"Composition anallergique et procédé pour sa préparation" La présente invention concerne des substances anallergiques et un procédé pour leur préparation. Plus particulièrement, l'invention se rapporte à une nouvelle substance anallergique faisant usage des lactobactéries appartenant au Stroptococcus genus.
De nombreux types de médicaments ont été produits au départ de micro-organismes ou de parties de ceux-ci. Les médicaments basés sur les micro-organismes, tels que les produits pharmaceutiques pour le contrôle des fonctions intestinales, préparés à partir de souches appartenant au Streptococcus genus, plus spéciale-
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nes polyvalents obtenues en partant de microbes pathogéniques ou de microbes de l'appareil respiratoire, sont largement utilisés. Le constituant principal de ces micro-organismes est un type de protéines qui est étranger chez l'homme et chez les animaux. Toutes les enzymes pharmaceutiques sont dérivées de substances ou de corps autres que l'homme, sauf l'urokinase, et sont hétérogènes pour l'homme.
Lorsqu'un certain type de protéines étrangères au corps est introduit dans un mammifère, des anticorps se produisent automatiquement. La tendance à la production des anticorps est généralement importante lorsque ces protéines sont injectées dans un muscle, bien que le problème consiste en ce que cette injection peut produire l'anticorps IgE capable d'induire une allergie. Dès que des allergènes sont produits dans un corps vivant, un choc anaphylactique peut être provoqué dans celui-ci à cause de la réaction immunologique à l'effet toxique des antigènes introduits dans le corps.
Les symptômes pathologiques résultant des diverses réactions immunologiques causées par l'entrée d'hétéro-antigènes étrangers dans le corps, sont dénommés "maladie d'hétéro-immunité".
Les maladies allergiques ont été classées par Gell et Coombs
(Gell PGH, Coombs RRA, Lachmann PJ (éditeurs)) : "Clinical Aspects of Immunology" - (Aspects cliniques de l'immunologie), 3me édition, Blackwell, 1975) en quatre types fondés sur la nature des réactions immunologi.ques :
Type 1 : les anticorps IgE fixés sur des cellules usées réagissent avec l'antigène, en déclenchant la libération de l'histamine et l'activation de la substance à réaction lente (SRS-A) et du facteur chémotactique éosinophile (ECF-A); il s'agit du mécanisme responsable de l'atopie de l'asthme, du rhume des foins, de l'urticaire, de la dermatite atopique, de l'anaphylaxie et de
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Type II : les anticorps IgE et IgM réagissent avec l'antigène des cellules-cibles et activent le complément en causant la lyse
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réactions aux médicaments;
Type III : les anticorps IgG ou IgH forment des complexes avec l'antigène et complètent les facteurs chémotactiques neutrophiles, ce qui conduit à une inflammation locale des tissus; la maladie du sérum fait naître ce mécanisme;
Type IV : les lymphocytes sensibilisés réagissent avec l'antigène en produisant une inflammation par l'intermédiaire de l'action des lymphokines; un exemple principal est la dermatite par contact allergique.
Ces réactions allergiques se rencontrent chez différents mammifères, ainsi que chez l'homme.
La Demanderesse a effectué une série de recherches sur la production d'anticorps dans des cobayes en utilisant des protéines étrangères appliquées à ceux-ci. Des résultants intéressants ont été obtenus par l'application de Stroptococci, dérivés du lait de vache, à des cobayes souffrant d'une augmentation de la valeur des anticorps et où les bactéries inhibaient une surproduction de IgE, qu'ils soient vivants ou morts.
En partant de la possibilité d'inhiber la surproduction de <EMI ID=4.1> <EMI ID=5.1>
diverses maladies d'hétéro-immunité et ainsi les prévenir. Elle a recherché en outre l'effet d'inhibition d'une réaction allergique en se servant d'une maladie d'hétéro-immunité typique, pour laquelle un système expérimental a pu être aisément établi et a donné des résultants très valables et satisfaisants.
La présente invention est réalisée conformément aux observations précitées.
Il existe un grand nombre de lactobactéries appartenant au Streptococcus genus, à savoir le Streptococcus pyogenes, le Streptococcus equismilis, le Streptococcus zooepidemicus, le Streptococ eus equi, le Streptococcus dysgslatiae, le Streptococcus sanguis,
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tococcus agalactiae, le Streptococcus acidominimus, le Streptococ-
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Streptococcus equinus, le Streptococcus thermophiluB, le Streptococcus faecalis, le Streptococcus faecium, le Streptococcus avium, le Streptococcus uberis, le Streptococcus lactis et le Streptococcus cremoris.
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micro-organisme non pathogénique typique que l'on trouve dans la plupart des laits d'animaux et qui est largement utilisé pour la préparation de produits laitiers, de beurre, de fromage, de yogourt et analogues.
