DE3152621T1

DE3152621T1 - Verfahren zur reinigung von polyosiden von streptococcus pneumoniae und vaccine auf der basis derart gereinigter polyoside

Info

Publication number: DE3152621T1
Application number: DE813152621T
Authority: DE
Inventors: Francois 69004 Lyon Arminjon; Robert 69003 Lyon Donikian
Original assignee: Institut Merieux SA
Current assignee: Institut Merieux SA
Priority date: 1980-12-11
Filing date: 1981-12-11
Publication date: 1983-11-17
Also published as: CH662056A5; FR2495939B1; DE3152621C2; NL8120466A; WO1982001995A1; FR2495939A1; GB2102291A; GB2102291B; BE891444A

Description

Verfahren zur Reinigung von Polyosiden von Streptococcus pneumoniae und Vaccine auf der Basis derart gereinigter Polyoside.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Polyosiden von Streptococcus pneumoniae.

Die Erfindung betrifft ebenfalls eine Vaccine gegen Infektionen, die durch Bakterien Streptococcus pneumoniae hervorgerufen werden, auf Basis von derart gereinigten Polyosiden.

Man weiß, daß mehrere Typen von Streptococcus pneumoniae verschiedene Infektionen hervorrufen, wie die Meningitis, Pneumoni^en, Otitis und verschiedene bakterielle Infektionskrankheiten.

Es ist ebenfalls bekannt, daß die Reinigung von Kapsel-Polyosiden aus einem gereinigten Extrakt von den Bakterien Streptococcus pneumoniae es gestattet, Vaccine zur Immunisierung gegen Infektionen herzustellen, die durch die genannten Bakterien hervorgerufen werden.

In der europäischen Patentanmeldung 78.400185.1 ist ein Verfahren zur Reinigung von Polyosiden von Streptococcus pneumoniae durch fraktioniertes Ausfällen mittels Alkohol und anschließender Eliminierung der Proteine und der Nucleinsäuren beschrieben. Die Eliminierung der Proteine und Nucleinsäuren wird entweder durch Behandlungen mit Hilfe von Enzymen oder durch Behandlungen mittels kationischer oberflächenaktiver Substanzen bewirkt und den Behandlungen folgt eine Diafiltration.

Gemäß dieser europäischen Patentanmeldung wird die fraktionierte Ausfällung durch Alkohol unmittelbar im Kulturmilieu durchgeführt, ohne vorhergehende Lyse und es ist wegen der Gegenwart der verschiedenen Verunreinigungen notwendig, die unterschiedlichen Reinigungsbehandlungen systematisch bei jedem Versuchsansatz durchzuführen, wobei einleitend die Mengen der zuerst angewendeten Stoffe bestimmt werden, die benötigt werden zur fraktionierten alkoho-

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lischen Ausfällung und zur Behandlung mit den ^ationischen oberflächenaktiven Mitteln.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird an einem Ausgangsprodukt durch geführt, das durch Lyse der Zellreste, die eliminiert worden sind (Klärung), erhalten worden ist.

Das Verfahren gestattet, daß die Durchführung systematischer Vorversuche vermieden werden kann.

Ganz allgemein erlaubt das Verfahren, die Dauer der Aufeinanderfolge der Reinigungsstufen der Polyoside von Streptococcus pneumoniae wesentlich abzukürzen. ■

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Reinigung eines Polyosid'' Streptococcus pneumoniae, das dadurch gekennzeichnet ist, daß als Ausgangsprodukt eine wässerige Lösung des Polyosides eingesetzt wird, die Protein-Verunreinigungen enthält und durch Lyse einer Kultur von Streptococcus pneumoniae mit darauffolgender Klärung und Konzentration des Polyosides erhalten worden ist, daß man zu dieser Lösung 5 bis 50 Vol.-% Phenol bei einer Temperatur von etwa 5 bis 30 C zufügt, das bei man rührt und anschließend die wässerige Phase abtrennt und isoliert und daß man, falls notwendig, die Phenolbehandlung wiederholt bis der Proteingehalt der wässerigen Phase niedriger als ein vorher festgesetzter Grenzwert .ist...

Das Behandlungsverfahren mit Phenol erlaubt die Eliminierung eines größeren Teils der in der verunreinigten Ausgangslösung vorhandenen Proteine. Es wurde gefunden, daß die Behandlung mit Phenol die Molekularstruktur und damit die biologische Aktivität des Polyosides nicht modifiziert.

Es wurde festgestellt, daß die Behandlung mit Phenol hier in einem dem Reinigungsverfahren vorgeschaltetem Stadium an einem Ausgangsprodukt durchgeführt wird, das mindestens 20 Gew.-% und

allgemein 30 bis 50 Gew.-% Proteine enthält (bezogen auf das trockene Ausgangsmaterial).

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren durch folgende Merkmale allein oder in Kombination gekennzeichnet:

Die wässerige Ausgangslösung enthält 1 bis 30 g/Liter des verunreinigten Polyosides,

- man arbeitet bei einer Temperatur von etwa 10 bis 20° C,

- man fügt das Phenol in Form einer Mischung von Phenol und Wasser zu,

- das Gemisch Phenol-Wasser besteht aus Phenol, in welchem das Wasser aufgelöst ist,

- man bewirkt die Behandlung mit dem Phenol bei einem pH-Wert von 6,9 - 0,5,

- die Ausgangslösung des Polyosides ist eine gepufferte Lösung,

- die gepufferte Lösung ist z.B. eine Losung mit Natriumazetat als Puffer,

- das Phenol wird in Form eines Gemisches von Phenol mit einer gepufferten Lösung zugefügt,

- es wird 10 bis 60 Vol.-% je Volumen des Gemisches aus Phenol und Wasser oder Phenol und der gepufferten Lösung zugefügt,

- die Wassermenge der gepufferten Lösung dieses Gemisches entspricht möglichst genau der Maximalmenge, die durch das Phenol gelöst werden kann,

- der genannte Grenzwert entspricht einem Proteingehalt von 5 Gew.-%, d.h. 5g Proteine je 100g rohes Polyosid ,

- man unterwirft die isolierte wässerige Phase einer Dialyse, um das restliche Phenol zu entfernen.

Um das Verfahren der Deproteinisierung durch ein Phenol durchzuführen, wird vorzugsweise in folgender Weise verfahren: Man gibt das Phenol zur Lösung des zu reinigenden Polyosides zu und unterwirft das Gemisch anschließend einer Ultrazentrifugierung. Hierbei erhält man eine Auftrennung in drei Phasen: Eine Untere phenolische Phase, eine proteinische Zwischenphase und eine obere wässerige Phase, die das Polyosid enthält, Diese wässerige Phase wird isoliert und, falls notwendig, einer erneuten Phenolbehandlung unterworfen. Das Verfahren kann wiederholt werden«, bis ein Proteingehalt unterhalb des festgelegten Grenzwerts erhalten wird.

Die Bestimmung des proteinischen Verunreinigungstiter kann nach der Isolierung durchgeführt werden und geschieht durch alkoholische Ausfällung und anschließende Trocknung im Vakuum einer aliquoten Polyosid^menge, die in der wässrigen Phase enthalten ist, und durch colorimetrische Bestimmung nach dem Verfahren von Lowry et coil, in J.Biol .Cheiti. 143, Seite 265 (1951) mittels eines Rinder-Albumin-Serums als Vergleichslösung.

Die Erfahrung hat jedoch gezeigt, daß dann, wenn konstante Bedingungen der Kulturtechnik angewendet werden, es möglich ist, einmal die Bestimmung für eine ganze Anzahl von Behandlungen mit Phenol (im allgemeinen 1 oder 2) zu bestimmen, die notwendig sind, für jeden Poly©giö~Typ.

Um das Polyosid in vorteilhafter Weise zu reinigen, kann man neben der Deproteinisierungs-Behandlung mit Phenol andere Behandlungen anwenden, insbesondere solche Behandlungen, die es gestatten, Nucleinsäure-Verunreinigungen zu entfernen.

Gemäß einer Ausführungsform des oben definierten Verfahrens und zur Eliminierung von Nucleinsäure-Verunreinigungen fügt man außerdem zur Polyosid lösung in Gegenwart von Calciumionen einen

Alkohol zu, der mit Wasser mischbar ist, in einer Menge, die ausreicht, die Nucleinsäure-Verunreinigungen auszufällen und eliminiert den Niederschlag und fügt anschließend erneut diesen Alkohol in einer Menge zu, die ausreicht, um das Polyosid auszufällen

Gemäß einer besonderen Ausführungsform hat diese zusätzliche Behandlung mit einem Alkohol in Gegenwart von ^alciumionen noch folgende Merkmale isoliert oder in Kombination:

Man bewirkt die fraktionierte Ausfällung durch Alkohol allgemein nach der Phenolbehandlung. Es ist dennoch möglich, diese Behandlung vor der Phenolbehandlung durchzuführen, wie dies im folgen^ den Beispiel 17 erläutert wird,

als Alkohol wird Äthanol verwendet,

man bewirkt die fraktionierte Ausfällung durch Alkohol bei einer Temperatur von 0 bis +15 C,

man fügt den Alkohol bis zu einer Konzentration von 10 bis 35 Vol..-%/Vol. zu zur Ausfällung der Nucleinsäure-Verunreinigungen, fügt aber weiteren Alkohol zur überstehenden Flüssigkeit zu, bis zur vollständigen Ausfällung des Polyosides,

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man arbeitet in Gegenwart von Calciumionen in einer molaren Konzentration von 0,25 bis 2 Mol.

