WO1982001995A1 - Procede de purification de polyosydes de streptococcus pneumoniae et vaccin a base de polyosides ainsi purifies - Google Patents

Procede de purification de polyosydes de streptococcus pneumoniae et vaccin a base de polyosides ainsi purifies Download PDF

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WO1982001995A1
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WO
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polysaccharide
precipitate
added
solution
concentration
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Application number
PCT/FR1981/000161
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Inventor
Merieux Sa Inst
Francois Arminjon
Robert Donikian
Original Assignee
Merieux Inst
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • A61K39/092—Streptococcus

Definitions

  • the present invention relates to a process for the purification of polysaccharides from Streptococcus pneumoniae.
  • the invention also relates to a vaccine against infections caused by Streptococcus pneumoniae bacteria based on polysaccharides thus purified.
  • Streptococcus pneumoniae causes various infections such as meningitis, pneumonia, otitis and various bacteremia.
  • European patent application No. 78.400135.1 describes in particular a process for the purification of Streptococcus pneumoniae polysaccharide by fractional precipitation with alcohol and then elimination of proteins and nucleic acids.
  • the elimination of proteins and nucleic acids is carried out either by treatments using enzymes or by treatments using cationic surfactant, these treatments being followed by diafiltration.
  • the fractional precipitation by alcohol is applied directly to the culture medium, without prior lysis, and, due to the presence of various impurities, the various purification treatments require systematic production on each batch. preliminary tests to determine the quantities of raw materials to be used for fractional alcoholic precipitation, and for treatment with the cationic surfactant.
  • the process of the present application is carried out on a lysed starting product from which the cellular debris has been eliminated (clarification).
  • this process makes it possible to significantly shorten the duration of all the stages of purification of the polysaccharides of Streptococcus pneumoniae.
  • the present invention relates to a process for purifying a polysaccharide of Streptococcus pneumoniae, characterized in that the starting product is an aqueous solution of said polysaccharide, containing protein impurities, obtained by iysis of a culture of Streptococcus pneumoniae then clarification and concentration of the polysaccharide, which is added from 5 to 50% by volume of phenol, at a temperature of about 5 to 30 ° C., which is stirred, then separates and collects the aqueous phase, and which is repeat, if necessary, the phenol treatment until the protein content of the aqueous phase is below a predetermined threshold.
  • This phenol treatment process therefore makes it possible to carry out the elimination of most of the proteins present in the impure starting solution. It has been discovered that this phenol treatment does not modify the molecular structure and therefore the biological activity of the polysaccharide.
  • this phenol treatment is carried out here at an early stage of the purification process, on a starting product containing at least 20% by weight, and generally from 30 to 50% by weight, of proteins (on starting product dry).
  • this process also has the following characteristics, taken individually or in combination: - the starting aqueous solution contains from 1 to 30 g / liter of impure polysaccharide;
  • the phenol is added in the form of a mixture, phenol-water;
  • the phenol-water mixture consists of phenol in which the water is dissolved
  • the phenol treatment is carried out at a pH of approximately 6.9 ⁇ 0.5;
  • the starting polysaccharide solution is a buffered solution
  • the buffered solution is for example a sodium acetate buffer
  • the phenol is added in the form of a phenol-buffered solution mixture
  • the amount of water or buffered solution of said mixture corresponds substantially to the maximum amount that can be dissolved in phenol
  • - Said threshold corresponds to a protein content of 5% by weight, that is to say 5g of protein per 100g of crude polysaccharide;
  • the collected aqueous phase is subjected to dialysis to remove the residual phenol.
  • the procedure is advantageously as follows: add the phenol to the polysaccharide solution to be purified and then the mixture is subjected to ultracentrifugation. A separation is thus obtained in three phases: a lower phenolic phase, a protein interphase and an upper aqueous phase containing the polysaccharide. This aqueous phase is collected and subjected if necessary to a new treatment with phenol. The process can thus be repeated until a protein content below the set threshold is obtained.
  • the determination of the protein contamination rate can be carried out after isolation, by alcoholic precipitation then desiccation under vacuum, of an aliquot of polysaccharide contained in the aqueous phase, by colorimetric assay according to the technique of Lowry et al. described in J. Biol. Chem. 143, 265 (1951) with bovine serum albumin as a standard.
  • a water-miscible alcohol in sufficient quantity to precipitate is added to the polysaccharide solution, in the presence of calcium ions. nucleic contaminants, the precipitate is removed and then said alcohol is added again in an amount sufficient to precipitate the polysaccharide.
  • this additional treatment with an alcohol in the presence of calcium ions still has the following characteristics, taken individually or in combination:
  • the alcohol used is ethanol
  • Alcohol is added to a concentration of approximately 10 to 35% (vol / vol) to precipitate the nucleic contaminants, then alcohol is added to the supernatant until complete precipitation of the polysaccharide;
  • the solution to be purified in order to remove the nucleic contaminants, it is also possible to subject the solution to be purified to an additional treatment with activated carbon in an amount sufficient to adsorb most of the nucleic contaminants, then remove the activated carbon on which the nucleic contaminants are adsorbed.
  • This activated carbon treatment can be carried out either in place of the alcohol treatment in the presence of calcium ions, or in addition to this treatment. If the initial rate of nucleic contamination is greater than 15% by weight, the fractional precipitation with alcohol is first carried out in the presence of calcium ions.
  • the polysaccharide precipitate can be dissolved and then subjected to an activated carbon treatment as described above.
  • the elimination of nucleic acids is preferably carried out only by treatment with activated carbon.
  • the nucleic acid contamination rate can be assessed by spectrophotometric measurement of the absorption at 260 nm of an aqueous polysaccharide solution prepared by redissolution in distilled water of an aliquot of polysaccharide obtained by drying the precipitate from the ethanol treatment. an aliquot of the solution obtained after the phenol and dialysis treatment. A value equal to 1 is assigned to the absorbance of 50 micrograms of nucleic acid in 1 ml of water, in a cell having an optical path of 1 cm.
  • the optimum concentration of activated carbon which is the one which allows the greatest reduction in the level of nucleic acids, is determined by preliminary tests on each batch of polysaccharide to be purified. This concentration of activated carbon varies in practice from 0.1 to 12% (weight / volume).
  • the polysaccharide can be subjected to precipitation and then the precipitate is washed.
  • the precipitate is then washed with at least one washing agent chosen from the group consisting of an alcohol (such as ethanol), acetone or ethyl ether.
  • a water-miscible alcohol is added to an aqueous polysaccharide solution to be purified (obtained after lysis, clarification and concentration) so as to precipitate the polysaccharide and then the precipitated in solution.
  • This precipitation can be carried out in several stages (generally two stages) by adding the alcohol in increasing amounts so as to precipitate impurities first and then the polysaccharide. It is also possible in certain cases, in particular when the polysaccharide precipitates for a relatively low alcohol concentration, to carry out direct alcoholic precipitation. This is particularly the case for polysaccharides of types 3 and 8, as illustrated below in the experimental part.
  • the alcohol precipitation is carried out in the presence of a salt soluble in the medium, in order to increase the ionic strength.
  • a salt soluble in the medium in order to increase the ionic strength.
  • This preliminary precipitation can also be carried out with alcohol in the presence of calcium salts. In this case, this preliminary stage makes it possible to eliminate most of the nucleic contaminants, before the stage of elimination of proteins by phenol.
  • the salt concentration can vary from 0.1 to 2M.
  • Direct precipitation consists in adding a sufficient volume of alcohol to allow the insolubilization of the polysaccharide. This is recovered by centrifugation with or without prior settling of the supernatant.
  • the fractional alcoholic precipitation is preferably carried out in two stages. First we add a volume ethanol allowing the selective precipitation of contaminants (mainly proteins and nucleic acids). To the supernatant obtained after centrifugation, the volume of alcohol sufficient to cause complete precipitation of the polysaccharide is added in a second step. After centrifugation, the sediment is put back into solution for treatment with phenol.
  • contaminants mainly proteins and nucleic acids
  • an alcohol concentration of 10 to 30% is sufficient to insolubilize part of the protein and nucleic contaminants.
  • a final concentration varying according to the case between 30 and 80% is generally necessary for the precipitation of polysaccharides.
  • the alcohol used is preferably ethanol. Precipitation with alcohol is generally carried out at a temperature of 0 to + 15 ° C. approximately.
  • This preliminary alcohol precipitation can be replaced by precipitation with an aqueous ammonium sulphate solution of sufficient concentration to precipitate the polysaccharide.
  • the starting product was subjected to a prior concentration after lysis of the culture medium and removal of the cell culture debris by clarification. To achieve this concentration, it is preferably carried out by ultrafiltration.
  • the concentration factor can vary from approximately 4 to 15, depending on the volume and the viscosity of the supernatant to be concentrated.
  • Ultrafiltration is carried out for example using membranes retaining substances of molecular weight greater than 10,000. It is also possible to use membranes which retain substances with a molecular weight greater than 50,000, or greater than 100,000.
  • the culture of Streptococcus pneumoniae is carried out in a semi-synthetic medium free of proteins.
  • the culture preferably comprises three preculture stages of 3-4 hours each.
  • Liquid precultures and industrial culture are carried out in a semi-synthetic medium.
  • a semi-synthetic medium For culture in a large fermenter, it is advantageous to provide automatic pH regulation and addition of glucose.
  • the pH is regulated between approximately 6.0 and 7.4 by addition of 5N sodium hydroxide or any other alkaline solution.
  • the culture should be stopped after complete development of the microbial bodies, ie approximately after 12-18 hours at a temperature of 37 ⁇ 0.2 ° C.
  • the culture is sterilized for example by the addition of a small amount of phenol (for example 0.5%) and the germs are lysed by the addition of a lysing agent such as sodium deoxycholate.
  • a lysing agent such as sodium deoxycholate.
  • the pH is adjusted to 7.6.
  • the 50% glucose solution is prepared by dissolving 50 g of anhydrous glucose in 100 ml of distilled water. Sterilized for 30 minutes at 120 ° C.
  • the solution of vitamins, salts and growth factors has the following formula:
  • This sterile filtered solution is stored at + 4 ° C.
  • the vitamin solution can have the following composition: - Biotin 0.15mg
  • the salt solution has the following formula:
  • the bicarbonate and thioglycolic acid solution has the following formula:
  • 1.25 ml of the 50% glucose solution, 2.50 ml of the solution of vitamins, salts and growth factors and 1.25 ml of the bicarbonate solution are sterile added to containers containing 45 ml of base medium. thioglycolic acid.
  • 361 sterilized base media are used which are saturated with carbon dioxide.
  • To this basic medium is added 1 liter of the glucose solution, 21 of the solution of vitamins, salts and growth factors, and 1 liter of the solution of bicarbonate and thioglycolic acid.
  • the pH is reduced to 7.6 with 5N sodium hydroxide.
  • Cultivation is carried out at a temperature of 36 ° C., with stirring, without aeration, preferably under inert gas or under carbon dioxide, the pH being regulated between 6.0 and 7.4 with 5N sodium hydroxide.
  • the stopping of the culture is a function of the lysis of the germs:
  • polysaccharides. purified from Streptococcus pneumoniae allow vaccines to be produced.
  • the invention also relates to a pneumococcal vaccine containing at least one polysaccharide purified according to the method described in the present application.
  • a monovalent pneumococcal vaccine is formed by dissolving a purified polysaccharide in a buffered isotonic solute.
  • a multipurpose pneumococcal vaccine consists of at least 2 purified polysaccharides dissolved in a buffered isotonic solute.
  • the invention also relates to a purification process having all or part of the characteristics of the processes described in the following nonlimiting examples.
  • the sodium acetate used is hydrated sodium acetate AcNa, 3H20.
  • the acetic acid used is pure acetic acid called glacial acetic acid.
  • physiological water is an apyrogenic aqueous solution of sodium chloride at 8 g / l.
  • ethanol pre-cooled to -20 ° C. is used in order to avoid a significant increase in temperature due to the dissolution of the ethanol.
  • a fermenter with a useful capacity of 200 l comprising a Vortex-type stirring.
  • the culture supernatant (3 ⁇ 200 liters) prepared as described above is concentrated, washed with 3 ⁇ 60 liters of 0.5% phenol physiological water and again concentrated by ultrafiltration on hollow fibers having a retention threshold of substances including the molecular weight is greater than 10,000 (Amicon or Romicon type). Fractional alcoholic precipitation
  • the pH is adjusted to 5.8 with acetic acid, and ethanol is added slowly, with vigorous stirring, to a final alcohol concentration of between 15 and 35% (preferably 20%). Stirring is continued for 20 minutes at + 4 ° C. then the mixture is continuously ultracentrifuged at 35,000 rpm at + 4 ° C.
  • the concentration of sodium acetate in the alcoholic supernatant (153 liters) is brought to 5 g% (weight / volume) and the pH is adjusted to 5.8 by glacial acetic acid.
  • the crude polysaccharide (1900 g wet weight) is dissolved in about 40 liters of 0.3M sodium acetate buffer pH 6.9. To this solution is added 0.2 to 0.4 volume (preferably 0.33 volume) of the phenol-0.3M sodium acetate buffer pH 6.9 mixture (1: 0.4 vol / vol).
  • the emulsion obtained is subjected to an ultracentrifu gation at 35,000 rpm, at + 14 ° C.
  • the aqueous phase containing the polysaccharide is again subjected to a second phenolic treatment. The process is repeated, if necessary, until the aqueous phase contains less than 5g% of protein (generally 2 cycles are sufficient).
  • the protein assay is carried out according to the technique of Lowry et al., J; Biol. Chem. 143, 265 (1951).
  • the aqueous phase is then dialyzed against demineralized water for 16 hours at + 4 ° C to remove the residual phenol.
  • stage 3 To the dialyzed solution obtained in stage 3 (44.7 liters) is slowly added 6.4 liters of an aqueous solution of CaCl 2 4M. The mixture is stirred for 15 minutes and then ethanol is added slowly, with vigorous stirring, until a final concentration of between 10 and 30% (preferably 15%) is obtained. Stirring is continued for 30 minutes at + 4 ° C. then the mixture is continuously ultracentrifuged at 30,000 rpm at + 4 ° C.
  • the ethanolic concentration of the supernatant is brought, with vigorous stirring, to a value between 40 and 60%, generally 44.4%.
  • the mixture is stirred for 2 minutes then left to stand for 30 minutes at + 4oC.
  • the carbon is then removed by filtration.
  • the filtrate is dialyzed against demineralized water for 16 hours at + 4 ° C.
  • the precipitate is suspended in two liters of absolute ethanol pre-cooled to -20oC and then centrifuged as indicated above. The process is restarted once. Two successive washes are then carried out with 3 ⁇ 500 ml of acetone precooled to -20 ° C. and with 3 ⁇ 500 ml of ethyl ether precooled to -20 ° C. Filtered on sintered glass of porosity 5. The precipitate thus washed and dehydrated is dried under vacuum overnight at 0 ° C.
  • the dehydrated polysaccharide is reduced to powder.
  • Example No. 1 The experimental conditions for fermentation and preparation of the supernatant are similar to those described in Example No. 1, except for the pH regulation which is carried out at a pH equal to 7.2 ⁇ 0.2.
  • the culture supernatant (600 liters) is reduced to a volume of approximately 50 liters and washed several times by dilution-concentration with 100-200 liters of 0.5% phenol physiological water. This operation is carried out by filtration on hollow fibers having a retention threshold close to 10,000.
  • the supernatant thus freed from low molecular weight substances is then again concentrated by ultrafiltration.
  • concentration factor depends on the volume and the viscosity of the initial supernatant, it is generally between 4 and 15.
  • the sodium acetate concentration of the supernatant (73 liters is brought to 7.5 g% and the pH adjusted to 5.80 with acetic acid. Ethanol is added to a final alcohol concentration of the around 60-80% (preferably 75%).
  • the pH is, if necessary adjusted to 6.80 with acetic acid and the mixture is left to stand at + 4 ° C for 16-18 hours.
  • the supernatant is removed by decantation and the precipitate of crude polysaccharide recovered by centrifugation.
  • the crude polysaccharide (530 g wet weight) is dissolved in about 20 liters of 0.3M sodium acetate buffer, pH 6.9.
  • Example 1 After vigorous stirring for 30 seconds using a disperser, the mixture is ultracentrifuged as in Example 1.
  • the aqueous phase containing the polysaccharide is subjected to a second cycle of phenolic treatment. The process is repeated, if necessary, until a polysaccharide solution containing less than 5g% of proteins is obtained.
  • the aqueous phase is then dialyzed against demineralized water for 16 hours at + 4 ° C.
  • the ethanol concentration of the supernatant is brought, with stirring, to a value between 60 and 80%, generally 75. After half an hour of stirring the mixture is left to stand at + 4 ° C for 16 hours.
  • the precipitate is recovered by centrifugation at 4200 rpm at + 4 ° C and then dissolved in an aqueous solution of 0.14 M sodium chloride, pH 6.9 (8 liters).
  • the culture and preparation conditions for the culture supernatant are identical to those used for the preparation of the pneumococcal polysaccharide type 4 (Example 2).
