FR2481927A1 - Composition anti-allergique et son procede de preparation a partir d'une bacterie lactique du genre streptococcus - Google Patents

Abstract

COMPOSITION ANTI-ALLERGIQUE ET SON PROCEDE DE PREPARATION. ON OBTIENT LA COMPOSITION A PARTIR D'UNE BACTERIE LACTIQUE DU GENRE STREPTOCOCCUS. ON LA FAIT FERMENTER, ON LAVE LA SOUCHE, ON LA MET EN SUSPENSION DANS DE L'EAU, ON LA BROIE, ON CENTRIFUGE, ON RECUEILLE LE LIQUIDE SURNAGEANT QU'ON DIALYSE; ON CENTRIFUGE ET RECUEILLE UN SECOND LIQUIDE SURNAGEANT, QU'ON LYOPHILISE OU SOUMET A PRECIPITATION FRACTIONNEE. CE PRODUIT PERMET D'EVITER DES CHOCS ANAPHYLACTIQUES CHEZ DES MAMMIFERES.

Description

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La présente invention concerne des substance

anti-allergiques ainsi que leur procédé de préparation.

Plus particulièrement, l'invention concerne une nouvelle

substance anti-allergique utilisant des bactéries lacti-

ques appartenant au genre Streptococcus.

De nombreuses catégories de produits médici-

naux sont actuellement produites à partir de microor-

ganismes ou de parties de microorganismes. On utilise

largement des produits médicinaux provenant de micro-

organismes, comme des produits destinés à régler les fonctions intestinales et qui sont préparés à partir de

souches appartenant au genre Streptococcus, plus parti-

culièrement des Enterococcus actifs aussi bien que des préparations d'antigènes polyvalents que l'on obtient à partir de divers microbes pathogènes ou de microbes de l'appareil respiratoire. Le principal constituant de ces microorganismes est un genre de protéine étrangère à l'être humain et aux animaux. A l'exception de lurokinase,

toutes les enzymes pharmaceutiques proviennent de subs-

tances ou de corps étrangers à l'être humain et sont

hétérogènes à l'égard de l'être humain.

Lorsqu'un certain genre de protéine étrangère à l'organisme est introduite dans un mammifère, il en résulte la production automatique d'anticorps. La tendance

à la production d'anticorps est généralement très impor-

tante quand de telles protéines sont injectées dans un muscle, mais l'on se heurte à un problème consistant en un risque de production de 1 anticorps IgE capable de provoquer de l'allergie. Lorsque des allergènes sont produits dans un organisme vivant, ils peuvent y susciter un choc anaphylactique grave en raison d'une réaction immunologique à l'effet toxique des antigènes introduits

dans l'organisme.

Des symptGmes pathologiques provenant de diver-

ses réactions immunologiques dues à l'entrée d'hétéro-

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antigènes étrangers dans l'organisme sont appelés

"réaction ou maladie hétéroimmunitaire".

Gell et Coombs ont classé dans l'ouvrage de PGH Gel, RRA Coombs, PJ Lachmann: "Clinical Aspects of Immunology", 3e édition, Blackwell, 1975), les mala- dies allergiques-en quatre types selon la nature des réactions immunologiques: Type I: Des anticorps comme IgE fixés sur certaines cellules réagissent avec de l'antigène, ce qui provoque une libération d'histamine et l'activation d'une substance à réaction lente

(SRS-A) et d'un facteur éosinophile chimio-

tactique (ECF-A).

Cela constitue le mécanisme responsable de l'atopie asthmatique, du rhume des foins, de l'urticaire, d'une dermatite atopiqueed'une réaction anaphylactique et de l'oedème des

vaisseaux, notamment rétiniens.

Type II: Des anticorps comme IgE ou IgM réagissent

avec l'antigène des cellules cibles et acti-

vent le complément, ce qui provoque une lyse des cellules. Cela se produit dans certains

types de réactions à des médicaments.

Type III: Des anticorps comme IgG ou IgH forment des complexes avec de l'antigène et des facteurs chimiotactiques neutrophiles du complément, ce qui provoque une inflammation locale des tissus. Une maladie due à l'état du sérum ou

à une injection de sérum implique ce mécanisme.

Type IV: Des lymphocytes T sensibilités réagissent avec l'antigène, en produisant une inflammation

sous l'effet de lymphokines.

Le principal exemple est une dermatite aller-

gique de contact.

Ces réactions allergiques se trouvent chez

divers mammifères et notamment chez l'être humain.

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La Demanderesse a effectué une série de recherches sur la production des anticorps chez des

cobayes en leur appliquant des protéines étrangères.

Des découvertes intéressantes ont été obtenues lors de 1 application de streptocoques provenant du lait de vache à des cobayes souffrant d'une élévation du titre en anticorps et chez lesquels les bactéries, vivantes

ou mortes, ont inhibé une surproduction de IgE.

Puisque l'introduction-d 'une hétéroprotéine -in vivo, par suite de l'application des streptocoques, peut inhiber la surproduction de IgE, la Demanderesse

a voulu étudier la possibilité d'utiliser des strepto-

coques pour un traitement curatif et préventif de diverses maladies hétéroimmunitaires. Elle a étudié en outre l'effet de l'inhibition d'une réaction d'allergie en utilisant une maladie hétéroixmunitaire typique pour laquelle un système expérimental a pu facilement être établi, ce qui a donné des résultats très intéressants

et couronnés de succès.

La présente invention a été mise au point

dans le cadre des observations ci-dessus.

Il existe un grand nombre de bactéries lactiques appartenant au genre Streptococcus, comme Streptococcus pyogenes, Streptococcus equismilis,

Streptococcus zoop2idemcus, Streptococcus egqui, Strepto-

coccus dysgalatiae0 Stiept'oc-occus Sanguis, Streptcoccus

pneumoniae, Streptococcus anrinosus" Streptococcus agalac-

tiae, Streptococcus acidominimus, Streptococcus' salivarius, Streptococcus mitis, Streptococcus bovis, 'Strep-tdcoccus equinus, Stretococcus thermophilus, Streptococcus faecalis, Streptococcus faecium, "StreptocoCcUs avium, Streptococcus

uberis,' Streptoco cWs lactis et Steptocl'cs cremoris.

Parmi ces bactéries lactiques, Streptococcus lactis est un microorganisme non-pathogène typique que l'on trouve dans le lait de la plupart des animaux et

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qui sert largement à fabriquer des produits laitiers, du beurre, du fromage, du yaourt, etc. Streptococcus bovis est un autre genre de bactérie lactique appartenant au genre Streptococcus et que l'on trouve dans la plupart des laits d'animaux. Streptococcus facilas provient de plantes et a servi à préparer des produits médicinaux destinés à

maîtriser les fonctions intestinales.

Les inventeurs ont découvert de nouvelles variétés de Streptococcus lactis possédant un constituant capable d'inhiber une allergie et pouvant servir à préparer des agents anti-allergiques. Il s'agit notamment

de Streptococcus lactis (Lister) Lohnis BK-042 et BK-045.

