (par exemple Pharma -Media), la farine d'arachides la farine de soja, l'extrait de levure, l'amine N-Z, la caséine, la L-asparagine, la farine de poisson, le nitrate

de sodi on d'ammonium, le sulfate d'ammonium et simi-

laires. On peut de plus ajouter au milieu de culture du

chlorure de sodium, des phosphates, du carbonate de cal-

cium, du sulfate de magnésium et d'autres sels minéraux.

On peut également ajouter, en traces, d'autres sels métalliques et différents sels de m6taux lourds,

pour autant qu'ils soient utilisés par la souche produc-

trice d'ébélactone et n'exercent pas d'effet néfaste sur la production de celle-ci. Tous les éléments nutritifs

connus pour la culture des actinomycetes peuvent être em-

ployés dans le procédé selon l'invention, pour autant

qu'ils soient assimilables par la souche productrice d'é-

bélactone pour la production de cette dernière.

Comme source de carbone on préfère la glycérine et comme source d'azote la farine de poisson. On pr6fère comme milieu de culture, un milieu contenant 3 % de glycérine,

2 % de farine de poisson et 0,2 % de carbonate de calcium.

Pour la production à grande échelle d'ébélactone, on préfère la culture liquide. On peut effectuer la culture

à toute température à laquelle la souche productrice d'é-

bélactone est susceptible de croître et de produire l'éb6-

lactone mais le domaine de température préférée pour l'incubation se situe entre 20 et 37 C et spécialement à 270C. On poursuit la culture pendant une durSe suffisante pour produire et accumuler dans le milieu ou le bouillon de culture une quantité suffisante d'ébélactone. Par exem- ple, cette production et cette accumulation atteint son maximum à la fin de l'incubation au bout de 1 à 3 jours,

si l'on a préparé et stérilisé un milieu de culture con-

tenant 3 % de glycérine, 2 % de farine de poisson, 0,2 % de carbonate de calcium, que l'on a inoculé avec des spores et mycelia récoltées d'une culture en pente de la

souche MG7-G1 et que l'on a cultivé sous agitation en con-

ditions aérobies à 27 C.

La détection de l'ébélactone obtenu au cours de la culture du microorganisme producteur, aussi bien que la récupération et la purification de l'ébélactone peut

être effectuée par détermination de l'activité anti-esté-

rase et de l'activité anti-formylméthionine aminopeptidase

selon les méthodes suivantes.

En premier lieu, le test de l'activité anti-estérase

de ltébélactone peut être effectué en déterminant le pou-

voir d'inhibition de l'estérase selon une modification de la méthode de C. Huggins et J. Lapides "J. Biol. Chemo", , 467 (1947). On dilue à 1000 fois son volume avec de l'eau une préparation d'estérase à partir de foie de perc disponible dans le commerce (vendue par SIGMA C , USA); on mélange la solution d'estérase résultante (0,025 mi) avec 1 ml d'une solution tamponnée de phosphate 0,1 M (PH 7,0) contenant 0,06 % de Triton X-100 (marque déposée pour un émulsifiant à base d'alkylphényléther de polyéthyléneglycol,

vendu par Rohm & Haas C , U.S.A.) et 0,95 ml d'eau conte-

nant un échantillon de l'ébélactone à essayer; on mélange

la solution obtenue (1,975 ml) avec 0,025 mi d'une solu-

tion de 40 mM d'acétate de p-nitrophényl (le substrat) dans du méthanol pour amorcer la réaction de l'acétate de

p-nitrophényl avec l'estérase. Une fois la réaction enzyma-

tique effectuée à température ambiante pendant 20 minutes,

on mesure l'absorbance (a) à 400 num de la solution réac-

tionnelle. On mesure d'autre part de la même façon l'absor-

bance (b) à 400 nm d'une solution de contrôle ne contenant pas d'6bélactone. On calcule le pourcentage d'inhibition de l'est4rase selon l'équation: Inhibition () (b - a) x 100 b Selon cette méthode d'essai, le produit cristallin incolore d'ébélactone A (produit de l'exemple 8 ciaprès) a un pouvoir inhibiteur tel que son ID50, c'est-à-dire la dose pour donner 50 % d'inhibition A l'estérase, est de 0,056 mcg/ml et le produit cristallin incolore d'ébélactone B (produit de l'exemple 9 ci- après) a un pouvoir inhibiteur

tel que son ID50 est de 0,00035 mcg/ml.