  • the culture supernatant (43 liters) is concentrated, washed with 3 ⁇ 12 liters of 0.5% phenolic physiological water and again concentrated by ultrafiltration so as to retain the substances whose molecular weight is greater than 10,000. concentration varies from 4 to 10 depending on the volume and viscosity of the initial supernatant.
  • the sodium acetate concentration of the alcoholic supernatant (11.1 liters) is brought to 7.5 g% and the pH is adjusted to 5.8-6.0 by addition of acetic acid.
  • the crude polysaccharide (400 g wet weight) is dissolved in about 3 liters of 0.3 M sodium acetate buffer, pH 6.9. To this solution is added 0.2 to 0.6 volume of the phenoltampon acetate mixture of Example 1. After vigorous stirring for 30 seconds using a disperser, the dispersion is subjected to ultracentrifugation as in Example 1. The aqueous phase containing the polysaccharide is again subjected to a second phenolic treatment. The process is possibly repeated until a polysaccharide solution containing less than 5 g% of proteins is obtained. The aqueous phase is then dialyzed against demineralized water for 16 hours at + 4 ° C to remove the residual phenol.
  • stage 3 To the dialyzed solution obtained in stage 3 (2.1 liters), 0.3 liter of aqueous 4M CaCl 2 solution is added slowly. The mixture is stirred for 15 minutes and then ethanol is added slowly, with vigorous stirring, until a final concentration of between 10 and 35% is obtained. Stirring is continued for 30 minutes at + 4 ° C. then the mixture is ultracentrifuged at 10,000 rpm for 20 minutes at + 4 ° C.
  • the supernatant is diluted with one to two volumes of ethanol to completely precipitate the polysaccharide.
  • the mixture is left to stand for approximately 24 hours at + 4 ° C. and then the precipitate is collected by centrifugation.
  • the precipitate (2 g) is dissolved in 0.6 liters of 0.14 M NaCl buffer pH 6.9 ⁇ 0.2, then the necessary volume of a suspension of Norit activated carbon at 20 g% is added quickly with stirring ( weight / volume) in a 0.14 M sodium chloride solution pH 6.9 to obtain a final concentration of activated carbon of between 0.1 and 8g%. The mixture is stirred for 2 minutes then left to stand for 30 minutes at + 4o0.
  • the carbon is removed by centrifugation and / or by filtration.
  • the filtrate is dialyzed against demineralized water for 16 hours at + 4 ° C.
  • the concentration of sodium acetate in the dialyzed solution obtained above is brought to a value between 6 and 12 g% (weight / volume) and the pH is adjusted to 5.4-5.8 by glacial acetic acid.
  • the precipitate is suspended in absolute ethanol pre-cooled to -20 ° C and then centrifuged at 4200 rpm at + 4 ° C.
  • the precipitate thus washed and dehydrated is dried under vacuum at 0 ° C.
  • the purified polysaccharide is reduced to powder.
  • the culture supernatant (2 ⁇ 220 liters) prepared as previously described is concentrated, washed with 2 ⁇ 60 liters of 0.5% phenolic physiological water and again concentrated, by ultrafiltration, as described in Example 1, stage 2.
  • the pH is adjusted to 5.8 with acetic acid, and ethanol is added, to a final alcohol concentration of between 15 and 35% (preferably 25%), then centrifuged.
  • the concentration of sodium acetate (AcNa, 3H20) of the supernatant (131 liters) is brought to 6.9 g% (weight / volume) and the pH is adjusted to 5.8 with acetic acid.
  • Ethanol is added to a final alcohol concentration of the order of 45-75% (preferably 56.5%). After half an hour of stirring, the mixture is left to stand at + 4 ° C for 16 hours; the precipitate is then collected by centrifugation. It constitutes the crude polysaccharide.
  • the crude polysaccharide (1100 g wet weight) is dissolved in about 50 liters of 0.3M sodium acetate buffer pH 6.9. To this solution is added 0.1 to 0.4 volume (preferably 0.25 volume) of the phenol-acetate buffer mixture of Example 1.
  • the dispersion After vigorous stirring for 30 seconds using a disperser, the dispersion is subjected to ultracentrifugation. The process is repeated several times, if necessary, until an aqueous phase containing less than 5 g% of proteins is obtained (generally 1 or 2 cycles are sufficient).
  • the aqueous phase is then dialyzed against demineralized water.
  • the ethanolic concentration of the supernatant is brought between 45 and 70%, generally 56.5%.
  • the precipitate is. suspended in two liters of absolute ethanol pre-cooled to -20 ° C and then centrifuged as indicated above. The process is restarted once. Washes are then carried out with acetone and ethyl ether, then dried as described in Example 1.
  • the culture supernatant (400 liters) is concentrated to 35 liters, washed with 3 ⁇ 40 liters of 0.5% phenol physiological water and again concentrated to 60 liters by ultrafiltration on Amicon H10 P10. Fractional alcoholic precipitation
  • stage 2 ethanol is added to a final concentration of 20-35% (preferably 28.5%) and, after ultracentrifugation, the concentration of sodium acetate of the supernatant is brought to 7.14 g%, the pH is. adjusted to 5.80 with acetic acid, and ethanol is added to a final concentration of 50-80% (preferably 63.6%).
  • Example 1 The crude polysaccharide (1143 g wet weight) is dissolved in 24 liters of 0.3M sodium acetate buffer pH 6.9. To this solution is added 0.1 to 0.5 volume (preferably 0.33 volume) of the phenol-acetate mixture of Example 1 stage 3, and the procedure is as in Example 1.
  • the precipitate (400g wet weight) is dissolved in 40 liters of 0.14M sodium chloride and the procedure is then as in Example 1, stage 4b, with a final concentration of activated carbon of between 0.5 and 10g% (preferably 2g%).
  • stage 2 ethanol is added to a final concentration of 17-37% (preferably 28%), and, after ultracentrifugation, the sodium acetate concentration of supernatant is brought to 7.20 g%, the pH is adjusted to 5.90 with acetic acid, and ethanol is added to a finite concentration of 50-75% (preferably 60%).
  • the pH is, if necessary, adjusted to 6.80.
  • the precipitate is then recovered by centrifugation. It constitutes the crude polysaccharide.
  • the crude polysaccharide (500 g wet weight) is dissolved in 42 liters of 0.3M sodium acetate buffer pH 6.9.
  • stage 4b the solution obtained is treated with activated carbon with a final concentration of activated carbon of between 0.5 and 10 g% (preferably 1.5%), then the carbon is removed and dialysis.
  • Stage 1 Culture The experimental conditions for fermentation and preparation of the supernatant are identical to those described in Example 1, except for the regulation of the pH which is carried out at a pH equal to 7.2 + 0.2.
  • the culture supernatant (600. liters) is reduced to a volume of approximately 100 liters and washed several times by dilution-concentration with 200 to 300 liters of 0.5% phenol physiological water. This operation is. performed by ultrafiltration on hollow fibers with a retention threshold of around 10,000 (Amicon or Romicon type).
  • the supernatant thus freed from low molecular weight substances is then concentrated to 96 liters by ultrafiltration.
  • the crude polysaccharide precipitate is then recovered by ultracentrifugation.
  • the crude polysaccharide (335 g wet weight) is dissolved in 48 liters of 0.3M sodium acetate buffer, pE 6.9.
  • stage 4b the solution obtained is treated with active carbon in an amount of between 0.1 and 8 g% (preferably 2 g%), then the carbon is removed and dialyzed.
  • the experimental fermentation conditions are those described in Example No. 2. After sterilization with phenol and lysis of the germs with sodium deoxycholate, the cellular debris is removed by centrifugation.
  • the culture supernatant (200 liters) is concentrated to 40 liters, washed with 0.5% phenol physiological water and then again concentrated to 34.5 liters. These operations are carried out by ultrafiltration on hollow fibers of the Romicon type, having a retention threshold for substances whose molecular weight is greater than 10,000.
  • the crude polysaccharide (690 g wet weight) is dissolved in 24 liters of sodium acetate buffer 0, 3M pH 6.9. To this solution is added 0.1 to 0.6 volume (preferably 0.3 volume) of the phenol-sodium acetate buffer mixture and the procedure is as in Example 1, stage 3.
  • the precipitate is recovered by centrifugation (430 g wet weight) and dissolved in 12 liters of sterile pyrogen-free distilled water.
  • stage 3 To the solution obtained in stage 3 (12 liters) is slowly added, with stirring, 4 liters of 2M CaCl 2 solution.
  • the double precipitation is then carried out with ethanol, first with a concentration of 15-35% (generally 25%), then, after ultracentrifugation, with a final concentration of 45-65% (preferably 55.5%).
  • the precipitate is then recovered by decantation and centrifugation.
  • stage 4 The precipitate obtained in stage 4 is suspended in two liters of absolute ethanol pre-cooled to -20 ° C and then centrifuged as shown above. The operation is repeated once. Washes are then carried out with acetone and ethyl ether and dried as described in example 1, stage 5.
  • Example No. 1 The experimental conditions for culture and preparation of the supernatant are identical to those described in Example No. 1, except for the pH which is regulated at 7.2-7.4 with 5N sodium hydroxide.
  • the concentration factor varies from 4 to 15 depending on the volume and the viscosity of the supernatant to be ultrafiltered.
  • the crude polysaccharide (469 g wet weight) is dissolved in 16 liters of 0.3M sodium acetate buffer pH 6.9. To this solution is added 0.1 to 0.5 volume (preferably 0.25 volume) of the phenol-sodium acetate buffer mixture and the procedure is as in Example 1, stage 3.
  • the precipitate is suspended in two liters of absolute ethanol pre-cooled to -20oC and then centrifuged as indicated above.
  • the experimental fermentation conditions are those used in Example 2. After sterilization with phenol and lysis of the germs with sodium deoxycholate, the cellular debris is removed by centrifugation.
  • the culture supernatant (400 liters) is concentrated to 50 liters, washed with 0.5% phenol physiological water and then again concentrated to 40.3 liters. These operations are carried out by ultrafiltration on hollow fibers of the Romicon type, having a retention threshold for substances whose molecular weight is greater than 10,000.
  • the crude polysaccharide (427 g wet weight) is dissolved in 16 liters of 0.3M sodium acetate buffer pH 6.9. To this solution is added 0.1 to 0.6 volume (preferably 0.25 volume) of the phenol-sodium acetate buffer mixture and the procedure is as described in Example 1, stage 3.
  • stage 3 To the solution obtained in stage 3 (18.9 liters) on. add 2.7 liters of 4M CaCl 2 solution. Ethanol is added (final alcohol concentration between 15 and 35%, generally 25%), and, after ultracentrifugation, ethanol is added to the supernatant up to a final concentration of 55-75% (preferably 63 , 5%), and the precipitate is then recovered by decantation and centrifugation.
  • Ethanol is added (final alcohol concentration between 15 and 35%, generally 25%), and, after ultracentrifugation, ethanol is added to the supernatant up to a final concentration of 55-75% (preferably 63 , 5%), and the precipitate is then recovered by decantation and centrifugation.
  • the precipitate is suspended in three liters of absolute ethanol pre-cooled to -20oC and then centrifuged as indicated above. The operation is repeated once. Washes are then carried out with acetone and ethyl ether, then dried as described in Example 1, stage 5.
  • the experimental conditions are those described in Example 1, stage 1, with the exceptions of pH regulation (6,2-6,8) and the addition of glucose (addition every 2h30mn).
  • the culture supernatant (200 liters) is concentrated, washed with 0.5% phenol physiological water and again concentrated by ultrafiltration on hollow fibers having a retention threshold of substances whose molecular weight is greater than 10,000 (Amicon type or Romicon).
  • concentration factor varies from 4 to 10 depending on the volume and the viscosity of the supernatant to be ultrafiltered.
  • the crude polysaccharide (110 g wet weight) is dissolved in about 30 liters of sodium acetate buffer 0, 3M pH 6.9. To this solution is added 0.1 to 0.4 volume (preferably 0.15 volume) of the phenol-0.3M sodium acetate buffer pH 6.9 mixture (1: 0.4 vol / vol). After gentle agitation (manual or magnetic) for approximately 10 minutes to create the emulsion, the phenol solution is ultracentrifuged. The aqueous phase containing the polysaccharide is, if necessary, subjected to a second phenolic treatment, but generally 1 cycle is sufficient.
  • the aqueous phase is then dialyzed against demineralized water for 16 hours at + 4oC to remove the residual phenol.
  • the mixture is stirred for 2 minutes then left to stand for 30 minutes at + 4 ° C.
  • the carbon is then removed by filtration.
  • the filtrate is dialyzed against demineralized water for 16 hours at + 4 ° C.
  • Sodium acetate is added to the dialysed polysaccharide solution until a concentration of 15 g% is obtained and the pH is adjusted to 6.00 with acetic acid. Is added slowly, with vigorous stirring, the volume of dehydrated absolute ethanol pre-cooled to -20 ° C sufficient to obtain a final alcoholic concentration of 60-80% (preferably 75%). After 30 minutes of stirring, the pH is adjusted to 6.9 and the solution is left to stand at + 4 ° C for 16 hours. The polysaccharide is recovered by centrifugation. The precipitate is suspended in a liter of absolute ethanol pre-cooled to -20 ° C and then centrifuged as indicated above.
  • the experimental conditions are those described in Example 2, stage 1. After sterilization with phenol and lysis of the germs with sodium deoxycholate, the cellular debris is removed by centrifugation.
  • the culture supernatant (400 liters) is concentrated to 50 liters, washed with 0.5% phenol physiological water and then concentrated again to 42 liters. These operations are carried out by ultrafiltration on hollow fibers of the Romicon type, having a retention threshold for substances whose molecular weight is greater than 10,000.
  • the crude polysaccharide precipitate is then recovered by decantation and centrifugation.
  • the crude polysaccharide (660 g wet weight) is dissolved in 24 liters of sodium acetate buffer 0, 3M pH 6.9. To this solution is added 0.1 to 0.6 volume (preferably 0.3 volume) of the phenol-sodium acetate buffer mixture, and the procedure is as in Example 1, stage 3.
  • stage 4 To the solution obtained in stage 4 (38 liters), 3420 g of sodium acetate are added and the pH is adjusted to 5.4 with acetic acid. Ethanol is added slowly, with vigorous stirring, to a final concentration of 50-65% (preferably 55.5%).
  • the precipitate is then recovered by decantation and centrifugation, and suspended in two liters of absolute ethanol pre-cooled to -20 ° C then centrifuged. The operation is repeated once. Washings are then carried out with acetone and ethyl ether, then the precipitate is dried, as in Example 1, stage 5.
  • the culture supernatant (40 liters) is concentrated to 10 liters, washed with 0.5% phenol physiological water and again concentrated to 9 liters by ultrafiltration using an Amicon system supporting 5 columns. H10 P10.
  • the precipitate previously obtained (174 g wet weight) is dissolved in 8 liters of sodium acetate buffer 0, 3M pH 6.9.
  • Example 1 To this solution is added 0.1 to 0.5 volume (preferably 0.5 volume) of the cold phenol-acetate mixture of Example 1, stage 3, and the procedure is as in Example 1.
  • stage 4b an active carbon treatment is carried out followed by dialysis.
  • the suspension of Norit active carbon is added to obtain a final concentration of active carbon of between 1 and 7 g% (preferably 3g%).
  • stage 4 To the dialyzed solution obtained in stage 4 (9 liters), 450 g of sodium acetate are added and the pH is adjusted to 5.60 with acetic acid. Ethanol is added to a concentration of 45-75% (preferably 66.6%), and the pH is adjusted, if necessary, to 6.6-6, -8. The polysaccharide is then recovered by centrifugation, then suspended in a liter of absolute ethanol pre-cooled to -20 ° C and centrifuged. Washings are then carried out with acetone and ethyl ether, then the precipitate is dried, as described in Example 1, stage 5.
  • the polysaccharide 12 A is distinguished from the polysaccharide type 12 F by the absence of galactose in its chemical composition.
  • the quantitative determination of hexosamines and of oses was carried out, after controlled hydrolysis, respectively by colorimetric assay according to the technique of G. Ashwell, "Methods in Enzymology” 3 (1957) pages 95-97, SP Colowick & NO Kaplan, Eds.
  • the culture supernatant (30 liters) is concentrated, washed with physiological phenolic water at 0.5% and again concentrated to a volume equal to 9 liters, by ultrafiltration on hollow fibers having a retention threshold of substances whose weight molecular is greater than 10,000 (type Amicon H10 P10).
  • the crude polysaccharide (110 g wet weight) is dissolved in about 4 liters of sodium acetate buffer 0, 3M pH. 6, 9. To this solution is added 0.1 to 0.5 volume (preferably 0.3 volume) of phenol-sodium acetate buffer mixture, and the procedure is as in Example 1, stage 3.
  • stage 4b an active carbon treatment is carried out followed by dialysis.
  • the sodium chloride concentration of the solution obtained after dialysis in stage 3 (4.3 liters) is brought to 0.14M then the suspension of Norit activated carbon is added at 20g% to obtain a final concentration of activated carbon included. between 0.1 and 8g% (preferably 3.6g%).