Les deux bactéries ont été déposées à l'Institut de Recherche sur les fermentations, Agence des Sciences et Technologies Industrielles à Ibaraki (Japon) et à l'American Type Culture Collection (Maryland, Etats- Unis d'Amérique). Voici les numéros de dépôt de ces cultures (FERM-P: Institut de Recherche sur la Fermentation): Streptococcus lactis (Lister) Lohnis BK-042:

FERM-P 4590

ATCC 31861

Streptococcus lactis (Lister) Lohnis BK-045:

' FERM-P 4591

ATCC 31862

Voici les caractéristiques mycologiques de ces microorganismes: I) Streptococcus lactis (Lister) Lohnis KB-042 a) Caractéristiques morphologiques: (1) Forme: Ovoides en chaîne Diamètre: 0,6 à 1,0 micron (2) Mobilité: Non-rmotilité (3) Coloration de Gram: positive b) Caractéristiques de fermentation: (1) Croissance: facultativement anaérobie (2) Croissance à 45 C: pas de résultat net

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(3) Liquéfaction de la gélatine: résultat négatif (4) Réduction du lait au tournesol: résultat positif (5) Fermentation de saccharides +: nette fermentation; -: pas de fermentation;

+:-pas de résultat net.

Mannose +' Mannitol + Maltose + Salicine + Saccharose + Amidon Glucose +

Inuline -

c) Caractéristiques physiologiques (1) Recherche d'oxydase: résultat négatif (2) Recherche de catalase: résultat négatif (3) Essai O-F (oxydation-fermentation): F (fermentation) (4) Croissance dans un bouillon à 6,5 % de NaCl: pas de croissance nette (5) Croissance à pH 9, 6: pas de croissance nette

(6) Effet de la température sur la crois-

sance (30 minutes de chauffage à 60 C): pas de croissance nette (7) Taux de production d'acide lactique à partiT du glucose: 96 % (8) Rotation optique de l'acide lactique produit par la souche: D+ II) Streptococcus lactis (Lister)' Lohnis BK-045 a) Caractéristiques morphologiques

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(1) Forme: ovoïdes en chaîne Diamètre: 0,6 à 1,0 microns (2) Mobilité: non-motilité (3) Coloration de Gram: positive b) Caractéristiques de fermentation (1) Croissance: facultativement anaérobie (2) Croissance à 45 C: positive (3) Liquefaction de la gélatine: résultat négatif (4) Réduction de lait au tournesol: résultat positif (5) Fermentation de saccharides (o +: nette fermentation; -: pas de fermentation nette; +: pas de résultat net): Mannose:.+ Mannitol: + Maltose: + Salicine: +

Saccharose -

Amidon: -

Glucose:+

Inuline: -

c) Caractéristiques physiologiques (1) Recherche d'oxydase: résultat négatif (2) Recherche de catalase: résultat négatif (3) Essai O-F (oxydation-fermentation): F (fermentation) (4) Croissance dans un bouillon à 6,5 % de NaCl: pas de croissance nette (5) Croissance à pH 9, 6: pas de croissance nette (6) Effet de la température sur la croissance (30 minutes de chauffage à 60 C): pas

de croissance nette.

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(7) Taux de production d'acide lactique à partir du glucose: 92 % (8) Rotation optique de l'acide lactique produit par la souche: D+ d) Hémolyse (1) Gélose au sang de cheval: réaction y (2) Gélose au sang de chèvre: réaction y Streptococcus lactis BK-051 a été déposé à

l'Institut de Fermentation d'Osaka (Japon) (désigné ci-

après par "IFO") sous le numéro de dépôt "'IFO 12007".

Streptococcus bovis BK-052 et Streptococcus faecalis BK-026 ont été respectivement déposés à IFO et à l'American Type Culture Collection. Voici les numéros de dépôt de ces souches dans les catalogues des souches Streptococcuis bovis BK-052. IFO 12057

ATCC 15351

Streptococcus fa:ecalis BK-026: IFO 12964

ATCC 10100

Les inventeurs ont également trouvé que ces souches possèdent, comme les nouvelles variétés BK-042 et BK-045, des constituants utiles- pour préparer des

agents anti-allergiques.

Au cours des recherches conduites par les inventeurs de la présente invention pour trouver un nous vel agent antiïallergique présentant une grande efficacité pour inhiber la production de l'immuno-globuline E (IgE)

pour éviter une maladie allergique par suite d'une sur-

production de IgE dans l'organisme, on a provoqué l'apparition de symptômes d'allergie chez des animaux d'expérience (cobayes) chez lesquels une application des constituants antiallergiques découverts selon la présente invention a suscité une réaction anti-allergique appréciable, ce. qui a confirmé le succès de l'application

des constituants de l'invention.

La présente invention vise donc notamment à

proposer un agent anti-allergique et son procédé de prépa-

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ration, les constituants efficaces de cet agent consis-

tant en une souche complète ou en un extrait-de souche de bactérie lactique appartenant au genre Streptococcus et choisis parmi Streptococcus lactis, Streptococcus bovis et Streptococcus faecalis. Selon la présente invention, des souches vivantes des microorganismes mentionnés

peuvent servir de principe actif pour l'agent anti-

allergique. Cependant, des souches mortes, traitées par la chaleur, ou des souches en poudre traitées par lyophilisation et des fragments de la souche peuvent également servir de principe actif pour l'agent. Des additifs ou stabilisants courants peuvent être appliqués à la substance obtenue selon la présente invention. Aucune restriction particulière n'est imposée pour la forme de l'agent anti-allergique qui peut donc être une suspension, un granule ou un granulé ou bien une poudre. Il n'y a pas de restriction pour le mode d'administration de l'agent produit selon l'invention, et cette administration peut

s'effectuer par voie orale, intrapéritonéale ou intra-

veineuse.

Voici les avantages spécifiques des agents anti-allergiques produits selon l'invention: (1) L'agent est efficace dans le cas de divers types de maladies immunitaires dues à un agent hétérogène, comme l'asthme bronchique allergique, l'asthme infantile, des rhinites allergiques (rhume ou asthme des

foins, etc), de la dermatite atopique, une allergie ali-

mentaire, une dermatose médicamenteuse, une toxicose hépatique allergique, une gastroentérite allergique, et il est efficace pour le traitement d'autres types de

maladies immunitaires.

(2) La préparation produite selon la présente

invention, consiste surtout en le microorganisme lui-

même. Au cours des expériences, on n'a constaté ni toxicité ni effetssecondaires, de sorte que la préparation peut

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être considérée comme présentant une grande sécurité pharmacologique.

(3) Contrairement à des préparations anti-

allergiques classiques obtenues à partir d'antigènes polyvalents, la présente invention n'utilise qu'une

seule bactérie.

(4) Les souches à utiliser sont non-pathogènes, de sorte qu'elles ne provoquent pas d'infections et offrent la possibilité d'utiliser un microorganisme

vivant.

(5) Contrairement à des préparations micro-

biennes classiques, qui sont à administrer par inoculation ou injection, les préparations selon la présente invention peuvent être administrées par voie orale, de sorte qu'on offre au patient la possibilité de se libérer de la crainte et de la résistance psychologique inhérentes à

une inoculation ou à une injection.

(6) L'administration de la préparation de l'invention pour traiter l'asthme a donné une chute importante du taux de IgE, ce qui confirme que la présente préparation peut se comparer de façon satisfaisante avec

l'application de n'importe quel -mode classique de trai-

tement. (7) La présente invention permet d'utiliser

des extraits des souches comme agent anti-allergique.