Le test de l'activité auti-formylm&thionineaminopep-

tidase de l'6bélactone peut être effectué selon la méthode

suivante On utilise, comme solution substrat, une solu-

tion de N-formylm6thionine t-naphtylamide dans du méthanol

contenant 5 % (poids/volume) de Tween 20 (tensioactif non-

ionique comercialisé par Atlas Powder CO, U.S.A.). La for-

mylm&thionineaminopeptidase employée est celle préparée A partir de foie de rat. On m6lange à un volume total de 0,95 ml la solution-substrat (0, 005 ml), 0,5 Il de solution tamponn6e 0,1 M d'acide tris-chlorhydrique (pU 7,8) et 0,495 1ml d'eau contenant un échantillon de l'ébélactone à essayer. On mélange ensuite la solution r6actionnelle ainsi

obtenue avec 0,05 ml de la solution d'enzyme puis on ef-

fectue la réaction enzymatique pendant 25 minutes A 37C.

La solution réactionnelle est ensuite mélangée A 1 ml d'une solutioncontenant du Fast Garnet GPC (produit vendu par

SIGNA CO, USA) à une concentration de 1 mg/ml dans une so-

lution tamponnée d'acétate 1 N (pH 4,2) contenant 10 % de "TWeen" 20 pour stopper la réaction enzymatique. Après

maintien A température ambiante pendant 15 minutes, on me-

sure l'absorbance (a) A 525 nm de la solution réactionnelle.

On mesure d'autre part l'absorbance (b) à 525 nm d'une solu-

tion témoin. On calcule le pourcentage d'inhibition de la formylméthionineaminopeptidase de façon similaire à celle mentionnée ciavant pour l'estérase. Selon cette méthode,

le produit cristallin incolore d'ébélactone A a un pou-

voir inhibiteur tel que son ID50, c'est-à-dire la dose pour donner 50 % d'inhibition à la formylméthionineamino- peptidase est de 0,08 mcg/ml, et le produit cristallin incolore d'ébélactone B a un pouvoir inhibiteur tel que son IDo50 est de 0,02 mcg/ml L'ébélactone peut être produit aussibien par une m6thode de culture en cuve que par une méthode de culture sous agitation. Par exemple, on place 1000 1 d'un milieu

de culture liquide contenant 3 % de glycérine, 2 % de fa-

rine de poisson et 0,2 % de carbonate de calcium dans une

cuve de fermentation de 2 000 1, on stérilise et on ino-

cule le milieu avec une culture en pente de la souche M7-G1 à une dimension d'inoculum de 2 %, en faisant passer au travers du milieu de culture de l'air stérile

à une vitesse de 800 1/minute, en agitant avec un agita-

teur rotatif à 240 t.p.m. La température d'incubation est de 27 C. Dans cette expérience, la production d'ébélactone

atteint un maximum à la fin de 37 heures d'incubation. L'é-

bélactone produite est présente dans le bouillon de cul-

ture ainsi que dans les mycelia de la souche MQ7-GI1. Pour

récupérer l'ébélactone on peut extraire le bouillon de fer-

mentation une fois la réaction terminée, avec un volume égal d'un solvant organique non miscible à l'eau tel que l'acétate de butyl, le butanol et similaires en mélangeant

le bouillon de fermentation au solvant organique et en agi-

tant le mélange pendant plusieurs heures pour transférer l'ébélactone de la phase liquide de la culture et des

mycelia à la phase solvant organique. L'ébélactone pré-

sent dans le filtrat du bouillon de fermentation peut aussi être extrait par un solvant organique non miscible