  • the culture supernatant (200 liters) is reduced to a volume of approximately 80 liters and washed several times with 0.5% phenol physiological water. This operation is carried out by ultrafiltration on hollow fibers having a retention threshold close to 10,000. The supernatant thus freed from low molecular weight substances is then concentrated to 50 liters.
  • the crude polysaccharide (2180 g wet weight) is dissolved in 85 liters of 0.3M sodium acetate buffer pH 6.9. To this solution is added 0.1 to 0.5 volume (preferably 0.2 volume) of the phenol-sodium acetate buffer mixture, operating as in Example 1, stage 3.
  • stage 4b an active carbon treatment is carried out followed by dialysis.
  • the sodium chloride concentration of the solution obtained in stage 3 after dialysis is brought to 0.14M and the suspension of active carbon Norit is added to obtain a final concentration of active carbon of between 0.1 and 8g% (preferably 4g%).
  • the culture supernatant (400 liters) is reduced to a volume of approximately 60 liters and washed with 0.5% phenol physiological water. This concentration is carried out by ultrafiltration on hollow fibers having a retention threshold close to 10,000. The supernatant thus freed from low molecular weight substances is then concentrated to 51.5 liters.
  • the crude polysaccharide (2260 g wet weight) is dissolved in 32 liters of sodium acetate buffer 0, 3M pH 6.9. To this solution is added 0.1 to 0.5 volume (preferably 0.25 volume) of the phenol-sodium acetate buffer mixture, operating as in Example 1, stage 3.
  • stage 3 (1400 g wet weight) is dissolved in 27 liters of 0.14 M sodium buffer pH 6.9. This solution is treated with activated carbon, followed by dialysis, as in Example 1, stage 4b, by adding a suspension of Norit active carbon to obtain a final concentration of activated carbon of between 1 and 10 g% ( preferably 10g%).
  • stage 4 To the solution obtained in stage 4 after dialysis (27 liters), 1350 g of sodium acetate are added and the pH is adjusted to 5.4-5.6 with acetic acid. Ethanol is added to a concentration of 18-40% (preferably 33.3%), and, after centrifugation, the precipitate is suspended in two liters of absolute ethanol pre-cooled to -20 ° C then centrifuged. This operation is repeated once. Washes are then carried out with acetone and ethyl ether, then dried as described in Example 1, stage 5. 52g of purified type 8 polysaccharide are thus obtained.
  • the experimental fermentation conditions are similar to those described in Example 9, stage 1, except for the duration of the culture which is extended to 42 hours.
  • the culture is then sterilized by phenol and whole germs and cell debris are removed by centrifugation.
  • the culture supernatant (40 liters) is concentrated to 10 liters, washed with 0.5% phenol physiological water and again concentrated to 8.2 liters. These operations are carried out by ultrafiltration on Amicon hollow fibers type H10 P10.
  • Stage 3 Deproteinization
  • the crude polysaccharide (40 g wet weight) is dissolved in four liters of sodium acetate buffer 0, 3M pH 6.9.
  • To this solution is added 0.1 to 0.5 volume (preferably 0.5 volume) of the phenol-0.3M sodium acetate buffer pH 6.9 (1: 0.4 vol / vol) mixture. After vigorous stirring for 30 seconds using a disperser, the mixture is ultracentrifuged.
  • the upper aqueous phase is recovered and then subjected to a second cold phenol treatment. The process is repeated a total of 3 times.
  • the aqueous phase is then dialyzed against demineralized water for 18 hours at + 4 ° C.
  • the precipitate is then recovered by centrifugation, then suspended in a liter of absolute ethanol pre-cooled to -20 ° C and centrifuged. This operation is repeated once. Washes are then carried out with acetone and ethyl ether, then dried as in Example 1, stage 5.
  • pneumococcal polysaccharide type 6 3 can also be purified according to the techniques described in Example 9.
  • EXAMPLE 13 Polyoside 7F
  • This example illustrates the final purification by precipitation of the polysaccharide (7F) with ammonium sulphate.
  • the starting solution on which the ammonium sulphate precipitation is carried out is the dialyzed solution obtained after treatment with active carbon, that is to say the solution obtained in Example 11 stage 4.
  • the NaCl concentration is brought to 0.85 g%.
  • the pH of this solution is adjusted to 6.5 with dilute acetic acid and the necessary volume of saturated ammonium sulphate solution or the amount of (NH 4 ) 2 SO 4 is added slowly, with stirring. sufficient to obtain a final concentration of (NH 4 ) 2 SO 4 between 30 and 80g%, preferably 74g%.
  • the mixture is left to stand (30 minutes to 4 hours) and then ultracentrifuged at 15,000 rpm for 30 minutes.
  • the precipitate is recovered and dissolved in approximately 10 liters of pyrogen-free distilled water. Residual salts are removed by dialysis or diafiltration.
  • the active principle is then recovered by direct precipitation with ethanol in the presence of sodium salts as described in Example 11, stage 5.
  • EXAMPLE 19 Making and using a vaccine
  • the isotonic buffered solution has the following formula:
  • the pneumococcal vaccine should not be used in pregnant women.

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Abstract

Ce procede est caracterise par le fait que le produit de depart est une solution aqueuse dudit polyoside, contenant des impuretes proteiques, obtenue par lyse d'une culture de Streptococcus pneumoniae, clarification et concentration du polyoside, que, dans le but de reduire la teneur en proteines l'on ajoute de 5 a 50% en volume de phenol, a temperature de 5 a 30 C environ, que l'on agite, puis separe et recueille la phase aqueuse, et que l'on repete, si necessaire, le traitement au phenol jusqu'a ce que la teneur en proteines de la phase aqueuse soit inferieure a un seuil predetermine.

Description

Procédé de purification de polyosides de Streptococcus pneumoniae et vaccin â base de polyosides ainsi purifiés.
La présente invention a pour objet un procédé de purification de polyosides de Streptococcus pneumoniae.
L'invention a également pour objet un vaccin contre les infections provoquées par des bactéries Streptococcus pneumoniae à base de polyosides ainsi purifiés.
On sait que plusieurs types de Streptococcus pneumoniae provoquent diverses infections telles que des méningites, des pneumonies, des otites et diverses bactériémies.
Il est connu également que la purification de polyoside capsulaire purifié extrait de bactéries Streptococcus pneumoniae permet de réaliser des vaccins pour l'immunisation contre les infections provoquées par lesdites bactéries.
La demande de brevet européenne n°78.400135.1 décrit notamment un procédé de purification de polyoside de Streptococcus pneumoniae par précipitation fractionnée à l'alcool puis élimination des protéines et des acides nucléiques. L'élimination des protéines et des acides nucléiques est effectuée soit par des traitements à l'aide d'enzymes soit par des traitements à l'aide de tensio-actif cationique, ces traitements étant suivis d'une diafiltration.
Dans cette demande de brevet européenne, la précipitation fractionnée par l'alcool est appliquée directement au milieu de culture, sans lyse préalable, et, en raison de la présence d'impuretés variées, les divers traitements de purification nécessitent la réalisation systématique sur chaque lot d'essais préliminaires de détermination des quantités de matières premières à utiliser pour les précipitations alcooliques fractionnées, et pour le traitement par le tensio-actif cationique. Le procédé de la présente demande est effectué sur un produit de départ lysé dont les débris cellulaires ont été éliminés (clarification).
Ce procédé permet d'éviter la réalisation d'essais préliminaires systématiques.
D'une façon générale, ce procédé permet de raccourcir de façon importante la durée de l'ensemble des étapes de purification des polyosides de Streptococcus pneumoniae.
La présente invention a pour objet un procédé de purification d'un polyoside de Streptococcus pneumoniae, caractérisé par le fait que le produit de départ est une solution aqueuse dudit polyoside, contenant des impuretés protéiques, obtenue par iyse d'une culture de Streptococcus pneumoniae puis clarification et concentration du polyoside, que l'on ajoute de 5 à 50% en volume de phénol, à température de 5 à 30°C environ, que l'on agite, puis sépare et recueille la phase aqueuse, et que l'on répète, si nécessaire, le traitement au phénol jusqu'à ce que la teneur en protéines de la phase aqueuse soit inférieure à un seuil prédéterminé.
Ce procédé de traitement au phénol permet donc de réaliser l'élimination de la majeure partie des protéines présentes dans la solution impure de départ. On a découvert que ce traitement au phénol ne modifie pas la structure moléculaire et donc l'activité biologique du polyoside.
On notera que ce traitement, au phénol est effectué ici à un stade précoce du procédé de purification, sur un produit de départ contenant au moins 20% en poids, et généralement de 30 à 50% en poids, de protéines (sur produit de départ sec).
Selon des modes de réalisation particuliers actuellement préférés, ce procédé présente encore les caractéristiques suivantes, prises isolément ou en combinaison: - la solution aqueuse de départ contient de 1 à 30g/litre de polyoside impur;
- on opère à température de 10 à 20°C environ;
- on ajoute le phénol sous la forme d'un mélange, phénol-eau;
- le mélange phénol-eau est constitué par du phénol dans lequel l'eau est dissoute;
- on effectue le traitement au phénol à un pH de 6,9 ± 0,5 environ;
- la solution de polyoside de départ est une solution tamponnée;
- la solution tamponnée est par exemple un tampon acétate de sodium;
- le phénol est ajouté sous la forme d'un mélange phénolsolution tamponnée;
- on ajoute de 10 à 60% vol/vol du mélange phénol-eau ou phénol-solution tamponnée;
- la quantité d'eau ou de solution tamponnée dudit mélange correspond sensiblement à la quantité maximum pouvant être dissoute dans le phénol;
- ledit seuil correspond à une teneur en protéines de 5% en poids, c'est-à-dire de 5g de protéines pour 100g de polyoside brut;
- on soumet la phase aqueuse recueillie à une dialyse pour éliminer le phénol résiduel.
Pour mettre en oeuvre ce procédé de déprotéinisation par un phénol, on procède avantageusement de la façon suivante: on ajoute le phénol à la solution de polyoside à purifier puis on soumet le mélange à une ultracentrifugation. On obtient ainsi une séparation en trois phases: une phase inférieure phénolique une interphase protéique et une phase aqueuse supérieure contenant le polyoside. Cette phase aqueuse est recueillie et soumise si nécessaire à un nouveau traitement au phénol. Le processus peut être ainsi recommencé jusqu'à l'obtention d'une teneur en protéines inférieure au seuil fixé.
La détermination du taux de contamination protéique peut être réalisée après isolement, par précipitation alcoolique puis dessication sous vide, d'une quantité aliquote de polyoside contenu dans la phase aqueuse, par dosage colorimêtrique selon la technique de Lowry et coll. décrite dans J. Biol. Chem. 143, 265 (1951) avec la sérum- albumine bovine comme étalon.
Toutefois, l'expérience a montré qu'en utilisant des techniques constantes de culture, il est possible de déterminer une fois pour toutes le nombre de traitements au phénol (généralement 1 ou 2) nécessaires pour chaque type de polyoside.
Afin de purifier davantage le polyoside, on peut effectuer, outre le traitement de déprotéinisation par le phénol, d'autres traitements, et notamment des traitements permettant d'éliminer les contaminants nucléiques.
Selon un mode de réalisation du procédé tel que défini cidessus, et afin d'éliminer les contaminants nucléiques, on ajoute en outre à la solution de polyoside, en présence d'ions calcium, un alcool miscible à l'eau en quantité suffisante pour précipiter les contaminants nucléiques, on élimine le précipité puis on ajoute à nouveau ledit alcool en quantité suffisante pour précipiter le polyoside.
Selon des modes de réalisation particuliers, ce traitementsupplémentaire par un alcool en présence d'ions calcium, présente encore les caractéristiques suivantes, prises isolément ou en combinaison:
- on effectue cette précipitation fractionnée à l'alcool généralement après le traitement au phénol; il est toutefois possible de l'effectuer avant le traitement au phénol, comme illustré à l'exemple 17 ci-après;
- l'alcool utilisé est l'éthanol;
- on effectue la précipitation fractionnée à l'alcool à une température de 0 à + 15ºC environ;
- on ajoute l'alcool jusqu'à une concentration de 10 à 35% environ (vol/vol) pour précipiter les contaminants nucléiques, puis on ajoute encore de l'alcool au surnageant jusqu'à précipitation complète du polyoside;
- on opère en présence d'ions calcium à une molarité de 0,25-2M environ.
Selon un autre mode de réalisation du procédé de purification de l'invention, pour éliminer les contaminants nucléiques, il est encore possible de soumettre la solution à purifier à un traitement supplémentaire au charbon actif en quantité suffisante pour adsorber la majeure partie des contaminants nucléiques, puis d'éliminer le charbon actif sur lequel les contaminants nucléiques sont adsorbés.
Généralement, on ajoute de 0,1 à 12% (poids/volume) de charbon actif. Si la teneur en acides nucléiques, après un premier traitement au charbon actif, est supérieure au seuil que l'on s'est fixé, on peut répéter ledit traitement.
Ce traitement au charbon actif peut être effectué soit à la place du traitement à l'alcool en présence d'ions calcium, soit en complément de ce traitement. Si le taux initial de contamination nucléique est supérieur à 15% en poids, on effectue d'abord la précipitation fractionnée à l'alcool en présence d'ions calcium.
Si, après la précipitation fractionnée à l'alcool, la teneur en acide nucléique du polyoside est supérieure au seuil fixé (par exemple supérieure à 1 ou 2% en poids), on peut remettre en solution le précipité de polyoside et le soumettre alors à un traitement au charbon actif tel que décrit précédemment.
Si le taux initial de contamination nucléique est inférieur à 15% en poids, l'élimination des acides nucléiques est depréférence réalisée uniquement par un traitement au charbon actif.
Le taux de contamination nucléique peut être apprécié par mesure spectrophotometrique de l'absorption à 260nm d'une solution aqueuse polyosidique préparée par redissolution dans l'eau distillée d'une quantité aliquote de polyoside obtenu par dessiccation du précipité provenant du traitement à l'éthanol d'une partie aliquote de la solution obtenue après le traitement au phénol et dialyse. Une valeur égale à 1 est attribuée à l'absorbance de 50 microgrammes d'acide nucléique dans 1ml d'eau, dans une cuve ayant un trajet optique de 1cm.
Toutefois, l'expérience a montré qu'en utilisant des techniques constantes de culture, il est possible de déterminer une fois pour toutes le type et le nombre de traitements nécessaires pour une élimination satisfaisante des contaminants nucléiques. La concentration optimale en charbon actif, qui est celle qui permet la plus forte réduction du taux d'acides nucléiques, est déterminée par des essais préliminaires sur chaque lot de polyoside à purifier. Cette concentration en charbon actif varie en pratique de 0,1 à 12% (poids/volume).
Pour la purification finale du polyoside, on peut soumettre le polyoside à une précipitation puis laver le précipité. On peut effectuer par exemple la précipitation avec une solution aqueuse de sulfate d'ammonium ou avec un alcool. On lave ensuite le précipité avec au moins un agent de lavage choisi dans le groupe constitué par un alcool (tel que l'éthanol), l'acétone ou l'éther éthylique.
Généralement, pour obtenir la solution aqueuse de polyoside de départ, on ajoute à une solution aqueuse de polyoside à purifier (obtenue après lyse, clarification et concentration) un alcool miscible à l'eau de façon à précipiter le polyoside puis l'on remet le précipité en solution. On peut effectuer cette précipitation en plusieurs étapes (généralement deux étapes) en ajoutant l'alcool en quantités croissantes de façon à précipiter d'abord des impuretés puis le polyoside. On peut également dans certains cas, en particulier lorsque le polyoside précipite pour une concentration d'alcool relativement faible, effectuer une précipitation alcoolique directe. C'est en particulier le cas pour les polyosides des types 3 et 8, comme cela est illustré ci-après dans la partie expérimentale. De préférence la précipitation à l'alcool est effectuée en présence d'un sel soluble dans le milieu, afin d'augmenter la force ionique. On peut utiliser par exemple un sel de sodium. On peut également effectuer cette précipitation préliminaire à l'alcool en présence de sels de calcium. Dans ce cas ce stade préliminaire permet d'éliminer la majeure partie des contaminants nucléiques, avant le stade d'élimination des protéines par le phénol.
La concentration du sel peut varier de 0,1 à 2M.
La précipitation directe consiste en l'addition d'un volume d'alcool suffisant pour permettre d'obtenir l'insolubilisation du polyoside. Celui-ci est récupéré par centrifugation avec ou sans décantation préalable du surnageant.
La précipitation alcoolique fractionnée est réalisée de préférence en deux temps. Dans un premier temps on ajoute un volume d'éthanol permettant la précipitation sélective des contaminants (principalement protéines et acides nucléiques). Au surnageant obtenu après centrifugation, on ajoute dans un deuxième temps le volume d'alcool suffisant pour provoquer la précipitation complète du polysaccharide. Après centrifugation le sédiment est remis en solution en vue du traitement par le phénol.