L'efficacité est garantie par une posologie qui peut être aussi faible que 1 mg/kg de poids corporel/jour et peut aller jusqu'à 50 mg/kg/jour, ce qui signifie une utilité inhabituelle pour un médicament. L'administration

peut s'effectuer par injection hypodermique, intra-

musculaire ou intraveineuse ou par voie orale.

L'invention se comprendra plus facilement à

l'étude des exemples suivants, présentés à titre illus-

tratif mais nullement limitatif du cadre de l'invention.

EXEMPLE I

On a fait fermenter Streptococcus lactis BK-042 et BK-045, respectivement, puis on les a isolés à l'aide

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d'une centrifugeuse. On a ensuite lavé de façon poussée les souches respectives avec de l'eau distillée puis l'on a effectué une lyophilisation de manière classique pour

obtenir une poudre sèche.

Pour les expériences, on a observé à titre préliminaire durant une semaine, des cobayes femelles âgés de 4 semaines et pesant 340 à 460 g. On a ainsi pu choisir des animaux sains. Pendant la totalité de la

période de l'observation préliminaire et pendant l'expé-

rience, on a gardé les cobayes dans une cage maintenue

dans des conditions réglées de 22 + 2 C pour la tempéra-

ture et de 50 + 5 % pour l'humidité, en les laissant absorber à volonté des aliments solides et de l'eau du robinet. Pour sensibiliser les cobayes d'essai, on a injecté à un lapin pesant environ 3 kg, une dose d'un ml

d'une suspension à 1:1 en poids de solution à 1 % d'a-

amylase (a-amylase cristalline provenant d'un bacille) et d'adjuvant complet de Freund, deux fois par semaine durant quatre semaines, cependant que l'on a injecté par voie

intrapéritonéale-à 21 cobayes, pour obtenir une sensibi-

lisation passive, 2 ml par animal d'une dose de sérum de

lapin anti-a-amylase (titre en anticorps: 32 fois) prove-

nant du lapin.

En commençant une, deux ou trois semaines avant d'effectuer la sensibilisation passive à l'aide du sérum de lapin anti-a-amylase, on a administré de force chaque jour, à l'aide d'une sonde métallique stomacale, à un groupe de trois cobayes-, 100 mg d'une suspension de

souches de'Streptococcus lactis BK-042 et BK-045, respec-

tivement, dans une solution saline physiologique.

On a étudié la production des anticorps en examinant les résultats des tests de recherche de IgE (en utilisant une trousse "Rhadebas" pour test de recherche d'IgE). Les résultats concernant les groupes d'animaux témoins (n'ayant pas reçu d'administration du produit) et les animaux d'essai (traités et sensibilisés)

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figurent au tableau Ie sur lequel les chiffres mentionnés indiquent la moyenne obtenue pour les trois animaux de

chaque groupe individuel.

TABLEAU I

Test de recherche du taux de IgE (ilm/ml) Il ressort à l'évidence du tableau I que la capacité de production d'anticorps est nettement inhibée,

chez les animaux du groupe traité par la souche bacté-

rienne, en comparaison des animaux qui n'ont pas été traités. La valeur un peu plus faible notée dans le cas des animaux ayant subi un traitement de deux semaines est attribuée au fait que les cobayes d'essai ont eu tendance à régurgiter la souche précitée administrée de force à

l'aide de la sonde stomacale, ce qui a provoqué une bron-

chite chez ces animaux.

L'inhibition de la réaction allergique, à l'aide des souches ci-dessus, a été étudiée de façon

correspondante.

On a effectué des essais comme pour la méthode de sensibilisation passive. C'est-à-dire que, 48 heures après achèvement de la sensibilisation passive à l'aide

du sérum de lapin anti-a-amylase produit comme indiqué ci-

dessus, on a placé des groupes de sept cobayes (pesant environ 340 g à 460 g) dans une chambre dans laquelle on les a soumis à une pulvérisation à l'aide d'une solution à 1 % d'a-amylase, à raison de 1,46 ml par minute pendant minutes, à l'aide d'un nébuliseur ultra-sonique pour observer le choc allergique subi par les animaux. On a _ Durée Souche Aucune 1 semaine 2 semaines 3 semaines administration S. lactis 31,7 17,3 17,0

BK 042

S. lactis 68,7

BK-045 33,0 16,3 19,3

,-.......L='..'.'

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administré de force chaque jour des doses de 400 mg de la souche bactérienne par kg de poids corporel. On a déterminé

l'efficacité de l'inhibition du choc allergique en compa-

rant le choc moyen des animaux individuels soumis au traitement à l'aide de la souche avec le choc des animaux des groupes qui n'ont pas été traités. Les résultats intéressants sont présentés sur le tableau II. Le degré de gravité ou de sévérité de l'attaque est indiqué par l'échelle suivante: Degré O:pas de signes Degré 1:tremblement, éternuement Degré 2:Dyspnée, ataxie, miction, défécation, Degré 3:Dyspnée, ataxie, miction, défécation, convulsions,

paralysie, cyanose.

Degré 4:mort.

TABLEAU II

Souche Témoin S. lactis BK-045 Témoin S. lactis BK-042 Posologie (mg/kg. 400 400 400 - 400 400 400 jour) Durée (jours) - 1 2 3 - 1 2 3 Degré 4 2 Sévérité de l'attaque Degré 3 4 1 2 2 1 et fréquenDegr 2 3 6 6 2 2 5 4 3 ce Degré 1 2 1 3 Degré 0 1 1 1 Nombre total de cobayes 7 7 7 7 7 7 7 7 Degré moyen de sévérité 2,57 2,14 1,86 1,71 3,00 2,29 1,71 1,29 Ecarttype 0.,535 0,3.78. 0,378 1,1.13 0,81.6 0,488 0,951 0,75 Mortalité (%) 0 0 0 0 29 0 0 0 Test t de Student. 1,740 2,872 1.,845 - 1,977 0,613 1,690 w w o N4 -4

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Dans le cas des animaux témoins non traités, on a constaté que tous les cobayes d'essai présentaient de l'hyperpnée, 3 minutes environ après pulvérisation de la solution de l % d'ô(-amylase, et l'on a observé parfois, environ 5 minutes plus tard, de la régurgita- tion, des convulsions, une miction et des signes analogues. On a trouvé que deux animaux ont souffert de cyanose, de paralysie des pattes arrière, et qu'ils sont morts en raison du choc anaphylactique général à la fin

de la pulvérisation.

On a trouvé par ailleurs -que les groupes de

cobayes traités par la bactérie présentaient, en comparai-

son des groupes de cobayes non traités, une excellente

inhibition du choc anaphylactique général.

EXEMPLE 2

On a fait fermenter des souches de Streptococcus lactis BK-042 et BK-045, puis on les a lavées de façon poussée à l'eau. A 150 g de chaque souche, on a ensuite ajouté de l'eau distillée pour compléter à 500 ml, et l'on

a soumis le tout durant 60 minutes à l'action des ultra-

sons (20 kHz, 200 W) pour rompre les bactéries. Chaque liquide contenant de la souche de S. Lactis rompue a été centrifugé à 11000 tours par minute durant 60 minutes, et chaque liquidesurnageant a été lyophilisé pour donner

environ 8 à 9 grammes de produit sec.

Les produits contenus dans les liquides surna-

geants respectifs ont été étudiés en vue de vérifier par des essais comparatifs l'efficacité de l'inhibition d'un

choc anaphylactique.