à l'eau tel que le butanol, l'acétate de butyl et simi-

laires et l'ébélactone présent dans les mycelia peut être extrait par un solvant organique miscible à l'eau tel que le méthanol, l'éthanol ou similaire. On peut aussi récupérer l'ébélactone avec un bon rendement à partir d'une

solution la contenant par adsorption sur un adsorbant a-

dapté suivie de désorption. On peut employer dans ce but un adsorbant minéral tel que le charbon actif, l'alumine, le gel de silice et le silicate de magnésium (Frorigil) ainsi qu'un adsorbant organique tel que l'Amberlite XAD (résine non-ionique, hautement micro-poreuse, produit par

Rohm & Haas, CI, USA). On peut par exemple adsorber l'é-

bélactone sur du gel de silice et l'en éluer avec un mé-

lange n-hexane-chloroforme.

Pour isoler l'ébélactone A de l'ébélactone B, il est spécialement efficace de soumettre un mélange de ces deux produits à une chromatographie sur colonne avec un gel de silice de chromatographie en phase inverse préparé par liaison d'un silane aux surfaces du gel de silice, l'élution étant faite avec un mélange méthanol-eau. On peut par exemple récupérer et isoler les ébélactones A et B par extraction du filtrat du bouillon de fermentation avec un solvant organique non miscible à l'eau tel que l'acétate de butyl, concentration de l'extrait acétate

de butyl sous pression réduite pour obtenir un concen-

trat huileux, purification de cette huile par chromato-

graphie sur gel de silice, puis passage à nouveau en chro-

matographie sur colonne de gel de silice développée avec un système de solvant adapté tel que n-hexane-chloroforme ce qui permet d'obtenir d'une part les fractions actives de l'éluat contenant l'ébélactone A seul et d'autre part les fractions actives contenant l'ébélactone B seul; on isole ensuite séparément les ébélactones A et B des

fractions actives respectives..

On peut effectuer la purification finale de l'ébé-

lactone par cristallisation. Comme chacun des ébélactones A et B est bien cristallisable, il se dépose sous forme

d'aiguilles à partir d'une solution dans un mélange mé-

thanol-eau.

L'étude des propriétés pharmacologiques de l'ébé-

lactone a permis de trouver qu'il présente une activité pour la stimulation de la r6ponse immunologique chez un animal vivant en augmentant l'immunité cellulaire aussi bien que pour la réduction des inflammations chez un animal vivant. Les propri6tés pharmacologiques de l'éb6élactone sont décrites ci-après. (1) Influence de l'éb6lactone sur l'augmentation

de l'immunité cellulaire.

Cette influence a été étudiée selon une technique

connue d'hypersensibilité type retardé (DTH) (Cf. P.H.

Lagrange, G.B. Mackaness et T.E. Mille: "J. Exp. Med.", 159, 1529-1539 (1974) en utilisant des souris immunisées

avec des plaques sanguines de mouton (SRBC) comme anti-

gène. On inocule donc 108 SRBC mises en suspension dans 0,05 ml de solution saline physiologique par injection sous-cutanée sur l'un des côtés de la semelle plantaire arrière de souris CDF1 (5 souris par groupe, femelle, 8 semaines) pour les immuniser. Simultanément à cette

immunisation on injecte à chaque souris, par voie intra-

péritonéale, 50 mg/kg, 12,5 mg/kg, 3,125 mg/kg ou 0,78 mg/kg d'ébélactone. Quatre jours plus tard on injecte par voie sous-cutanée dans l'autre côté de la semelle

plantaire arrière de chaque souris 108 SRBC pour en dé-

duire la réponse immunitaire. 24 heures après cette in-

jection on mesure l'épaisseur (on mm) de la semelle plantaire pour évaluer le degr6 de gonflement dans la patte qui a reçu cette injection. Le taz de gonflement sert de mesure de l'immunité cellulaire. Les résultats

de l'essai sont rassemblés dans la Table 2 ci-après.

o r- c'4 Z, ci Deus:S01 ç'O DRUS OT v uowr@qj T 'ST "ftHS 0;'0i T ' 8 SUBO; (S19J1UOO) o: o; f0 * uo $ Tqj T'9::Deus 90T (oT9.xq.uoo 0 o0 DS 0TT o C'tis Ai, erao mmae um!mea Co ';I. TEL'0 9' CT 1 sGa'; (liEu;'O x) (uo;;um (elgqunuuç

