LU86195A1 - Acylglycannes extraits de klebsiella,leur procede d'obtention,leur application a titre de medicaments et les compositions les renfermant - Google Patents
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- C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
Description
— “cd/3 G
151» Τ1Γ5 de «®*** . du Lâêcs*ôre 1985 φ &=iœ le Kaisrn ~ ,... , 'Jy^SGi de l'Economie et des Classes Moyennes
Titre delivre : B» *
Service de la Propriété Intellectuelle
= ‘ LUXEMBOURG
Demande de Brevet d’invention
v* ' VV
ïfi*
I. Requête rH
Roussel-Uclaf, 35 bd des Invalides, F-75007 Paris, représentée^] par Monsieur Jean Waxweiler, 21-25 Allée Scheffer, Luxembourg^ ^
agissant.....en qualité de mandataire ~ ÎÉB
—-..........................................................................................................................*............................................................................................................................................"» 1 .
dépose(nt) ce cinq décembre mil neuf cent quatre-vingt-cing................... __ à A*?./..?.?.........heures, au Ministère de l’Économie et des Classes Moyennes, à Luxembourg :
1. la présente requête pour l’obtention d’un brevet d'invention concernant : . - sÆfæSÊfr Acylqlycannes extraits de Klebsiella, leur procédé d obtentionffi^L
leur application à titre de médicaments et les compositions lesillit' renfermant'........................................................
" ν/·ΐιΒΒ0ΐΡ^.ΐΓι ; '^IPSl.
.................................. -................................................................................................. .............. ...............................
2. la délégation de pouvoir, datée de.....Paris........................... le ..2.0......n.QV.€ffibre..jJ8^ S. la description en langue.......ÎXaJlÇSLiSê... ..............de l'invention en deux exemplaires · 4........../............... planches de dessin, en deux exemplaires; ALi 1 ; >£,32HÜfik ’t." δ. la quittance des taxes versées au Bureau de l'Enregistrement à Luxembourg, le .. ,ç;mç[ décembre mil neuf cent quatre- vingt-cinq _
déclare(nt) en assumant la responsabilité de cette déclaration, que ries» inventeurs) est (soera^S
Pierre.....SME.T.S.., ...rue. ...de.._l.I.Our.cq....JL.D.B.., .F-..7.5.Q1.S..Paris................................................
Rene. ..ZÄLXS.Z..,.....rue.J2.elatj^e_jâe_îl!mss±g.n$L.2.iDj[.....F-95180, Menucourt .................................................................................................................................................................................................................................................................
revendique(nt) pour la susdite demande de brevet la priorité d'une (des) demande(s) de ||·ΒΒ (S)........................brevet...........................................déposée(s) en (7· ...France............................................................................
le 6 décembre _1984 sous le Mo. 8418627 ^ *Ê3£f$Îr au nom de . ..Rans.S.e.lm.ü..C.I.af................................................... ..... ............ ....................................................vÜ'vî élit(élisent) pour lui (elle) et. si désigné, pour son mandataire, a Luxembourg.........................„X_
Jean Waxweirer, 21-25 Allée Scheffer, Luxembourg ^ soIUcite(nt) la délivrance d’un brevet d’invention pour lotie: décrit et représenté dans Tm , annexes susmentionnées, — avec ajournement de cette délivrance à........./........................................mois. (U) \L im^ndataine '··. Üj// ......-K-Ι- .-j...............-.......................
IL Procès-verbal de Dépôt
La susdite demande de brevet d’invention a été déposée au Ministère de l’Économie et des Classes Moyennes, Service de la Propriété Intellectuelle à Luxembourg, en date du ; / // Λ~ί ‘ V\ / / ' *, \ Pt. le Ministre à 33*00 jjeures j * s ! de l’Économie e: des Classes Moyennes, I β1 ·£ j - b - %ί [30 JCV/JD/8683
BREVET D’INVENTION Société Anonyme dite: ROUSSEL-UCLAF
Acylglycannes extraits de Klebsiella, leur procédé d'obtention, leur application à titre de médicaments et les compositions les renfermant.
Inventeurs: Pierre SMETS René ZALISZ
Convention Internationale - Priorité d'une demande de brevet déposée en France le 6 décembre 1984 sous le n° 84-18627.