Le Streptococcus bovis est un autre type de lactobactérie appartenant au Streptococcus genus trouvé dans la plupart des laits d'animaux.
Le Streptococcus facilas est dérivé de plantes et a été utilisé pour préparer des médicaments destinés au contrôle des fonctions intestinales.
<EMI ID=9.1> gie et qui peuvent être utilisées peur préparer des agents anallergiques, notamment les Streptococcus lactis (Lister) Lohnis BK-042 et BK-C45. Les deux bactéries ont été déposées au "Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology", Ibaraki, Japon (ci-après FERM-P) et à l' "American Type Culture Collection", Maryland, Etats-Unis d'Amérique (ci-après ATCC).
Les numéros de dépôt de ces cultures sont les suivants :
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ATCC 31861 Streptococcus Lactis (Lister) Lohnis BR-045 : FERM-P 4591
ATCC 31862 Les caractéristiques mycologiques de ces micro-organismes sont données ci-après.
I. Streptococcus lactis (Lister) Lohnis BK-042.
a) Caractéristiques morphologiques 1) Forme : ovoïde enchaînée
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2) Mobilité : non susceptible de se mouvoir
3) Coloration de Gram : positive b) Caractéristiques de fermentation 1) Etat de croissance : facultativement anérobie
2) Croissance à 45[deg.]C : aucun essai marqué
3) Liquéfaction de la gélatine : négative
4) Réduction du lait de Litmus : positive
5) Fermentation sur des saccharides :
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c) Caractéristiques physiologiques 1) Essai à l'oxydase : négatif
2) Essai à la catalase : négatif
3) Testé 0-F : F
4) Croissance dans le bouillon de NaCl à 6,5% : aucune
croissance marquée
5) Croissance au pH 9,6 : aucune croissance marquée
6) Effet de la température sur la croissance (chauffé pendant 30 minutes à 60[deg.]C) . aucune croissance marquée
7) Taux de glucose à la production d'acide lactique : 96%
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che : D+
II. Streptococcus lactis (Lister) Lohnis BK-045 a) Caractéristiques morphologiques 1) Forme : ovoïde enchaînée
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2) Mobilité : non susceptible de se mouvoir
3) Coloration de Gram : positive b) Caractéristiques de fermentation 1) Etat de croissance : facultativement anérobie
2) Croissance à 45[deg.]C : positive
3) Liquéfaction de la gélatine : négative
4) Réduction du lait de Litmus : positive
5) Fermentation sur des sacharrides :
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c) Caractéristiques physiologiques 1) Essai à l'oxydase: négatif
2) Essai à la catalase : négatif
3) Testé O-F : F
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croissance marquée
5) Croissance au pH 9,6 : aucune croissance marquée
6) Effet de la température sur la croissance (chauffé pendant 30 minutes à 60[deg.]) : aucune croissance marquée
7) Taux de glucose à la production d'acide lactique : 92%
8) Rotation optique de l'acide lactique produit par la
souche : D+ d) Hémolyse 1) Agar-agar/sang de cheval : réaction y
2) Agar-agar/sang de mouton : réaction y
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for Fermentation", Osaka, Japon (ci-après IFO) sous le numéro de dépôt IFO 12007. Les Streptococcus bovis BK-052 et Streptococcus
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rican Type Culture Collection" (ci-après ATCC). Le catalogue des aouches indique que les numéros de dépôt de ces souches sont les suivantes :
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ATCC 15351
Streptococcus faecalis BK-026 : IFO 12964
ATCC 10100
La Demanderesse a découvert également que ces souches contiennent des constituants utiles pour la préparation d'agents anallergiques, de même que les variétés nouvelles BK-042 et BK-045.
Au cours des recherches effectuées par la Demanderesse pour trouver un nouvel agent anallergique inhibant d'une manière hautement efficace la production d'immunoglobines E (IgE) en vue de la prévention de la maladie allergique résultant de la surproduction de IgE dans le corps, on a contraint des symptômes allergiques à se produire parmi des animaux expérimentaux (cobayes), auxquels les constituants anallergiques découverts conformément à la présente invention ont été administrés subséquemment et ont provoqué une réaction anallergique appréciable confirmant leur utilisation satisfaisante.
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agent anallergique et un procédé pour sa préparation, les constituants efficaces de cet agent se composant d'une souche entière ou d'un extrait de celle-ci. Le Streptococcus lactis, le Streptococcus bovis ou le Streptococcus faecalis a été choisi parmi les lacto-bactéries appartenant au Streptococcus genus.
Conformément à la présente invention, les souches vivantes des micro-organismes peuvent être utilisées comme principe actif pour l'agent anallergique. Toutefois, des souches mortes traitées à la chaleur ou des souches pulvérulentes traitées par dessiccation par évaporation de glace, ainsi que des fragments de souche peuvent aussi être employés comme principe actif pour l'agent. Des stabilisants ou des additifs communs peuvent être appliqués à la substance obtenue conformément à l'invention. Aucune restriction particulière n'est imposée à la forme de l'agent anallergique et celui-ci peut par conséquent avoir la forme d'une suspension, de grains, de granules ou d'une poudre. La méthode d'administration de l'agent produit conformément à l'invention n'est pas limitée et peut être du type oral, intrapéritonéal ou intraveineux.