Généralement une concentration en alcool de 10 à 30% (vol/vol) est suffisante pour insolubiliser une partie des contaminants protéiques et nucléiques. Une concentration finale variant selon les cas entre 30 et 80% est généralement nécessaire pour la précipitation des polyosides. Toutefois, lorsque le polyoside précipite déjà pour une faible concentration en alcool (par exemple pour une concentration de 15-20%) on effectue alors une précipitation directe du polyoside. L'alcool utilisé est de préférence l'éthanol. On effectue la précipitation à l'alcool généralement à une température de 0 à+15°C environ.
Cette précipitation préliminaire à l'alcool peut être remplacée par une précipitation avec une solution aqueuse de sulfate d'ammonium de concentration suffisante pour précipiter le polyoside.
Comme il a été indique ci-dessus, le produit de départ a été soumis à une concentration préalable après lyse du milieu de culture et élimination des débris de culture cellulaire par clarification. Pour réaliser cette concentration on opère de préférence par ultrafiltration. Le facteur de concentration peut varier de 4 à 15 environ, suivant le volume et la viscosité du surnageant à concentrer. L'ultrafiltration est réalisée par exemple à l'aide de membranes retenant les substances de poids moléculaire supérieur à 10.000. Il est également possible d'utiliser des membranes qui retiennent les substances de poids moléculaire supérieur à 50.000, ou supérieur à 100.000. Selon un mode de réalisation préféré, pour obtenir la solution de polyoside de départ, on effectue la culture de Streptococcus pneumoniae en milieu semi-synthétique exempt de protéines. La culture comporte de -préférence trois étapes de préculture de 3-4 heures chacune.
L'utilisation d'un milieu semi-synthétique pour une culture industrielle de Streptococcus pneumoniae n'avait jamais été réalisée. Elle permet de simplifier les purifications ultérieu- res en évitant l'addition de protéines étrangères difficiles à éliminer.
Les précultures liquides et la culture industrielle sont effectuées en milieu semi-synthétique. Pour la culture en grand fermenteur, il est avantageux de prévoir une régulation du pH et une addition de glucose automatiques.
Le pH est, suivant les cas, régulé entre 6,0 et 7,4 environ par addition de soude 5N ou de toute autre solution alcaline.
Afin d'obtenir un taux optimal en polysaccharide, il y a lieu d'arrêter la culture après complet développement des corps microbiens, soit environ après 12-18 heures à température de 37± 0,2°C.
En fin de cycle, la culture est stérilisée par exemple par addition d'une faible quantité de phénol (par exemple 0,5%) et les germes sont lysés par addition d'un agent lysant tel que le désoxycholate de sodium.
Pour la culture on utilise comme milieu de base, le milieu suivant:
- Hydrolysat acide de caséine 22,230g
- L Cystine 0,166g
- L Tryptophane 0,022g
- L tyrosine 0,220g
- Phosphate bipotassique ICH PO4 5,560g
- Eau distillée q.s.p 1000ml Le pH est ajusté à 7,6 par addition de soude.
Le milieu complet utilisé pour effectuer la deuxième préculture et les suivantes ainsi que la culture industrielle correspond à la formule suivante:
- milieu de base 900ml
- solution de glucose à 50% 25ml
- solution de vitamines, de sels et de facteurs de croissance 50ml
- solution de bicarbonate et d'acide thioglycolique 25ml.
Le pH est ajusté à 7, 6.
La solution de glucose à 50% est préparée par dissolution de 50g de glucose anhydre dans 100ml d'eau distillée. On stérilise pendant 30 minutes à 120°C.
La solution de vitamines, de sels et de facteurs de croissance a la formule suivante:
- solution de vitamines 200ml
- solution de sels 40ml
- L-Glutamine 12,5g
- Asparagine 2 g
- Chlorhydrate de choline 0 ,2g
- eau distillée q.s.p 1000ml
Cette solution filtrée stérilement est conservée à + 4°C.
La solution de vitamines peut avoir la composition suivante: - Biotine 0, 15mg
- Ac. Nicotinique 100mg
- Pyridoxal 100mg
- Calcium pantothenate 500mg
- Thiamine 100mg
- Riboflavine 100mg
- Adenine sulfate 1000mg
- Uracil 1000mg
- Eau distillée froide qsp 1000ml
La solution de sels a la formule suivante:
- Sulfate de magnésium Mg SO4,7H2O 250g
- Sulfate ferreux Fe SO4 , 7H2O 2 , 5g
- Sulfate de zinc Zn SO 4 , 7H2O 0 , 400g
- Sulfate de manganèse Mn SO4, H2O 0,180g
- Acide chlorhydrique 10ml
- Eau distillée q.s.p 1000ml
La solution de bicarbonate et d ' acide thioglycolique a la formule suivante:
- bicarbonate de sodium 40g
- acide thioglycolique 10% 40ml
- eau distillée q.s.p 1000ml
On donne ci-après le schéma d'une technique de culture:
Préculture I
On ensemence des boites de gélose à 5% de sang de cheval avec le Streptococcus pneumoniae choisi lyophilisé. On dilue le contenu de l'ampoule lyophilisée avec 1ml de bouillon trypticase soja et on répartit à la surface des boîtes de Pétri. On place à l'étuve pendant 16-17 heures à 36°C. Préculture II
Dans des récipients contenant 45ml de milieu de base on ajoute stérilement 1,25ml de la solution de glucose à 50%, 2,50ral de la solution de vitamines, de sels et de facteurs de croissance et 1,25ml de la solution de bicarbonate et d'acide thioglycolique.
On ensemence à partir du produit de la préculture I et on cultive à 36°C pendant 3 à 4 heures sous agitation lente.
Préculture III
Dans un flacon de 51 renfermant 2,4 litres de milieu de base, on ajoute 60ml de la solution dé glucose, 120ml de la solution de vitamines, de sels et de facteurs de croissance et 60ml de la solution de bicarbonate et d' acide thioglycolique.
On ensemence avec 500ml de la prêculture II, puis on cultive pendant 3 à 4 heures en agitant à 36°C.
Culture proprement dite
On utilise 361 de milieu de base stérilisés que l'on sature en gaz carbonique. On ajoute à ce milieu de base 1 litre de la solution de glucose, 21 de la solution de vitamines, de sels et de facteurs de croissance, et 1 litre de la solution de bicarbonate et d'acide thioglycolique.
On ramène le pH à 7,6 avec de la soude 5N.
On cultive à température de 36°C, en agitant, sans aération, de préférence sous gaz inerte ou sous gaz carbonique, le pH étant régulé entre 6,0 et 7,4 avec de la soude 5N.
Au bout de 8 heures de culture environ, on ajoute le mélange suivant: - 1 litre de la solution de glucose à 50%
- 0,3351 d'une solution d'acétate d'ammonium à 46,2g%
Arrêt de la culture
L'arrêt de la culture est fonction de la lyse des germes:
a) lyse naturelle : elle survient au bout de 60 à 96 heures de culture et on peut la suivre par l'examen microscopique de la morphologie des germes;
b) lyse provoquée au bout de 12-17 heures de culture: à la culture refroidie et transvasée dans un récipient, on ajoute sous agitation 10% d'une solution de désoxycholate de sodium à 10%, soit une concentration finale de 1%. On agite pendant 30 minutes.
Clarification
Pour éliminer les débris cellulaires, on effectue une centrifugation et on récupère le surnageant clarifié.
Comme il a été indiqué ci-dessus, les polyosides. purifiés de Streptococcus pneumoniae permettent de réaliser des vaccins.
L'invention a également pour objet un vaccin pneumococcique contenant au moins un polyoside purifié selon le procédé décrit dans la présente demande.
Un exemple de réalisation et d'utilisation d'un tel vaccin est donné ci-après dans la partie expérimentale.
Un vaccin pneumococcique monovalent est constitué par dissolution d'un polyoside purifié dans un soluté isotonique tamponné. Un vaccin pneumococcique polyvalent est constitué d'au moins 2 polyosides purifiés dissous dans un soluté isotonique tamponné. On sait que l'on peut distinguer plusieurs types sérologiques de Streptococcus pneumoniae, qui sont répertoriés selon la nomenclature rappelée dans le Tableau I ci-après.
Figure imgf000017_0001
Dans la présente demande, on a utilisé la nomenclature danoise.
On donne ci-après des modes d'exécution non limitatifs du procédé de l'invention pour certains polyosides particuliers:
- Procédé de purification d'un polyoside de Streptococcus pneumoniae du type 1, 4, 5, 10A, 12 F, 15B, 17F, 18 C, 20, 22F, 23 F ou 25, caractérisé par le fait qu'après lyse, clarificati et concentration, on ajoute d'abord à ladite solution aqueuse de départ un alcool miscible à l'eau en quantités croissantes pour précipiter d'abord des impuretés, puis après élimination de celles-ci, pour précipiter le polyoside, que l'on redissout le précipité de polyoside et soumet la solution obtenue au traitement avec un phénol pour réduire la teneur en protéines, et que l'on soumet la phase aqueuse recueillie au traitement d'élimination des contaminants nucléiques par précipitation fractionnée avec un alcool en présence d'ions calcium puis par le traitement au charbon actif.
- Procédé de purification d'un polyoside de Streptococcus pneumoniae du type. 2, 6 A, 6 B ou 19 F, caractérisé par le fait qu'après lyse, clarification et concentration, on ajoute d'abord à ladite solution aqueuse de départ un alcool miscible à l'eau en quantités croissantes pour précipiter d'abord, des impuretés, puis après élimination de celles-ci, pour précipiter le polyoside, que l'on redissout le précipité de polyoside et soumet la solution obtenue au traitement avec un phénol pour réduire la teneur en protéines, puis que l'on soumet la phase aqueuse recueillie au traitement d'élimination des contaminants nucléiques par précipitation fractionnée avec un alcool en présence d'ions calcium.
- Procédé de purification d'un polyoside de Streptococcus pneumoniae du type 7 F, 9 N, 12- A ou 14, et selon la revendication 17, caractérisé par le fait qu'après lyse, clarification et concentration, on ajoute à ladite solution aqueuse du polyoside un alcool miscible à l'eau en quantités croissantes pour précipiter d'abord des impuretés puis, après élimination de celles-ci, pour précipiter le polyoside, que l'on dissout le précipité de polyoside et soumet la solution obtenue au traitement avec un phénol pour réduire la teneur en protéines, puis que l'on soumet la phase aqueuse recueillie au traitement d'élimination des contaminants nucléiques par le charbon actif.
- Procédé de purification d'un polyoside de Streptococcus pneumoniae du type 3 ou 8, caractérisé par le fait qu'après lyse, clarification et concentration, on ajoute à ladite solution aqueuse du polyoside un alcool miscible à l'eau en quantité suffisante pour précipiter directement le polyoside, que l'on redissout le précipité de polyoside et soumet la solution obtenue au traitement avec un phénol pour réduire la teneur en protéines, puis que l'on soumet la phase aqueuse recueillie au traitement d'élimination des contaminants nucléiques par le charbon actif.
- Procédé de purification d'un polyoside de Streptococcus pneumoniae du type 6 B, caractérisé par le fait qu'après lyse, clarification et concentration, on ajoute à ladite solution aqueuse du polyoside, en présence d'ions calcium, un alcool miscible à l'eau en quantité suffisante pour précipiter les contaminants nucléiques, on élimine le précipité et ajoute à nouveau ledit alcool en quantité suffisante pour précipiter le polyoside, que l'on redissout le précipité de polyoside puis que l'on soumet la solution obtenue au traitement avec un phénol pour réduire la teneur en protéines.
L'invention a également pour objet un procédé de purification présentant tout ou partie des caractéristiques des procédés décrits dans les exemples non limitatifs suivants.
Dans ces exemples l'acétate de sodium utilisé est l'acétate de sodium hydraté AcNa,3H20. L'acide acétique utilisé est l'acide acétique pur appelé acide acétique glacial.
On rappelle que l'eau physiologique est une solution aqueuse apyrogène de chlorure de sodium à 8g/l.
D'une façon générale, pour les précipitations à l'éthanol, on utilise de l'éthanol prê-refroidi à -20°C afin d'éviter une augmentation notable de température due à la dissolution de l'éthanol.
EXEMPLE N°1 : Purification du polyoside pneumococcique type 1
Stade 1 : Culture Précultures
lère préculture:
A partir de germes lyophilisés on ensemence des boîtes de Roux de 2 1 renfermant de la gélose à 5% de sang de cheval. On laisse incuber 16h à 36° C ± 1, de préférence en atmosphère humide et sous gaz carbonique.
2ème préculture:
Après un contrôle de pureté on ensemence, avec la suspension obtenue à partir de ces 6 boîtes de gélose, 6 erlens renfermant 500ml de milieu complet. On cultive pendant 2 à 2h30mn à 36°C ± 1 avec une agitation modérée.
3ème préculture:
On utilise à ce stade soit un fermenteur soit un récipient comportant un système permettant une légère agitation de l'ordre de 50 rpm. Après un contrôle de pureté, on transfère la culture obtenue à partir des erlens dans 12 1 de milieu complet frais et on laisse incuber à 36°C ± 1 pendant 3 à 3h30mn. Culture
On utilise un fermenteur de capacité utile de 200 1 comportant une agitation de type Vortex.
Après la stérilisation du milieu et l'introduction des facteur de croissance, on procède à un balayage par du gaz carbonique jusqu'à stabilisation, du pH à 6,2 + 0,2. On ramène le pH à 7,6 avec de la soude 5N et on ensemence à raison de 6% d'inoculum. On maintient la culture à 36°C + 1 sous une agitation de 600 rpm avec une régulation de pH à 6,8 avec de la soude 5N. Au bout de 8h de culture on procède à une addition de glucose et d'acétate d'ammonium à raison respectivement de 12,50g et 4g par litre de milieu.
Au bout de 16h de culture on vérifie la pureté et l'identité de la culture puis on procède à la lyse des germes par additio de 1% d'une solution de desoxycholate de sodium à 10%.
Après une demi-heure de contact sous agitation on vérifie que la lyse est totale. On ajoute 0,5% de phénol aqueux puis on centrifuge. Le surnageant est collecté dans une cuve préalable ment stérilisée et refroidie.
Stade 2 : Purification préliminaire du polyoside pneumococciqu
Concentration
Le surnageant de culture (3 × 200 litres) préparé comme précédemment décrit est concentré, lavé avec 3 × 60 litres d'eau physiologique phénolée à 0,5% et à nouveau concentré par ultrafiltration sur fibres creuses possédant un seuil de rétention de substances dont le poids moléculaire est supérieur à 10000 (type Amicon ou Romicon). Précipitation alcoolique fractionnée
A la solution concentrée (110 litres) on ajoute de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 5% (poids/volume).
Le pH est ajusté à 5,8 par l'acide acétique, et on ajoute lentement, sous agitation vive, de l'éthanol jusqu'à une concentration finale d'alcool comprise entre 15 et 35% (préférentiellement 20%). L'agitation est poursuivie pendant 20 minutes à + 4°C puis le mélange est ultracentrifugé en continu à 35000 rpm à + 4ºC.
La concentration en acétate de sodium du surnageant alcoolique (153 litres) est amenée à 5g% (poids/volume) et le pH est ajusté-à 5,8 par l'acide acétique glacial.
On ajoute, sous agitation, de l'éthanol absolu déshydraté prérefroidi à -20°C jusqu'à une concentration finale en alcool de l'ordre de 40-65% (préfërentiellement 44,4%). Après une demiheure d'agitation, le pH est, si nécessaire, ajusté à 6,8 avec l'acide acétique. Le mélange est laissé au repos à +4ºC pendant 16 heures, le précipité est alors recueilli par décantation et centrifugation à 4200 rpm, à + 4°C. Il constitue le polyoside brut.
Stade 3 : Déprotéinisation
Le polyoside brut (1900g poids humide) est mis en solution dans environ 40 litres de tampon acétate de sodium 0,3M pH 6,9. A cette solution est ajouté 0,2 à 0,4 volume (préférentiellement 0,33 volume) du mélange phénol-tampon acétate de sodium 0,3M pH 6,9 (1 : 0,4 vol/vol).
Après agitation vigoureuse pendant 30 secondes à l'aide d'un disperseur on soumet l'émulsion obtenue à une ultracentrifu gation à 35000 rpm, à + 14°C. La phase aqueuse contenant le polyoside est à nouveau soumise à un deuxième traitement phénolique. Le processus est recommencé, si nécessaire, jusqu'à ce que la phase aqueuse contienne moins de 5g% de protéines (généralement 2 cycles sont suffisants). Le dosage des protéines est effectué selon la technique de Lowry et coll., J; Biol. Chem. 143, 265 (1951).
La phase aqueuse est alors dialysée contre l'eau déminéralisée pendant 16 heures à + 4°C pour éliminer le phénol résiduel.