MEMOIRE DESCRIPTIF 2Mk/L- déposé à l'appui d'une demande de BREVET D'INVENTION au
GRAND_DyÇKE_DE_LUXEMBOyRG
Acylglycannes extraits de Klebsiella, leur procédé d'obtention, leur application à titre de médicaments et les compositions les renfermant.
Société dite : Roussel-Uclaf
La présente invention concerne des acylglycannes extraits de Klebsiella, leur procédé d'obtention, leur application à titre de médicaments et les compositions les renfermant.
Un certain nombre de brevets français ont décrit des ; 5 glycoprotéines extraites de corps microbiens lysés de Klebsiella et/ou leur procédé de préparation. Il en est ainsi, par exemple, des brevets français 2.043.475, 2.088.112, 2.171.907, 2.462.477, 2.490,495, 2.490.496 et 2.540 136.
La .présente demande concerne de nouveaux extraits bactériens, 10 et a ainsi pour objet des acylglycannes extraits de Klebsiella caractérisés en ce qu'ils sont essentiellement constitués d'environ 80 % d'oses neutres et 20 % de lipides, renferment moins de 2 % de protéines et ont un poids moléculaire d'environ 12 500.
On désigne par oses neutres des oses qui ne comportent pas de 15 reste basique ou acide, notamment des hexoses neutres tels que le glucose, le galactose ou le mannose.
Ils sont dosés par la méthode de Tillmans et Philippi (Biochem.
Z., 1929, 215, 36) modifiée par Rimington (Biochem. J.,1931, 25,1062).
Les protéines sont dosées par la méthode de Lowry (J. Biol.
20 Chem, 1951, 193, 265-273).
Les lipides sont dosés par chromatographie en phase vapeur après mêthanolyse.
Le poids moléculaire des acylglycannes de la présente demande a été estimé par filtration sur gel hydrophile et insoluble à base de 25 dextrane tel que le Séphadex^, de seuil de chromatographie égal à 50 000.
Des acylglycannes préférés sont ceux pour lesquels les oses sont présents dans les proportions relatives approximatives suivantes, pour 1 glucose : environ 4 galactoses, environ 1 mannose et environ t 2 1 heptose. Cette détermination peut, par exemple, être effectuée par chromatographie en phase vapeur.
Des acylglycannes plus particulièrement préférés comportent un enchaînement de galactoses liés en jb 1—^3 de poids moléculaire 5 d'environ 9 000.
Les acylglycannes de l'invention peuvent être extraits de différentes espèces de Klebsiella. On retient cependant plus particulièrement ceux qui proviennent de Klebsiella pneumoniae, et tout particulièrement ceux qui proviennent de la souche portant 10 à l'Institut Pasteur ou Collection Nationale de Culture de
Micrcorganismes les numéros 52145 et 1-163, et à la National Culture Type Collection le ne 5 055. Cette souche est depuis longtemps commercialisée et librement disponible auprès du public, notamment auprès de l'Institut Pasteur à Paris sous la référence 52 145 ; 15 cette souche a de plus été déposée par la demanderesse le 25 Juin 1981 sous le N° 1-163 à l'Institut Pasteur (encore appelé Collection Nationale de Cultures de Microorganismes).
En plus des oses et des lipides, les acylglycannes selon la présente invention sont caractérisés par la présence d'acide 2-céto 20 3-dêsoxy- octolosonique, de glucosamines, de phosphates d'acides^ et J)-hydroxy myristique et d'acide palmitique.
Les acylglycannes selon la présente invention se présentent sous forme d'une poudre blanche inodore hydrosoluble.
Comme toutes les molécules d'origine biologiques, ils sont hydratés 25 ou s'hydratent facilement ; leur spectre infrarouge n'est donc pas caractéristique, les nombreux pics étant fondus entre eux. Leur point de fusion n'est pas non plus caractéristique* puisqu'il s'agit d'une carbonisation qui se fait sur une large plage de températures.