Les avantages spécifiques des agents anallergiques préparés selon l'invention sont les suivants :
1) l'agent est efficace contre divers types de maladies hétérogènes relevant de l'immunité, telles que l'asthme bronchique allergique, l'asthme infantile, les rhinites allergiques (rhume des foins, pollinose, etc.) , la dermatite atopique, l'allergie alimentaire, l'éruption due à un médicament, la toxicose allergique du foie, la gastro-entérite allergique; de même qu'il est souverain pour d'autres types de maladies relevant de l'immunité;
2) la préparation obtenue conformément à l'invention se compose principalement du micro-organisme lui-même; on n'a observé aucune toxicité ni aucun effet secondaire au cours des expériences, si bien que l'on peut dire que la préparation offre une grande sécurité pharmacologique;
3) contrairement aux préparations anallergiques classiques formées d'antigènes polyvalents, la présente invention ne fait usage que d'une seule bactérie;
4) les souches à utiliser ne sont pas pathogéniques, de sorte qu'elles ne donnent pas naissance à une infection et qu'elles offrent la possibilité d'utiliser des micro-organismes vivants;
5) contrairement aux préparations microbiennes classiques qui doivent être administrées par inoculation ou injection, la préparation conforme à la présente invention peut être administrée par la voie orale, de sorte qu'on offre au patient la possibilité de se libérer de la crainte et de la résistance psychologique inhérente à l'inoculation;
6) l'emploi de la préparation de l'invention pour le traitement de l'asthme a entraîné une chute importante du niveau de IgE, ce qui a confirmé que la présente préparation peut être comparée d'une manière satisfaisante et peut être utilisée avec toute méthode classique;
7) la présente invention rend possible l'utilisation d'ex-traits de souche contre agent anallergique; l'efficacité est assurée par une dose aussi petite que 1 mg/kg de poids de corps par jour et, ce jusqu'à 50 mg/kg/jour, ce qui signifie une activité inhabituelle du médicament dont l'application peut se faire par
une injection hypodermique, intramusculaire ou intraveineuse, ou encore par la voie orale.
L'invention est décrite en détail ci-après et permet d'être mieux comprise grâce aux exemples ci-après, lesquels ne sont donnés cependant qu'à titre démonstratif et ne limitent en aucune façon la portée de l'invention.
Exemple 1.
Les Streptococcus lactis BK-042 et BK-045 sont mis à fermenter respectivement, puis sont isolés au moyen d'une centrifugeuse.
Ensuite, les souches respectives sont lavées entièrement à l'eau distillée et subséquemment séchées par évaporation de glace d'une manière classique pour en obtenir une poudre sèche.
Au cours des expériences, des cobayes femelles âgés de quatre ans, d'un poids de 340 à 460 g, sont conservés intacts au préalable pendant une période d'une semaine. Les animaux en bonne santé
sont ensuite sélectionnés en conséquence. Pendant la période en- tière préalable et au cours de l'expérience, les cobayes sont maintenus à l'état homéostatique dans une cage contrôlée à une température de 22 + 2[deg.]C et sous une humidité de 50 + 5%, tout en étant autorisés à prendre de la nourriture solide et de l'eau de ville sans aucune restriction.
Pour la sensibilisation des cobayes testés, un lapin d'un
poids d'environ 3 kg reçoit une injection d'une dose de
1 ml/corps d'une suspension de 1/1 (en poids) formée d'une solution d'alpha-amylase à 1% (alpha-amylase cristalline provenant
du bacile du rhume des foins) et d'adjuvant complet de Freund,
deux fois par semaines, pendant une période de quatre semaines, tandis qu'une dose de 2 ml/corps de sérum de lapin du type anti- alpha-amylase (valeur des anticorps : 32 fois), provenant du lapin, est injectée par la voie intrapéritonéale à vingt-et-un cobayes pour une sensibilisation passive.
Des souches de Streptococcus lactis BK-042 et BK-045 Font administrées respectivement à un groupe se composant de trois cobayes; on agit de telle sorte qu'une suspension de 100 mg/corps de solution de sel physiologique soit donnée de force chaque jour avec une sonde stomacale métallique, en commençant, une, deux et trois semaines avant de réaliser la sensibilisation passive à
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résultats des essais de IgE (en utilisant le dispositif de Rhadebas pour l'essai de IgE). Les résultats des groupes-témoins testés et non testés sont donnés au tableau I où les chiffres indiquent la moyenne de trois animaux de chaque groupe individuel.