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/'L 9HOIS 90T oeguto:)TaezUI:SlS T g ouo:oualgq (wm Tf ' 0 x) (uoT:. usTunlmmT o:.ud satbde.nop emt:;) (,xnoO) ep eueld uoT:su.ToTlqp (Si/sm) uoMlsTunuT znod emTsTCda uo1Toe[ul ouo4oulqgtp esogQeusiuvp uoTLOOPuI uFTmuXe esodwoD sTnos sol zeqo DiHS B HM osuodg. v op quemossrTTqu m,,I s *uoowTq} * op *ouonLT3:u Z aw Il ressort de ces résultats que l'administration d'ébélactone à une dose de 0,781-50 mg/kg par injection

intrapéritonéale ou à une dose de 0,5 mg/kg par voie bu-

cale à des souris, augmente de façon remarquable la r6ponse DTH et que l'ébélactone pr6sente un effet potentialisateur

sur l'immunit6 cellulaire.

(2) Influence de 1'ébélactone sur la réduction de l'inflammation. On fait des essais pour estimer l'effet suppressif de 1'6bélactone et de l'est6rastine (USP 4 189 438 et 4 242 453) sur le gonflement de la semelle plantaire

occasionné par injection de carragheenine quand les com-

posés à examiner sont administr6s par voie orale ou in-

trap6ritonéale à l'animal d'essai (rats Vister, mâles, poids: 140 à 150 g) . Le composé à essayer est dissous dans

environ 0,5 ml dt'6thanol additionn6 d'une goutte de l1a-

gent tensio-actif non-ionique "Tween 80", et cette solu-

tion dans 1'éthanol est diluée avec une solution aqueuse

de gomme arabique pour préparer une suspension aqueuse con-

tenant la dose à essayer d'ébélactone ou d1esterastine.

La suspension ainsi préparée est alors administré6e, par voie orale ou intrapériton6ale, aux rats. Une heure plus tard on fait une injection sous-cutan6e dans la semelle plantaire de t % de carraeénine aqueuse. Après cette injection, on mesure le volume de la semelle p1aétaire d'abord au bout de trois heures pnis au bout de cinq heures. Pour l'essai de contrle, on omet l' bilactoue

ou l'est6rastine. Le degré (%) de suppression de gonfle-

ment est calculé à partir des volumes mesures de la se-

melle plantaire inflammé6e. Les résultats-obtenus sont

rassemblés dans les tables 3 et 4.

TABLE 3

Effet suppressif sur l'inflammation de l'ébélactone et de l'estérastine administr6s oralement

Degré (%) de suppression du gon-

flement Composé essayé 3 heures 5 heures Gomme arabique

(contrôle) - -

Estérastine (50 mg/kg) 10,3 % - 3,0 % (à titre comparatif)

________________________________________________________

Ebélactone B (10 mg/kg) 11,2 % 8,2 % Ebélactone B (50 mg/kg) 11,6 % 7,8 % Ebélactone B (100 mg/kg) 7,0 % 9,6 %

TABLE 4

Effet suppressif sur l'inflammation de l'ébélactone et de l'estérastine administrés par voie intrapéritonéale

Degré (%) de suppression du gon-

flement Composé essayé 3 heures 5 heures Gomme arabique

(contrôle) - -

Estérastine (30 mg/kg) 31,1 % 28,1 % (à titre comparatif) Ebélactone B (5 mg/kg) 17,1 % 8,8 % Ebélactone B (10 mg/kg) 9,1 % 10,0 % Ebéléctone B (30 mg/kg) 50,6 % 20,9 % Ebélactone A (30 mg/kg) 45,9 % 18,5 % Il ressort de ces tables que, par administration

orale d'6bélactone Bon peut obtenir avec 10 mg/kg d'tébé-

lactone B une réduction significative du degré de gonfle-

ment comparativement au groupe contrôle aussi bien 3 heures que 5 heures après injection de carraghéenine; avec une dose de 50 mg/kg d'ébélactone B, 3 heures après injection

de carraghéenine et avec une dose de 100O mg/kg d'ébélac-

tone B, 5 heures après injection de carraghéenine. On peut

de plus noter que, par administration intrapéritonéale d'é-

bélactone, on constate une réduction significative du de-

gré de gonflement par rapport au contrôle, avec toutes les doses d'ébélactone A et B ainsi que pour toutes les durées, sauf au bout de 5 heures avec une dose de 5 mg/kg et au bout de 3 heures avec une dose de 10 mg/kg d'ébélactone B.