La présente demande a également pour objet un procédé d'obtention 30 des acyglycannes tels que définis ci-dessus, ledit procédé étant caractérisé en ce que Ton traite un extrait bactérien hydrosoluble de Klebsiella renfermant 30 % à 45 % de protéines, 30 % à 40 % d'oses neutres, une faible proportion d'acides uroniques, 2 % l 5 % d'osamines et ayant un poids moléculaire d'envrion 350 000, à l'aide d'un 35 détergent, chauffe à environ 80° C, chromatographie sur silice branchée hydrophobe et récupère la fraction correspondant au pic d'élution repéré par spectrométrie à 200 nm, disparaissant à 280 nm, et apparaissant à 492 nm après coloration au phénol sulfurique.
Par faible proportion d'acides uroniques, on entend moins 40 de 6 % d'acides uroniques et de préférence moins de 4 %.
' ' 3 * Les extraits bactériens hydrosolubles de Klebsiella de départ du procédé peuvent être notamment obtenus par mise en culture de germes appartenant au genre Klebsiella, lyse des germes, séchage, délipidation par extraction à l’aide de solvants des lipides, 5 ul trafi1tration, traitement de la solution aqueuse ainsi obtenue â l’aide d’un sel d’ammonium quaternaire, élimination du précipité, puis soit traitement I froid du surnageant à l’aide d’un alcanol de faible poids moléculaire, isolation, puis dissolution dans l’eau, dialyse et séchage du produit obtenu, remise en solution, filtration 10 sur gel puis isolation de la première fraction éluée et séchage, soit concentration du surnageant par utilisation d’au moins un dispositif de sélection de molécules, traitement à froid du concentré à l’aide d’un alcanol et isolation du précipité obtenu.
De telles préparations ont déjà été décrites notamment dans le 15 brevet français N° 2.490.496 et dans la demande de brevet européen n° 0.049.182 publiée sous le n° 29.070 E par Derwent Publications Farmdoc book n° 1.500 du 2 Juin 1980, ainsi que dans la demande de brevet français ne 2.540.136.
C’est ainsi que la présente demande a aussi pour objet un procédé 20 d’obtention des acylglycannes tels que définis ci-dessus, ledit procédé étant caractérisé en ce que l’on traite à l’aide d’un détergent, un extrait bactérien hydrosoluble de Klebsiella, tel que préparé ci-dessus, chauffe à environ 80° C, chomatographie sur silice branchée hydrophobe et récupère la fraction correspondant au troisième pic 25 d’élution repéré par spectrométrie à 200 nm disparaissant à 280 nm, et apparaissant à 492 nm après coloration au phénol sulfurique.
D’autres extraits bactériens hydrosolubles de Klebsiella de départ, convenables pour la mise en oeuvre du procédé sont, par exemple, obtenus par mise en culture des germes, lyse des germes par 30 broyage, centrifugation fractionnée pour sédimenter les débris cellulaires sous une accélération d’environ 8 000 g, puis les membranes sous une accélération de 20 000 à 40 000 g, séparation de l’extrait brut par centrifugation fractionnée en solution saline et dans l’eau, traitement par une base ou un hypobromite, élimination de l’excès de 35 réactif et du résidu insoluble, traitement à l’aide d’une solution aqueuse d’acide acétique à une température de 70° C à 100e C, élimination de la fraction insoluble, délipidation par extraction à l’aide de solvants des lipides, traitement à l’aide de lysozyme, séparation de la fraction de poids moléculaire d’environ 350 000 et 40 séchage. Un exemple d’une telle préparation figure, par exemple, dans , > 4 . la demande de brevet européen n° 0089266.
Les produits doués de propriétés détergentes sont bien connus. Il s'agit, par exemple, de sels d'ammonium quaternaires, notamment des halogénures d'ammonium quaternaires tels que l'iodure de 5 tétraéthylammonium, le chlorure de N-hexadécyl-N,N-diméthylbenzène mêthanaminium, le bromure de N-hexadêcyl-2-hydroxy-N,N,N-triméthy1-l-hexadécanaminium, les halogénures de N,N,N-triméthyl-l-hexadécanaminium ou de cétylpyridinium.
Il s'agit aussi de sulfates ou sulfonates alcalins de type ester 10 alkyl ou alkylarylique tels que le sodium dioctyl sulfosuccinate, le sodium dodécylbenzène sulfonate, le sodium dodécyl sulfate, le sodium têtradécyl sulfate, le lithium dodécylsulfate, des polyéthylène-glycols mono (nonylphényl) éthers comme les Triton N^, des polyêtylènes glycols p-isooctyl phényléthers comme les Triton ou des polymères 15 de 4-(1,1,3,3-tétraméthylbutyl ) phénol avec le formaldéhyde et l'oxirane comme le Triton^) A20.