Gemäß einer anderen Durchführungsform des Reinigungsverfahrens gemäß der Erfindung ist es zum Eliminieren der Nucleinsäure-Verunreinigungen möglich, der zu reinigenden Lösung in einer ergänzenden Behandlung Aktivkohle zuzufügen in einer Menge, die ausreicht, den größeren Teil der Nucleinsäure-Verunreinigungen zu adsorbieren, und anschließend die Aktivkohle mit den daran adsorbierten Nucleinsäure-Verunreinigungen zu eliminieren.

Im allgemeinen fügt man 0,1 bis 12 Gew.-%/Volumen Aktivkohle zu.

Wenn der Gehalt an Nucleinsäuren nach einer ersten Behandlung mit Aktivkohle oberhalb eines Grenzwerts liegt, der festgelegt ist, kann die Behandlung wiederholt werden.

Die Behandlung mit Aktivkohle kann entweder anstelle der Behandlung mit Alkohol in Gegenwart von C_alciumionen oder zusätzlich zu dieser Behandlung durchgeführt werden.

Wenn der Anfangstiter der Nucleinsäure-Verunreinigungen oberhalb

liegt
15 Gev.-%/, wird zuerst die fraktionierte Fällung mit Alkohol in Gegenwart von Calciumionen durchgeführt.

Wenn nach der fraktionierten Ausfällung mittels Alkohol der Gehalt an Nucleinsäuren im Polyosid oberhalb eines festgelegten Grenzwerts liegt { z.B. oberhalb 1 oder 2 Gew.-% ) kann man den Polyosid -Niederschlag erneut in Lösung bringen und diesen einer Behandlung mit Aktivkohle wie vorher beschrieben unterwerfen.

Wenn der Anfangstiter der Verunreinigung mit Nucleinsäure unterhalb 15 Gew.-% liegt, wird die Eliminierung der Nucleinsäuren vorzugsweise mit einer nur einmaligen Behandlung mit Aktivkohle bewerkstelligt. .

Der Titer der Verunreinigungen mit Nucleinsäuren kann durch spektrophotometrische Messungen bei einer Absorption von 260 nm einer wässrigen Polyosid lösung bestimmt werden, die durch erneutes Auflösen einer aliquoten Menge des Polyosides in destilliertem Wasser erhalten worden ist, wobei das Polyosid durch Trocknen eines Niederschlags erhalten worden ist, der aus der Behandlung eines aliquoten Teils einer Lösung mit Äthanol stammt, die nach einer Behandlung mit Phenol und einer Dialyse erhalten worden ist. Ein Wert gleich 1 wird einer Absorption von 50 microgramm der Nucleinsäure je cm³ Wasser in einer Cuvette, die einen optischen Durchgangsweg von 1 cm hat, zugeschrieben.

Die Erfahrung hat auch gezeigt, daß bei der Anwendung konstanter Kulturtechniken es möglich ist, einmal festzulegen, welche Arten und Anzahl der Behandlungen notwendig sind für die zufriedenstel-

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lende Eliminierung von Nucleinsäure-Verunreinigungen. Die optimale Konzentration der Aktivkohle, die es gestattet, den Titer an Nucleinsäuren am stärksten herabzusetzen, wird durch vorangehende Proben für jeden zu reinigenden Polysid -Ansatz festgelegt. Diese Konzentration an Aktivkohle schwankt in der Praxis von 0,1 bis 12 Gew.-%/Vol.

Zur endgültigen Reinigung des Polyosides kann das Polyosid einer Ausfällung nach dem Waschen des Niederschlags unterworfen werden. Dies kann z.B. durch Ausfällung mit einer wässerigen Amoniumsulfatlösung oder mit einem Alkohol durchgeführt werden. Man wäscht anschließend den Niederschlag mit mindestens einem Waschmittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Alkohol (wie Äthanol) Aceton oder Äthyläther.

Im allgemeinen wird zur Erzielung einer wässrigen Polyosid -Ausgangslösung eine wässrige, zu reinigende Polyosid lösung (erhalten nach der Lyse, Klärung und Konzentration) mit einem Alkohol versetzt, der mit Wasser mischbar ist, in der Art, daß das Polyosid ausfällt, aber daß der Niederschlag in Lösung bleibt. Man kann diese Ausfällung in mehreren Stufen durchführen (allgemein in 2 Stufen), wobei der Alkohol in ansteigenden Mengen derart zugegeben wird, daß die Verunreinigungen außer dem Polyosid ausgefällt werden. Man kann in bestimmten Fällen ebenfalls insbesondere dann, wenn das Polyosid durch eine relativ schwache Alkoholkonzentration ausgefällt wird, eine direkte Ausfällung durch Alkohol durchführen. Dies ist insbesondere dann der Fall bei Polyosiden der Typen 3 und 8, wie dies im folgenden experimentellen Teil erläutert wird. Vorzugsweise wird die Ausfällung durch Alkohol in Gegenwart eines Salzes durchgeführt, das im Milieu löslich ist, um die Ionenkräfte zu erhöhen. Man kann z.B. hierzu ein Natriumsalz anwenden. In gleicher Weise kann man diese vorausgehende Ausfällung durch Alkohol in Gegenwart von Calciumsalzen durchführen. In diesem Fall gestattet das vorhergehende Stadium die Eliminierung des größeren Teils der Nucleinsäure-Verunreinigungen vor dem Stadium der Eliminierung der Proteine durch das Phenol.

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Die Konzentration des Salzes kann von 0,1 bis 2 Mol schwanken.

Die direkte Ausfällung besteht in der Zugabe eines Alkoholvolumens, das ausreicht, einelnsolubilisierung des Polyosides zu erzielen. Dieses wird isoliert durch Zentrifugieren mit oder ohne
vorhergehender Dekantierung der überstehenden Flüssigkeit.

Die fraktionierte alkoholische Fällung wird vorzugsweise in zwei Stufen durchgeführt. In der ersten Stufe wird ein Volumen Äthanol zugefügt, das eine selektive Ausfällung der Verunreinigungen gestattet ( in erster Linie Proteine und Nucleinsäuren). Zu der
überstehenden Flüssigkeit, die nach der Zentrifugierung erhalten wird, wird in einer zweiten Stufe ein Volumen Alkohol zugefügt,
das ausreicht, eine vollständige Ausfällung der Polysaccharide
zu erreichen. Nach dem Zentrifugieren wird das Sediment erneut
in Lösung gebracht zur Behandlung mit dem Phenol.

Im allgemeinen reicht eine Konzentration des Alkohols von 10 bis 30 VoI.-%/Volumen aus, um einen Teil der Protein- und Nucleinsäure Verunreinigungen zu insolubilisieren. Eine Endkonzentration, die in diesem Fall zwischen 30 und 80 % schwankt, ist im allgemeinen notwendig zur Ausfällung der Polyoside. Gleichfalls kann das PoIyosid durch eine schwache Alkoholkonzentration (z.B. einer Konzentration von 15 bis 20 %} ausgefällt werden, womit eine direkte
Polyosid -Ausfällung bewirkt werden kann.

Der verwendete Alkohol ist vorzugsweise Äthanol. Man bewirkt die Ausfällung durch den Alkohol im allgemeinen bei einer Temperatur von etwa 0 bis 15 C.

Diese vorläufige Ausfällung durch Alkohol kann durch eine Ausfällung mit einer wässerigen Lösung von Amoniumsulfat einer ausreichenden Konzentration, um das Polyosid auszufällen, ersetzt werden . ' '

Wie oben angegeben, wird das Ausgangsprodukt bei einer vorhergehenden Konzentration nach Lyse im Kulturmilieu und Eliminierung

der Zellreste der Kultur durch Klärung erhalten. Um diese Konzentration zu bewirken, wird vorzugsweise mit Ultrafiltration gearbeitet. Der Konzentrationsfaktor kann von etwa 4 bis 15 schwanken, wonach das Volumen und die Viskosität der überstehenden Flüssigkeit eingeengt werden. Die Ultrafiltration wird beispielsweise mit Hilfe von Membranen durchgeführt, welche die Substanzen von Molekulargewichten über 10.000 zurückhalten. Es ist ebenfalls möglich, die Membranen zu verwenden, die Substanzen mit einem Molekulargewicht über 50.000 zurückhalten oder die solche mit einem Molekulargewicht über 100.000 zurückhalten. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform zur Erzielung einer PoIyosid -Ausgangslösung wird die Kultur von Streptococcus pneumoniae in einem halbsynthetischen Milieu, das frei ist von Proteinen, durchgeführt. Die Kultur umfaßt vorzugsweise drei Vorkulturen von jeweils 3 bis 4 Stunden.

Die Anwendung eines halbsynthetischen Milieus für eine im industriellen Maßstab durchgeführte Kultur von Streptococcus pneumoniae wurde bisher nicht durchgeführt. Sie gestattet eine Vereinfachung der Reinigungen in letzter Stufe und vermeidet die Zugabe von Fremdproteinen, die schwierig zu entfernen sind.