Pour les expériences, on a choisi des cobayes femelles, pesant en moyenne 240 g, que l'on a maintenus

en observation préliminaire durant une semaine.

Parmi ces cobayes, on a ensuite choisi 30 indivi-

dus sains pour constituer trois groupes séparés.

Pendant la totalité de la période préliminaire et pendant l'expérience, les animaux d'essai ont été

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maintenus dans une chambre thermostatée daélevage, à la température de 22 + 2 C et à 50 + 5 % d'humidité, en les laissant absorber sans aucune restriction une nourriture en poudre disponible dans le commerce et de l!eau du robinet. Avant la sensibilisation passive par application de sérum de lapin anti-albumine, on a fourni durant 20 jours aux 10 cobayes de chaque groupe, sauf le groupe témoin, de l'aliment auquel on a mélangé liagent produit selon l'invention et qui a été introduit en une quantité soigneusement calculée de manière à donner une dose

d'addition de 100 mg par animal et par jour.

Le sérum de lapin anti-albumine, a été prélevé sur un lapin (pesant environ 4 kg) auquel on a administré par voie intramusculaire, trois fois par semaine, pendant une période continue de 5 semaines, 1 ml d'une suspension d'un mélange de 1:1 de solution à 1 % d'albumine et

d'adjuvant complet de Frend.

On a injecté par voie intrapéritonéale à chaque cobaye, pour le soumettre à une sensibilisation passive, 2 ml du sérum de lapin anti-albumine (taux d'anticorps: 16 fois). 48 heures plus tardg chaque cobaye a été placé dans une chambre de 52,5 litres dans laquelle il a subi une pulvérisation d'une solution à 1 % d'albumine, appliquée à l'aide d'un nébuliseur ultrasonique à raison de 1,5- ml par minute pendant 30 minutes, afin d'observer le choc anaphylactique se produisant chez le cobaye pendant la pulvérisation et afin de comparer avec un cobaye témoin

non traité par le produit selon l'invention.

Les symptômes observes pour le choc ont été évalués et classes en 5 degrés (de O à 4) comme indiqué à l'exemple 1. Les résultats obtenus sont présentés au tableau III.

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TABLEAU III

S. lactis Souche Témoin BK-042 BK-045 Posologie (mg/ animal.jour) 100 Durée (jours) - 20 20 Degré 4 2 Sévérité Sevérité Degré 3 5 2 2

et fré-

quence Degré 2 2 del'at- Degré2..2 1. 2

de l'at-

taque taque Degré 1. 1 3 0 Degré 0 4 6 Nombre total des cobayes... 10 . 10 10 Degré moyen de sévérité. 2.,8 1,1 1,0 Ecart-type.. 0,919 1,197 1, 333 Mortalité..(%)............ 0 0 0 t de Student 3,564 2,871 (Note: a signifie 95 ** signifie 99 % de fiabilité % de fiabilité) Chaque cobaye a absorbé la nourriture à laquelle l'extrait préparé selon le procédé de l'exemple 2 a été mélangé en vue d'administrer 100 mg par animal et par

jour et le poids du cobaye a augmenté normalement.

On a trouvé que deux des cobayes non traités du groupe témoin présentaient une crampe grave 30 secondes apres la pulvérisation dtune solution à 1 % d'albumine et, une minute après le début de la pulvérisation, ils sont morts. Un autre cobaye a été fortement affecté par de la cyanose; on a trouvé que deux cobayes souffraient de cyanose et de paralysie des pattes arrière, 5 minutes environ après le début, et cinq animaux ont souffert de

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tachypnée, de paralysie des pattes arrière, d'ataxie, etc. Contrairement aux animaux du groupe témoin, six cobayes traités par la substance provenant de S. lactis BK-045 et quatre cobayes traités par la substance provenant de S.lactis PK-042 n'ont été nullement affectés et n'ont pas montré de changement. Certains des autres cobayes traités par la substance préparée selon la présente invention ont montré ses signes sérieux de cyanose, des crampes, etc, mais aucun des cobayes traités n'est

mort, et l'on a nettement observé une tendance à la diminu-

tion des symptômes de choc.

On peut également noter que l'on a trouvé que tous les animaux du groupe témoin présentaient un début de symptômes sévères, alors que six des dix animaux traités par la substance provenant de S.lactis n'ont pas présenté de symptomes par suite de la diminution du choc ou par suite de l'effet dû à l'administration de la

substance préparée selon l'invention.

Il convient également de noter que l'on n'a pas trouvé, sur les cobayes traités par le produit préparé selon l'exemple 2, d'effet secondaire pouvant être attribué

à ce produit.

A cinq rats Wistar (pesant 200 à 240 g), on a administré par voie orale, chaque jour, durant une période continue d'une semaine, 50 à 70 g, par kg de poids du corps et par jour, du produit lyophilisé obtenu par le procédé de l'exemple 2. L'autopsie de chacun de ces

animaux n'a révélé aucun signe d'anomalie quelconque.

EXEMPLE 3

On a fait fermenter de la même manière que celle décrite à l'exemple 2, Streptococcus lactis BK-042, BK-045, BK-051, Streptococcus bovis BK-052 et Streptococcus

faecalis BK-026, respectivement, pour obtenir un extrait.

Chaque extrait a été administré par voie orale, en le mélangeant à l'alimentation et selon une dose

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calculée de façon semblable à celle de l'exemple 2, à chaque cobaye des groupes d'essai avant la sensibilisation, et chaque extrait a également été administré au cobaye

après la sensibilisation, de la même façon.

L'antisérum de sensibilisation à appliquer au

cobaye a été obtenu à l'aide de sérum de lapin anti-a-

amylase de bacille, que l'on a ensuite dilué à 32 fois par une solution physiologique de sel. On a injecté par voie intrapéritonéale 1,5 ml de cette solution au cobaye

pour le sensibiliser. L'induction d'une réaction aller-

gique de l'animal a été obtenue 48 heures après la sensibilisation. Les symptomes observés pour la réaction ont été classés de la même façon que celle indiquée dans

l'exemple 1 ci-dessus.

Pour l'induction, on a placé sept cobayes de chaque groupe dans une cage de 52,2 litres et l'on a projeté par pulvérisation sur les cobayes d'essai une solution physiologique de sel, contenant 1 % d'a-amylase, projetée à raison de 1,5 -ml par seconde, à l'aide d'un nébuliseur ultrasonique pendant une période continue de minutes pour provoquer une inhalation du produit par les animaux. Les résultats obtenus sont présentés au

tableau IV.