Il s'agit de préférence d'un sulfate alcalin de type ester alkyl, tel que le sodium dodécyl sulfate.
Le détergent est utilisé en solution dans un solvant 20 pharmaceutiquement acceptable conservant au détergent ses propriétés détersives, de préférence en solution dans l'eau. Selon le pouvoir détergent, il est utilisé à la concentration d'environ 1 % dans le cas de produits très détergents tels que le sodium dodécyl sulfate, ou plus concentré, par exemple 2 % à 10 % dans le cas des sels d'ammoniums 25 quaternaires.
La température d'environ 80° C est conservée quelques minutes, de préférence environ 5 minutes.
Le gel de silice utilisé pour la chromatographie est constitué de silice sur laquelle sont branchés des groupements hydrophobes, de 30 préférence des acides gras. Les acides gras peuvent, par exemple, être des acides gras en C3 à C3q, notamment en C3 à 033· On utilise de préférence le gel Cg commercialisé sous le nom Aquapore^ RP300.
Le repérage de la fraction intéressante de nature glucidique et 35 subtantiellement dépourvue de protéines est réalisé, par exemple, par spectrophotométrie à 200 nm (détection des glucides et des protéines), 280 nm (détection des protéines seules), 492 nm après coloration par le phénol sulfurique (détection des sucres seuls).
L'êlution est de préférence réalisée a l'aide d'un mélange 40 acétonitri le-solution aqueuse d'acide trifluoroacétique 0,1 % pH 1,8 ‘ . · 5 > utilisé en gradient. Le gradient est avantageusement constitué successivement d'un mélange acétonitrile - solution d'acide trifluo-roacétique 20-80, puis 50-50. Dans ces conditions, les acylglycannes recherchés correspondent au troisième pic repéré à 200 nm lorsqu'on 5 utilise un gel en Cg· Ce pic disparaît à 280 nm et apparaît à 492 nm après coloration au phénol sulfurique.
L'isolation des acylglycannes est faite de manière classique pour des macromolêcules mélangées à des petites molécules, c'est-à-dire par exemple par ultrafiltration à l'aide de membranes de seuil de rétention 10 5 000 par exemple, par dialyse, ou par chromatographie sur gel.
Les acylglycannes peuvent ensuite être séchés, par exemple, par lyophilisation, évaporation ou atomisation.
La présente invention a également pour objet les acylglycannes tels qu'obtenus par les procédés ci-dessus décrits, c'est-à-dire 15 lorsqu'ils sont obtenus par la mise en oeuvre de ces procédés ou lorqu'ils présentent des caractéristiques physiochimiques analogues à celles des acylglycannes obtenus par la mise en oeuvre de ces procédés.
Les acylglycannes, objet de la présente invention, possèdent de 20 très intéressantes propriétés pharmacologiques ; ils sont doués notamment de remarquables propriétés antiallergiques et immunomodulatrices. Ils stimulent, en particulier, l'immunité à médiation cellulaire.
Parmi les propriétés immunomodulatrices des acylglycannes selon 25 l'invention, on peut citer en particulier des propriétés stimulantes de la sécrétion d'interleukine I et de Colony Stimulating Factor ainsi que des propriétés mitogènes.
Ces propriétés sont illustrées plus loin dans la partie expérimentale.
30 Ces propriétés justifient l'utilisation des acylglycannes selon l'invention à titre de médicaments.
La présente demande a ainsi également pour objet l'application, à titre de médicaments, des acylglycannes tels que définis ci-dessus, pour leur utilisation dans une méthode de traitement thérapeutique -35 curatif ou préventif - du corps humain ou animal.
Parmi les acylglycannes, objet de l'invention, on retient, tout particulièrement, les acylglycannes caractérisés en ce qu'ils sont constitués par les acylglycannes tels qu'obtenus par les procédés de l'invention, pour leur utilisation dans une méthode de traitement 40 thérapeutique curatif ou préventif du corps humain ou animal.