Die flüssigen Vorkulturen und die industrielle Kultur werden in einem halbsynthetischen Milieu durchgeführt. Um eine Kultur in einem großen Gärgefäß durchzuführen ist es vorteilhaft, vorher eine Einstellung des pH-Wertes und eine Glucosezugabe automatisch durchzuführen.

Der pH-Wert wird in diesem Fall etwa zwischen 6,0 und 7,4 durch Zugabe von 5ώ -Sodalösung oder einer anderen alkalischen Lösung eingestellt.

Um einen optimalen Polysaccharidtiter zu erhalten wird die Kultur nach vollständiger Entwicklung der Mikrobenkörper bei einer Temperatur von 3 7 - 0,2⁰C 12 bis 18 Stunden lang angehalten.

Am Ende des Zyklus wird die Kultur beispielsweise durch Zugabe einer kleinen Phenolmenge (z.B. 0,5 %) sterilisiert und die Bak-

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terien werden einer Lyse unterworfen durch Zugabe eines Mittels, wie Natrium-^esoxycholat .

Zur Durchführung der Kultur wird von ein.?m Grundini lieu, wie folgendem, ausgegangen:

- saures Casein-Hydrolysat	22,230g
- L-Cystin	0,166g
- L-Tryptophan	0,022g
- L-Tyrosin	0,220g
- Dikaiiumhydrogenphosphat
K₂H PO₄	5,560g
-■ destilliertes Wasser auf	1000cm³

Der pH-Wert wird auf 7,6 durch Zugabe von Soda eingestellt.

Das vollständig verwendete Milieu zur Bewirkung der zweiten Vorkultur und der folgenden Kulturen sowie der industriellen Kultur entspricht dem folgenden Ansatz:

- Grundmilieu 900cm³

- Glucoselösung 50% 25cm³

- Vitaminlösung, Salze und
Wuchsstoffe 50cm³

- Lösung von Bicarbonat und
Thioglycolsäure 25cm³

Der pH-Wert wird auf 7,6 eingestellt.

Die Glucoselösung von 50 % wird durch Lösen von 50g wasserfreier Glucose in 100cm³ destilliertem Wasser hergestellt. Die Lösung wird 30 Minuten bei. 120 C sterilisiert.

Die Lösung von Vitaminen, Salzen und Wuchsstoffen hat folgende Zusammensetzung:

	200cm³
- Vitaminlösung	40cm³
- Salzlösung	' 1 2, 5g
- L-Glutamin	2g
- Asparagin	0,2g
- Cholin-HCl	1000cm³
- destilliertes Wasser auf

Diese Lösung wird steril filtriert und bei + 4°C aufbewahrt

Die Vitaminlösung kann folgende Zusammensetzung haben:

- Biotin 0,15mg

- Nicotinsäure 100mg

- Pyridoxal 100mg

- Calciumpanto thenät 500mg

- Thiamin 100mg

- Riboflavin 100mg

- Adenin sulfat 1000mg

- Uracil 1000mg

- kaltes destilliertes Wasser auf

1000cm³

Die Salzlösung hat folgende Zusammensetzung:

- Magnesiumsulfat .	Mg	so₄	, 7H₂O	25 0g
- Eisensulfat	Fe	so₄	. 7H₂O	2,5g
- Zinksulfate	Zn	so₄	.7H₂O	0,400g
- Mangansulfat	Mn	SO₄.	* ^H2°	0, 180g
- Salzsäure				10cm³
- destilliertes Wasser auf				1000cm³

Die Bicarbonatlösung und Thioglikolsäurelösung hat folgende Zusammensetzung:

- Natriumbicarbonat 40g

- Thioglykolsäure 10% 40cm³ -destilliertes Wasser auf 1000cm³

Es wird im folgenden ein Schema der Kulturtechnik wiedergegeben:

Vorkultur I

Es werden Flaschen Geloselösung und 5% Pferdeblut mit Streptococcus pneumoniae geimpft und dann gefrier .-getrocknet. Der Inhalt von einer gef rier-getrockneten Ampulle! mit lern³ Trypticase-Bouillon aus Sojabohnen verdünnt und auf die Oberfläche von Petrischalen ausgegossen. Die Schalei
Brutschrank aufbewahrt.

ausgegossen. Die Schalen werden 16 bis 17 Stunden bei 36 C im

Vorkultur II

In Behälter die 45cm³ Grundmilieu enthalten, werden steril 1,25cm³ einer Glucoselösung von 50%, 2,50cm³ der Lösung von Vitaminen, Salzen und Wuchsstoffen und 1,25cm^J Lösung von Bicarbonat und Thioglykolsäure zugegeben.

Es wird die Lösung mit dem Produkt der Vorkultur I beimpft und bei 36°C 3 bis 4 Stunden unter langsamem Rühren kultiviert.

Vorkultur III

In einer 51-Flasche werden 2,41 Grundmilieu eingefüllt und 60cm³ Glucoselösung, 120cm³ der Lösung von Vitaminen, Salzen und Wuchsstoffen und 60cm³ der Lösung von Bicarbonat und Thiog^rk ölsäure

eingefüllt. .

Es wird mit 500cm³ der Vorkultur II beimpft und 3 bis 4 Stunden unter Rühren bei 36°C kultiviert.

Eigentliche Kultur

Es werden 361 des sterilisierten Grundmilieus mit Kohlendioxydgas gesättigt. Zu diesem Grundmilieu wird 11 Glucoselösung, 21 der

Lösung von Vitaminen, Salzen und Wuchsstoffen und 11 der Lösung von Bicarbonat und Thioglykolsäure zugefügt.

Der pH-Wert wird mittels 5n-Sodalösung auf 7,6 eingestellt.

Es wird bei einer Temperatur von 36°C unter Rühren ohne Belüftung vorzugsweise unter inert 9^as °der Kohlendioxydgas kultiviert, wobei der pH-Wert zwischen 6,0 und 7,4 mittels 5n-Sodalösung eingestellt wird.

Nach etwa 8 Stunden Kulturdauer wird folgende Mischung zugefügt:

- 1 Liter Glucoselösung 50%

- 0,335 Liter einer Lösung von Ammoniumacetat von 46,2 Gew.-%

Stoppen der Kultur

Das Stoppen der Kultur ist eine Funktion der Lyse der Bakterien:

a) Natürliche Lyse: hierbei überleben die Bakterien ungefähr 60 bis 96 Stunden Kulturdauer und können durch mikroskopische Prüfung der Bakterienmorphologie verfolgt werden.

b) Eine Lyse wird nach etwa 12 bis,17 Stunden Kulturdauer provoziert: Die Kultur wird abgekühlt und in einen Behälter gegossen und unter Rühren 10% einer Natrium-desoxycholatlösung von 10% zugegeben, so daß die Endkonzentration hiervon 1% beträgt. Es wird 30 Minuten gerührt.

Klärung

Um die Zellreste zu eliminieren wird zentrifugiert und die geklärte überstehende Flüssigkeit gesammelt.

Wie im folgenden dargelegt erlauben die gereinigten Polyoside von Streptococcus pneumoniae die Herstellung von Vaccinen.

Die Erfindung hat ebenfalls zum Gegenstand eine Pneumococcenvaccine die mindestens ein Polyosid enthält, das gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren gereinigt worden ist.

Ein Beispiel der Herstellung und Anwendung einer solchen Vaccine ist im folgenden experimentellen Teil wiedergegeben:

Eine monovalente Pneumococcen-Vaccine besteht aus der Lösung eines gereinigten Polyosides in einer gepufferten isotonischen Lösung. Eine polyvalente Pneumococcen-Vaccine besteht aus mindestens 2 Polyosiden, die gereinigt und in einer gepufferten isotonischen Lösung gelöst sind.

Es ist bekannt, daß mehrere serologische Typen von Streptococcus pneumoniae unterschieden werden können, die gemäß der in der folgenden Tabelle I wiedergegebenen Nomenklatur unterschieden werden.

Tabelle I

TYPE

dänische Nomenklatur amerikanische Nomenklatur

1 1 .

2 2

3 3

4 4

5 5

6 A 6

6 B 26

7 F 51

8 8

9 N 9 10 A 34 12 A 83 12 F 12

14 14

15 B 54 17 F 17 18C 56

19 F 19

20 20

22 F 22

23 F 23 25 25

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die dänische Nomenklatur angewendet.