Stade 4 : Elimination des acides nucléiques
a) Précipitation alcoolique fractionnée
A la solution dialysée obtenue au stade 3 (44,7 litres) on ajoute lentement 6,4 litres d'une solution aqueuse de CaCl2 4M. On agite le mélange pendant 15 minutes puis on ajoute lentement, sous agitation vive, de l'éthanol jusqu'à l'obtention d'une concentration finale comprise entre 10 et 30% (préférentiellement 15%). L'agitation est poursuivie pendant 30 minutes à + 4°C puis le mélange est ultracentrifugé en continu à 30000 rpm à + 4°C.
La concentration éthanolique du surnageant est, sous agitation vive, amenée à une valeur comprise entre 40 et 60%, généralement 44,4%.
Après 30 minutes d'agitation, la solution est laissée au repos à + 4°C pendant 16 heures puis centrifugée en continu à 15000 rpm, à + 4°C.
Le précipité ainsi obtenu (430g poids humide) est remis en solution dans 40 litres d'une solution aqueuse de chlorure de sodium 0,14M. b) Traitement au charbon actif
On ajoute rapidement, sous agitation, à la solution polyosidique le volume nécessaire d'une suspension de charbon actif Norit à 20g% (poids/volume) dans une solution aqueuse de chlorure de sodium 0,14M, pH 6,9, pour obtenir une concentration finale en charbon actif comprise entre 0,5 et 8g% (préfërentiellement 3g%).
Le mélange est agité pendant 2 minutes puis laissé au repos pendant 30 minutes à +4ºC.
Le charbon est ensuite éliminé par filtration.
Le filtrat est dialyse contre l'eau déminéralisée pendant 16 heures à + 4°C.
Stade 5 : Obtention du polyoside purifié
A la solution polyosidique dialysée (57 litres) on ajoute 3420g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,60 par l'acid acétique. On ajoute lentement, sous agitation vive, le volume d'éthanol absolu déshydraté pré-refroidi à -20°C suffisant pour obtenir une concentration alcoolique finale comprise entre 40 et 65% (préférentiellement 44,4%). Après 30 minutes d'agitation, le pH est, si nécessaire, ajusté à 6,80 et la solution est laissée au repos à + 4°C pendant 16 heures. Le polyoside est récupéré par décantation et centrifugation à 4200 rpm à + 4°C.
Le précipité est mis en suspension dans deux litres d'éthanol absolu pré-refroidi à -20ºC puis centrifugé comme indiqué cidessus. Le processus est recommencé une fois. On procède ensuite à 2 lavages successifs par 3 × 500ml d'acétone prérefroidi à -20°C et par 3 × 500ml d'ëther éthyliσue prérefroidi à -20°C. On filtre sur verre fritte de porosité 5. Le précipité ainsi lavé et déshydraté est séché sous vide durant une nuit à 0°C.
Le polyoside déshydraté est réduit en poudre.
On obtient ainsi 80g de polyoside purifié type 1.
En opérant de façon analogue à celle décrite ci-dessus, on a purifié les polyosides pneumococciques de types 10 A, 15 B, 17 F, 20 et 22 F.
EXEMPLE N°2 : Polyoside pneumococcique type 4
Stade 1 : Culture
Les conditions expérimentales de fermentation et de préparation du surnageant sont analogues à celles décrites dans l'exemple n°1, exception faite de la régulation pH qui est réalisée à un pH égal à 7,2 ± 0,2.
Stade 2 : Purification préliminaire
Concentration
Le surnageant de culture (600 litres) est réduit à un volume d'environ 50 litres et lavé plusieurs fois par dilution-concentration avec 100-200 litres d'eau physiologique phénolée à 0,5%. Cette opération est réalisée par filtration sur fibres creuses possédant un seuil de rétention voisin de 10000.
Le surnageant ainsi débarrassé des substances de faible poids moléculaire est alors à nouveau concentré par ultrafiltration. Le facteur de concentration dépend du volume et de la viscosité du surnageant initial, il est compris généralement entre 4 et 15. Précipitation alcoolique fractionnée
A la solution concentrée (47 litres), on ajoute de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 6% (poids/ volume). Le pH est ajusté à 5,40 par l'acide acétique et on ajoute lentement, sous agitation vive, un volume suffisant d'éthanol pour obtenir une concentration finale en alcool comprise entre 30 et 50% (préfërentiellement 37,5%).
Après 30 minutes d'agitation à + 4°C, le mélange est ultracentrifugé.
La concentration en acétate de sodium du surnageant (73 litres est amenée à 7,5g% et le pH ajusté à 5,80 par l'acide acétique. On- ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration finale en alcool de l'ordre de 60-80% (préfërentiellement 75%).
Au bout d'une demi-heure d'agitation, le pH est, si nécessaire ajusté à 6,80 avec l'acide acétique et le mélange est laissé au repos à + 4°C pendant 16-18 heures. Le surnageant est éliminé par décantation et le précipité de polyoside brut récupéré par centrifugation.
Stade 3 : Déprotéinisation
Le polyoside brut (530g poids humide) est mis en solution dans environ 20 litres de tampon acétate de sodium 0,3M, pH 6,9.
A cette solution est ajouté 0,2 à 0,5 volume, généralement 0,25 volume, du mélange phénol-tampon acétate de sodium 0,3M, pH 6,9 (1 : 0,4 vol/vol).
Après agitation vive pendant 30 secondes à l'aide d'un disperseur, le mélange est ultracentrifugé comme à l'exemple 1.
La phase aqueuse contenant le polyoside est soumise à un deuxième cycle de traitement phénolique. Le processus est recommencé, si nécessaire, jusqu'à l'obtention d'une solution polyosidique contenant moins de 5g% de protéines.
La phase aqueuse est alors dialysée contre l'eau déminéralisée pendant 16 heures à + 4°C.
Stade 4 : Elimination des acides nucléiques
a) Précipitation alcoolique fractionnée
A la solution dialysée obtenue au stade 3 (18,5 litres) on ajoute lentement 2,65 litres d'une solution de CaCl2 4M. Après 15 minutes d'agitation à + 4°C, on ajoute lentement, sous agitation vive, de l'éthanol jusqu'à l'obtention d'une concentration finale comprise entre 15 et 35% (préférentiellement 25%). L'agitation est poursuivie pendant 30 minutes à +4°C puis le mélange est ultracentrifugé en continu à 35000 rpm, à + 4°C.
La concentration en éthanol du surnageant est, sous agitation, amenée à une valeur comprise entre 60 et 80%, généralement 75. Après une demi-heure d'agitation le mélange est laissé au repos à +4°C pendant 16 heures.
Après décantation, le précipité est récupéré par centrifugation à 4200 rpm à + 4°C puis dissous dans une solution aqueuse de chlorure de sodium 0,14M, pH 6,9 (8 litres).
b) Traitement au charbon actif
A la solution polyosidique on ajoute rapidement, sous agitation, le volume nécessaire d'une suspension de charbon actif Norit à 20g% (poids/volume) dans du chlorure de sodium 0,14M, pH 6, 9 pour obtenir une concentration finale en charbon actif comprise entre 0,1 et 5g% (préférentiellement 0,5%). Le mélange est agité pendant 2 minutes puis laissé au repos pendant 30 minutes à + 4°C. Le charbon est ensuite éliminé par filtration. Le filtrat est dialyse contre l'eau déminéralisée pendant 15 heures à + 4°C.
Stade 5 : Obtention du polyoside purifié
A la solution obtenue après dialyse (11 litres) on ajoute 1320g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,40 par addition d'acide acétique. On ajoute lentement, sous agitation vive, le volume d'éthanol absolu déshydraté pré-refroidi à - 20°C suffisant pour obtenir une concentration alcoolique comprise entre 60 et 80% (préfërentiellement 75%). Après 30 minutes d'agitation, le pH est, si nécessaire, ajusté à 6,80 + 0,1 et la solution est laissée au repos à + 4°C pendant 16-18 heures. Le polyoside est récupéré par décantation et centri fugation. Il est mis en suspension par agitation manuelle dans un litre d'éthanol absolu pré-refroidi à -20°C puis centrifugé. Cette opération est répétée une fois. On procède ensuite à 2 lavages successifs par 3 × 300ml d'acétone prérefroidi à -20°C et par 3 × 300 ml d'éther êthylique prérefroidi à -20°C. On filtre sur verre fritte de porosité 5.
Le précipité ainsi lavé et déshydraté est séché à 0°C et réduit en poudre. On obtient ainsi 64g de polyoside purifié type 4.
EXEMPLE N°3 : Polyoside pneumococcique type 5
Stade 1 : Culture
Les conditions de culture et de préparation du surnageant de culture sont identiques à celles utilisées pour la préparation du polyoside pneumococcique type 4 (exemple 2).
Stade 2 : Purification préliminaire
Concentration Le surnageant de culture (43 litres) est concentré, lavé avec 3 × 12 litres d'eau physiologique phénolée à 0,5% et à nouveau concentré par ultrafiltration de façon à retenir les substances dont le poids moléculaire est supérieur à 10000. Le facteur de concentration varie de 4 à 10 suivant le volume et la viscosité du surnageant initial.
Précipitation alcoolique fractionnée
A la solution concentrée (8 litres) on ajoute de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 5g% (poids/volume). Le pH est ajusté à 5,8 par l'acide acétique, et on ajoute lentement, sous agitation vive, de l'éthanol jusqu'à une concentration finale comprise entre 15 et 40%. L'agitation est poursuivie pendant 30 minutes à + 4°C puis le mélange est ultracentrifugé en continu à 35000 rpm à + 4°C.
La concentration en acétate de sodium du surnageant alcoolique (11,1 litres) est amenée à 7,5g% et le pH est ajusté à 5,8-6,0 par addition d'acide acétique.
On ajoute, sous agitation, un volume d'éthanol permettant la précipitation complète du polyoside (concentration finale comprise entre 40 et 80%). Après une demi-heure d'agitation, le pH est, si nécessaire, ajusté à 6,80 + 0,2 avec l'acide acétique glacial. Le mélange est laissé au repos à + 4°C pendant environ 24 heures. Le précipité de polyoside brut est recueilli par décantation et centrifugation.
Stade 3 : Déprotéinisation
Le polyoside brut (400g poids humide) est mis en solution dans environ 3 litres de tampon acétate de sodium 0,3M, pH 6,9. A cette solution est ajouté 0,2 à 0,6 volume du mélange phénoltampon acétate de l'exemple 1. Après agitation vigoureuse pendant 30 secondes à l'aide d'un disperseur, on soumet la dispersion à une ultracentrifugation comme à l'exemple 1. La phase aqueuse contenant le polyoside est à nouveau soumise à un deuxième traitemen-p phénolique. Le processus est éventuelle- ment recommencé jusqu'à l'obtention d'une solution polyosidique contenant moins de 5g% de protéines. La phase aqueuse est alors dialysée contre l'eau déminéralisée pendant 16 heures à + 4°C pour éliminer le phénol résiduel.
Stade 4 : Elimination des acides nucléiques
a) Précipitation alcoolique fractionnée
A la solution dialysée obtenue au stade 3 (2,1 litres), on ajoute lentement 0,3 litre de solution aqueuse de CaCl2 4M. On agite le mélange pendant 15 minutes puis on ajoute lentement, sous agitation vive, de l'éthanol jusqu'à l'obtention d'une concentration finale comprise entre 10 et 35%. L'agitation est poursuivie pendant 30 minutes à + 4°C puis le mélange est ultracentrifugé à 10000 rpm pendant 20 minutes à + 4°C.
On dilue le surnageant avec un à deux volumes d'éthanol pour précipiter complètement le polyoside. Le mélange est laissé au repos pendant environ 24 heures à + 4°C puis on recueille le précipité par centrifugation.
b) Traitement au charbon actif
Le précipité (2g) est mis en solution dans 0,6 litre de tampon NaCl 0,14 M pH 6,9 ± 0,2 puis on ajoute rapidement sous agitation le volume nécessaire d'une suspension de charbon actif Norit à 20g% (poids/volume) dans une solution de chlorure de sodium 0,14 M pH 6,9 pour obtenir une concentration finale en charbon actif comprise entre 0,1 et 8g% . Le mélange est agité pendant 2 minutes puis laissé au repos pendant 30 minutes à + 4º0.
Le charbon est éliminé par centrifugation et/ou par filtration. Le filtrat est dialyse contre l'eau déminéralisée pendant 16 heures à + 4°C.
Stade 5 : Obtention du polyoside purifié
La concentration en acétate de sodium de la solution dialysée obtenue précédemment est amenée à une valeur comprise entra 6 et 12g% (poids/volume) et le pH est ajusté à 5.4-5,8 par l'acide acétique glacial.
On ajoute lentement, sous agitation vive, le volume d'éthanol absolu déshydraté pré-refroidi. à -20°C permettant la précipitation complète du principe actif, (concentration finale en alcool comprise entre 40 et 80%). Après une demi-heure d'agitation, le pH est, si nécessaire, ajusté à 6,80 avec l'acide acétique et la solution est laissée au repos à + 4°C pendant 24 à 48 heures. Le polyoside est récupéré par ultracentrifugation en continu à 35000 rpm, à + 4°C.
Le précipité est mis en suspension dans de l'éthanol absolu pré-refroidi à -20°C puis centrifugé à 4200 rpm à +4°C.
Cette opération est recommencée une fois puis le précipité est lavé successivement par l'acétone et l'éther, comme décrit aux exemples précédents.
Le précipité ainsi lavé et déshydraté est séché sous vide à 0°C.
Le polyoside purifié est réduit en poudre.
EXEMPLE N°4 : Polyoside pneumococcique type 12 F
Stade 1 : Culture
Les conditions expérimentales de culture et de préparation du surnageant sont analogues à celles décrites dans l'exemple nºl, exception faire du pH qui est régulé à 7,2-7,4 avec la soude 5N. Stade 2 : Purification préliminaire du polyoside pneumococcique
Concentration
Le surnageant de culture (2 × 220 litres) préparé comme précédemment décrit est concentré, lavé avec 2 × 60 litres d'eau physiologique phënolëe à 0,5% et à nouveau concentré, par ultrafiltration, comme décrit à l'exemple 1, stade 2.
Précipitation alcoolique fractionnée
A la solution concentrée (91 litres) on ajoute de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 5,2% (poids/volume)
Le pH est ajusté à 5,8 par l'acide acétique, et on ajoute de l'éthanol, jusqu'à une concentration finale d'alcool comprise entre 15 et 35% (préférentiellement 25%), puis on centrifuge.
La concentration en acétate de sodium (AcNa, 3H20) du surnageant (131 litres) est amenée à 6,9g% (poids/volume) et le pH est ajusté à 5,8 par l'acide acétique.
On ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration finale en alcool de l'ordre de 45-75% (préfërentiellement 56,5%). Après une demi-heure d'agitation, le mélange est laissé au repos à + 4°C pendant 16 heures; le précipité est alors recueilli par centrifugation. Il constitue le polyoside brut.
Stade 3 : Déprotéinisation
Le polyoside brut (1100g poids humide) est mis en solution dans environ 50 litres de tampon acétate de sodium 0,3M pH 6,9. A cette solution est ajouté 0,1 à 0,4 volume (préféren tiellement 0, 25 volume) du mélange phénol-tampon acétate de l'exemple 1.
Après agitation vigoureuse pendant 30 secondes à l'aide d'un disperseur, on soumet la dispersion à une ultracentrifugation. Le processus est recommencé plusieurs fois, si nécessaire, jusqu'à l'obtention d'une phase aqueuse contenant moins de 5g% de protéines (généralement 1 ou 2 cycles sont suffisants).
La phase aqueuse est alors dialysée contre l'eau déminéralisée.
Stade 4 : Elimination des acides nucléiques
a) Précipitation alcoolique fractionnée
A la solution dialysée (60,4 litres) on ajoute lentement 8,6 litres d'une solution aqueuse de CaCl2 4M. On agite le mélange pendant 15 minutes puis on ajoute lentement, sous agitation vive, de l'éthanol jusqu'à une concentration finale comprise entre 10 et 35% (préfërentiellement 20%). L'agitation est poursuivie pendant 30 minutes à + 4°C puis le mélange est ultracentrifugé.
La concentration éthanolique du surnageant est amenée entre 45 et 70%, généralement 56,5%.
Après 30 minutes d'agitation, la solution est laissée au repos à + 4°C pendant 16 heures puis centrifugée. Le précipité ainsiobtenu est remis en solution dans 50 litres d'une solution de chlorure de sodium 0,14M pH 6,9.
b) Traitement au charbon actif
On opère comme à l'exemple 1, stade 4b, avec une concentration finale en charbon actif comprise entre 0,5 et 8g% (préférentiellement 2g%). Stade 5 : Obtention du polyoside purifié
A la solution polyosidique dialysée (70 litres) on ajoute 6400g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,60 par l'acide acétique. On ajoute lentement, sous agitation vive, le volume d'éthanol suffisant pour obtenir une concentration alcoolique finale comprise entre 45 et 75% (préférentiellement 56,5%). Après 30 minutes d'agitation, le pH est, si nécessaire, ajusté à 6,80 et la solution est laissée au repos à + 4ºC pendant 16 heures. Le polyoside est récupéré par décantation et centrifugation.