On peut observer des résultats similaires avec l'ébélac-

tone A.

D'autres tests ont permis de constater que l'ébélac-

tone à une concentration de 100 mcg/ml ne présente pas de toxicité cellulaire vis-à-vis des cellules tissulaires

et qu'ne dose de 250 mg/kg d'ébélactone (par voie intra-

péritonéale) ne laisse apparaître aucun symptôme de toni-

cité dans tous les tests d'estimation de toxicité aigue

chez les souris.

Ceci, ainsi que les résultats mentionnés ci-avant, montre que l'ébélactone est de faible toxicité et est utile comme agent pharmaceutique qui peut être employé avec une grande sécurité et qui! est utile au moins en

tant qu'agent potentialisateur de l'immunité cellulaire.

L'invention concerne donc également une composition pharmaceutique contenant une quantité sure et efficace d'au moins un des ébélactones A et B, en mélange avec un

support pharmaceutiquement acceptable.

L'invention concerne plus particulièrement un stimu-

lateur de défense de l'hôte, permettant d'augmenter la réponse immunitaire chez un animal vivant, qui contient comme ingrédient actif au moins l'un des ébélactones A et

B, en combinaison avec un support pharmaceutiquement ac-

ceptable de l'ingrédient actif.

La méthode permettant de stimuler la réponse imuni-

taire chez un animal vivant consiste à administreraudit

animal une quantité sure et immunopotentiellement effi-

cace d'au moins un des &bélactones A et B.

L'invention concerne également une composition anti-

inflammatoire pour le traitement des inflammations chez un animal vivant, qui contient, comme ingrédient actif, au moins l'un des éb6élactones A et B en combinaison avec un support pharmaceutiquement acceptable dudit ingrédient actif. La méthode de traitement des inflammations chez un

animal vivant consiste à administrer audit animal une quan-

tité sûre et efficace d'au moins l'un des ébélactones A et B. La composition pharmaceutique selon l'invention, qu'elle soit utilisée comme stimulateur de défense de l'hôte anti- ou comme agent/inflammatoire peut être formulée sous des formes conventionnelles administrables par voie orale, telle que des tablettes, capsules, poudres, solutions et supensions, soit en mélangeant une certaine quantit6 d'éb&lactone avec un support solide pharmaceutiquement acceptable, tel que l'amidon, le sucrose, le talc, et le carbonate de calcium, soit en dissolvant ou en mettant en suspension une certaine quantité d'éb4lactone dans un support liquide pharmaceutiquement acceptable tel que l'6thanol et l'eau. Les proportions d'ébélactone et de support solide ou liquide peuvent être choisies de façon appropri6e selon la forme de la formulation administrable oralement, et se situent habituellement entre 1:1 et

1:100 en poids.

La composition selon l'invention peut également être

formulée sous forme de solutions injectables ou de sus-

pensions en dissolvant ou en mettant en suspension l'éb6-

lactone A une dose de 0,1 % à 10 % en poids dans une

solution saline physiologique ou tout autre v6hicule li-

quide pharmaceutiquement acceptable tel que la solution de Ringer, avec ou sans aide d'un dispersant convenable. La solution ou la suspension injectable ainsi préparée peut être administrée par injection intraveineuse, intramusculaire ou intrapéritonéale.

On peut se rendre compte que la dose préférée d'ébé-

lactone utilisée variera selon la composition particulière

formulée, le mode d'administration et la maladie à traiter.