• ‘ δ * Les médicaments selon l'invention trouvent leur emploi, par exemple, dans le traitement ou la prévention, chez l'homme et l'animal, des maladies infectieuses causées par les bactéries ou les virus, dans le traitement des maladies à parasites, des toxi-infections, dans le 5 traitement des infections posthospitalières et postchirurgicales, et des allergies de toutes origines.
A titre préventif, les acylglycannes, selon la présente invention peuvent être utilisés seuls ; ils peuvent également être utilisés I titre d'adjuvant dans des vaccins.
10 La dose usuelle, variable selon le dérivé utilisé, le sujet et l'affection en cause peut être, par exemple, de 1 mg à 15 mg par jour. Par voie orale, chez l'homme, le dérivé de l'exemple 1 peut être administré à la dose quotidienne de 2 mg à 10 mg, par exemple pour le traitement de la bronchite chronique, soit environ de 0,03 mg à 0,15 mg 15 par kilogramme de poids corporel.
L'invention a enfin pour objet les compositions pharmaceutiques qui renferment les acylglycannes selon la présente invention, à titre de principe actif.
A titre de médicaments, les acylglycannes de la présente demande 20 peuvent être administrés par les voies digestive, parentérale ou locale.
Les compositions pharmaceutiques correspondantes peuvent être, par exemple, solides ou liquides et se présenter sous les formes pharmaceutiques couramment utilisées en médecine humaine, comme, par 25 exemple, les comprimés, simples ou dragéifiés, les gélules, les granulés, les solutions, les sirops, les suppositoires, les préparations injectables lyophilisées ou non, les ovules, les crèmes, les pommades, les lotions, les gouttes, les collyres, les aérosols ; elles sont préparées selon les méthodes usuelles. Le ou les principes 30 actifs peuvent y être incorporés à des excipients habituellement employés dans ces compositions pharmaceutiques, tels que le talc, la gomme arabique, le lactose, l'amidon, le stéarate de magnésium, le beurre de cacao, les véhicules aqueux ou non, les corps gras d'origine animale ou végétale, les dérivés paraffiniques, les glycols, les divers 35 agents mouillants, dispersants ou émulsifiants, les conservateurs.
Il va être donné maintenant à titre non limitatif, des exemples de mise en oeuvre de l'invention.
Exemple η* 1
On ajoute 7,83 ml d'une solution aqueuse à 1 % de sodium 40 dodécyl sulfate à 235 mg d'extrait bactérien hydrosoluble de ' ‘ 7
Klebsiella préparé comme indiqué ci-après selon l'option b, et chauffe pendant 5 minutes à 80° C. Après refroidissement, on chromatographie par fractions de 0,5 ml, sur une colonne pour chromatographie liquide haute performance (HPLC) de silice greffée 5 par des acides gras en Cg (AquaporeR RP30Q de 4,6 x 25 cm), en éluant à l'aide d'un gradient acétonitrile - solution aqueuse à 0,1 % pH 1,8 d'acide trifluoracétique sous un débit de 2 ml/mn, dans les conditions suivantes (cf. tableau ci-après) : 10 | Temps | Acétonitrile | eau |
I_!_I I
| 0 1 0 | 100 |
| 10 I 0 I 100 I
| 20 I 20 I 80 I
15 | 35 | 20 I 80 | | 45 | 50 I 50 | | 60 | 50 I 50 | | 80 | 100 I 0 | i_!_i i 20 On isole les fractions correspondant au troisième pic repéré par spectrométrie à 200 mn, élimine les petites molécules par dialyse et amène à sec. On obtient 67,85 mg des acylglycannes attendus.
Analyse : 25 C% : 42 H% : 7,8 N% : 0,3
Protéines 0,8 %, sucres 80 %, lipides 24,5¾.
Préparation de l'extrait bactérien hydrosoluble de Klebsiella de départ :
Stade A : culture 30 On prépare un milieu de culture répondant à la formule suivante : - extrait de viande............................... 690 g - chlorure de sodium................... 690 g - peptone de caséine.............................. 690 g - autolysat de levure................ 690 g 35 - phosphate bipotassique.......................... 483 g - phosphate monopotassique........................ 207 g - glucose......................................... 4104 g - peptone papa’inique de soja.............. 2760 g - eau distillée q.s.p............................. 138 litres.