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D'après le tableau I, la possibilité de production d'anticorps par les groupes traités avec la souche est sensiblement in-
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leur quelque peu plus basse enregistrée pour le groupe de traite- ment de deux semaines est attribuée au fait que les cobayes tes- tés ont tendance à régurgiter lorsqu'on leur donne de force la souche précitée au moyen de la sonde stomacale, ce qui a pour con- séquence de les contraindre à souffrir de bronchite.
L'inhibition de l'action allergique concernant les souches précitées est ensuite testée en conséquence.
Les essais sont effectués comme pour la méthode de sensibili- <EMI ID=27.1> <EMI ID=28.1>
de lapin à l'anti-alpha-amylase, produit comme esquissé ci-avant, les animaux sont introduits dans une chambre où ils reçoivent une pulvérisation d'une solution d'alpha-amylase à 1% à un débit de 1,46 ml par minute pendant une période de trente minutes au moyen d'un nébuliseur ultrasonore en vue d'observer le choc allergique subit par les animaux. Des doses de 400 mg/kg sont administrées chaque jour de force. L'efficacité de l'inhibition du choc allergique est déterminée en comparant le choc moyen des groupes d'essai individuels ayant été testés à l'aide de la souche, avec celui des groupes non traités. Les résultats concernés sont donnés au tableau II. Le degré de sévérité de l'attaque est défini par l'échelle ci-après :
degré 0 : aucun signe
degré 1 : tremblement, éternuement
degré 2 : dypsnée, ataxie, urination, défécation
degré 3 : dypsnée, ataxie, urination, défécation, convulsions, paralysie, cyanose
degré 4 : mort
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Dans le cas de groupes-témoins non traités, on observe que
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nutes après avoir été pulvérisés à la solution d'alpha-amylase à 1%, tandis qu'on observe une régurgitation occasionnelle, des convulsions, une urination et analogues environ 5 minutes plus tard.
On constate aussi que deux animaux souffrent de cyanose, de paralysie des pattes de derrière et meurent en raison du choc anaphylactique général à la fin de la pulvérisation.
D'autre part, on constate que les groupes traités avec les bactéries montrent une excellente inhibition à l'anaphylaxie générale, en comparaison des groupes non traités.
Exemple 2.
Des souches de Streptococcus lactis BK-042 et BK-045 sont mises à fermenter et sont ensuite lavées entièrement à l'eau dis-
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à chaque souche en une quantité de 150 g à 500 ml, puis est divisée par la voie ultrasonore (20 kHz, 200 W) pendant 60 minutes. Chaque liquide contenant une souche clastique de S. lactis est centrifugé à 11.000 tours par minute pendant 60 minutes et chaque produit surnageant résultant est lyophilisé pour donner environ 8 à 9 g de produit sec.
Les profits contenus dans les liquides surnageants respectifs sont étudiés pour examiner l'efficacité de l'inhibition du choc anaphylactique par voie de comparaison.
Pour les expériences, des cobayes femelles d'un poids moyen de 240 g sont sélectionnés et conservés intacts au préalable pendant une période d'Orne semaine.
Ensuite, 30 cobayes en bonne santé sont sélectionnés pour constituer trois groupes individuels.
Les animaux testés sont conservés intacts au préalable au cours d'une périoda entière et, durant l'expérience, sont introduits dans une chambre d'élevage statique à une température de <EMI ID=33.1>
à prendre une nourriture en poudre disponible dans le commerce et de l'eau de ville sans aucune restriction.
Dix cobayes de chaque groupe sont testés, sans le groupe-témoin, en leur donnant, pendant une période de 20 jours, avant la sensibilisation passive au sérum de lapin à l'anti-albumine, un aliment mélangé avec l'agent produit conformément à l'invention et ce, en une quantité calculée soigneusement de façon qu'elle atteigne 100 mg/corps par jour.
Le sérum de lapin à l'anti-albumine est prélevé d'un lapin
(d'un poids de 4 kg environ) auquel 1 ml d'une suspension formée d'un mélange de 1/1 d'une solution d'albumine à 1% et d'un adju-
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laire trois fois par semaine pendant une période continue de 5 semaines.
2 ml de sérum de lapin à l'anti-albumina (valeur des anticorps 16 fois) sont injectés par la voie intrapéritonéale à chaque cobaye pour la sensibilisation passive. 48 heures plus tard, chaque cobaye est introduit dans une chambre d'un volume de
52,5 1, où une pulvérisation est appliquée en utilisant une solution d'albumine à 1% au moyen d'un nébuliseur ultrasonore à un
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d'observer le choc anaphylactique produit sur les cobayes au cours de la pulvérisation et en vue de comparer chaque cobaye-témoin non traité avec le produit conforme à l'invention.
Les symptômes de choc observés sont évalués et classés en cinq degrés, comme décrit à l'exemple 1; les résultats sont donnés au tableau III.
Tableau III.