Im folgenden werden nicht beschränkte Ausführungsformen des Verfahrens gemäß der Erfindung bei bestimmter. Polyosiden wiedergegeben:

Verfahren zur Reinigung eines Polyosides von Streptococcus pneumoniae der Typen 1, 4, 5, 1OA, 12F, 15B, 17F, 18C, 20, 22F, 23F oder 25, dadurch gekennzeichnet, daß nach der Lyse, Klärung und Konzentration zu einer wässerigen Ausgangslösung ein Alkohol zugegeben wird, der mit Wasser mischbar ist, in ausreichenden Mengen um die Verunreinigungen auszufällen und nach der Eliminierung dieser Verunreinigung das Polyosid auszufällen, daß man den Niederschlag von Polyosid erneut löst und die erhaltene Lösung einer Behandlung mit Phenol unterwirft, um den Proteingehalt zu verringern und daß man die gewonnene wässerige Phase einer Behandlung zur Eliminierung von Nucleinsäure-Verunreinigungen

durch fraktionierte Ausfällung mit einem Alkohol in Gegenwart von calciumionen und anschließender Behandlung mit. Aktivkohle unterwirft.,

Verfahren zur Reinigung eines Polyosides von Streptococcus pneumoniae der Typen 2, 6A, 6B oder 19F, dadurch gekennzeichnet,

TISCH

daß man\3er Lyse, Klärung und Konzentration zu einer wässerigen Ausgangslösung einen Alkohol zufügt, der mit Wasser mischbar ist, in Mengen, die ausreichen, um die Verunreinigungen auszufällen, und daß man nach der Eliminierung dieser Verunreinigungen cP s Polyosid ausfällt und den Polyosid -Niederschlag erneut löst und die erhaltene Lösung einer Behandlung mit einem Phenol unterwirft, um den Proteingehalt zu verringern, wonach man die wässerige erhaltene Phase einer Behandlung zur Eliminierung der Nucleinsäure-Verunreinigungen durch fraktionierte Ausfällung mit einem Alkohol in Gegenwart von Calciumionen unterwirft.

Verfahren zur Reinigung eines Polyosides von Streptococcus pneumoniae der Typen 7F, 9N, 12A oder 14, dadurch gekennzeichnet,

daß nach der Lyse, Klärung und Konzentration der wässerigen Lösung des Polyosides ein Alkohol zugegeben wird, der mit Wasser mischbar ist, in einer zur Ausfällung der Verunreinigungen ausreichenden Menge und daß man nach der Eliminierung der Verunreinigungen zur Ausfällung des Polyosides man den Polyosid -Niederschlag erneut löst und die erhaltene Lösung einer Phenolbehandlung zur Verminderung des Proteingehalts unterwirft, wonach man die erhaltene wässerige Phase einer Behandlung mit Aktivkohle zur Eliminierung der Nucleinsäure-Verunreinigungen unterwirft.

Verfahren zur Reinigung eines Polyosides von Streptococcus pneumoniae vom Typ 3 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß man nach der Lyse, Klärung und Konzentration zu der wässerigen Losung des Polyosides einen Alkohol, der mit Wasser mischbar ist, zur direkten Ausfällung des Polyosides in ausreichender Menge zusetzt, daß man den erhaltenen Niederschlag erneut löst und die erhaltene Lösung einer Behandlung mit einem Phenol zur Verminderung des Proteingehalts unterwirft und danach die isolierte wässerige Phase einer Behandlung mit Aktivkohle zur Eliminierung der Nucleinsäure-Verunreinigungen unterwirft.

Verfahren zur Reinigung eines Polyosides von Streptococcus pneumoniae vom Typ 6B, dadurch gekennzeichnet, daß man nach der Lyse, Klärung und Konzentration zu der wässerigen Lösung des Polyosides in Gegenwart von Calciumionen einen Alkohol , der mit Wasser mischbar ist, in einer zur Ausfällung der Nucleinsäure-Verunreinigungen ausreichende Menge zusetzt, den Niederschlag eliminiert und neue Mengen des genannten Alkohols in einer zur Ausfällung des Polyosides ausreichenden Menge zufügt und den erhaltenen Polyosid -Niederschlag erneut löst und danach die erhaltene Lösung einer Behandlung mit einem Phenol zur Verminderung des Proteingehalts unterwirft.

Die Erfindung hat weiterhin ein Verfahren zur Reinigung zum Gegenstand, das ganz oder teilweise die Kennzeichen des Verfahrens aufweist, die in den als nicht-beschränkend aufzufassenden folgenden Beispielen beschrieben sind.

In den Beispielen ist das verwendete Natriumazetat ein Natriumazetat-Hydrat AcNa.3H₂O.

Die verwendete Essigsäure ist eine Essigsäure, die als Eisessig

bezeichnet wird . i _s-^

Die genannte physiologische Lösung leine wässerige von pyrogenen Substanzen befreite Lösung von Natriumchlorid in einer Menge von

In allgemeiner Weise wird zur Durchführung der Ausfäliungen durch Äthanol ein vorgekühltes Äthanol von -20 C verwendet, um eine merkliche Temperaturerhöhung bei der Lösung im Äthanol zu vermeiden . ..

Beispiel .1

Reinigung des Polyosides von Pneumococcen Typ 1

Stadium 1: Kultur
YSJLiSyJ: türen

1. Vorkultur: . .

Ausgehend von gefriergetrockneten Bakterien werden Roux-Flaschen von 21-Inhalt beimpft, die Gelose mit 5% Pferdeblut enthalten. Die Flaschen werden 16 Stunden bei 36° - 1°C inkubiert, vorzugsweise in feuchter Atmosphäre und unter Kohlendioxydgas.

2. Vorkultur:

Nach der Kontrolle der Reinheit der Beimpfung wird mit einer Suspension, die ausgehend von 6 Flaschen Gelose erhalten worden war, 6 Erlenmeierkolben von 500cm³ mit dem vollständigen Milieu gefüllt. Es wurde 2 bis 2 1/2 Stunden bei 36 + 1°C unter mäßigem Rühren kultiviert.

'20-

3, Vorkultur:

In diesem Stadium wurde ein Fermenteur mit einem Aufnahmegefäß verwendet, daß ein System enthielt, das ein leichtes Rühren in der Größenordnung von 50 U/Min, erlaubte. Nach der Reinheitskontrolle wurde die in den Erlenmeierkolben durchgeführte Kultur in 121 vollständigem frischen Milieu überführt und 3 bis 3 1/2 Stunden bei 36 + 1 C inkubiert.

Kultur

Es wurde ein Fermentiergefäß von einer Kapazität {Nutzinhalt) von 200 1 mit einem Vortex-Rührer verwendet.

Nach dem Sterilisieren des Milieus und dem Zugeben von Wachstumsfaktoren wurde mittels einer Spülvorrichtung Kohlendioxydgas eingeleitet, bis zu einer Stabilisierung beim pH-Wert 6,2 +0,2. Der pH-Wert wurde mittels 5n~Sodalösung auf 7,6 angehoben und mit 6% Inoculum geimpft. Die Kultur wurde auf 36 + 1°C unter Rühren mit 600 U/Min, unter Regulierung des pH-Werts auf 6,8 mit 5n-Sodalösung gehalten. Nach 8 Stunden Kultur wurde Glucose und Amoniumazetat in einer Menge von 12,50g bzw. 4g je Liter Milieu zugeführt.

Nach Ablauf von 16 Stunden Kulturdauer wurde die Reinheit und die Identität der Kultur geprüft und danach eine Lyse der Bak-

rjg —

terie durch Zugabe von 1% einer 10%-igen/uäsoxydcholatlösung vorgenommen.

Nach einer 1/2 Stunde Kontakt unter Rühren wurde geprüft, daß die Lyse vollständig war. Es wurden 0,5% wässeriges Phenol zugefügt und anschließend wurde zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde in einem vorher sterilisierten und gekühlten Tank gesammelt.

Stadium 2:

Vorreinigung des Pneumococcen-Polyosides Konzentration

Die überstehende Flüssigkeit der Kultur (3 χ 200 Liter), die wie vorher beschrieben hergestellt wurde, wurde eingeengt, mit 3 χ 60 Liter physiologischer Kochsalzlösung mit 0,5% Phenolgehalt gewaschen und erneut durch Ultrafiltration über Hohl fasern konzentriert, die einen Rückhaltewert, von Substanzen, mit einem Molekulargewicht oberhalb 10.000 aufwiesen (Typ Amicon oder Romicon).

Fraktionierte alkoholische Ausfällung

Die eingeengte Lösung (110 Liter) wurde mit Natriumazetat bis zu einer Endkonzentration von 5 Gew.-%/Volumen versetzt.

Der pH-Wert wird durch Essigsäure auf 5,8 eingestellt und langsam unter heftigem Rühren Äthanol zugeführt bis zu einer Endkonzentration des Alkohols zwischen 15 und 35% (vorzugsweise 20%). Das Rühren wurde 20 Minuten bei +4⁰C fortgesetzt und anschließend das Gemisch im Vakuum bei 35.000 U/Min, bei 4°C ultrazentrifugiert. ·

Die Konzentration von Natriumazetat in der überstehenden alkoholischen Flüssigkeit (153 Liter) wurde auf 5g% (Gewicht/Volumen) und der pH-Wert auf 5,8 mittels Eisessig eingestellt.

Es wurde unter Rühren entwässerter, auf -20⁰C vorgekühlter absoluter Alkohol zugegeben bis zu einer Endkonzentration an Alkohol in der Größenordnung von 40-65% (vorzugsweise 44,4%). Nach halbstündigem Rühren wurde der pH-Wert, sofern notwendig, auf 6,8 mit Essigsäure eingestellt. Das Gemisch wurde bei +4⁰C 16 Stunden stehengelassen und der gebildete Niederschlag wurde anschließend durch Dekantieren und Zentrifugieren bei 4.200 U/Min, und + 4°C gesammelt. Er bestand aus rohem Polyosid .