*TABLEAU iV

tAnimaux toin Souchex témoins 5. lactis Sobovis S.faecalis Souche (a) (b) BK-042 BK-045 I B-051 BK-052 BIK-05 Dose (mg/kg..jour) Durée (jours) Degré 4 Sévérité et fré- Degré 3 quence de l'at- Degré 2 taque Degré 1 Degré 0Nombre d'animaux Degré moyen de sévérité Ecart-type Mortalité (%) t de Student 3,14 0,690 28,6 2,00 [7 1,57

1,15510,976

2,336 3,476 10

14 I 14

1,86 1,069 1,29 1,113

2,242 2,607

1,57 1,512 14,3 2,308 1,57 1,134 i 2,14 1,574 28, lu 1' 1,57 1,13e U 2,00 0,816 1U 1,25 1,254

3,130 11,5401 2,0181 2,24013,144

_______________________________________ J.0 ______________ 0 -- ___________________________

a) animaux témoins ni sensibilisés, ni traités b) animaux témoins sensibilisés, mais non traités *) 95 % de fiabilité; C) 99 % de fiabilité Co \0 mO% "0

2481 927

--EXEMPLE 4

On a fait fermenter une souche de Streptococcus lactis BK-045 dans 100 litres d'un bouillon de culture comprenant 1 % de glucose, 1 % de levure en poudre et 1 % de peptone à 320C pendant une période continue de 18 heures, puis le bouillon de fermentation a été centrifugé à 10 000 tours par minute afin d'isoler la souche du bouillon. La souche a été ensuite lavée de façon poussée à l'eau distillée et l'on a placé 150 g de cette souche dans un bécher conique de 500 ml, puis on a dilué à l'eau distillée jusqu'à 500 ml pour obtenir une suspension de la souche. La suspension a été ensuite soumise à rupture des cellules sous l'effet des ultra-sons, à 200 kHz et 200 watts, dans un bain d'eau glacée pendant une période

continue d'une heure. La souche ainsi brisée a été -

centrifugée à il 000 tours par minute pendant une heure

pour précipiter des substances à poids moléculaire élevé-

comprenant surtout des parois grossières des cellules de la souche. Le liquide surnageant a été ensuite concentré à basse température et sous pression réduite, puis dialysé pendant une période continue de 48 heures à travers une membrane semi-perméable du type cellulosique pour obtenir un résidu de dialyse. Le résidu a été ensuite traité par centrifugation à 12 000 tours par minute pendant une période continue de 20 minutes. On a prélevé le liquide surnageant qui a-été lyophilisé pour donner une poudre. La poudre obtenue a été blanche ou jaune pâle et inodore. Le rendement en poudre a été d'environ 500 mg

pour 100 g de souche vivante.

La poudre obtenue à partir du dernier liquide surnageant, selon l'exemple 4 ci-dessus, a été étudiée en vue d'en confirmer l'efficacité pour inhiber l'apparition

d'un choc anaphylactique.

Des cobayes femelles (pesant en moyenne 210 g)

ont servi pour l'expérience et ont été soumis à une obser-

2481 927

vation préliminaire durant 10 jours. Parmi ces animaux, cinq cobayes sains ont été prélevés pour chaque groupe d'essai. Pendant l'observation préliminaire, aussi bien

qu'au cours de la période d'essai, les animaux ont été main-

tenus dans une chambre thermostatée dont la température a été gardée à 23 + 30C, les cobayes pouvant absorber sans aucune restriction un aliment en poudre disponible dans le

commerce et de l'eau du robinet.

La poudre obtenue selon le présent exemple a été mise en suspension dans une solution physiologique de sel et la solution a été administrée par voie intraveineuse dans les pattes avant, pendant une période continue de deux jours, à la dose de 50 mg de la poudre

par kg de poids corporel par jour.

Pour obtenir chez les cobayes d'essai une sensi-

bilisation passive, on leur a injecté par voie intra-

péritonéale, 1,5 ml de sérum de lapin anti-a-amylase (titre en anticorps: 32 fois) obtenu sur un lapin, pesant 3 kg, et auquel on a injecté, trois fois par semaine pendant une période continue de 5 semaines, par voie intramusculaire, 1 ml (par animal) d'une suspension d'adjuvant complet de Freund, dans une solution à. % d'a-amylase. 48 heures après cette sensibilisation, on a placé chaque cobaye dans une chambre cylindrique de 1,68 litre dans laquelle le cobaye a subi, pendant une période continue de 10 minutes, en vue d'une inhalation, une pulvérisation, effectuée à raison de 0,5 ml par minute à l'aide d'un nébuliseur à ultra-sons, d'une solution à 1 % d'a--amylase afin d'observer sur ce cobaye le choc anaphylactique et de pouvoir comparer avec le comportement de cobayes témoins. Le classement de la sévérité du choc s'est

effectué comme décrit à l'exemple 1.

Les résultats observés sont présentés au

tableau V.

2481 927

TABLEAU V

Souche S. lactis Témoin. BK-045 Dose (mg/kg.jour)............-..... 50 Durée (jours)............... 2 Degré.4.......4.....

Degré 3..................

Sévérité et fré- Degré 2........ 1 quence de l'at- Degr.é 1............ 2 taque

Degré 0............. 2.

Nombre de cobayes............. 5..

Degré moyen de sévérité..... 3,.8... 0,8 Ecart-type... . 0.,.447.... 0., 837 Mortalité.(%).................8.0'.. 0 tde student..............7.,.0. 76.._ (Note 99 % de fiabilité.) Au cours des expériences, on a observé que les cobayes du groupe témoin subissent une grave crampe 30 secondes après la pulvérisation avec une solution à 1 %

d'albumine, et une minute après le début de la pulvéri-

sation, 4 cobayes sont morts. Le dernier a présenté une

forte cyanose, mais n'est pas mort.

Par ailleurs, l'un des cobayes traités à l'aide des poudres préparées selon l'exemple 4 a présenté de la dyspnée, une crampe ou de l'ataxie, les autres cobayes ont présenté de Ihyperpnée et des convulsions, mais aucun n'est mort. On voit ainsi la grande efficacité,

à l'encontre des réactions d'allergie, des poudres obte-

nues selon l'exemple 4.

2481 927

EXEMPLE 5

Deux souches de S. lactis BK-045, séchées en 1935, ont été respectivement brisées, centrifugées et dialysées de façon semblable à celle utilisée pour l'exemple 4. Les dialysats respectifs ont été ensuite

centrifugés à 12 000 tours par minute durant 20 minutes.

Un précipité a été écarté et un liquide surnageant

lyophilisé, ce qui a donné 10,05 g d'un produit pulvé-

rulent blanc ou jaune pale. L'autre précipité a été lyophilisé, et le rendement a été de 4,95 g. On appellera

ci-après "B-i" ce produit ou cette fraction.

On a lentement ajouté de l'alcool éthylique à 99,5 % en volume à l'autre liquide surnageant pour obtenir une solution présentant une concentration d'environ 25 %

en volume d'alcool éthylique, en vue d'un fractionnement.

Pendant l'addition de l'alcool éthylique, on a observé une suspension blanche que l'on a ensuite centrifugée à 12 000 par minute durant 20 minutes pour obtenir un précipité. Après décantation, ce précipité a été lyophilisé et a donné 4,60 g d'un produit pulvérulent blanc ou jaune pâle. On appellera ci-après B-21' ce produit ou cette fraction. - On a versé dans le liquide surnageant décanté un supplément d'alcool éthylique à 99, 5 % pour obtenir une solution contenant environ 40 % en volume d'alcool éthylique, et l'on a observé à nouveau une suspension blanche qui a été centrifugée à 12 000 tours par minute durant 20 minutes- pour séparer le précipité. Le liquide surnageant a été décanté et le précipité lyophilisé, ce qui a donné 4,23 g d'un produit pulvérulent blanc ou jaune pâle. On appellera cis-après "B--3" ce produit ou

cette fraction.