L'homme de l'art tiendra compte de nombreux facteurs modi-

fiant l'action du médicament selon l'invention, tels que, par exemple, l'âge, le poids, le sexe, le régime, la durée

et la voie d'administration, le taux d'excrétion, les combi-

naisons de médicaments, les sensibilités réactionnelles et

la sévérité de la maladie. En règle générale, on peut don-

ner entre 0,5 mg/lg à environ 100 mg/kg d'ébélactone par jour à un adulte. Les doses optimales, pour une gamme de conditions chez un patient, peuvent être déterminées par

le spécialiste en utilisant les tests classiques de dé-

termination des doses selon les indications ci-dessus, et

selon les expériences passées pour la détermination des do-

ses adaptées des médicaments connus.

Les exemples suivants illustreront Ilinvention sans

pour autant la limiter.

Exemple 1

On inocule une boucle de culture incl née de somcne Streptomycee M&7-Gi (FERM-P 5363 oe ATCC N 31820), en tant que souche productrice d'ébélactone, à!5 litres d'u milieu de culture contenant 3,@ %j de glycérine, 2,0 l de farine de poisson et 0,2 % de carbonate de calcium, p!ac6 en portions de 110 ml dans des fioles rotatives de 500 cc,

et stérilisé par chauffage pendant 20 minutes à 1200C.

L'incubation est menée pendant 10 jours consécutifs

à 27 C à une vitesse de rotation de 180 t.p.m., des échan-

tillons du milieu incubé étant prélevés régulièrement, et

chaque échantillon étant exami-19- quant au pouvoir de I é-

bélactone, afin d'observer la production dl'bélactone pen-

dant la période d'incubation. Cette production atteint in

maximum au 2ème jour d'incubation et le niveau de subs-

tance inhibant l'estérase dans le milieu d'incubation diminue lentement depuis le 3ème jour d'incubation. Le pH du milieu incubé varie de 7,0 le premier jour à 6,6, le second jour, 7,3 le 3ème jour, 7,8 le 4ème jour et 8,2 le ème jour.

Exemple 2

On cultive la souche Streptomyces lG7-G1 (FERM-P 5363 ou ATCC N 31820) pendant 2 jours en utilisant les mêmes milieu de culture et conditions d'incubation que celles

de l'exemple 1, et le bouillon de fermentation ainsi obte-

nu (2,5 1, activité antiestérase, ID50:l1 g/ml) est mé-

langé à 2,5 1 d'acétate de butyl. Le mélange résultant est agité pendant 3 heures à température ambiante, puis filtré à l'aide d'un adjuvant de filtration (terre de diatomée

vendue sous le nom de "Htyflo-Supercel"). Le filtrat obte-

nu est séparé en phase acétate de butyl et phase aqueuse.

La phase acétate de butyl est concentrée sous pression réduite pour donner 4,36 g d'un produit huileux contenant l'ébélactone.

Exemple 3

Le produit huileux (4,36 g) obtenu dans l'exemple 2 et contenant l'ébélactone est chromatographié à travers une colonne (2,5 x 35 cm) d'un gel de silice ( ako Gel C-200, vendu par VAKO CHEMICAL, Japon) en utilisant comme éluent un mélange de n-hexane-chloroforme-acétate d'éthyl (5:5:1 en volume). L'éluat est rassemblé en fractions de g; les fractions n 41-137 contiennent la substance active, l'ébélactone. Les fractions actives combinées sont concentrées à siccité sous pression réduite pour donner

un produit huileux jaune clair. Rendement 434 mg.

Exemple 4

Le produit huileux (434 mg) obtenu dans l'exemple 3 est chromatographié à travers une colonne (1,2 x 47 cm) de gel de silice phase inversée (Silicagel 60, Silanized de Merck C , R.F.A.) en utilisant comme éluent un mélange méthanol-eau (1:1 en volume). L'éluat est rassemblé en fractions de 10 ml-et l'on obtient les fractions actives n 38-53 contenant l'ébélactone A et les fractions actives n 65-81 contenant l'ébélactone B. Ces fractions actives sont respectivement combinées et concentrées sous pression

réduite pour donner 20 mg d'une poudre incolore d'ébélac-

tone A et 10 mg d'une poudre incolore d'6bélactone B. Ces produits donnent une tache unique (Rf 0,72 et 0,80 res- pectivement) une fois développés en óhromatographie en

couche mince sur gel de silice avec un mélange n-hexane-

chloroforme-acétate d'tthyl (5:5:1 en volume).