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(Note : * signifie fiabilité à 85%
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Chaque cobaye absorba toute la nourriture avec laquelle l'extrait préparé selon le procédé de l'exemple 2 est mélangé, de façon à administrer 100 mg/corps par jour; le poids du cobaye augmente normalement.
On constate que deux des cobayes du groupe-témoin souffrent de sérieuses crampes 30 secondes après avoir été pulvérisés avec la solution d'albumine à 1% et meurent une minute plus tard après le début de la pulvérisation. Un autre cobaye souffre fortement de cyanose, deux cobayes souffrent encore de cyanose et de paralysie des pattes de derrière environ 5 minutes après le début de
la pulvérisation et cinq autres animaux souffrent de tacypnée,
de paralysie des pattes de derrière, d'ataxie, etc.
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la substance du S. lactis BK-045 et quatre cobayes traités avec la substance du S. lactis BK-042 ne sont ni affectés ni modifiés.
Certains, des cobayes traités avec la substance préparée selon la présente invention présentent une cyanose sérieuse, des crampes, etc., mais aucun des cobayes ne meurt, et une tendance à la réduction de ces symptômes de choc est notablement observée.
On peut donc dire dès lors que tous les animaux du groupetémoin ont subi une attaque se traduisant par divers symptômes, mais six à dix animaux traités avec la substance du S. lactis ne montrent aucun symptôme par suite de la réduction du choc ou de
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vention.
Il faut aussi noter qu'aucun effet secondaire basé en apparence sur le produit précité ne se manifeste parmi les cobayes traités avec la substance préparée selon l'exemple 2.
Cinq rats de la famille Wistar (poids de 200 à 240 g) reçoivent, par une administration orale, 50 à 70 g/kg (poids de corps) par jour de produit séché par évaporation de glace et obtenu seLon la méthode de l'exemple 2 et ce, chaque jour pendant une période continue d'une semaine, mais l'autopsie subie par ceux-ci ne révèle aucun signe d'anomalie quelconque.
Exemple 3.
Les Streptococcus lactis BK-042, BK-045, BK-051, le Strepto-
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à fermenter respectivement de la même façon que celle décrite à l'exemple 2 pour en retirer l'extrait.
Avant la sensibilisation, chaque extrait est administré par la voie orale à chaque cobaye des groupes d'essai en le mélangeant avec la nourriture et chaque dosage est calculé de la même façon que celle de l'exemple 2; chaque extrait est aussi donné au cobaye de la même manière après la sensibilisation.
Un anti-sérum de sensibilisation à appliquer aux cobayes est préparé en partant du sérum de lapin à l'alpha-amylase et au ba-cille de l'anti-rhume des toins et est ensuite dilué dans 32 fois son volume de solution de sel physiologique; puis 1,5 ml de la solution est injecté par la voie intrapéritonéale aux cobayes pour leur sensibilisation. L'induction de la réaction allergique a lieu 48 heures après la sensibilisation. Les symptômes observés de la réaction sont classés de la manière exposée à l'exemple 1 précédent.
L'induction est réalisée en introduisant sept cobayes de chaque groupe dans une cage d'un volume de 52,2 1 où ces cobayes sont testés en les pulvérisant d'une solution de sel physiologique à l'alpha-amylase à 1% à un débit de 1,5 ml par seconde au moyen d'un nébuliseur ultrasonore pendant une période continue de 10 minutes pour inhalation. Les résultats sont donnés au tableau IV..
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Exemple 4.
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ter dans 100 1 de bouillon de culture se composant de 1% de glucose, de 1% de levure en poudre et de 1% de peptone et dont la
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18 heures, puis le bouillon fermenté est centrifugé à 10.000 tours par minute afin d'isoler la souche du bouillon.
La souche est ensuite soigneusement lavée à l'eau distillée et 150 g de celle-ci sont placés dans un bécher conique de 500 ml et sont dilués dans de l'eau distillée jusqu'à 500 ml en vue de mettre la souche en suspension. Subséquemment, la suspension est divisée par la voie ultrasonore dans un bain d'eau glacée et ce, à
200 kHz et à 200 W pendant une période continue d'une heure. La souche clastique est centrifuée à 11.000 tours par minute pendant
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léculaire élevé se composant principalement des parois grossières des cellules. Le produit surnageant est ensuite concentré à une basse température et à une pression réduite, puis est dialysé pendant une période continue de 48 heures à travers une membrane semi.-perméable du type cellulose pour obtenir un résidu de dialyse. Le résidu est alors traité d'une manière centrifuge à 12.000
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prélever le produit surnageant. Le produit surnageant est ensuite lyophilisé en vue d'en obtenir une poudre. La poudre est blanche ou jaune pâle et inodore. Le rendement en poudre est d'environ 500 mg par 100 g de souche vivante.