On a ajouté au liquide surnageant décanté un supplément d'alcool éthylique à 99,5 % pour obtenir une solution comportant environ 50 % en volume d'alcool

2481 927

éthylique, et l'on a observé la formation d'une sus-

pension légèrement blanche que l'on a centrifugée à 12 000 tours par minute durant 20 minutes. On a obtenu par décantation le précipité qui a été lyophilisé et a donné 0,05 g d'un produit pulvérulent blanc ou jaune

pâle. On appellera ci-après ce produit "P-4".

On a administré chaque fraction à des cobayes pour en étudier l'effet anti-anaphylaxie. Pour cette étude, on a choisi de la même façon qu'à l'exemple 3

des femelles que l'on a réparties en des groupes compor-

tant chacun 7 cobayes. Les autres conditions ont été les mêmes qu'à l'exemple 3. Chaque fraction de produit a été mélangée à l'alimentation de chaque cobaye à la dose de 150 mg de produit par kg et par jour. La dose a été calculée en tenant compte du poids d'aliment absorbé par chaque cobaye le jour précédent. Le durée de l'essai a été de 14 jours, et le traitement après

l'administration a été le même qu'à l'exemple 3.

Les résultats obtenus sont présentés au

tableau VI.

TABLEAU VI

Fraction Témoin B-1 B-2 B-3 B-4 Dose (mg/kg.jour) 150 150 150 150 Durée (jour) - 14 14 14 14 Degré 4 5 4 3 1 1 Sévérité Degré 3 2 3 1 1 3

de l'at-

taque et Degré 2 1 3 1 fréquence Degré 1 1 1 1 Degré 0 1 1 Nombre total de cobayes 7 7 7 7 7 Degré moyen de sévérité 3,71 3,57 2,57 2,00 2,29 Ecart-type 1,428 0,535 1,618 1,291 1,033 Mortalité (%) 71 57 43 14 14 t de Student 0,512 0,971 3,281** 2,569* % de fiabilité : 99 % de fiabilité un o %0 ru

2481 927

Après induction à l'aide d'une solution à 1 % d'o d-amylase, on a constaté que tous les animaux témoins ont présenté de la dyspnée et des éternuements, et que

cinq d'entre eux sont morts, 4 minutes environ après le.

début de l'induction. Deux cobayes ont présenté des atta-

ques sévères de cyanose, de convulsions et de paralysie.

Quatre des cobayes traités par administration de la fraction B-1 sont morts, et trois d'entre eux avaient présenté de graves symptômes, ce qui revient à dire que la fraction B-1 n'a pas été efficace contre des symptomes d'allergie. Trois des cobayes traités par administration de lafraction B-2 sont morts et un seul a présenté de graves symptômes. Puisque les autres n'ont pas présenté des sympt6mes d'allergie à un degré aussi élevé que dans le cas des animaux traités par la fraction B-1, on a pensé

qu'une fraction B-2 a pu efficacement empêcher l'appari-

tion de symptômes allergiques.

D'autre part, les fractions B-3 et B-4 ont pu de façon nettement efficace empêcher l'apparition de symptômes d'allergie. L'un des animaux traités par administration de la fraction B-3 est mort et un autre cobaye a présenté de graves symptômes, mais les autres animaux n'ont présenté que des symptômes légers. Ainsi, on a trouvé que la fraction B-3 peut-très efficacement empêcher l'apparition de symptômes d'allergie. L'un des cobayes traités par administration de la fraction B-4 est mort et trois autres de ces animaux ont présenté de graves symptômes, mais les autres n'ont eu que de faibles symptômes. Ainsi, la fraction B-4 a pu très efficacement empêcher l'apparition de

symptômes d'allergie.

Enfin, on n'a pas trouvé au cours de cette étude

d'effets secondaires chez-les cobayes.

EXEMPLE 6

Selon la présente invention, on peut faire fermenter la bactérie lactique appartenant au genre ..........sl Streptbcocceus 'lactts en milieu solide ou liquide de culture,

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mais il vaut mieux choisir un milieu liquide de culture ou un bouillon pour obtenir une grande quantité de souches. Différents genres de bouillons de culture sont disponibles dans le commerce, mais, pour augmenter le rendement en bactéries vivantes par unité en poids ou volume de bouillon de culture, on a préparé spécialement pour les expériences certains genres de bouillon de culture, comme décrit ci-après Bouillon de culture I: Dans un litre d'eau ayant subi un échange d'ions, on a dissous 5 à 50 g de glucose, 3 à 20 g de poudre de levuree3 à 20 g de peptone, et 0 à 20 g de bicarbonate de sodium, puis l'on a stérilisé sous pression élevée à la température de 1210C durant 20 minutes et l'on a ensuite ajusté,avec de la soude caustique, le pH

à une valeur comprise entre 7,0 et 8,5.

Bouillon de culture Il: Dans de l'eau ayant subi un échange d'ions, on a dissous 5 à 50 g de glucose, 0 à 20 g de citrate de sodium, 0 à 20 g de bicarbonate de sodium, 0 à 20 g de phosphate de potassium, pour obtenir 500 ml de bouillon A. Dans de l'eau ayant subi un échange d'ions, on a dissous 5 à 20 g de levure en poudre et 5 à 20 g de peptone pour obtenir 500 mlde bouillon B.

On a stérilisé les bouillons A et B sous pres-

sion élevée, à la température de 1210C durant 20 minutes, puis on les a mélanges. On a ajusté le pH du mélange avec de la soude caustique à une valeur comprise entre 7,0 *et

8,5.

Bouillon de culture III Dans un litre d'eau ayant subi un échange d'ions, on a dissous 5 à 20 g de glucose, 5 à 20 g de levure en poudre, 5 à 20 g de peptone, 0 à 20 g de citrate de sodium et 0 à 20 g de phosphate de potassium, puis l'on a ajusté le pH à l'aide de soude caustique à une valeur

2481 927

comprise entre 7,0 et 8,5 et l'on a traité par ultra-

filtration. On a fait fermenter respectivement Streptococcus lactis BK042, BK-045 et BK-051; Streptococcus bovis BK-052; et Streptococcus faecalis BK-026. Une mesure du pH du bouillon de culture à la fin de la fermentation

a donné une valeur de 4,3 à 4,5.

Après la fermentation, toutes les souches ont

été respectivement isolées de leur bouillon de culture.

Voici les rendements obtenus par souche: Streptococcus lactis: environ 6, 0 à 6,5 g/l Streptococcus faecalis: environ 6,0 à 6,5 g/l

Streptococcus bovis: environ 8 g /1.

Dans la première étape, les souches obtenues selon le mode opératoire cidessus ont été lavées de façon

poussée deux fois avec un volume de solution saline physio-

logique représentant environ 5 fois le volume des souches, puis celles-ci ont été lavées une fois avec suffisamment

d'eau distillée.

Dans la seconde étape, de l'eau distillée a été ajoutée à 150 g des souches lavées pour obtenir environ 1500 ni d'une suspension des souches que l'on a ensuite traitée par des ultrasons pour briser les souches. La suspension contenant les souches brisées a été-centrifugée

et l'on a récupéré le liquide surnageant.