Exemple 5

Un milieu de culture (1000 1) contenant 3,0 % de gly-

c6rine, 2,0 % de farine de poisson, 0,2 % de carbonate de calcium et 0,01 % de produit antimousse (polyoxyalkylène vendu sous le nom "Adecanol", Asahi Denka C0 , Japon) est chargé dans un réservoir en acier inoxydable de 2 000 1

puis stérilisé par chauffage à 120 C pendant 30 minutes.

On inocule à ce milieu de culture stérilisé 50 1 d'une

culture obtenue par incubation de souche Stre__cets <MG?7-

G1 (FERM-P 5363-ATCC 31820) pendant 2 jours à 280C sous aération et agitation. Le milieu de culture inoculé est incubé à 28 C pendant 43 heures à une vitesse d'aération

de 80 1/minute et à une vitesse d'agitation de 240 t.p.m.

Le bouillon de fermentation ainsi obtenu est m&langS à 350 1 d'acétate de butyl puis agité pendant 4 heures, décanté et filtré à l'aide d'un adjuvant de filtration (lyflo-Supercel) et au moyen d'une centrifugeuse à panier pour enlever les mycelia. La phase acétate de butyl est ainsi éliminée puis concentrée sous pression réduite pour donner 1,9 litre d'une solution concentrée contenant ltébélactone.

Exemple 6

La solution concentrée (1,9 1) obtenue dans l'exemple et contenant l'kbélactone est placée dans une colonne (10 x 60 cm) de gel de silice (Vako-Gel C-100, vendu par WAKO CEHMICAL CO, Japon) qui est ensuite lavée par passage de 7 1 de n-hexane. La colonne est ensuite développée avec 4, 5 1 d'un mélange n-hexane-chloroforme (1:1 en volume) puis avec 10 1 d'un mélange n-hexane-chloroforme-acétate

d'éthyl (5:5:1 en volume) come éluent. L'éluat est ras-

semblé en fractions de 50 m et l'on obtient les fractions actives n' 81200. Ces fractions actives sont combinées

et concentrées pour donner 150,9 g d'un produit huileux.

Exemple ?

Le concentrat huileux (71,6 g) obtenu dans l'exemple 6

et contenant l'ébélactone est chromatographi& dans une co-

lonne (5,5 x 17,5 cm) de gel de silice phase inversée (Silicagel 60, Silanized, Merck C , R.F.A.) en utilisant

commne éluent un mélange méthanol-eau (1:1 en volume).

* L'éluat est rassemblé en fractions de 20 ml.

En chromatographie en couche mince, l'ébélactone A est

surtout détecté dans les fractions ne 105-147 dans les-

quelles on ne peut détecter l'ébélactone B. Les ébélacto-

noes A et B sont toutes deux d&tectées dans les fractions n 148-270 et l'&bélactone B dans les fractions n 271-443 dans lesquelles on ne peut détecter l'&b&lactone A. Les fractions combinées an 105-147, 148-270 et 271-443 sont

concentrées sous pression réduite pour donner respective-

ment 392 mg d'une poudre jaune, 974 mg d'une poudre jaune

et 518 mg d'une poudre jaune.

Exemple 8

La poudre jaune (392 mg) obtenue dans l'exemple 7 et

contenant principalement l'bSlactene A est chromatogra-

phiée sur colonne de gel de silice (Wako-Gel C-300, WA" CHEMICAL Ce, Japon, 1,3 x 48 cm) en utilisant come éluent un m&lange n-hexanechloroforme (3:1 en volume). L'éluat est rassemblé en fractions de 5 g et les fractions actives

n 101-130 sont combinées et concentrées sous pression ré-

duite pour donner 175 mg d'une poudre incolore d'ébélac-

tone A qui donne une tache unique (Rf 0,72) en chromato-

graphie en couche mince sur gel de silice en utilisant un mélange nhexane-chloroforme-acitate d'éthyl (5:5:1 en volume). Cette poudre incolore est dissoute dans un

petit volume de méthanol et on ajoute à la solution me-

thanolique, on petites quantités, de l'eau pour donner 128 mg d'aiguilles d'ébélactone A. Ptf. 860C. Ce produit cristallisé à un ID50 vis-à-vis de l'estérase de 0,056 mcg/ml.