La poudre provenant du dernier produit surnageant, conformément à l'exemple 4, est examinée en vue de confirmer l'efficacité de l'inhibition de l'attaque du choc anaphylactique.
Des cobayes femelles (d'un poids moyen de 210 g) sont utilisés pour l'expérience et conservés intacts au préalable pendant
10 jours; ensuite, cinq cobayes en bosse santé sont prélevés pour chaque groupe d'essai. Cn maintient ensuite les animaux
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durant la période d'essai, dans une chambre thermostatique où la
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à prendre une nourriture en poudre disponible dans le commerce et de l'eau de ville sans aucune restriction.
La poudre est mise en suspension dans une solution de sel physiologique, puis la suspension est administrée par la voie intraveineuse aux pattes de devant, le dosage de 50 mg (poudre) par kg (poids du corps) par jour étant appliqué pendant une période continue de deux jours.
Afin de sensibiliser les cobayes testés, on leur injecte par la voie intrapéritonéale 1,5 ml de sérum de lapin à l'anti-alphaamylase (valeur des anticorps 32 fois) provenant d'un lapin (dont
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trois fois par semaine et pendant une période continue de cinq
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mée d'une solution d'alpha-amylase à 1% et d'un adjuvant complet de Freund pour la sensibilisation passive. 48 heures après la sensibilisation, chaque cobaye est introduit dans une chambre
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une pulvérisation d'une solution d'alpha-amylase à 1% au moyen d'un nébuliseur ultrasonore pendant une période continue de dix minutes pour inhalation, afin d'observer le choc anaphylactique sur les cobayes qui est comparé à celui des cobayes-témoins.
Les résultats obtenus sont classés conformément à la sévérité du choc comme décrit à l'exemple 1.
Le classement est donné au tableau V.
Tableau V
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Au cours des expériences, les cobayes du groupe-témoin subissent, comme ceci a été observé, de sérieuses crampes 30 secondes après avoir été pulvérisés avec la solution d'albumine à 1% et quatre cobayes meurent une minute après le début de la pulvérisation. Le dernier souffre d'une forte cyanose, mais ne meurt pas.
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préparées selon l'exemple 4 souffre de dyspnée, de crampes et d'ataxie; d'autres cobayes souffrent d'hyperpnée et de convulsions, mais aucun de ceux-ci ne meurt. Les poudres préparées selon l'exemple 4 ont une grande efficacité contre les réactions allergiques.
Exemple 5.
Deux souches de S. lactis BK-045 séchées, type 1935, sont respectivement divisées, centrifugées et dialysées d'une manière semblable à celle de l'exemple 4. Les dialysats respectifs de la <EMI ID=56.1>
dant 20 minutes. Un précipité est rejeté et un produit surnageant est séché par évaporation de glace, ce qui donne 10,05 g de produit pulvérulent blanc ou jaune pâle. L'autre précipité est séché par évaporation de glace et le rendement est de 4,95 g. Ce produit ou cette fraction est désignée par la référence "B-l" ciaprès.
Une portion d'alcool éthylique à 99,5% (en volume) est ajoutée lentement à l'autre produit surnageant pour donner une solution d'une concentration en alcool éthylique d'environ 25% (en volume), ceci dans le but de fractionner le produit surnageant.
Pendant l'addition de l'alcool éthylique, on observe une suspension blanche qui est ensuite centrifugée à 12.000 tours par minute pendant 20 minutes pour précipiter la suspension. Après décantation, le précipité est séché par évaporation de glace, ce qui donne 4,60 g de produit pulvérulent blanc ou jaune paie. ce produit ou cette fraction est désignée par la référence "B-2" ciaprès.
De l'alcool éthylique supplémentaire à 99,5% est versé dans le produit surnageant décanté pour obtenir une solution d'une concentration en alcool éthylique d'environ 40% (en volume); on observe de nouveau une suspension blanche qui est ensuite centrifu-
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suspension. Puis, le produit surnageant est décanté et le précipité est séché par évaporation de glace, ce qui donne 4,23 g de produit pulvérulent blanc ou jaune pâle. Ce produit ou cette fraction est désignée par la référence "B-3" ci-après.
Une autre pcrtion d'alcool éthylique à 99,5% est ajoutée au produit surnageant décanté pour donner une solution d'une concentration en alcool éthylique d'environ 50% (en volume); on observe de nouveau une suspension légèrement blanche qui est ensuite centrifugée à 12.000 tours par minute pendant 20 minutes. Le préci-té est obtenu par décantation et est séché par évaporation de glace, ce qui donne 0,05 g de produit pulvérulent blanc ou jaune pâle. Ce produit est désigné par la référence "B-4" ci-après.