Le précipité est. mis en suspension dans deux litres d'éthanol absolu pré-refroidi à -20°C puis centrifugé comme indiqué cidessus. Le processus est recommencé une fois. On procède ensuite à des lavages à l'acétone et à l'éther éthylique, puis on sèche comme décrit à l'exemple 1.
On obtient ainsi 76g de polyoside purifié type 12 F.
EXEMPLE N°5 : Polyoside pneumococcique type 18 C
Stade 1 : Culture
Les conditions expérimentales de fermentation et de préparation du surnageant de culture sont analogues à celles utilisées à l'exemple 2.
Stade 2 : Purification préliminaire du polyoside pneumococcique
Concentration
Le surnageant de culture (400 litres) est concentré à 35 litres, lavé avec 3 × 40 litres d'eau physiologique phénolée à 0,5% et à nouveau concentré à 60 litres par ultrafiltration sur Amicon H10 P10. Précipitation alcoolique fractionnée
A la solution concentrée, on ajoute 3000g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,40 avec l'acide acétique.
De façon analogue à celle décrite à l'exemple 1, stade 2, on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 20-35% (préférentiellement 28,5%) et, après ultracentrifugation, la concentration en acétate de sodium du surnageant est amenée à 7,14g%, le pH est. ajusté à 5,80 par l'acide acétique, et on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 50- 80% (préférentiellement 63,6%).
Après une demi-heure d'agitation, le pH est ajusté à 6,8 avec l'acide acétique. Le précipité est ensuite recueilli par centrifugation. Il constitue le polyoside brut.
Stade 3 : Déprotéinisation
Le polyoside brut (1143g poids humide) est mis en solution dans 24 litres de tampon acétate de sodium 0,3M pH 6.9. A cette solution est ajouté 0,1 à 0,5 volume (préférentiellement 0,33 volume) du mélange phénol-acétate de l'exemple 1 stade 3, et on opère comme à l'exemple 1.
Stade 4 : Elimination des acidesnucléiques
a) Précipitation alcoolique fractionnée
A la solution dialysée (26,1 litres) on ajoute lentement, sous agitation, 8,7 litres d'une solution de chlorure de calcium 2M. On effectue ensuite la double précipitation à l'éthanol, comme à l'exemple 1, stade 4a, d'abord avec une concentration en alcool de 15-35% (préférentiellement 25%), puis de 45-75%, généralement 63,6%. b) Traitement au charbon actif
Le précipité (400g poids humide) est dissous dans 40 litres de chlorure de sodium 0,14M et on opère ensuite comme à l'exemple 1, stade 4b, avec une concentration finale en charbon actif comprise entre 0,5 et 10g% (préférentiellement 2g%).
Stade 5 : Obtention du polyoside purifié
A la solution dialysée (51 litres) on ajoute 2560g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,4 avec l'acide acétique. On ajouta de l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 50-80% (préférentiellement 63,6%). Après 30 minutes d'agitation, le pH est ajusté à 6,6-6,8 avec l'acide acétique et le mélange est laissé au repos 16 heures à + 4°C. Le précipité est récupéré par décantation et centrifugation puis mis en suspension dans deux litres d'éthanol absolu pré-refroidi à -20°C.
Après centrifugation, le processus est recommencé une fois.
On procède ensuite à des lavages à l'acétone et à l'éther éthylique, puis on sèche comme décrit à l'exemple 1.
On obtient ainsi 108g de polyoside purifié type 18C.
EXEMPLE N°6 : Polyoside pneumococcique type 23 F
Stade 1 : Culture
Les conditions expérimentales de fermentation et de préparation du surnageant de culture sont identiques à celles de l'exemple 2.
Stade 2 : Purification préliminaire
Concentration Le surnageant de culture (400 litres) est concentré à un volume d'environ 80 litres, lavé plusieurs fois par dilutionconcentration avec 240 litres d'eau physiologique phénclée à 0,5% puis à nouveau concentré (facteur de concentration = 5,6). Ces opérations sont réalisées par ultrafiltration respectivement sur Amicσn type H10 P10 et sur Romicon PM 10.
Precipitayionalcoolique fractionnée
A la solution concentrée (71,4 litres) .on ajoute 3570g d'acét de sodium et on ajuste le pH à 5,4-5,6 avec l'acide acétique.
De façon analogue à celle décrite à l'exemple 1, stade 2, on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 17-37% (préférentiellement 28%), et, après ultracentrifugation, la concentration en acétate de sodium du surnageant est amenée à 7,20g%, le pH est ajusté à 5,90 par l'acide acétique, et on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration finaie de 50-75% (préférentiellement 60%).
Après une demi-heure d'agitation à + 4°C, le pH est, si nécessaire, ajusté à 6,80. Le précipité est ensuite récupéré par centrifugation. Il constitue le polyoside brut.
Stade 3 : Déprotéinisation
La polyoside brut (500g poids humide) est mis en solution dans 42 litres de tampon acétate de sodium 0,3M pH 6,9.
A cette solution est ajouté 0,1 à 0,5 volume (préférentiellement 0,2 volume) du mélange phénol-tampon acétate de sodium et l'on opère comme à l'exemple 1, stade 3.
Stade 4 : Elimination des acides nucléiques
a) Précipitation alcoolique fractionnée On opère de façon analogue à celle décrite à l'exemple 1, stade 4a.
A la solution polyosidique obtenue après dialyse (56 litres) on ajoute 7,9 litres de solution CaCl24M. On effectue ensuite le fractionnement à l'éthanol, avec une concentration en alcool de 10-35% (préférentiellement 25%), puis de 50-75% (généralement 60%). Le précipité (350g poids humide) est récupéré par centrifugation puis dissous dans 36 litres d'une solution aqueuse de chlorure de sodium 0,14M pH 6,9.
b) Traitement au charbon actif
De façon analogue à l'exemple 1, stade 4b, on traite la solution obtenue au charbon actif avec une concentration finale en charbon actif comprise entre 0,5 et 10g% (préférentiellement 1,5%), puis on élimine le charbon et on dialyse.
Stade 5 : Obtention du polyoside purifié
A la solution obtenue après dialyse (47,7 litres) on ajoute 5700g d'acétate de sodium e-t on ajuste le pH à 5,4-5,6 avec l'acide acétique. On ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 50-70% (préférentiellement 60%) . Après 30 minutes d'agitation, et repos à + 4°C pendant 16-18 heures, le précipité est recueilli par centrifugation, puis mis en suspension dans deux litres d'éthanol absolu pré-refroidi à -20°C et centrifugé. Cette opération est répétée une fois. On procède ensuite à des lavages à l'acétone et à l'éther ethylique, puis on sèche comme décrit à l'exemple 1.
On obtient ainsi 100g de polyoside purifié type 23 F.
EXEMPLE N°7 : Polyoside pneumococcique type 25
Stade 1 : Culture Les conditions expérimentales de fermentation et de préparation du surnageant sont identiques à celles décrites dans l'exemple 1, exception faite de la régulation du pH qui est réalisée à un pH égal à 7,2 + 0,2.
Stade 2 : Purification préliminaire
Concentration
Le surnageant de culture (600. litres) est réduit à un volume d'environ 100 litres et lavé plusieurs fois par dilutionconcentration avec 200 à 300 litres d'eau physiologique phénolée à 0,5%. Cette opération est. réalisée par ultrafiltration sur fibres creuses possédant un seuil de rétention voisin de 10000 (type Amicon ou Romicon).
Le surnageant ainsi débarrassé des substances de faible poids moléculaire est alors concentré à 96 litres par ultrafiltration.
Précipitation alcoolique fractionnée
A la solution concentrée on ajoute de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 5,6g%. Le pK est ajusté à 5,70 par l'acide acétique. De façon analogue à celle décrite à l'exemple 1, on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration de 20-35% (préférentiellement 28,5%), et, après ultracentrifugation, la concentration en acétate de sodium du surnageant est amenée à 7,14g%, le pH est ajusté à 5,80 par l'acide acétique, et on ajoute de l'éthanol jusqu' à une concentration finale de l'ordre de 40-70% (préférentiellement 62%).
Le précipité de polyoside brut est ensuite récupéré par ultracentrifugation.
Stade 3 : Déprotéinisation
Le polyoside brut (335g poids humide) est mis en solution dans 48 litres de tampon acétate de sodium 0,3M pE 6,9.
A cette solution est ajouté 0,2 à 0,5 volume (généralement 0,29 volume) du mélange phénol-tampon acétate de sodium et l'on opère comme à l'exemple 1, stade 3.
Stade 4 : Elimination des acides nucléiques
a) Précipitation alcoolique fractionnée
On opère de façon analogue à celle décrite à l'exemple 1, stade 4a.
A la solution dialysée obtenue au stade 3 (55,7 litres) on ajoute lentement 8 litres de CaCl2 4M. On effectue ensuite la double précipitation à l'éthanol, d'abord avec une concentration de 15-35% (préférentiellement 30%), puis de 40-70% (généralement 62%). Après décantation, le précipité est récupère par centrifugation puis dissous dans une solution aqueuse de chlorure de sodium 0,14M pH 6, 9 (20 litres).
b) Traitement au charbon actif
De façon analogue à l'exemple 1, stade 4b, on traite la solution obtenue par le charbon actif en quantité comprise entre 0,1 et 8g% (préférentiellement 2g%), puis on élimine le charbon et on dialyse.
Stade 5 : Obtention du polyoside purifié
A la solution obtenue après dialyse (27,76 litres), on ajoute 2760g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,80 avec l'acide acétique. On ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration de 40-70% (préférentiellement 62%). Après 30 minutes d'agitation, le pfï est, si nécessaire, ajusté à 6,30 ± 0,1 et on laisse au repos à + 4°C pendant 16-18 heures. Le précipité est récupéré par décantation et centrifugation, mis en suspension dans un litre d'éthanol absolu pré-refroidi à -20°C puis centrifugé. Cette opération est répétée une fois. On procède ensuite à des lavages successifs par l'acétone et par l'éther ethylique, puis on sèche, comme décrit à l'exemple 1. On obtient ainsi 35g de polyoside purifié type 25.
EXEMPLE N°8 : Polyoside pneumococcique type 2
Stade 1 : Culture
Les conditions expérimentales de fermentation sont celles décrites à l'exemple n°2. Après stérilisation par le phénol et lyse des germes par le désoxycholate de sodium, les débris cellulaires sont éliminés par centrifugation.
Stade 2 : Purification préliminaire
Concentration
Le surnageant de culture (200 litres) est concentré à 40 litres, lavé à l'eau physiologique phénolée à 0,5% puis à nouveau concentré à 34,5 litres. Ces opérations sont réalisées par ultrafiltration sur fibres creuses type Romicon, possédant un seuil de rétention de substances dont le poids moléculaire est supérieur à 10.000.
Précipitation alcoolique fractionnée
A la solution concentrée on ajoute, sous agitation, de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 7,5g%. On ajuste le pH à 5,4 par l'acide acétique. De façon analogue à l'exemple 1, stade 2, on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration de 10-30% (préférentiellement 18%), et, après ultracentrifugation, jusqu'à une concentration finale de 45-65% (préférentiellement 55,5%). Le précipité de polyoside brut est ensuite récupéré par décantation et centrifugation.
Stade 3 : Déprotéinisation
Le polyoside brut (690g poids humide) est mis en solution dans 24 litres de tampon acétate de sodium 0, 3M pH 6,9. A cette solution est ajouté 0,1 à 0,6 volume (préférentiellement 0,3 volume) du mélange phénol-tampon acétate de sodium et on opère comme à l'exemple 1, stade 3.
Après dialyse, le principe actif est extrait de la solution par précipitation éthanolique (concentration finale=45-65%) en présence d'acétate de sodium. Le précipité est récupéré par centrifugation (430g poids humide) et mis en solution dans 12 litres d'eau distillée stérile apyrogène.
Stade 4 : Elimination des acides nucléiques
On opère de façon analogue à celle décrite à l'exemple 1, stade 4a.
A la solution obtenue au stade 3 (12 litres) on ajoute lentement, sous agitation, 4 litres de solution de CaCl2 2M. On effectue ensuite la double précipitation à l'éthanol, d'abord avec une concentration de 15-35% (généralement 25%), puis, après ultracentrifugation, avec une concentration finale de 45-65% (préférentiellement 55,5%).
Le précipité est ensuite récupéré par décantation et centrifugation.
Stade 5 : Obtention du polyoside purifié
Le précipité obtenu au stade 4 est mis en suspension dans deux litres d'éthanol absolu pré-refroidi à -20°C puis centrifugé comme indiqué ci-dessus. L'opération est recommencée une fois. On procède ensuite à des lavages à l'acétone et à l'êther ethylique, et on sèche comme décrit à l'exemple 1, stade 5.
On obtient ainsi 69g de polyoside purifié.
EXEMPLE N°9 : Polyoside pneumococcique type 6 A
Stade 1 : Culture
Les conditions expérimentales de culture et de préparation du surnageant sont identiques à celles décrites dans l'exemple n°1, exception faite du pH qui est régulé à 7,2-7,4 avec la soude 5N.
Stade 2 : Purification préliminaire
Concentration
Le surnageant de culture (2 × 200 litres) préparé comme précédemment décrit est concentré à 40 litres, lavé à l'eau physiologique phénolée à 0,5% et à nouveau concentré (volume final=33,6 litres), sur fibres creuses possédant un seuil de rétention de substances dont le poids moléculaire est supérieur à 10.000 (type Amicon H10 P10). Le facteur de concentration varie de 4 à 15 suivant le volume et la viscosité du surnageant à ultrafiltrer.
Précipitation alcoolique fractionnée
A la solution concentrée on ajoute de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 5g% . Le pH est ajusté à 5,4 par l'acide acétique. De façon analogue à l'exemple 1, stade 2, on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration de 20-35% (préférentiellement 27%), puis, après ultracentrifugation, la concentration en acétate de sodium du surnageant est amenée à 8,75g%, le pH est ajusté à 5,6 par l'acide acétique, et l'on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 40-70% (préférentiellement 60%). Le précipité de polyoside brut est ensuite recueilli par centrifugation.
Stade 3 : Déprotéinisation
Le polyoside brut (469g poids humide) est mis en solution dans 16 litres de tampon acétate de sodium 0,3M pH 6,9. A cette solution est ajouté 0,1 à 0,5 volume (préférentiellement 0,25 volume) du mélange phénol-tampon acétate de sodium et on opère comme à l'exemple 1, stade 3.
Stade 4 : Elimination des acides nucléiques
On opère de façon analogue à l'exemple 1, stade 4a.
Pour cela à la solution dialysée obtenue au stade 3 (18,2 litres) on ajoute lentement 6 litres de solution aqueuse CaCl2 2M. Après agitation on ajoute l'éthanol (concentration filiale comprise entre 15 et 35%, généralement 25%) puis le mélange est ultracentrifugé, et on ajoute au surnageant de l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 40-70% (préférentiellement 60%). Le précipité est récupéré par décantation et centrifugation.
Stade 5 : Obtention du polyoside purifié
Le précipité est mis en suspension dans deux litres d'éthanol absolu pré-refroidi à -20ºC puis centrifugé comme indiqué cidessus.
Le processus est recommencé une fois. On procède ensuite à des lavages à l'acétone et à l'éther ethylique, et on sèche le précipité comme décrit à l'exemple 1, stade 5. On obtient ainsi 119g de polyoside purifié type 6A.
EXEMPLE Nº10 : Polyoside pneumococcique type 19 F
Stade 1 : Culture
Les conditions expérimentales de fermentation sont celles utilisées à l'exemple n°2. Après stérilisation par le phénol et lyse des germes par le désoxycholate de sodium, les débris cellulaires sont éliminés par centrifugation.
Stade 2 : Purification préliminaire
Concentration
Le surnageant de culture (400 litres) est concentré à 50 litres, lavé à l'eau physiologique phénolée à 0,5% puis à nouveau concentré à 40,3 litres. Ces opérations sont réalisées par ultrafiltration sur fibres creuses type Romicon, possédant un seuil de rétention de substances dont le poids moléculaire est supérieur à 10.000.
Précipitation alcoolique fractionnée
A la solution concentrée on ajoute, sous agitation, de l'acéta de sodium jusqu'à une concentration finale de 5g%. On ajuste le pH à 5,4 par l'acide acétique. De façon analogue à l'exempl 1, stade 2, on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration de 15-35% (préférentiellement 27%), et, après ultracentrifugation, la concentration en acétate de sodium du surnageant recueilli est amenée à 7,3%, on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 55-75% (préférentiellement 63,5%), et le précipité de polyoside brut est ensuite récupéré par centrifugation. Stade 3 : Déprotéinisation
Le polyoside brut (427g poids humide) est mis en solution dans 16 litres de tampon acétate de sodium 0,3M pH 6,9. A cette solution est ajouté 0,1 à 0,6 volume (préférentiellement 0, 25 volume) du mélange phénol-tampon acétate de sodium et on opère comme décrit à l'exemple 1, stade 3.
Stade 4 : Elimination des acides nucléiques
On opère de façon analogue à celle décrite à l'exemple 1, stade 4a.