Dans la troisième étape, on a lyophilisé, à l'aide d'un appareil approprié, le liquide surnageant obtenu dans la seconde étape pour concentrer à 1/10e du volume d'origine. Le concentré a été dialysé deux fois à travers une membrane semi-perméable du type cellulosique en présence d'une quantité d'eau distillée représentant dix fois celle du concentre, pendant une période continue de 24 heures dans une pièce à basse température. Le résidu du dialysat a été centrifugé à 12000 tours par minute pendant une période continue de 20 minutes, et l'on

2481 927

a recueilli le liquide surnageant.

On a ensuite ajouté progressivement à ce liquide surnageant de l'alcool éthylique à 99,5 %. L'addition de

l'alcool éthylique a provoqué-une modification des proprié-

tés de la protéine insoluble dans le liquide surnageant

et qui est passée en suspension dans ce liquide surnageant.

L'addition de l'alcool a été arrêtée pour une concentration en alcool éthylique de 30 %. Le liquide surnageant a été centrifugé pour obtenir un précipité. On a noté que l'on a ajouté au liquide surnageant, dans la quatrième étape, 43 ml d'lalcool éthylique à 99,5 % pour 5 ml du liquide

surnageant de départ.

On a lyophilisé le précipité obtenu dans cette quatrième étape pour obtenir une poudre. La poudre a été

de couleur blanche ou gris clair, inodore et sans goût.

Le rendement en poudre a représenté 0,23 % du poids de la

souche lavée.

EXEMPLE 7

On a répété le mode opératoire décrit à l'exemple 6, et on a préparé, en opérant comme pour la quatrième

étape, 10 g de précipité. On a ajouté à ce précipité de-

l'eau distillée pour obtenir 50 ml d'une suspension. On a placé la suspension dans un récipient et on l'a chauffée dans un bain-marie bouillant durant 15 minutes. La protéine thermiquement dénaturée que l'on a ainsi obtenue a été centrifugée à 12 000 tours par minute pendant une période continue de 20 minutes, pour obtenir un précipité qui a été lyophilisé et a donné -une poudre sèche. La poudre sèche a contenu la plupart de la protéine thermiquement dénaturée, le traitement décrit cidessus ayant enlevé les substances solubles combinées- à la protéine. Le rendement en poudre a été d'environ 0,12 % du poids de la souche lavée. Les produits obtenus dans les exemples 6 et 7

ont été soumis à des essais sur les animaux.

2481 921

En général, on connaît bien des méthodes pour induire une réaction allergique chez des vertébrés. Voir, par exemple, T. Yagura et al. "Experimental Allergic Asthma in Guinea Pigs" LAsthme allergique expérimental chez des cobayes7, Allergology, Excepta Medica P. 148,

1971 Amsterdam.

Les inventeurs ont fait appel à des cobayes comme animal d'expérience pour produire des antigènes in vivo par introduction d'une hétéro- protéine dans un cobaye, et l'on a ensuite provoqué de l'asthme allergique par sensibilisation active par l'antigène. On a ainsi pu vérifier l'action anti-allergique des substances préparées

comme décrit dans les exemples 6 et 7. Les résultats obte-

nus sont présentés au tableau VII.

TABLEAU VII

Témoins Animaux témoins (a) (b) Exemple 6 Exemple 7 Dose (mg/kg. jour) 1 1 Durée (jour) 3 3 sévérité Degré 4 7

de l'at-

ltaquet Degré 3 2 3 3 taque et fréquence Degré 2 1 4 3 Degré 1 2 1 Degré 0 5 1 1 Nombre total de cobayes 5 10 10 10 Degré moyen de sévérité 0 3,6 1,9 2,4 de l'attaque Ecart-type 0,699 0,994 1,265 Mortalité (%) 70,0 0 20, 0 t de Student 4,422** 2,626* (a) témoins ni traités ni sensibilisés (b) témoins sensibilisés, mais non traités par le produit *: 95 % de fiabilité; ** 99 % de fiabilité de l'invention ra Co %O >J w b-'

2481 927

Il ressort des résultats présentés sur le tableau VII que les substances préparées selon les exemples 6 et 7 ont des effets remarquables dans l'inhibition des anticorps, des substances chimiques induisant une attaque comme de l'histamine, de la sérotonine, etc, sur l'antagonisme entre les anticorps

et les substances chimiques et pour favoriser la produc-

tion d'anticorps anti-allergiques.

Par ailleurs, un asthme allergique expérimental a été provoqué chez des cobayes par sensibilisation passive à l'aide d'un sérum de lapin. On a étudia, l'action anti-allergique des substances préparées selon les exemples 6 et 7 en administrant ces substances à des cobayes d'essai. Les résultats de l'administration des produits des exemples 6 et 7 sont respectivement présentés

sur les tableaux VIII et IX.

TABLEAU VIII

Témoins S. lactis S.bovis S.faecalis (a) (b) BK-045 BK-052 BK-026 Dose (mg/kg.jour) 3 1 0,5, 3 3 Durée (jours) 10 10 10 10 10 I Sévérité de Degré 4 9 1 1 2 3 1 l'attaque i Degré 3 7 2 2 4 1 3 et fréquence Degré 2 1 2 3 1 2 1 Degré 1 2 3 2 1 1 Degré 0 5 Nombre de cobayes 5 17 10 10 10 7 7 Degré moyen de sévérité 0 3,47 1,60 1,90 2,40 2,85 2,28 de l'attaque Ecart-type 0,624 1,430 1,197.1,350 1,215 1,380 Mortalité (%)52,9 10,0 10, 0 20,0 42,9 14,3 t de Student 4,71* 4,48** 4,57* 1,67 2,96** (a) animaux témoins ni sensibilisés'ni traités (b) animaux témoins sensibilisés et non traités : 95 % de fiabilité; *: 99 % de fiabilité w w -%I No

TABLEAU IX

Témoins S.lactis S.bovis S.faecalis (a) (b) BK-045 BK-052 BK-026 Dose (mg/kg.jour) 1 1 1 Durée (jours) 7 7 7 , Degré 4 6 1 Sévérité de l'attaque Degré 3 3 4 4 5

et fré-

quence Degré 2 1 1 2 Degré 1 2 2 2 Degré 0 5 3 2 1 Nombre de cobayes 5 10 10 10 10 Degré moyen de sévérité 3,5 1,6 2,0 2,1 de l'attaque Ecart-type 0,707 1,350 1,414 1,101 Mortalité (%) 60 0 10 0 t de Student 3,943** 3, 000**.3,385** (a) animaux témoins ni sensibiliÉês, ni traités (b) animaux témoins sensibilisés et non traités *: 95 % de fiabilité; ** 99 % de fiabilité oa Co O$ r%.

2481 927

Dans le cas de la sensibilisation passive, de l'anticorps IgE anti-lapin a été produit dans le sérum anti-lapin. On comprendra qu'en administrant à un cobaye d'essai l'anticorps IgE précité, on provoque chez ce cobaye une réaction allergique pouvant être inhibée par

la substance préparée selon l'invention.

Streptococcus lactis, Streptococcus bovis et.

Streptococcus faecalis sont des microorganismes très sûrs.

Comme on en utilise des extraits dans la présente inven-

tion, les agents anti-allergiques selon l'invention seront naturellement très sûrs aussi. On a cependant choisi et

examiné certaines des souches et certains de leurs ex-

traits pour en confirmer la sécurité. Les résultats

obtenus sont présentés sur les tableaux X à XIII.