40 On prépare le milieu de culture en mélangeant successivement . * 8 l'extrait de viande, le chlorure de sodium, la peptone de caséine, l'autolysat de levure, le phosphate bipotassique et le phosphate monopotassique dans environ 20 litres d'eau distillée. On ajuste le pH aux environs de 7.
5 On stérilise le milieu à 120° C pendant 40 minutes. Les solutions de glucose et de peptone papaïnique de soja sont introduites dans le milieu de culture au moment de l'ensemencement après avoir été stérilisées au préalable.
La souche de Klebsiella (Institut Pasteur n° 1-163) est ensemencée 10 dans 50 cm3 de milieu de culture. Cette solution, servant d'inoculum est introduite dans le reste du bouillon de culture. On ajuste le volume total du milieu de culture à 138 litres par addition d'eau distillée stérile.
Le milieu de culture est maintenu à 37° C et le pH est ajusté 15 automatiquement à 7 environ (par addition d'une solution d'ammoniaque ou par addition d'une solution d'acide chlorhydrique).
La croissance des germes est appréciée au photomètre.
Stade B : lyse A 138 litres de bouillon de culture à complet développement obtenu 20 au stade A ci-dessus, on ajoute une solution aqueuse de chlorhydrate de lysozyme, (stérilisée par filtration sur membrane), afin d'avoir une concentration finale de 160 V de chlorhydrate de lysozyme par cm3 de milieu de culture.
On laisse en contact une heure à 56° C en présence de 0,25 g 25 d'Edta par litre de bouillon, de 862,5 mg de mercurothiolate sodique et de 80 g de polysorbate (commercialisé sous le nom de Tween 80), par litre de bouillon de culture.
On poursuit la lyse pendant environ 10 jours à 37e C dans des conditions stériles.
30 On recueille le lysat, homogénéise par agitation puis lyophilise.
Stade C : traitement a) Par l'acétone :
On met en suspension dans 138 litres d'acétone la poudre obtenue au stade B ci-dessus, puis agite vigoureusement pendant environ 35 3 heures.
La suspension est alors centrifugée et on recueille une poudre que Ton essore.
b) Par le méthanol :
La poudre obtenue précédemment est mise en suspension dans 138 40 litres de méthanol et agitée vigoureusement pendant environ 3 heures.
- * 9
La suspension obtenue est alors centrifugée.
La poudre essorée est séchée à température ambiante sous , pression réduite.
Stade D : Utrafiltration 5 On met en solution dans 6 fois 10 litres d'eau distillée contenant 1 g/1 de merthiolate, six parties égales de poudre obtenue au stade C ci-dessus.
On maintient la solution sous agitation 1 +4° C pendant 24 heures, centrifuge pendant environ 2 heures à 20 000 g, puis à 60 000 g.
10 On récupère la solution que Ton complète à 10 litres avec l'eau distillée filtrée (sur membrane stérilisante). On introduit la solution obtenue dans un appareil à diafiltrer équipé de membranes poreuses pour ultrafiltration dont le seuil de rétention est de 300 000 et de diamètre apparent des pores d'approximativement 2 A (membranes 15 commercialisées par la Société AMICON ou par la Société ROMICOH sous la désignation XM 300).
On fait circuler dans l'appareil 50 volumes d'eau distillée, soit un volume de 500 litres.
La solution diafiltrée est récupérée puis centrifugée à 60 000 g 20 et la solution obtenue lyophilisée.
Stade E :
Option a : 20 g ae produit tel qu'obtenu au stade D ci-dessus sont dissous dans deux litres d'eau permutée.
25 On ajoute, lentement, environ 1,6 litre de bromure de cétyl-triméthyl ammonium à 3 % dans l'eau, agite l'ensemble pendant une heure, puis centrifuge à 10 000 t/mn pendant 15 minutes. On élimine le précipité, ajoute ensuite au surnageant isolé 3 litres d'éthanol à 95° en 15 minutes. Après une heure d'agitation, on centrifuge à 10 000 t/mn 30 pendant 15 minutes; le surnageant ainsi obtenu est éliminé et le précipité est redissous dansl litre d'eau, puis dialysé pendant 48 heures dans des tubes Visking^ contre de l'eau permutée a +4° C. Au terme de cette dialyse, la solution est lyophilisée. On obtient 6,2 g de glycoprotéines dont on dissout 1 g dans 19 ml d'une solution aqueuse de 35 carbonate d'ammonium Q,1M. La solution est passée sur une colonne de 2,5 cm de diamètre renfermant 1 litre d ' Ul trage! ^ACA34 (éluant : solution aqueuse de carbonate d'ammonium 0,1M); les fractions correspondant au premier pic d'élution (détection aux U.V. à 280 nm) sont rassemblées et lyophilisées, et on obtient 0,51 g d'extrait 40 bactérien hydrosoluble de Klebsiella.