A la solution obtenue au stade 3 (18,9 litres) on. ajoute 2,7 litres de solution de CaCl2 4M. On ajoute de l'éthanol (concentration finale en alcool comprise entra 15 et 35%, généralement 25%), et, après ultracentrifugation, on ajoute au surnageant de l'éthanol jusqu'à une concentration finale dé 55-75% (préférentiellement 63,5%), et le précipité est ensuite récupéré par décantation et centrifugation.
Stade 5 : Obtention du polyoside purifié
Le précipité est mis en suspension dans trois litres d'éthanol absolu pré-refroidi à -20ºC puis centrifugé comme indiqué cidessus. L'opération est recommencée une fois. On procède ensuite à des lavages à l'acétone et à l'éther ethylique, puis on sèche comme décrit à l'exemple 1, stade 5.
On obtient ainsi 120g de polyoside purifié, type 19 F.
EXEMPLE N°11 : Polyoside pneumococcique type 7 F
Stade 1 : Culture
Les conditions expérimentales sont celles décrites à l'exemple 1, stade 1, exceptions faites de la régulation pH (6,2-6,8) et de l'addition de glucose (addition toutes les 2h30mn).
Stade 2 : Purification préliminaire du polyoside pneumococcique
Concentration
Le surnageant de culture (200 litres) est concentré, lavé à l'eau physiologique phénolée à 0,5% et à nouveau concentré par ultrafiltration sur fibres creuses possédant un seuil de rétention de substances dont le poids moléculaire est supérieur à 10.000 (Type Amicon ou Romicon). Le facteur de concentration varie de 4 à 10 suivant le volume et la viscosité du surnageant à ultrafiltrer.
Précipitation alcoolique fractionnée
A la solution concentrée (41 litres) on ajoute de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 7g% . Le pH est ajusté à 5,8 par l'acide acétique. De façon analogue à l'exemple 1, stade 2, on ajouté de l'éthanol jusqu'à une concentration de 35-55% (préférentiellement 45%), et, après ultracentrifugation, la concentration en acétate de sodium du surnageant est amenée à 8,2g% et le pH est ajusté à 6,8 par l'acide acétique, puis on ajouta de l'éthanol jusqu'à une concentration de l'ordre de 60-80% (préférentiellement 75%). Après une demi-heure d'agitation, le pH est ajusté à 6,8 avec l'acide acétique glacial. Lé mélange est laissé au repos à + 4°C pendant 16 heures, le précipité de polyoside brut est alors récupéré par centrifugation.
Stade 3 : Déprotéinisation
Le polyoside brut (110g poids humide) est mis en solution dans environ 30 litres de tampon acétate de sodium 0, 3M pH 6,9. A cette solution est ajouté 0,1 à 0,4 volume (préférentiellement 0,15 volume) du mélange phénol-tampon acétate de sodium 0,3M pH 6,9 (1:0,4 vol/vol). Après agitation douce (manuelle ou magnétique) pendant environ 10 minutes pour créer l'émulsion, la solution phénolée est ultracentrifugée. La phase aqueuse contenant le polyoside est, si nécessaire, soumise à un deuxième traitement phénolique, mais généralement 1 cycle est suffisant.
La phase aqueuse est alors dialysée contre l'eau déminéralisé pendant 16 heures à + 4ºC pour éliminer le phénol résiduel.
Stade 4 : Elimination des acides nucléiques
On ajoute rapidement, sous agitation, à la solution polyosidique dialysée (36 litres) le volume nécessaire d'une suspension de charbon actif Norit à 20g% (poids/volume) dans du chlorure de sodium 0,14M pH 6,9 ou dans l'eau distillée apyrogène pour obtenir une concentration finale en charbon actif comprise entre 0,1 et 8g% (préférentiellement 1,5g%).
Le mélange est agité pendant 2 minutes puis laissé au repos pendant 30 minutes à + 4°C.
Le charbon est ensuite éliminé par filtration.
Le filtrat est dialyse contre l'eau déminéralisée pendant 16 heures à + 4°C.
Stade 5 : Obtention du polyoside purifié
A la solution polyosidique dialysée on ajoute de l'acétate de sodium jusqu'à l'obtention d'une concentration de 15g% et on ajuste le pH à 6,00 par l'acide acétique. On ajoute lentement, sous agitation vive, le volume d'éthanol absolu déshydraté pré-refroidi à -20°C suffisant pour obtenir une concentration alcoolique finale de 60-80% (préférentiellement 75%). Après 30 minutes d'agitation, le pH est ajusté à 6,9 et la solution est laissée au repos à + 4°C pendant 16 heures. Le polyoside est récupéré par centrifugation. Le précipité est mis en suspension dans un litre d'éthanol absolu pré-refroidi à -20°C puis centrifugé comme indiqué ci-dessus.
Le processus est recommencé une fois. On procède ensuite à des lavages successifs par l'acétone et par l'éther ethylique, puis on sèche comme décrit à l'exemple 1, stade 5.
On obtient ainsi 20g de polyoside purifié type 7F.
EXEMPLE N°12 : Polyoside pneumococcique type 9N
Stade 1 : Culture
Les conditions expérimentales sont celles décrites à l'exemple n°2, stade 1. Après stérilisation par le phénol et lyse des germes par le désoxycholate de sodium, les débris cellulaires sont éliminés par centrifugation.
Stade 2 : Purification préliminaire
Concentration
Le surnageant de culture (400 litres) est concentré à 50 litres, lavé à l'eau physiologique phénolée à 0,5% puis à nouveau concentré à 42 litres. Ces opérations sont réalisées par ultrafiltration sur fibres creuses type Romicon, possédant un seuil de rétention de substances dont le poids moléculaire est supérieur à 10.000.
Précipitation alcoolique fractionnée
A la solution concentrée on ajoute, sous agitation, de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 6g% . On ajuste le pH à 5,4 par l'acide acétique. On opère comme à l'exemple 1, stade 2, et on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration de 20-40% (préférentiellement 33%), puis, après ultracentrifugation, la concentration en acétate de sodium du surnageant est amenée à 6g%, et on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 50-65% (préférentiellement 55,5%).
Le précipité de polyoside brut est ensuite récupéré par décantation et centrifugation.
Stade 3 : Déprotéinisation
Le polyoside brut (660g poids humide) est mis en solution dans 24 litres de tampon acétate de sodium 0 ,3M pH 6,9. A cette solution est ajouté 0,1 à 0,6 volume (préférentiellement 0,3 volume) du mélange phénol-tampon acétate de sodium, et on opère comme à l'exemple 1, stade 3.
Stade 4 : Elimination des acides nucléiques
On effectue un traitement au charbon actif, suivi d'une dialyse, en opérant de façon analogue à celle de l'exemple 1, stade 4b.
On ajouta, à la solution polyosidique dialysée (30 litres) obtenue au stade 3, la suspension de charbon actif Norit jusqu'à une concentration finale en charbon actif comprise entre 0,2 et 8g% (préférentiellement 3,33%).
Stade 5 : Obtention du polyoside purifié
A la solution obtenue au stade 4 (38 litres) on ajoute 3420g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,4 avec l'acide acétique. On ajoute lentement, sous agitation vive, de l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 50-65% (préférentiellement 55,5%).
Le précipité est ensuite récupéré par décantation et centrifugation, et mis en suspension dans deux litres d'éthanol absolu pré-refroidi à -20°C puis centrifugé. L'opération est recommencée une fois. On procède ensuite à des lavages à l'acétone et à l'éther ethylique, puis on sèche le précipité, comme à l'exemple 1, stade 5.
On obtient ainsi 68g de polyoside purifié type 9N.
EXEMPLE N°13 : Polyoside pneumococcique type 12 A
Stade 1 : Culture
Les conditions expérimentales sont celles décrites à l'exemple 4.
Stade 2 : Purification préliminaire du polyoside pneumococcique
Concentration
Le surnageant, de culture (40 litres) est concentré à 10 litres, lavé à l'eau physiologique phénolée à 0,5% et à nouveau concen- tré à 9 litres par ultrafiltration à l'aide d'un système Amicon supportant 5 colonnes H10 P10.
Précipitation alcoolique fractionnée
A la solution concentrée on ajoute 468g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,8 avec l'acide acétique. En opérant comme à l'exemple 1, on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration de 15-35% (préférentiellement 25%), puis, après ultracentrifugation, la concentration en acétate de sodium du surnageant est amenée à 7,1g%, le pH est ajusté à 5,8 par l'acide acétique, et on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 45-75% (préférentiellement 58,5%).
Le précipité de polyoside brut est ensuite recueilli par centrifugation. Stade 3 : Déprotéinisation
Le précipité précédemment obtenu (174g poids humide) est mis en solution dans 8 litres de tampon acétate de sodium 0 , 3M pH 6,9.
A cette solution est ajouté 0,1 à 0,5 volume (préférentiellement 0,5 volume) du mélange froid phénol-acétate de l'exemple 1, stade 3, et on opère comme à l'exemple 1.
Stade 4 : Elimination des acides nucléiques
En opérant de façon analogue à l'exemple 1, stade 4b, on effectue un traitement au charbon actif suivi d'une dialyse.
A la solution dialysée obtenue au stade 3 (7,6 litres) on ajoute la suspension de charbon actif Norit pour obtenir une concentration finale en charbon actif comprise entre 1 et 7g% (préférentiellement 3g%).
Stade 5 : Obtention du polyoside purifié
A la solution dialysée obtenue au stade 4 (9 litres) on ajoute 450g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,60 avec l'acide acétique. On ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration de 45-75% (préférentiellement 66,6%), et on ajuste le pH, si nécessaire, à 6,6-6,-8. Le polyoside est ensuite récupéré par centrifugation, puis mis en suspension dans un litre d'éthanol absolu pré-refroidi à -20°C et centrifugé. On procède ensuite à des lavages à l'acétone et à l'éther ethylique, puis on sèche le précipité, comme décrit à l'exemple 1, stade 5.
On obtient ainsi 2g de polyoside purifié type 12 A.
Le polyoside 12 A, ainsi obtenu, se distingue du polyoside type 12 F par l'absence de galactose dans sa composition chimique. La détermination quantitative des hexosamines et des oses (glucose, galactose) a été effectuée, après hydrolyse ménagée, respectivement par dosage colorimétrique selon la technique de G. Ashwell, "Methods in Enzymology" 3 (1957) pages 95-97, S. P. Colowick & N. O. Kaplan, Eds. Académie Press, N. Y. et par dosage spectrophotométrique des co-enzymes réduits (NADH et NADPH) obtenus après action enzymatique de la galactose déshydrogénase pour le dosage du galactose et du système plurienzymatique hexokinase-glucose 6 phosphate déshvdrogénase pour le dosage du glucose. Le polyoside type 12 A ainsi obtenu contient 33-38% d'hexosamines et 23-28%. de glucose (poids/poids).
EXEMPLE N°14 : Polyoside pneumococcique type 14
Stade 1 : Culture
Les conditions expérimentales de fermentation sont analogues à celles utilisées à l'exemple 2, stade 1.
Stade 2 : Purification préliminaire du polyoside pneumococcique
Concentration
Le surnageant de culture (30 litres) est concentré, lavé à l'eau physiologique phénolée à 0,5% et à nouveau concentré à un volume égal à 9 litres, par ultrafiltration sur fibres creuses possédant un seuil de rétention de substances dont le poids moléculaire est supérieur à 10.000 (type Amicon H10 P10).
Précipitation alcoolique fractionnée
A la solution concentrée on ajoute de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 5g%. Le pH est ajusté à 5,4 par l'acide acétique. De façon analogue à l'exemple 1, stade 2, on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration de 15-35% (préférentiellement 20%), et, après ultracentrifugation la concentration en acétate de sodium du surnageant est amenée à 8g% et le pH est ajusté à 5,8, puis on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 50-70% (préférentiellement 60%). Après une demi-heure d'agitation, le pH est ajusté à 6,6-6,8. Le mélange est laissé au repos à + 4°C pendant 16 heures, le précipité de polyoside brut est alors récupéré par centrifugation.
Stade 3 : Déprotéinisation
Le polyoside brut (110g poids humide) est mis en solution dans environ 4 litres de tampon acétate de sodium 0 ,3M pH. 6 , 9 . A cette solution est ajouté 0,1 à 0,5 volume (préférentiellemen 0,3 volume) de mélange phénol-tampon acétate de sodium, et on opère comme à l'exemple 1, stade 3.
Stade 4 : Elimination des acides nucléiques
En opérant de façon analogue à l'exemple 1 , stade 4b, on effectue un traitement au charbon actif suivi d'une dialyse. Pour cela la concentration en chlorure de sodium de la solution obtenue après dialyse au stade 3 (4,3 litres) est amenée à 0,14M puis on ajoute la suspension de charbon actif Norit à 20g% pour obtenir une concentration finale en charbon actif comprise entre 0,1 et 8g% (préférentiellement 3,6g%).
Stade 5 : Obtention du polyoside purifié
A la solution dialysée (6 litres) obtenue au stade 4 on ajoute de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration de 10g% et on ajuste le pH à 5,8 par l'acide acétique. On ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration de 50-70% (préférentiellement 60%). Après 30 minutes d'agitation, le pH est ajusté à 6,8. Le précipité est ensuite récupéré par centrifugation, mis en suspension dans un litre d'éthanol absolu pré-refroidi à -20ºC puis centrifugé. Le processus est recommencé une fois. On procède ensuite à des lavages à l'acétone et à l'éther ethylique, puis on sèche le précipité, comme à l'exemple 1, stade 5.
On obtient ainsi 4 , 4g de polyoside purifié type 14.
EXEMPLE N°15 : Polyoside pneumococcique type 3
Stade 1 : Culture
Les conditions expérimentales sont analogues à celles décrites dans l'exemple n°1, stade 1, exception faite de la régulation pH qui est effectuée à un pH voisin de 7,2.
Stade 2 : Purification préliminaire
Concentration
Le surnageant de culture (200 litres) est réduit à un volume d'environ 80 litres et lavé plusieurs fois à l'eau physiologique phénolée à 0,5%. Cette opération est réalisée par ultrafiltration sur fibres creuses possédant un seuil de rétention voisin de 10.000. Le surnageant ainsi débarrassé des substances de faible poids moléculaire est alors concentré à 50 litres.
Précipitation alcoolique directe
A la solution concentrée on ajoute 2500g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,4 par l'acide acétique. On ajoute lentement, sous agitation, un volume suffisant d'éthanol pour obtenir une concentration finale de 15-40% (préférentiellement 33,3%).
Après 30 minutes d'agitation, le mélange est laissé au repos pendant 16 heures à + 4°C. Le précipité est récupéré par centrifugation. Le précipité recueilli est remis en solution dans 60 litres de tampon acétate de sodium 0,37M, pH 5,4, puis est à nouveau précipité par addition, sous agitation, de 0,15 à 0,7 volume (préférentiellement 0,5 volume) d'éthanol. Après 30 minutes d'agitation et 16 heures de repos à + 4°C, le précipité de polyoside brut est récupéré par centrifugation.
Stade 3 : Déprotéinisation
Le polyoside brut (2180g poids humide) est dissous dans 85 litres de tampon acétate de sodium 0,3M pH 6,9. A cette solution est ajouté 0,1 à 0,5 volume (préférentiellement 0,2 volume) du mélange phénol-tampon acétate de sodium, en opérant comme à l'exemple 1, stade 3.
Stade 4 : Elimination des acides nucléiques
Comme à l'exemple 1, stade 4b, on effectue un traitement au charbon actif suivi d'une dialyse. Pour cela la concentration en chlorure de sodium de la solution obtenue au stade 3 après dialyse (115 litres) est amenée à 0,14M et on ajoute la suspension de charbon actif Norit pour obtenir une concentration finale en charbon actif comprise entre 0,1 et 8g% (préférentiellement 4g%).
Stade 5 : Obtention du polyoside purifie
A la solution dialysée (139 litres) obtenue au stade 4 on ajoute 6950g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,4 avec l'acide acétique. On ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration de 15-40% (préférentiellement 33,3%). Le précipité est ensuite récupéré par décantation et centrifugation puis mis en suspension dans dix litres d'éthanol absolu pré-refroidi à -20°C.
Après centrifugation, le processus est recommencé une fois. On procède ensuite à des lavages à l'acétone et à l'éther ethylique, puis on sèche comme décrit à l'exemple 1, stade 5.
On obtient ainsi 235g de polyoside purifié type 3.
EXEMPLE N°16 : Polyoside pneumococcique type 8
Stade 1 : Culture
Les conditions expérimentales sont analogues à celles décrites dans l'exemple n°1, stade 1 exception faite de la régulation pH qui est effectuée à un pH voisin de 7,2.
Stade 2 : Purification préliminaire
Concentration
Le surnageant de culture (400 litres) est réduit à un volume d'environ 60 litres et lavé à l'eau physiologique phénolée à 0,5%. Cette concentration est réalisée par ultrafiltration sur fibres creuses possédant un seuil de rétention voisin de 10.000. Le surnageant ainsi débarrassé des substances de faible poids moléculaire est alors concentré à 51,5 litres.