Stadium 3: Deproteinisierung

Das rohe Polyosid (1900g Naßgewicht) wurde mit etwa 40 Litern Natriumazetatpuffer, 0,3 Molar vom pH-Wert 6,9 in Lösung gebracht. Diese Lösung wurde mit 0,2 bis 0,4 Volumen (vorzugsweise 0,33 Volumen ) eines Gemisches von Phenol-Matnumazetatpuffer 0,3 Molar von pH-Wert 6,9 vermischt (1:0,4 Vol./Vol.).

Nach heftigem Rühren etwa 30 Sekunden mit einem Dispergiergerät wurde die erhaltene Emulsion einer Ultrazentrifugierung bei 35.000 U/Min, bei +14 C unterworfen. Die wässerige Phase, die das Polyosid enthielt, wurde erneut einer zweiten Phenolbehandlung unterworfen. Das Verfahren wurde, sofern notwendig, wiederholt, bis die wässerige Phase mindestens 5 g-% Proteine enthielt (allgemein reichen 2 Zyklen aus). Die Proteindosierung wurde mittels der Technik von Lowry et coll., Jj Biol. ehern'. 143, Seite 265 (1951) vorgenommen.

Die wässerige Phase wurde gegen entmineralisierte.s Wasser 16 Stunden bei +4⁰C dialysiert zur Eliminierung des restlichen Phenols.

Stadium 4: Eliminierung der Nucleinsäuren

a) Fraktionierte alkoholische Fällung ,

Die erhaltene dialysierte Lösung aus dem Stadium 3 (44,7 Liter) wurde langsam mit 6,4 Liter einer wässerigen Lösung von CaCl_?, 4M versetzt. Das Gemisch wurde 15 Minuten gerührt und anschließend langsam unter heftigem Rühren Äthanol zugesetzt, bis eine Endkonzentration zwischen 10 und 30 % (vorzugsweise 15%) Alkohol erhalten wurde. Das Rühren wurde 30 Minuten bei +4⁰C fortgesetzt und anschließend wurde das Gemisch im Vakuum bei 30.000 U/Min, und +4⁰C ultrazentrifugiert.

Die Äthanolkonzentration der überstehenden Flüssigkeit wurde unter heftigem Rühren auf einen Wert zwischen 40 und 60%, allgemein 4 4,4% angehoben.

- aar 21

Nach 30 Minuten Rühren wurde die Lösung 16 Stunden stehengelassen und anschlii
trifugiert.

und anschließend im Vakuum bei 15.000 U/Min, und +4 C zen-

Der erhaltene Niederschlag ( 430g Naßgewicht ) wurde mit 40 Litern einer wässerigen Natriumchloridlösung von 0,14m in Lösung gebracht .

k) Behandlung mit Aktivkohle

Es wurde schnell unter Rühren zu der Polyosid lösung ein Volumen Aktivkohle Norit bis zur Erzielung" einer Suspension von 20g-.% (Gewicht/Volumen) 3-ⁿ einer wässerigen Natriumchloridlösung von 0,14m vom pH-Wert, 6 ,,9 zugegeben, so daß eine Endkonzentration

zwischen . . . .

von Aktivkohle 0,5 und 8 g-% (vorzugsweise 3 g-%) erhalten wurde.

Die Mischung wurde 2 Minuten gerührt und anschließend 30 Minuten bei +4⁰C stehengelassen.

Die Kohle wurde anschließend durch Filtrieren entfernt.

Das Filtrat wurde gegen entmineralisiertes Wasser 16 Stunden bei +4⁰C dialysiert.

Stadium 5: Gewinnung von gereinigtem Polyosid

Zu der dialysierten Polyosid lösung (57 Liter) wurden 3420g Natriumazetat gegeben und der pH-Wert wurde auf 5,60 mittels Essigsäure eingestellt. Es wurde langsam unter heftigem Rühren ein Volumen entwässerter absoluter Äthanol, der auf -20⁰C vorgekühlt war, zugegeben, wobei die Menge ausreichte eine Alkohol-Endkonzentration zwischen 40 und 65% (vorzugsweise 44,4%) zu erzielen. Nach 30 Minuten Rühren wurde der pH-Wert, sofern notwendig, auf 6,80 eingestellt und die Lösung wurde bei +4°c stehengelassen, und zwar 16 Stunden. Das Polyosid wurde durch Dekantieren und Zentrifugieren bei 4200 U/Min· und +4°C gewonnen.

per Niederschlag wurde mit 2 Litern absolutem . auf

-ag.

-20°C vorgekühltem Äthanol in Suspension gebracht und anschließend wie oben zentrifugiert. Der Vorgang wurde einmal wiederholt. Es wurde anschließend 2mal hintereinander mit 3 χ 500cm³ auf -20⁰C vorgekühltem Azeton und 3 χ 500cm³ -20⁰C vorgekühltem Ethyläther gewaschen. Es wurde durch eine Glasfritte der Porösität 5 filtriert.

Der gewaschene und entwässerte Niederschlag wurde anschließend eine Nacht bei 0⁰C getrocknet.

Das dehydratisierte Polyosid wurde pulverisiert. Es wurden 80 g gereinigtesPolyosid Typ 1 erhalten.

DurchArbeiten in analoger Weise, wie oben beschrieben, kann man die Pneumococcen-Polyoside der Typen 10A, 15B, 17F, 20 und 22F reinigen.

Beispiel 2: Pneumococcen Polyosid Typ 4 Stadium 1: Kultur

Die experimentellen Fermentations- i_jnd Herstellungsbedingungen für die überstehende Flüssigkeit waren analog denjenigen, die im Beispiel 1 beschrieben wurden, mit der Ausnahme, daß die Regelung des pH-Wertes auf einen Wert 7,2 + 0,2 erfolgte.

Stadium 2; Vorreinigung Konzentration

Die überstehende Flüssigkeit der Kultur (600 Liter) wurde auf ein Volumen von etwa 50 Litern reduziert und es wurde durch Verdünnung und Konzentration ^mi"t 100 bis 200 Liter physiologischer Kochsalzlösung mit Phenolgehalt von 0,5% mehrere Male gewaschen Dieser Verfahrensschritt wird durch Filtrieren über Hohlfasern durchgeführt, die einen Rückhalte-Grenzwert entsprechend einem Molekulargewicht bei 10.000 hatten.

Die überstehende Flüssigkeit wird ebenfalls von Substanzen mit geringem Molekulargewicht befreit und erneut durch Ultrafiltration konzentriert. Der Konzentrationsfaktor hängt vom Volumen und der Viskosität der überstehenden Flüssigkeit zu Beginn ab und beträgt allgemein zwischen 4 und 15. -

Fraktionierte Alkoholfä'llung

Zur konzentrierten Lösung (47 Liter) wurde Natriumazetat zugegeben, bis eine Endkonzentration von 6% (Gewicht/Volumen) erreicht war. Der pH-Wert wurde auf 5,40 durch Essigsäure eingestellt und es wurden langsam unter heftigem Rühren ein Volumen Äthanol zugegeben,das ausreichte, eine Endkonzentration an Alkohol zwischen 30 und 50 % (vorzugsweise 37,5%) zu erzielen.

Nach 30 Minuten Rühren bei +4 C wurde die Mischung ultrazehtrifugiert.

Die Konzentration an Natriumazetat der überstehenden Flüssigkeit (73 Liter) wurde auf 7,5g-% angehoben und der 'pH-Wert auf 5,80 durch Essigsäure eingestellt. Es wurde Äthanol bis zu einer Endkonzentration an Alkohol in der Größenordnung von 60-80% (vorzugsweise 75%) zugegeben.

Nach einer 1/2 Stunde Rühren wurde der pH-Wert, sofern notwendig, auf 6,80 mit Essigsäure eingestellt und die Mischung wurde bei +4 C 16 bis 18 Stunden stehengelassen. Die überstehende Flüssigkeit wurde durch Dekantieren entfernt und der rohe Polyosid -Niederschlag durch Zentrifugieren isoliert.

Deproteinisierung

Das rohe Polyoside (530g Naßgewicht) wurde mittels etwa 20 Liter Natriumazetatpuffer, 0,3m vom pH-Wert 6,9 in Lösung gebracht.

Zu dieser Lösung wurden 0,2 bis 0,5 Volumen , allgemein 0,25 Volumsn eines Gemisches aus Phenol und Natriumazetatpuffer, 0,3m vom pH-Wert 6,9 (1:0,4 Vol./Vol.) zugegeben.

,heftigem
Nach ^^\ Rühren über 30 Sekunden mit einem Dispergiergerät wurde das Gemisch gemäß Beispiel 1 ultrazentrifugiert.

Die wässerige Phase, die das Polyosid enthielt, wurde einer zweiten Phenolbehandlung unterworfen. Dieser Prozess wurde, falls nötig, wiederholt, bis eine Lösung des Polyosides erhalten wurde, die mindestens 5g-% Proteine enthielt.

Die wässerige Phase wurde danach gegen entmineralisiertes Wasser 16 Stunden bei + 4°C dialysiert.