\ . 10 . Option b :
On met en solution aqueuse à 10 g/litre, 1 kg de produit tel qu'obtenu au stade D ci-dessus.
On ajoute 0,8 volume de solution aqueuse à 3 % de bromure de 5 cétyltriméthylammonium à raison de 1 litre/minute environ et agite modérément pendant 1 heure. On élimine le précipité formé par centrifugation en continu à débit de 5 litres/heure environ, à 62 000 g.
Le surnageant est concentré par ultrafiltration sur fibres creuses 10 à seuil de rétention fixé à 5 000 (Hollow Fibers H10P5 commercialisées par AMICON et ROMICON) en 2 cycles de traitement dans les proportions 5/1. On ajoute, à la vitesse de 3 litres par minute, 6 volumes d'éthanol à 96 % et agite modérément pendant 15 minutes. On laisse décanter, essore et rince le précipité, sèche à moins de 40° C en présence de 15 déshydratant, homogéinise par broyage mécanique et obtient 200 g d'extrait bactérien hydrosoluble de Klebsiella.
Exemple 2 :
On a préparé des comprimés répondant à la formule : - Produit de l'exemple 1...................................... 1 mg 20 - Excipient q.s. pour un comprimé terminé à................... 100 mg.
(Détail de l'excipient : lactose, amidon, talc, stéarate de magnésium). Exemple 3 :
On a préparé des aérosols délivrant des doses contenant chacune : - Produit de l'exemple 1........................................ 0,5 mg 25 - Emulsifiant................................................... Q,15mg -Propulseur....................................................50 mg
Exemple 4 :
On a préparé une crème répondant à la formule : - Produit de l'exemple 1........................................ 1 mg 30 - Excipient : alcool 2-octyl-dodêcanol, alcool cétostêarylique, cétostéaryl sulfate de sodium, parahydroxybenzoate de méthyle et de propyle, eau purifiée........................................10 mg
ANNEXE PHARMACOLOGIQUE
* 1/. Test de réponse d'hypersensibilité retardée (HSR) au globule rouge 35 de mouton (GRM)
METHODE
L'expérience est réalisée sur des lots de 10 souris femelles âgées de 9 à 10 semaines pesant environ 20 g.
Le traitement est réalisé 3 heures avant l'immunisation par les 40 GRM par une injection intrapéritonéale de 0,5 ml de NaCl 9 % contenant • ' 11 i ' le produit testé. Les doses testées sont de 10, 100 et 1000 x 10”6 g par Kg.
* L'immunisation est réalisée 3 heures après le traitement par l'injection intraveineuse de GRM. (1Q8 GRM/souris).
5 La révélation de l'HSR est réalisée 4 jours plus tard par injection intraplantaire dans la patte arrière gauche de 40 x 1Û"6 1 d'une suspension de GRM.
La lecture est réalisée 24 heures après la révélation, par la mesure de l'épaisseur des pattes arrières gauches et droites.
10 Les résultats sont exprimés par la différence entre les épaisseurs des pattes arrières gauche et droite de chaque souris.
RESULTATS
Les résultats sont rassemblés dans le tableau suivant : 15 | I TRAITEMENT | DIFFERENCE | I _l 10~6g/kg_1_nm_|
II I I
1 Lot témoin | 0 1 3,23 + 0,76 |
I_!_I_I
20 [Lots traités | 10 | 4,74 + 0,95 |
i I_!_I
| | 100 | 6,33 + 0,93 |
i I_!_I
| | 1 000 i 9,00 + 1,80 | 25 1_|_j_|
Toute augmentation des différences patte gauche-patte droite par rapport au lot témoin traduit une augmentation des réponses d'hypersensiblilitê retardée. On s'aperçoit que pour toutes les doses étudiées {10; 100; 1000 10"6g/Kg), les acylglycannes de la présente 30 invention augmentent de manière importante les réponses d'HSR.