TABLEAU X

DL50 (mg/kg) Substance animal sexe Nbre - Dose (mg/kg) voie voie voie

intra- intra- per-

veineuse périto- orale .... '....... néale

BK-02 6....souiis d.-dy.. 8...19.0... 4 0......3.0.0 0..

" Irats Wister M 8 250 >5000

_.............................

BK-045. souris.ddy..M 1.0. 2.50.. 6 00... >3.0.00 0

le rats. Wister -M'..1.0....... >3.0.0.00.

BK-045 souris -ICR F 10 720-1040

extrait........................ .............

selon selon 2 rats.Wister M.1.0....00.... >3.0.0.00 l'Nbre: nombre Nbre: nombre

2481 927

TABLEAU XI

Substance animal sexe Nbre Dose (mg/kg) jours Constata-

--____ ____ ____ ___tion

K-045 rats Wister M 4 50000-70000 5 Aucun ani-

mal n'est mort Diarrhée ouris ddy M 6 100000 5 3 souris mortes de

malnutri-

____ _,__..,._.,_ _._ _ _ _ _ _ _tion

TABLEAU XII

Substance- animal sexe Nbre Dose Durée d' Constata-

alimen- tion ,......., tation BK-045 rats Wister. F. 1.0. 5000 mg/kg 3 mois BK-045 souris. ddy F. 10 300.0 mg/kg 6 mois BK-045 souris. çdy. M. 10. 3.000 mg/kg 6 mois Pas de

_______, - -change-

BK-045 rats Wister M 10 10 % de 4 mois ments

l'alimen- histochi-

....tation miques ou..DTD: . patholo-

BK-045 rats Wister F 10 10 % de 4 mois giques

l'alimen-

....... tation......DTD: BK-045

Extrait Dbtenu rats selon Fischer M 5 5 % de 22

l'ex.2. .l'alimen- semai-

-., _ tation nes

* On a utilisé des animaux âgés de 86 semaines.

2481 927

TABLEAU XIII

Il va de soi que, sans sortir du cadre de l'in-

vention, de nombreuses modifications peuvent être apportées a la composition anti-allergique et à son procédé de

production décrit ci-dessus.

Substance animal sexe Nbre Dose Durée Consta-

de 1' tation admi-

nistra-

.................. t i o n =_._.. ___.._ __ _ t ion BK-045 rats Wister M 4 0,05 % dam 18 mois..DTD: l'alimen-

tation pas de

tation _ change-

0,5 % dans 18 mois ments

l'alimen- 1moshisto-

tation. chimiques

t.at.on ou patho-

dans logiques % dans 18 mois logiques

l'alimen-

...... tation BK-026 rats. Wister M....5 1.5.0. mg/kg 1.8. mois souris. ddy. M 6....6.250. mg/kg 2.4 mois..DTD: 2481 927

Claims (18)

1REVENDICATIONS

1. Composition anti-allergique, caractérisée en ce qu'elle comporte comme constituant principal une

bactérie lactique appartenant au genre Streptococcus.

2. Composition anti-allergique selon la revendication 1, caractérisée en ce que la bactérie lactique est Streptococcus lactis (Lister) Lohnis BK042

(ATCC 31861).

3. Composition anti-allergique selon la reven-

dication 1, caractérisée en ce que la bactérie lactique est Streptococcus lactis (Lister) Lohnis BK-045 (ATCC

31862).

4. Composition anti-allergique selon la revendi-

cation 1, caractérisée en ce que la bactérie lactique

est Streptococcus lactis BK-051 (IFO 12007).

5. Composition anti-allergique selon la reven-

dication 1, caractérisée en ce que la bactérie lactique

est Streptococcus bovis BK-052 (ATCC 15351).

6. Composition anti-allergique selon la reven-

dication 1, caractérisée en ce que la bactérie lactique

est Streptococcus faecalis BK-026 (ATCC 10100).

7. Composition anti-allergique selon l'une

quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce

que le constituant principal de la bactérie lactique.est

lyophilisé sous forme d'une poudre.

8. Procédé de production d'une composition anti-

allergique, caractérisé en ce qu'on fait fermenter une bactérie lactique appartenant au genre Streptococcus, on isole cette bactérie lactique du milieu de fermentation obtenu et on la lyophilise pour l'obtenir sous forme de

poudre sèche.

9. Procédé de production d'une composition anti-

allergique, caractérisé en ce qu'on fait fermenter une bactérie lactique appartenant au genre Streptococcus, on lave la souche de cette bactérie lactique, on y ajoute

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de l'eau distillée, on broie la souche, on centrifuge le liquide contenant la souche broyée et l'on recueille le

liquide surnageant.

10. Procédé de production d'une composition anti-allergique, caractérisé en ce qu'on fait fermenter une bactérie lactique du genre Streptococcus, on lave

soigneusement la souche ayant fermenté, on la met en sus-

pension)dans de l'eau, on broie la souche dans cette suspension et l'on en précipite des impuretés pour obtenir un premier liquide surnageant que l'on dialyse à l'aide d'une membrane semi-perméable, et l'on centrifuge le résidu de la dialyse pour obtenir un second liquide surnageant.

11. Procédé de production d'une composition anti-allergique selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'on lyophilise le second liquide surnageant pour

obtenir une poudre.

12. Procédé de production d'une composition anti-allergique, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes consistant à: (A) laver la souche, ayant fermenté, d'une bactérie lactique du genre Streptococcus, (B) mettre cette souche lavée en suspension dans de l'eau, rompre ou broyer la souche, isoler de la suspension cette souche broyée et recueillir de la suspension un premier liquide surnageant;

(C) dialyser, a l'aide d'une membrane semii-.

perméable, ce liquide surnageant et, après centrifugation, recueillir un second liquide surnageant; et (D) ajouter de l'alcool ' ce second liquide surnageant pour précipiter la protéine-contenue, et

recueillir le précipité de cette solution alcoolique.

13. Procédé selon la revendication 12, pour produire une composition antiallergique, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes supplémentaires consistant à

2481 927

(E) ajouter de l'eau distillée au précipité pour le mettre en suspension; et (F) chauffer cette suspension pour recueillir

sous forme de précipité la protéine qui y est contenue.

14. Procédé de production d'une composition

anti-allergique, selon l'une quelconque des revendications

8 à 13, caractérisé en ce que la bactérie lactique du genre Streptococcus est Streptococcus lactis (Lister)

Lohnis BK-042 (ATCC-31861).

15. Procédé de production d'une composition

anti-allergique, selon l'une quelconque des revendications

8 à I3, caractérisé en ce que la bactérie lactique du

genre Streptococcus est Streptococcus lactis (Lister) -

Lohnis BK-045 (ATCC 31862).

16. Procédé de production d'une composition

anti-allergique, selon l'une quelconque des revendications

8 à 13, caractérisé en ce que la bactérie lactique du genre Streptococcus est Streptococcus lactis BL-051

(IFO 12007).

17. Procédé de production d'une composition

anti-allergique, selon l'une quelconque des revendications

8 a 13, caractérisé en ce que la bactérie lactique du genre Streptococcus est Streptococcus bovis BK-052 (ATCC

15351).

18. Procédé de production d'une composition anti-

allergique, selon l'une quelconque des revendications 8 à

13, caractérisé en ce que la bactérie lactique du genre Streptococcus est Streptococcus faecalis BK-026 (ATCC

10100).