Stadium 4: Eliminierung der Nucleinsäuren a) Fraktionierte Alkoholfällung

Zu der dialysierten Lösung, die gemäß Stadium 3 erhalten worden war (18,5 Liter) wurden langsam 2,65 Liter einer Lösung vonC alciumchlorid 4m (CaCl₃) zugegeben. Nach 15 Minuten Rühren bei +4⁰C wurde langsam und unter heftigem Rühren Äthanol zugegeben, bis eine Endkonzentration zwischen 15 und 35% (vorzugsweise 25%) an Alkohol erhalten wurde. Das Rühren wurde 30 Minuten bei +4 C fortgesetzt und anschließend wurde das Gemisch im Vakuum bei 35000 U/Min, bei +4⁰C ultrazentrifugiert.

Die Konzentration der überstehenden Flüssigkeit an Äthanol wurde unter Rühren auf einen Wert zwischen 60 und 80%, allgemein 75%, angehoben. Nach einer halben Stunde Rühren wurde das Gemisch bei +4⁰C 16 Stunden stehengelassen-

Nach dem Dekantieren wurde der Niederschlag durch Zentrifugieren mit 4200 U/Min bei +4 C isoliert und anschließend in einer wässerigen Lösung von Natriumchlorid, 0,14m vom pH-Wert 6,9 (8 Liter) gelöst.

- 21-

b) Behandlung mit Aktivkohle

Zur Polyosid.-Lösung wurde schnell unter Rühren das notwendige Aktivkohlevolumen Norit zugegeben, das zur Erzielung einer Suspension mit 20g~% (Gewicht/Volumen) notwendig war, in einer Lösung von Natriumchlorid 0,14m vom pH-Wert 6,9 um eine Endkonzentration an Aktivkohle zwischen 0,1 und 5 g-% (vorzugsweise 0,5%) zu erzielen. Das GemischY/ Minuten gerührt und anschließend 30 Minuten bei +4 C stehengelassen.

Die Kohle wurde anschließend durch Filtrieren entfernt. Das FiI-trat wurde gegenientrnineralisiertes Wasser 16 Stunden bei +4 C dialysiert. .

Stadium 5: Herstellung von gereinigtem Polyoside

Zu der nach der Dialyse erhaltenen Lösung (11 Liter) wurden 1320g Natriumazetat gegeben und der pH-Wert auf 5,40 durch Zugabe von Essigsäure eingestellt. Es wurde langsam unter heftigem Rühren das Volumen von vorgekühltem entwässertem absolutem Alkohol von -20 C zugegeben, das ausreichte, um eine Alkoholkonzentration zwischen 60 und 80% (vorzugsweise 75%) zu erzielen. Nach 30 Minuten Rühren wurde der pH-Wert, falls notwendig, auf 6,80 - 0,1 eingestellt und die Lösung wurde bei +4 C 16 bis 18 Stunden stehengelassen. Das Polyoside wurde durch Dekantieren und Zentrifugieren isoliert. Es wurde durch manuelles Rühren in 1 Liter auf -20 C vorgekühltem absolutem Äthanol in Suspension gebracht und anschließend zentrifugiert— Diese Operation wurde einmal wiederholt. Beim folgenden Verfahrensschritt fanden zwei aufeinanderfolgende Waschen durch 3 χ 300cm³ Aceton, das auf -20 C vorgekühlt war, und 3 χ 300 cm³ Diäthyläther, der auf -20⁰C vorgekühlt war, durchgeführt. Es wurde über eine Glasfritte der Porösität 5 filtriert.

Der gewaschene und entwässerte Niederschlag wurde bei 0 C getrocknet und dann pulverisiert. Es wurden 64g gereinigtes PoIyosid vom Typ 4 erhalten.

- yr -

Beispiel 3 Pneumococcen Polyosid Typ 5 Stadium 1: Kultur

Die Kulturbedingungen und die Herstellung der überstehenden Flüssigkeit der Kultur waren identisch/den für die Herstellung des Pneumococcen-Polyosides Typ 4 verwendeten Zellen (Beispiel 2).

Stadium 2; Vorreinigung Konzentration

Die überstehende Flüssigkeit der Kultur (43 Liter) wurden konzentriert, mit 3 χ 12 Litern physiologischer Kochsalzlösung mit 0,5%. Phenolgehalt gewaschen und erneut durch Ultrafiltration derart konzentriert, daß die Substanzen mit einem Molekulargewicht über 10000 zurückgehalten wurden. Der Konzentrationsfaktor schwankte zwischen 4 und 10 je nach dem Anfangsvolumen und der Anfangsviskosität der überstehenden Flüssigkeit.

Fraktionierte Alkoholfällung

Die konzentrierte Lösung (8 Liter) wurde mit Natriumazetat versetzt bis zu einer Endkonzentration von 5g-% (Gewicht/Volumen). Der pH-Wert wurde auf 5,8 mittels Essigsäure eingestellt und es wurde langsam unter heftigem Rühren Äthanol bis zu e iner.-Ejngik on zentration zwischen 15 und 40 % zugesetzt. Das Rühren(fortgesetzt über 30 Minuten bei +4 C und anschließend wurde das Gemisch im Vakuum bei 35000 U/Min, bei +4°C ultrazentrifugiert.

Die Konzentration der überstehenden Alkoholflüssigkeit an Natriumazetat (11,1 Liter) wurde auf 7,5g-% erhöht und der pH-Wert auf 5,8 bis 6,0 durch Zugabe von Essigsäure eingestellt.

Es wurde unter Rühren ein Äthanolvolumen zugefügt, das es gestattete, das Polyosid vollständig auszufällen (Endkonzentration

3152821

zwischen 40 und 80 %). Nach einer halben Stunde Rühren wurde der pH-Wert, falls notwendig, auf 6,80 + 0,2 mit Eisessig eingestellt. Das Gemisch wurde bei +4 C etwa 24 Stunden stehengelassen. Der rohe Polyosid -Niederschlag wurde durch Dekantieren und Zentrifugieren isoliert.

Stadium 3: Deproteinisierung

Das rohe Polyosid (400 g Naßgewicht) wurde mit etwa 3 Liter Natriumazetatpuffer, 0,3m vom pH-Wert 6,9 in Lösung gebracht. Zu dieser Lösung wurden 0,2 bis 0,6 Volumina eines Gemisches aus Phenol und Azetatpuffer gemäß Beispiel 1 zugegeben. Nach heftigem Rühren über 30 Sekunden mit Hilfe eines Dispergiergeräts wurde die Dispersion einer Ultrazentrifugierung gemäß Beispiel 1 unterworfen. Die wässerige Phase, die das Polyosid enthielt, wurde erneut einer zweiten Phenolbehandlung unterworfen. Der Prozess wurde gegebenfails wiederholt, bis eine Polyosid lösung erhalten wurde, die mindestens 5 g-% der Proteine enthielt. Die wässerige Phase wurde gleichfalls zwischen entmineralisiertem Wasser über 16 Stunden bei +4 C dialysiert, um restliches Phenol zu entfernen.

Stadium 4: Eliminierung der Nucleinsäuren a) Fraktionierte Alkoholfällung

Zu der dialysierten Lösung, die gemäß Stadium 3 erhalten worden war (2,1 Liter) wurde langsam 0,3 Liter einer wässerigen Lösung von calciumchlorid CaCl₃ 4m zugegeben. Das Gemisch wurde 15 Minuten gerührt und danach langsam unter heftigem Rühren Äthanol zugegeben, bis eine Endkonzentration zwischen 10 und 35% erhalten wurde. Das Rühren wurde 30 Minuten bei +4° fortgesetzt und danach das Gemisch bei 10000 U/Min. 20 Minuten bei +4⁰C zentrifugiert .

Die überstehende Flüssigkeit wurde mit 2 Volumina Äthanol verdünnt, um das Polyosid vollständig auszufällen. Das Gemisch wurde etwa 24 Stunden bei +4⁰C stehengelassen und anschließend der Niederschlag durch Zentrifugieren isoliert.

b) Behandlung mit Aktivkohle

Der Niederschlag (2g) wurde mit 0,6 Liter Kochsalzpuffer NaCl 0,14m vom pH-Wert 6,9 + 0,2 in Lösung gebracht und anschließend schnell unter Rühren das notwendige Volumen einer Suspension von Aktivkohle Norit 20g-% (Gewicht/Volumen) ^-ⁿ einer Natriumchloridlösung von 0,14m und dem pH-Wert 6,9 zugefügt, um eine Endkonzentration an Aktivkohle zwischen 0,1 und 8g-% zu erhalten. Das Gemisch wurde 2 Minuten gerührt und anschließend 30 Minuten bei +4⁰C stehengelassen.

Die Aktivkohle wurde durch Zentrifugieren und/oder Filtrieren entfernt. Das Filtrat wurde gegen entmineralisiertes Wasser 16 Stunden bei +4 C dialysiert.

Stadium 5: Herstellung von gereinigtem Polyosid

Die Konzentration der dialysierten Lösung an Natriumazetat wurde auf einen Wert zwischen 6 und 12 g-% (Gewicht/Volumen) erhöht und der pH-Wert auf 5,4 bis 5,8 mittels Eisessig eingestellt.