Chaque fraction est administrée aux cobayes pour examiner l'effet anaphylactique. Au cours de cet examen, des animaux-types, soit des cobayes femelles, sont choisis de la même façon que celle de l'exemple 3 et sont répartis en groupes qui contiennent chacun sept cobayes. Les autres conditions sont semblables à celles de l'exemple 3. Chaque fraction est mélangée avec la nourriture d� chaque cobaye et le dosage est de
150 mg/kg/jour pour chaque cobaye. Le dosage est calculé en tenant compte du poids de la nourriture prise la veille par chaque cobaye. La durée de l'essai est de 14 jours et le traitement après l'administration est le même que celui de l'exemple 3.
Les résultats obtenus sont groupés au tableau VI.
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Lors de l'injection de la solution d'alpha-amylase à 1%, tous les animaux-témoins souffrent de dyspnée et d'éternuement, tandis que cinq de ceux-ci meurent environ quatre minutes après le début de l'injection. Deux cobayes souffrent de sévères attaques de cyanose, de convulsions et de paralysie. Quatre cobayes
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ceux-ci révèlent de profonds symptômes, c'est-à-dire que la fraction B-l n'est pas efficace contre l'allergie. Trois des cobayes auxquels la fraction B-2 a été administrée, meurent et seul l'un de ceux-ci révèle de profonds symptômes. Comme les autres ne présentent pas des symptômes allergiques dans une mesure aussi grande que dans le cas du B-l, on considère que la fraction B-2 s'oppose aux symptômes de l'allergie.
D'autre part, les fractions B-3 et B-4 sont considérablement efficaces contre les symptômes de l'allergie. L'un des animaux ayant reçu la fraction B-3 meurt et un autre cobaye présente de profonds symptômes, mais les autres ne font apparaître que de Légers symptômes. Ainsi, la fraction B-3 est considérée comme très efficace contre l'allergie. L'un des cobayes auxquels la fraction B-4 a été administrée, meurt et trois de ceux-ci présentent de profonds symptômes, mais les autres ne font apparaître que de légers symptômes. Dès lors, la fraction B-4 est considérée comme très efficace contre l'allergie.
Par conséquent, on n'observe aucun effet secondaire concernant les cobayes au cours de l'examen.
Exemple 6.
Conformément à la présente invention, la lactobactérie appartenant au Streptococcus lactis peut être mise à fermenter dans un milieu de culture solide ou liquide, mais il est préférable de choisir un bouillon ou un milieu de culture liquide pour obtenir une grande quantité de souches.
Bien que différentes sortes de bouillons de culture soient disponibles dans le commerce, on a cependant préparé spécialement, pour les expériences, certains types de bouillons de culture, en vue d'augmenter le rendement de la bactérie vivante par quantité unitaire de bouillon de culture, conformément à la méthode pratique décrite ci-dessous.
Bouillon de culture I :
5 à 50 g de glucose, 3 à 20 g de levure en poudre, 3 à 20 g de peptone et 0 à 20 g de bicarbonate de sodium sont dissous dans 1 1 d'eau dont les ions sont échangés, qui est ensuite stérilisée sous une pression élevée à une température de 121[deg.]C pendant 20 minutes et dont le pH est réglé à 7,0-8,5 avec de la soude caustique.
Bouillon de culture II :
5 à 50 g de glucose, 0 à 20 g de citrate de sodium, 0 à 20 g de bicarbonate de sodium, 0 à 20 g de phosphate de potassium sont dissous dans de l'eau dont les ions ont été échangés, pour obtenir
500 ml d'un bouillon A.
Ensuite, 5 à 20 g de levure en poudre et 5 à 20 g de peptone sont dissous dans de l'eau dont les ions ont été échangés pour obtenir 500 ml d'un bouillon B.
Les deux bouillons A et B sont stérilisés sous une haute pression et à une température de 121[deg.]C pendant 20 minutes, puis sont mélangés ensemble. Le pH du mélange est réglé à 7,0-8,5 avec de la soude caustique.
Bouillon de culture III :
5 à 20 g de glucose, 5 à 20 g de levure en poudre, 5 à 20
g de peptone, 0 à 20 g de citrate de sodium et 0 à 20 g de phosphate de potassium sont dissous dans 1 1 d'eau dont les ions ont été échangés, dont le pH est réglé à 7,0-8,5 avec de la soude caustique et qui est ensuite traitée par ultrafiltration.
Les Streptococcus lactis BK-042, BK-045 et BK-051, le Streptotoccus bovis BK-052 et le Streptococcus faecalis BK-026 sont
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Toutes les souches fermentées sont respectivement isolées de leur bouillon de culture; les rendements de la souche sont donnés ci-dessous :
Streptococcus lactis environ 6,0 à 6,5 g/1
Streptococcus faecalis environ 6,0 à 6,5 g/1
Streptococcus bovis environ 8 g/1.
Au cours du premier stade, les souches obtenues conformément au procédé précité sont lavées deux fois entièrement avec une solution de sel physiologique dont le volume est environ cinq fois celui des souches, puis sont encore lavées une fois à l'eau distillée en suffisance.