2/ Toxicité aiglie
La dose létale 50 (DL 50) par voie intrapéritonéale, chez la souris a été déterminée par la méthode BEHRENS et KARBER.
Elle est d'environ 20 mg/Kg pour les acylglycannes de l'exemple 1.
Claims (5)
- V * 12 1/. Les acylglycannes extraits de Klebsiella, caractérisés en ce qu'ils sont essentiellement constitués d'environ 80 % d'oses neutres 5 et 20 % de lipides, renferment moins de 2 % de protéines et ont un poids moléculaire d'environ 12 500.
- 2/. Les acylglycannes selon la revendication 1, caractérisés en ce que les oses sont présents dans les proportions relatives approximatives suivantes, pour 1 glucose : environ 4 galactoses, environ 1 mannose et 10 environ 1 heptose.
- 3/. Les acylglycannes selon la revendication 1 ou 2, caractérisés en ce qu'ils comprennent un enchaînement de galactoses liés en S 1—>3 / de poids moléculaire d'environ 9 000.
- 4/. Les acylglycannes selon la revendication 1,2 ou 3, caractérisés en 15 ce qu' il s proviennent de Klebsiella pneumoniae.
- 5/. Les acylglycannes selon la revendication 4, caractérisés en ce qu'ils proviennent de la souche portant à l'Institut Pasteur ou Collection Nationale de Culture de Microorganismes les numéros 52 145 et 1-163, et à la National Culture Type Collection le N° 5 055. 20 6/. Procédé d'obtention des acylglycannes tels que définis à Tune des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que Ton traite un extrait bactérien hydrosoluble de Klebsiella renfermant 30 % à 45 % de protéines, 30 % à 40 % d'oses neutres, une faible proportion d'acides uroniques, 2 % à 5 % d'osamines et ayant un poids moléculaire d'environ 25 350 000, à l'aide d'un détergent, chauffe à environ 80e C, chromatographie sur silice branchée hydrophobe, et récupère la fraction correspondant au troisième pic d'élution repéré par spectrométrie à 200 nm et disparaissant à 280 ran. 7/. Procédé d'obtention des acylglycannes tels que définis à Tune des 30 revendications 115 dans lequel Ton prépare un extrait bactérien hydrosoluble de Klebsiella tel que celui obtenu par mise en culture de germes appartenant au genre Klebsiella, lyse des germes, séchage, délipidation par extraction à l'aide de solvants des lipides, ultrafiltration, traitement de la solution aqueuse ainsi obtenue à 35 l'aide d'un sel d'ammonium quaternaire, élimination du précipité, puis soit traitement à froid du surnageant à l'aide d'un alcanol de faible poids moléculaire, isolation, puis dissolution dans l'eau, dialyse et séchage du produit obtenu, remise en solution, filtration sur gel puis isolation de la première fraction éluêe et séchage, soit concentration * 13 du surnageant par utilisation d'au moins un dispositif de sélection de molécules, traitement à froid du concentré à l'aide d'un alcanol et - isolation du précipité obtenu, caractérisé en ce que Ton traite à l'aide d'un détergent ledit extrait bactérien hydrosoluble de 5 Klebsiella, chauffe à environ 80° C, chromatographie sur silice branchée hydrophobe et récupère la fraction correspondant au pic d'êlution repéré par spectrométrie à 200 nm, disparaissant à 280 nm et apparaissant à 492 nm après coloration au phénol sulfurique. 8/. Procédé selon la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce que : 10. le détergent est un sulfate alcalin de type ester alkyl, - Télution est effectuée à l'aide d'un gradient acêtonitrile -solution aqueuse à 0,1 % pH 1,8 d'acide trifluoroacêtique. 9/. Les acylglycannes tels qu'obtenus par le procédé selon Tune des revendications 6, 7 ou 8. 15 10/. Les acylglycannes tels que· définis à Tune quelconque des revendications 1 à 5 ou 9, pour leur utilisation dans une méthode de traitement thérapeutique préventif ou curatif du corps humain ou animal. 11/. Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles 20 renferment, comme principe actif, les acylglycannes tels que définis à la revendication 10.
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