Es wurde langsam unter heftigem Rühren ein Volumen von auf -20 C vorgekühltem dehydratisiertem absolutem Alkohol zugegeben, das gestattete, daß der wirksame Stoff vollständig ausgefällt wurde (Endkonzentration an Alkohol zwischen 40 und 80 %). Danach wurde eine halbe Stunde gerührt und der pH-Wert, falls notwendig, auf 6,80 mit Essigsäure eingestellt und die Lösung bei +4⁰C 24 bis 48 Stunden stehengelassen. Das Polyosid wurde durch Ultrazentrifugierung im Vakuum bei 35000 U/Min, isoliert.

em

Der Niederschlag wurde mit absolut/*auf -20 C vorgekühltem Äthanol in Suspension gebracht und anschließend bei 4200 U/Min, bei +4 C zentrifugiert.

Diese Verfahrensweise wurde einmal wiederholt und anschließend der Niederschlag hintereinander mit Aceton und Äther gewaschen, wie in den vorstehenden Beispielen beschrieben.

Der Niederschlag wurde danach gewaschen und dehydratisiert und getrocknet bei 0⁰C im Vakuum.

Das gereinigte Polyosid wurde pulverisiert.

Beispiel 4:
Pneumococcen-Polyoside Typ 12F

Stadium 1: Kultur

Die experimentellen Kulturbedingungen und Herstellungsbedingungen für die überstehende Flüssigkeit waren analog denjenigen, die in Beispiel 1 beschrieben wurden, mit der Ausnahme, daß der pH-Wert auf. 7,2 bis 7,4 mit 5n Sodalösung eingestellt wurde.

Stadium 2: Vorreinigung des Pneumococcen-Polyosides

Konzentration

Die überstehende Flüssigkeit der Kultur (2 χ 220 Liter), die wie oben beschrieben hergestellt worden war, wurde konzentriert, mit 2 χ 60 Liter physiologischer Kochsalzlösung mit 0,5% Phenolgehalt gewaschen und erneut konzentriert durch Ultrafiltration, wie dies im Beispiel 1, Stadium 2 beschrieben wurde.

Fraktionierte Alkoholfä 1.1 ungen

Zur konzentrierten Lösung (91 Liter) wurde Natriumazetat zugegeben, bis die Endkonzentration 5,2% (Gewicht/Volumen) betrug.

Der pH-Wert wurde durch Essigsäure auf 5,8 eingestellt und Äthanol bis zu einer Endkonzentration des Alkohols zwischen 15 und 35% (vorzugsweise 25%) zugefügt und anschließend zentrifugiert.

Die Konzentration an Natriumazetat (x 3H„0) in der überstehenden Flüssigkeit (131 Liter) wurde auf 6,9% (Gewicht/Volumen) erhöht

und der pH-Wert auf 5,8 durch Essigsäure eingestellt.

Es wurde Äthanol bis zu einer Endkonzentration an Alkohol in einer Größenordnung von 45 bis 75 % (vorzugsweise 56,5%) zugefügt. Nach einer halben Stunde Rühren wurde das Gemisch 16 Stunden bei +4⁰C stehengelassen. Der Niederschlag wurde erneut durch Zentrifugieren isoliert. Er stellte das rohe Polyosid dar.

Stadium 3: Deproteinisierung

Das rohe Polyosid (1100 g Naßgewicht) wurde mit etwa 50 Liter Natriumazetatpuffer 0,3m vom pH-Wert 6,9 in Lösung gebracht. Dieser Lösung wurde 0,1 bis 0,4 Volumen (vorzugsweise 0,25 Volumen) eines Gemisches aus Phenol und Acetatpuffer gemäß Beispiel 1 zugefügt.

Nach heftigem Rühren über 30 Sekunden mit Hilfe eines Dispergiergerätes wurde die Dispersion einer Ultrazentrifugierung unterworfen. Der Prozess wurde mehrere Male, falls erforderlich, wiederholt, bis eine wässerige Phase erhalten wurde, die mindestens 5g-% Proteine enthielt (allgemein sind 1 oder 2 Zyklen ausreichend) .

Die wässerige Phase wurde anschließend gegen entmineralisiertes Wasser dialysiert.

Stadium 4: Eliminierung der Nucleinsäuren a) Fraktionierte Alkoholfällung

Zur dialysierten Lösung ( 60,4 Liter ) wurden langsam 8,6 Liter einer wässerigen Lösung von Calciumchlorid 4m zugefügt. Das Gemisch wurde 15 Minuten gerührt und langsam unter heftigem Rühren Äthanol zugeführt bis die Endkonzentration zwischen 10 und 35% (vorzugsweise 20%) betrug. Das Rühren wurde 30 Minuten bei +4°C fortgesetzt und anschließend das Gemisch ultrazentrifugiert.

Die Athanolkonzentration der überstehenden Flüssigkeit wurde zwischen 45 und 70%, allgemein 56,5% eingestellt.

Nach 30 Minuten Rühren wurde die Lösung 16 Stunden bei +4 C stehengelassen und anschließend zentrifugiert. Der erhaltene Niederschlag wurde mit 50 Litern einer Lösung von Katriumchlorid, 0,1.4m,. vom pH-Wert 6,9 in Lösung gebracht.

b) Behandlung mit Aktivkohle

Es wird gemäß Beispiel 1, Stadium 4b gearbeitet mit einer Endkonzentration an Aktivkohle zwischen 0,5 und 8 g-% (vorzugsweise 2 g-%}.

Stadium__5_: Herstellung von gereinigtem Polyoside

Zu der dialysierten Polyosid lösung (70 Liter) wurden 6400g Na triumazetat zugegeben und der pH-Wert wurde auf 5,60 durch Essigsäure eingestellt. Es wurde langsam unter heftigem Rühren ein Äthanol volumen zugegeben, das ausreichte, eine Alkohol-Endkonzentration zwischen 45 und 75% (vorzugsweise 56,5%) zu erzielen. Nach 30 Minuten Rühren wurde der pH-Wert, falls notwendig, auf 6,80 eingestellt und die Lösung wurde 16 Stunden bei +4°C stehengelassen. Das Polyosid wurde durch Dekantieren und Zentrifugieren isoliert.

Der Niederschlag wurde mit 2 Liter auf -20⁰C vorgekühltem absolutem Äthanol in Suspension gebracht ui^^^chließend, wie oben angegeben, zentrifugiert. Der Prozess/einmal wiederholt. Es wurde** anschließend Wäscheil mit Aceton und Äthyläther durchgeführt, und danach eine Trocknung gemäß Beispiel 1 durchgeführt. Es wurden 76g gereinigtes Polyosid vom Typ 12 F erhalten.

Beispiel 5; Pneumococcen Polyosid Typ 18 C Stadium 1: Kultur

Die Versuchsbedingungen und Fermentationsbedingungen und die Herstellung der überstehenden Flüssigkeit der Kultur waren analog denjenigen, die in Beispiel 2 angewendet wurden.

Stadium 2: Vorreinigung des Pneumococcen-Polyosides Konzentration i ■ ■

Die überstehende Flüssigkeit der Kultur (400 Liter) wurde auf 35 Liter konzentriert, mit 3 χ 40 Liter physiologischer Kochsalzlösung mit 0,5% Phenolgehalt gewaschen und erneut auf 60 Liter durch Ultrafiltration über Amicon H10 P10 konzentriert.

Fraktionierte Alkoholfällung

Die konzentrierte Lösung wurde mit 3000g Natriumazetat versetzt und auf einen pH-Wert von 5,40 mit Essigsäure eingestellt.

In analoger Weise wie in Beispiel 1, Stadium 2 beschrieben, wurde Äthanol bis zu einer Endkonzentration von 20 bis 35% (vorzugsweise 28,5%) zugegeben und nach dem Ultrazentrifugieren wurde die Konzentration von Natriumazetat in der überstehenden Flüssigkeit auf 7,14 g-% erhöht und der pH-Wert auf 5,80 durch Essigsäure eingestellt und Äthanol bis zu einer Endkonzentration von 50 bis 80 % (vorzugsweise 63,6%) zugegeben.

Nach einer halben Stunde Rühren wurde der pH-Wert auf 6,8 mittels Essigsäure eingestellt. Der Niederschlag wurde anschließend durch Zentrifugieren isoliert. Er stellte das rohe Polyosid dar.

Stadium 3: Deproteinisierung

Das rohe Polyosid (1143g Naßgewicht) wurde mit 24 Litern Natriumazetatpufferlösung 0,3m vom pH-Wert 6,9 in Lösung gebracht. Zu dieser Lösung wurden 0,1 bis 0,5 Volum®*¹ (vorzugsweise 0,3 3 Volum⁶¹¹ ) des Gemisches von Phenol und Azetat gemäß Beispiel 1, Stadium 3 zugegeben und es wurde weiter gemäß Beispiel 1 gearbeitet. .

Stadium 4: Eliminierung der Nucleinsäuren a) Fraktionierte Alkoholfällung

Die dialysierte Lösung (26,1 Liter) wurde langsam unter Rühren mit 8,7 Liter einer Lösung von Calciumchlorid 2m versetzt. Es wurde anschließend eine doppelte Ausfällung mit Äthanol gemäß Beispiel I, Stadium 4a bis zu einer Konzentration des Alkohols von 15 bis 35 % (vorzugsweise 25%) und danach von 45 bis 75 %, allgemein 63,6 %, durchgeführt.

fr' Behandlung mit Aktivkohle

Der Niederschlag (400 g Naßgewicht) wurde in 40 Litern Natriumchlorid 0., 14m gelöst und gemäß Beispiel 1, Stadium 4b, weitergearbeitet, bis zu einer Endkonzentration an Aktivkohle zwischen 0,5 und 10 g-% (vorzugsweise 2g-%).