Précipitation alcoolique directe
A la solution concentrée (51,5 litres) on ajoute 3090g d'acétaye de sodium et on ajuste le pH à 5,4 par l'acide acétique. On ajoute lentement, sous agitation, un volume suffisant d'éthanol pour obtenir une concentration finale de 18-40% (préférentiellement 33,3%).
Après 30 minutes d'agitation, le mélange est laissé au repos pendant 16 heures à + 4ºC. Le précipité de polyoside brut est récupéré par décantation et centrifugation. Stade 3 : Déprotéinisation
Le polyoside brut (2260g poids humide) est dissous dans 32 litres de tampon acétate de sodium 0 , 3M pH 6,9. A cette solution est ajouté 0,1 à 0,5 volume (préférentiellement 0,25 volume) du mélange phénol-tampon acétate de sodium, en opérant comme à l'exemple 1, stade 3.
En outre, après dialyse, le polyoside est extrait de la phase aqueuse par précipitation éthanolique en présence de 10g% d'acétate de sodium (pH=5,4), avec 0,15 à 0,7 volume (préféren- tiellement 0,37 volume) d'éthanol absolu déshydraté prérefroidi à -20°C.
Stade 4 : Elimination des acides nucléiques
Le précipité du stade 3 (1400g poids humide) est mis en solution dans 27 litres de tampon de sodium 0,14M pH 6,9. Sur cette solution on effectue un traitement au charbon actif, suivi d'une dialyse, comme à l'exemple 1, stade 4b, en ajoutant une suspension de charbon actif Norit pour obtenir une concentration finale en charbon actif comprise entre 1 et 10g% (préférentiellement 10g%).
Stade 5 : Obtention du polyoside purifié
A la solution obtenue au stade 4 après dialyse (27 litres) on ajoute 1350g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,4-5,6 avec l'acide acétique. On ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration de 18-40% (préférentiellement 33,3%), et, après centrifugation, le précipité est mis en suspension dans deux litres d'éthanol absolu pré-refroidi à -20°C puis centrifugé. Cette opération est répétée une fois. On procède ensuite à des lavages à l'acétone et à l'éther éthylique, puis on sèchecomme décrit à l'exemple 1, stade 5. On obtient ainsi 52g de polyoside purifié type 8.
EXEMPLE N°17 : Polyoside pneumococcique type 6 B
Stade 1 : Culture
Les conditions expérimentales de fermentation sont analogues à celles décrites dans l'exemple 9, stade 1, exception faite de la durée de la culture qui est prolongée à 42 heures. La culture est alors stérilisée par le phénol et les germes entiers et les débris cellulaires sont éliminés par centrifugation.
Stade 2 : Purification préliminaire
Concentration
Le surnageant de culture (40 litres) est concentré à 10 litres, lavé à l'eau physiologique phénolée à 0,5% et à nouveau concentré à 8,2 litres. Ces opérations sont effectuées par ultrafiltration sur fibres creuses Amicon type H10 P10.
Précipitation alcoolique fractionnée
A la solution concentrée on ajoute de l'acétate de calcium jusqu'à une concentration finale de 5g% , et le pH est ajusté à 5,4 avec l'acide acétique. De façon analogue à l'exemple 1, stade 2, on ajoute, de l'éthanol jusqu'à une concentration de 10-35% (préférentiellement 25%), et, après ultracentrifugation, on ajoute au surnageant le volume d'éthanol nécessaire à la précipitation complète du polyoside (concentration éthanolique finale comprise entre 45 et 70%, généralement 50%). Le précipité de polyoside brut est ensuite recueilli par décantation et centrifugation.
Stade 3 : Déprotéinisation La polyoside brut (40g poids humide) est mis en solution dans quatre litres de tampon acétate de sodium 0, 3M pH 6,9. A cette solution est ajouté 0,1 à 0,5 volume (préférentiellement 0,5 volume) du mélange phénol-tampon acétate de sodium 0,3M pH 6,9 (1:0,4 vol/vol). Après agitation vigoureuse pendant 30 secondes à l'aide d'un disperseur, le mélange est ultracentrifugé.
La phase aqueuse supérieure est récupérée puis soumise à un deuxième traitement au phénol froid. Le processus est recommencé au total 3 fois.
La phase aqueuse est alors dialysée contre l'eau déminéralisée pendant 18 heures à + 4°C.
Stade 4 : Obtention du polyoside purifié
A la solution dialysée obtenue au stade 3 (5,2 litres), on ajoute 260g d'acétate de sodium et on ajuste le pH à 5,4 avec l'acide acétique. On ajoute lentement, sous agitation, un volume suffisant d'éthanol pour obtenir la précipitation complète du polyoside (concentration finale en alcool comprise entre 45 et 70% (préférentiellement 55,5%).
Le précipité est ensuite récupéré par centrifugation, puis mis en suspension dans un litre d'éthanol absolu pré-refroidi à - 20°C et centrifugé. Cette opération est recommencée une fois. On procède ensuite à des lavages à l'acétone et à l'éther ethylique, puis séché comme à l'exemple 1, stade 5.
On obtient ainsi 9g de polyoside purifié type 6 B.
Remarque: Le polyoside pneumococcique type 6 3 peut être également purifié selon les techniques décrites dans l'exemple 9. EXEMPLE N°13 : Polyoside 7F
Cet exemple illustre la purification finale par précipitation du polyoside (7F) au sulfate d'ammonium.
La solution de départ sur laquelle est effectuée la précipitation au sulfate d'ammonium est la solution dialysée obtenue après traitement au charbon actif, c'est-à-dire la solution obtenue à l'exemple 11 stade 4.
La concentration en NaCl est amenée à 0,85g%.
Le pH de cette solution est ajusté à 6,5 par l'acide acétique dilué et on ajoute lentement, sous agitation, le volume nécessaire d'une solution saturée de sulfate d'ammonium, ou la quantité de (NH4)2SO4 suffisante pour obtenir une concentration finale en (NH4)2SO4 comprise entre 30 et 80g%, préférentiellement 74g%.
Le mélange est laissé au repos (30 minutes à 4 heures) puis ultracentrifugé à 15.000 rpm pendant 30 minutes.
Le précipité est récupéré et mis en solution dans environ 10 litres d'eau distillée apyrogène. Les sels résiduels sont éliminés par dialyse ou diafiltration.
Le principe actif est ensuite récupéré par précipitation directe à l'éthanol en présence de sels de sodium comme décrit à l'exemple 11, stade 5.
EXEMPLE N°19 : Réalisation et utilisation d'un vaccin
Exemple de formule vaccinale - Polyoside purifié de Streptococcus pneumoniae . . .. . . . .. . . . .. . . . .. . . . .. . . 50 microgrammes de chacun des 14 types suivants: 1, 2, 3, 4, 6A, 7F, 8, 9N, 12P, 14, 18C, 19F, 23F, 25
- Soluté tamponné isotonique , q . s .p . . .. . 0 , 5ml
- Phénol (conservateur). au maximum 1,25mg
Le soluté tamponné isotonique a la formule suivante:
- Chlorure de sodium. . . .. . . . .. . . . .. . .. . 4 , 15mg
- Phosphate disodique (Na-HPO4, 2H2O)... 0,065mg
- Phosphate monosodique (NaH2PO4, 2H2O). 0,023mg
- Eau pour préparations injectables . . .. . 0 , 5ml
Mode et voie d'administration
Voie sous-cutanée ou intramusculaire.
Exemple de posologie
Adultes : 25 à 100μg de chaque polyoside en une seule injection.
Enfants : 10 à 50μg de chaque polyoside en une ou plusieurs injections, à quelques semaines d'intervalle.
Indications thérapeutiques
Prévention de l'infection pneumococcique en fonction de l'épidémiologie. Elles concernent plus particulièrement:
- les personnes âgées de plus de 50 ans d'une façon générale, - les bronchitiques chroniques, insuffisants respiratoires et tabagiques,
- les patients fragilisés par une maladie chronique (insuffisance cardiaque, diabète, insuffisance hépatique ou rénale, cancer viscéral ou alcoolisme chronique),
- les splénectomisés,
- les enfants drépanocytaires homozygotes,
- les personnes exposées aux méningites à pneumocoque en raison d'un traumatisme crânien avec fistule osteo-méningée ou d'une otite chronique,
- et probablement les enfants sujets aux infactions otitiques récidivantes ou atteints de syndromes néphrotiques.
Contre-indications
Par prudence, il convient de ne pas utiliser le vaccin antipneumococcique chez la femme enceinte.
Il en est de même pour les personnes présentant une infection aigûe en évolution, en particulier pneumococcique, pour les enfants de moins de 2 ans qui ne s'immunisent pas régulièrement contre plusieurs sérotypes souvent en cause dans l'infection pneumococcique à cet âge, et pour les personnes atteintes d'un déficit immunitaire (cancer - chimiothérapie) et en particulier d'une agranulocytose ou d'une aplasie médullaire.

Claims

Revendications de brevet
1. Procédé de purification d'un polyoside de Streptococcus pneumoniae, caractérisé par le fait que le produit de départ est une solution aqueuse dudit polyoside, contenant au moins 20% d'impuretés protéiques sur produit sec, obtenue par lyse d'une culture de Streptococcus pneumoniae, clarification et concentration du polyoside, que, dans le but de réduire la teneur en protéines, l'on ajoute de 5 à 50% en volume de phénol, à température de 5 à 30ºC environ, que l'on agite, puis sépare et recueille la phase aqueuse, et que l'on répète, si nécessaire, le traitement au phénol jusqu'à ce que la teneur en protéines de la phase aqueuse soit inférieure à un seuil prédéterminé.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on opère à température de 10 à 20°C environ.
3. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'on ajoute le phénol sous la forme d'un mélange phénol-eau.
4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que ledit mélange est constitué par du phénol dans lequel l'eau est dissoute.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'on effectue le traitement au phénol à un pH de 6,9 ± 0,5 environ.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que la solution de polyoside de départ est une solution tamponnée.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé par le fait que l'on ajoute le phénol sous la forme d'un mélange phénolsolution tamponnée.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, caractérisé par le fait que l'on ajoute de 10 à 60% vol/vol dudit mélange.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que ledit seuil correspond à une teneur en protéines de 5% en poids.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précéden- tes, caractérisé par le fait que l'on soumet la phase aqueuse recueillie à une dialyse pour éliminer le phénol résiduel.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précéden- tes, caractérisé par le fait qu'en outre, on ajoute à la solution de polyoside, en présence d'ions calcium, un alcool miscible à l'eau en quantité suffisante pour précipiter les contaminants nucléiques, on élimine le précipité puis on ajoute à nouveau ledit alcool en quantité suffisante pour précipiter le polyoside.
12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé par le fait que l'on effectue la précipitation fractionnée à l'alcool en présence d'ions calcium après le traitement au phénol.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 et 12, caractérisé par le fait que ledit alcool est l'éthanol.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 13, caractérisé par le fait que l'on effectue la précipitation fractionnée à l'alcool à une température de 0 à +15°C environ.
15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 14, caractérisé par le fait que l'on ajoute l'alcool jusqu'à une concentration de 10 à 35% environ (vol/vol) pour précipiter les contaminants nucléiques, puis que l'on ajoute encore de l'alcool au surnageant jusqu'à précipitation complète du polyoside.
16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 15, caractérisé par le fait que l'on opère en présence d'ions calcium à une molarité de 0,25-2M environ.
17. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'on soumet en outre la solution à purifier à un traitement au charbon actif en quantité suffisante pour éliminer la majeure partie des contaminants nucléiques, puis que l'on élimine le charbon actif.
18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé par le fait que l'on ajoute de 0,1 à 12% (poids/vol) de charbon actif.
19. Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 16, caractérisé par le fait que, si la teneur en acides nucléiques du polyoside est supérieure à 1 ou 2% en poids après la précipitation fractionnée à l'alcool, on remet en solution le précipité de polyoside et le soumet à un traitement au charbon actif selon l'une quelconque des revendications 17 et 18.
20. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'après lyse, clarification et concentration l'on ajoute un alcool miscible à l'eau à une solution aqueuse de polyoside à purifier, de façon à précipiter le polyoside, puis que l'on remet le précipité en solution pour obtenir la solution aqueuse de polyoside de départ.
21. Procédé selon la revendication 20, caractérisé par le fait que l'on ajoute l'alcool en quantités croissantes de façon à précipiter d'abord des impuretés avant de précipiter le polyoside.
22. Procédé selon la revendication 20, caractérisé par le fait que le polyoside est précipité directement par addition d'une quantité suffisante d'alcool.
23. Procédé selon l'une quelconque des revendications 20 à 22, caractérisé par le fait que la précipitation à l'alcool est effectuée en présence d'un sel dissous.
24. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes,, caractérisé par le fait que ladite concentration est effectuée par ultrafiltration, le facteur de concentration étant de 4 à 10 environ.
25. Procédé selon la revendication 24, caractérisé par le fait que l'ultrafiltration est réalisée à l'aide de membranes retenant les substances de poids moléculaire supérieur à 10.000.
26. Procédé selon la revendication 25, caractérisé par le fait que lesdites membranes retiennent les substances de poids moléculaire supérieur à 50.000 ou supérieur à 100.000.
27. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que la culture de Streptococcus pneumoniae est effectuée en milieu semi-synthétique exempt de protéines, sans aération sous gaz inerte ou sous gaz carbonique, avec régulation de pH et addition des métabolites automatiques.
28. Procédé de purification d'un polyoside de Streptococcus pneumoniae du type 1, 4, 5, 10 A, 12 F, 15 B, 17 F, 18 C, 20, 22 F, 23 F ou 25, selon les revendications 12, 19 et 23, caractérisé par le fait qu'après lyse, clarification et concentration, on ajoute d'abord à ladite solution aqueuse de départ un alcool miscible à l'eau en quantités croissantes pour précipiter d'abord des impuretés, puis après élimination de celles-ci, pour précipiter le polyoside, que l'on redissout le précipité de polyoside et soumet la solution obtenue au traitement avec un phénol pour réduire la teneur en protéines, et que l'on soumet la phase aqueuse recueillie au traitement d'élimination des contaminants nucléiques par précipitation fractionnée avec un alcool en présence d'ions calcium puis par le traitement au charbon actif.
29. Procédé de purification d'un polyoside de Streptococcus pneumoniae du type 2, 6 A, 6 B ou 19 F, selon la revendication 12, caractérisé par le fait qu'après lyse, clarification et concentration, on ajoute d'abord à ladite soluf on aqueuse de départ un alcool miscible à l'eau en quantités croissantes pour précipiter d'abord des impuretés, puis après élimination de celles-ci, pour précipiter le polyoside, que l'on redissout le précipité de polyoside et soumet la solution obtenue au traitement avec un phénol pour réduire la teneur en protéines, puis que l'on soumet la phase aqueuse recueillie au traitement d'élimination des contaminants nucléiques par précipitation fractionnée avec un alcool en présence d'ions calcium.
30. Procédé de purification d'un polyoside de Streptococcus pneumoniae du type 7F, 9N, 12A ou 14, selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, et selon la revendication 17, caractérisé par le fait qu'après lyse, clarification et concentration, on ajoute à ladite solution aqueuse du polyoside un alcool miscible à l'eau en quantités croissantes pour précipiter d'abord des impuretés puis, après élimination de celles-ci, pour précipiter le polyoside, que l'on dissout le précipité de polyoside et soumet la solution obtenue au traitement avec un phénol pour réduire la teneur en protéines, puis que l'on soumet la phase aqueuse recueillie au traitement d'élimination des contaminants nucléiques par le charbon actif.
31. Procédé de purification d'un polyoside de Streptococcus pneumoniae du type 3 ou 8, selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, et selon la revendication 17, caractérisé par le fait qu'après lyse, clarification et concentration, on ajoute à ladite solution aqueuse du polyoside un alcool miscible à l'eau en quantité suffisante pour précipiter directemen le polyoside, que l'on redissout le précipité de polyoside et soumet la solution obtenue au traitement avec un phénol pour réduire la teneur en protéines, puis que l'on soumet la phase aqueuse recueillie au traitement d'élimination des contaminants nucléiques par le charbon actif.
32. Procède de purification d'un polyoside de Streptococcus pneumoniae du type 6B, selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 et selon la revendication 11, caractérisé par le fait qu'après lyse, clarification et concentration, on ajoute à ladite solution aqueuse du polyoside, en présence d'ions calcium, un alcool miscible à l'eau en quantité suffisante pour précipiter les contaminants nucléiques, on élimine le précipité et on ajoute à nouveau ledit alcool en quantité suffisante pour précipiter le polyoside, que l'on redissout le précipité de polyoside puis que l'on soumet la solution obtenue au traitement avec un phénol pour réduire la teneur en protéines.
33. Vaccin pneumococcique, caractérisé par le fait qu'il contient au moins un polyoside purifié selon le procédé de l'une quelconque des revendications précédentes.
PCT/FR1981/000161 1980-12-11 1981-12-11 Procede de purification de polyosydes de streptococcus pneumoniae et vaccin a base de polyosides ainsi purifies WO1982001995A1 (fr)

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