Lors du deuxième stade, une portion d'eau distillée est ajoutée à 150 g de souches lavées pour donner 1500 ml d'une suspension
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ultrasonore pour broyer les souches. La suspension contenant la souche clastique est centrifugée et le produit surnageant est recueilli.
Durant le troisième stade, le produit surnageant obtenu pendant le deuxième stade est lyophilisé au moyen d'un appareil de séchage par évaporation de glace pour concentrer un dixième du vo-
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membrane semi-perméable du type cellulose avec de l'eau distillée dont le volume est égal à dix fois celui du concentré et ce, pendant une période continue de 24 heures à une basse température ambiante. Le dialysat résiduel est centrifugé à 12.000 tours par minute pendant une période continue de 20 minutes pour recueillir le produit surnageant.
Ensuite, une portion d'alcool éthylique à 99,5% est ajoutée
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cool éthylique, les protéines insolubles dans le produit surnageant voient leurs propriétés se modifier avec l'alcool et sont <EMI ID=67.1>
cool est achevée lorsque la concentration en alcool éthylique est de 30%. Le produit surnageant est ensuite centrifugé pour en obtenir le précipité. Il faut noter que la quantité d'alcool éthylique à 99,5% ajoutée au produit surnageant est de 43 à 10C ml par rapport au produit surnageant initial au cours du quatrième stade.
Le précipité obtenu pendant le quatrième stade est lyophilisé sous la forme d'une poudre. La poudre est blanche ou légèrement grise, insipide et inodore. Le rendement en poudre est de 0,23% en poids relativement à la souche lavée.
Exemple 7.
Le procédé décrit dans l'exemple 6 est répété et 10 g de précipité sont préparés comme au cours du quatrième stade. Une portion d'eau distillée est ajoutée au précipité pour donner 50 ml d'une suspension. Cette suspension est versée dans une cuve et chauffée au bain-marie pendant 15 minutes. Les protéines thermiquement dénaturées, ainsi réalisées, sont centrifugées à 12.000 tours par minute pendant une période continue de 20 minutes pour obtenir le précipité résultant qui est lyophilisé sous la forme d'une poudre sèche. Cette poudre sèche contient principalement
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bles, combinées avec les protéines ont été éliminées par le traitement mentionné ci-dessus. Le rendement en poudre est d'environ 0,12% en poids par rapport à la souche lavée.
Résultats des essais sur des animaux :
En général, les méthodes pour induire l'action allergique chez les animaux vertébrés sont bien connues. Voir, par exemple, Yagura et al : "Expérimental Allergie Asthma in Guinea Pigs"
(Asthme allergique expérimental des cobayes), Allergology, Excepta Medica, p. 148, 1971, Amsterdam.
La Demanderesse a utilisé des cobayes comme animaux expéri- <EMI ID=69.1>
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contraint de se produire par sensibilisation active avec les antigènes et la réaction anallergique des substances préparées selon les exemples 6 et 7 est vérifiée. Les résultats de cette expérience sont donnés au tableau VII.
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D'après les résultats donnés au tableau VII, il est évident que les substances préparées conformément aux exemples 6 et 7 exercent des effets remarquables pour inhiber la production d'anticorps et de substances d'induction d'attaque chimique telles que l'histamine et la sérotonine, etc., ainsi que l'antagonisme entre les anticorps et les produits chimiques et pour promouvoir la production d'anticorps anallergiques.
De plus l'asthme allergique expérimental est induit aux cobayes en conformité avec la sensibilisation passive par l'application du sérum anti-lapin. L'action anallergique des substances préparées selon les exemples 6 et 7 est examinée par application aux cobayes. Les résultats des exemples 6 et 7 sont respectivement groupés aux tableaux VIII et IX.
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Dans le cas de la sensibilisation passive, l'anticorps IgE anti-lapin est produit dans le sérum anti-lapin. On comprend donc aisément qu'en appliquant l'anticorps IgE précité au cobaye testé, ce cobaye voit se développer une réaction allergique qui peut être inhibée par la substance préparée selon l'invention.
Comme le Streptococcus lactis, le Streptococcus bovis et le Streptococcus faecalis sont extrêmement sûrs et que leurs extraits sont utilisés dans la présente invention, les agents anallergiques de cette dernière sont naturellement très sûrs. Mais, on a choisi
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confirmer leur sécurité. Les données obtenues sont reprises aux tableaux X, XI, XII et XIII.
Tableau X.
LD 50 (mg/kg)
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Tableau XI.
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Tableau XII.
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<EMI ID=84.1> Tableau XIII.
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Bien que l'invention ait été décrite en se référant à divers exemples de réalisation particuliers, il est bien certain que des changements et modifications peuvent être apportés sans s'écarter
de son esprit.
REVENDICATIONS.
1.- Composition anallergique, caractérisée en ce qu'elle com-
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Streptococcus genus.