Exemple 9

La poudre jaune (518 mg) obtenue dans l'exemple 7 et contenant essentiellement l'ébélactone B est chroma- tographiée sur colonne de gel de silice (Wako-Gel C-300, VAKO CHEMICAL C , Japon, 1,3 x 50 cm) en utilisant comne éluent un mélange de n-hexane-chloroforme (3:1 en volume)

Ltéluat est rassemblé en fractions de 10 g et les frac-

tions actives ne 49-58 sont combinées et concentrées sous pression réduite pour donner 219 mg d'une pondre incolore d'ébélactone B qui donne une tache unique (Rf 0,80) en chromatographie en couche mince sur gel de silice avec un mélange n-hexane-chloroforme-acétate déthyl (5:5:1 en volume). Cette poudre incolore est reprise dans un

petit volume de méthanol et on ajoute à la solution mé-

thanolique de l'eau, par petites quantités, pour obtenir 129 mg d'aiguilles d'ébélactone B. Ptf 77 C Ce produit cristallisé à un ID50 de 0,00035 mcg/ml vis-à-vis de

l'estérase.

Claims (5)

- REVENDICATIONS -

1 - Compos6s physiologiquement actifs présentant des propriétés iamunopotentialisatrices et anti-inflamatoires,

caractérisés en ce qu'ils sont dénomes ébélactone et pré-

sentent la formule générale:

CH3 CH3 HH3T 3 CH3

R-CH-CH-CH-CH 2-C=CH-CH-C-CH- -CH2-CH3

O=C-O O OH

dans laquelle R est un groupe méthyl ou éthyl.

o0 2 - Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est 16'ébélactone A de formule:

CH3 3 CH CH CH 3

CH -CH-CH-CH-CH -C=CH-CH--CH-CH-C-CH-CH

O=C-O 0 O H

-3 - Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est l'ébélactone B de formule:

CH 3 CH3 CC33 3

CH 3-CH -CH-CH-CH-CH2-C=CH-CH-C-CH-CH-CH-CH 2-CH3

O=- O >, 0E 2

i - Procédé d'obtention des composés selon l'une

quelconque des revendications 1 à 3, caract6risé on ce

qu'il consiste à cultiver une souche productrice du genre Streptomyces, en conditions aérobies, dans un milieu de

culture contenant des sources de carbone et dazote as-

similables pendant une dur6e suffisante pour produire et

accumuler l'6bélactone dans le milieu de culture.

- Procédé selon la revendication 4, caractérisé en

ce qu'il comporte une étape supplémentaire de récupéra-

tion de l'ébélactone du milieu de culture.

6 - Procédé selon les revendications 4 et 5, caracté-

risé en ce que la souche productrice d'Ebbélactone est la souche Streptomyces MG7-G1, identifiée sous les références

FERM-P 5363 ou ATCC N 31 820.

7 - Procédé selon l'une quelconque des revendications

4 A 6, caractérisé en ce que la souche Streptomyces M7-Gi1 est cultiv6e à une température de 20 A 37 C pendant 1 A

3 jours.

8 - Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comporte une quantité sûre et efficace d'au moins l'un des ébélactones A et B selon l'une quelconque des

revendications 1 a 3, en mélange avec un support phar-

maceutiquement acceptable.

9 - Stimulateur de défense de l'hôte pour l'augmenta-

tion de la réponse immunitaire chez un animal vivant,

caractérisé en ce qu'il est la composition pharmaceuti-

que selon la revendication 8.

- Composition anti-inflammatoire pour le traitement des inflammations chez un animal vivant, caractérisée en

ce qu'elle est la composition pharmaceutique selon la re-

vendication 8.