Stadium 5: Herstellung von gereinigtem Polyosid

Die dialysierte Lösung (51 Liter) wurde mit 2560g Natriumazetat versetzt und der pH-Wert auf 5,4 mit Essigsäure eingestellt. Es wurde Äthanol bis zu einer Endkonzentration von 50 bis 80% (vorzugsweise 63,6%) zugegeben. Nach 30 Minuten Rühren wurde der pH-Wert auf 6,6 bis 6,8 mit Essigsäure eingestellt und das Gemisch 16 Stunden bei +4 C stehengelassen. Der Niederschlag wurde durch Dekantieren und Zentrifugieren isoliert und erneut mit 2 Litern Äthanol, der vorgekühlt auf -20⁰C und entwässert war, in Suspension gebracht.

Nach dem Zentrifugieren wurde das Verfahren einmal wiederholt.

Es wurden anschließend Wäschen mit Aceton und Äthyläther gemäß Beispiel 1 durchgeführt und getrocknet.

Es wurden 108 g gereinigtes Polyosid vom Typ 18C erhalten.

Beispiel 6 Pneumococcen-Polyosid Typ 23 F

Stadium 1: Kultur

Die experimentellen Bedingungen und Fermentationsbedingungen und die Herstellung der überstehenden Flüssigkeit der Kultur waren identisch mit denjenigen von Beispiel 2.

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Stadium 2; Vorreinigung Konzentration

Die überstehende Flüssigkeit der Kultur (400 Liter) wurde auf ein Volumen von etwa 80 Liter konzentriert, mehrere Male durch Verdünnen und Konzentrieren mit 240 Litern physiologischer Kochsalzlösung mit 0,5% Phenolgehalt gewaschen und anschließend erneut konzentriert (Konzentrationsfaktor 5,6). Diese Operationen wurden durch Ultrafiltration über Amicon Typ H10 P10 und über Romicon PM10 durchgeführt.

Fraktionierte Alkoholfällunq

Zur konzentrierten Lösung (71,4 Liter) wurden 3570g Natriumazetat gegeben und der pH-Wert auf 5,4 bis 5,6 mit Essigsäure eingestellt.

In analoger Weise wie gemäß Beispiel 1, Stadium 2 wurde Äthanol zugefügt bis zu einer Endkonzentration von 17 bis 37 % (Vorzugs-

weise 28%) und nach dem Ultrazentrifugieren wurde die Konzentration von Natriumazetat in der überstehenden Flüssigkeit auf 7,20g-% erhöht und der pH-Wert auf 5,90 durch Essigsäure eingestellt und Äthanol zugegeben bis zu einer Endkonzentration von 50 bis 75% (vorzugsweise 6.0%).

Nach einer halben Stunde Rühren bei +4 C wurde der pH-Wert, falls es notwendig, auf 6,80 eingestellt. Der Niederschlag wurde anschließend durch Zentrifugieren isoliert. Es stellte das rohe Polypsid dar.

Stadium 3: Deproteinisierung

Das rohe Polyosid (500 g Naßgewicht) wurde in 42 Litern Natriumazetatpuffer 0,3m vom pH-Wert 6,9 in Lösung gebracht.

Zu dieser Lösung wurden 0,1 bis 0,5 Volumen (vorzugsweise 0,2 Volumen) eines Gemisches Phenol-Natriumazetatpuffer zugesetzt und weiter wie in Beispiel 1, Stadium 3 gearbeitet.

Stadium 4: Eliminierung der Nucleinsäuren

a) Fraktionierte Alkoholfällung

Es wurde analog Beispiel 1, Stadium 4a, gearbeitet.

Zu der nach der Dialyse erhaltenen Polyosid lösung (56 Liter) wurden 7,9 Liter Calciumchloridlösung 4m zugegeben. Es wurden anschließend die Fraktionierung mittels Äthanol mit einer Alkoholkonzentration von 10 bis 35% (vorzugsweise 25%) und danach auf 50 bis 75% (allgemein 60%) durchgeführt. Der Niederschlag (350 g Naßgewicht) wurde durch Zentrifugieren isoliert und anschließend in 36 Litern einer wässerigen Natriumchloridlösung 0,14m vom pH-Wert 6,9 gelöst.

b) Behandlung mit Aktivkohle

In analoger Weise, wie gemäß Beispiel 1, Stadium 4b, wurde die
erhaltene Lösung mit Aktivkohle bis zu einer Endkonzentration
zwischen 0,5 und 10g-% (vorzugsweise 1,5g-%) behandelt und danach die Kohle eliminiert und der Rückstand dialysiert.

Stadium 5; Herstellung von gereinigtem Polyosid

ⁿ ach der Dialyse erhaltenen Lösung (47,7 Liter) wurden 5700g Natriumazetat zugegeben und der pH-Wert auf 5,4 bis 5,6 mit Essigsäure eingestellt. Es wurde Äthanol bis zu einer Endkonzentration von 50 bis 70% (vorzugsweise 60%) zugegeben. Nach 30 Minuten Rühren wurde 16 bis 18 Stunden bei +4 C stehengelassen und
der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren isoliert und anschließend in 2 Liter auf -20 C vorgekühltem absolutem Äthanol in Suspension gebracht und zentrifugiert. Diese Operation wurde einmal wiederholt. Es wurden anschließend Wäschen mit Aceton und Äthyläther durchgeführt und anschließend getrocknet, wie in Beispiel
1 beschrieben.

Es wurden 100g gereinigtes Polyosid vom Typ 23F erhalten.

Beispiel 7 Pneumococcen-Polyosid Typ 25

Stadium 1: Kultur

Die Versuchsbedingungen und Bedingungen der Fermentation und der Herstellung der überstehenden Flüssigkeit war identisch mit denjenigen, die in Beispiel 1 beschrieben wurden, mit der Ausnahme, daß der pH-Wert 7,2 + 0,2 betrug.

Stadium 2: Vorreinigung
Konzentration

Die überstehende Flüssigkeit der Kultur (600 Liter) wurde auf
ein Volumen von etwa 100 Liter reduziert und mehrere Male durch

Verdünnen und Konzentrieren mit 200 bis 300 Liter physiologischer

uiurch Kochsalzlösung mit 0,5% Phenol gewaschen. Diese Operation wurde) Ultrafiltration über Hohlfasern mit einem Retentionsgrenzwert von etwa 10000 bezüglich des Molekulargewichts (Typ Amicon oder Romicon) bewerkstelligt.

Die überstehende Flüssigkeit wurde von Substanzen von geringerem Molekulargewicht befreit und auf 96 Liter durch Ultrafiltration konzentriert.

Fraktionierte Alkoholfa'llung

Zu der konzentrierten Lösung wurde Natriumazetat bis zu einer Endkonzentration von 5,6g-% zugegeben. Der pH-Wert wurde auf 5,70 mit Essigsäure eingestellt. In analoger Weise, wie gemäß Beispiel 1, wurde Äthanol bis zu einer Konzentration von 20 bis 35% (vorzugsweise 28,5%) zugegeben und nach dem Ultrazentrifugieren wurde die Konzentration von Natriumazetat in der überstehenden Flüssigkeit auf 7,14g-% erhöht und der pH-Wert auf 5,80 mittels Essigsäure eingestellt und Äthanol bis zu einer Endkonzentration in einer Größenordnung von 40 bis 70 % (vorzugsweise 62%) zugefügt.

Der rohe Polyosid -Niederschlag wurde anschließend durch Ultrazentrif ugieren isoliert.

Stadium 3: Deproteinisierung

Das rohe Polyosid (335g Naßgewicht) wurde mit 48 Litern Natriumazetatpuffer 0,3m von pH-Wert 6,9 in Lösung gebracht.

Zu dieser Lösung wurden 0,2 bis 0,5 Volumen (allgemein 0,29 Volumen) der Mischung Phenol und Natriumazetatpuffer zugegeben und weiter gemäß Beispiel 1, Stadium 3 gearbeitet.

— 2i%~ —

Stadium 4; Eliminierung von Nucleinsäuren

a ) Fraktionierte Alkoholfällung , ,_;.,,,

Es wurde in analoger Weise, wie gemäß Beispiel 1, Stadium 4a, gearbeitet.

Die im Stadium 3 erhaltene dialysierte Lösung (55,7 Liter) wurde langsam mit 8 Litern Calciumchlorid 4m versetzt. Anschließend wurde eine doppelte Ausfällung mit Äthanol bis zu einer Konzentration von 15 bis 35% (vorzugsweise. 30%) und danach 40 bis 70% (allgemein 62%) durchgeführt. Nach dem Dekantieren wurde der Niederschlag durch Zentrifugieren isoliert und anschließend in einer wässerigen Lösung von Natriumchlorid 0,14m vom pH-Wert 6,9 (20 Liter) gelöst.

b) Behandlung mit Aktivkohle

Die in analoger Weise, wie gemäß Beispiel 1, Stadium 4b, wurde die erhaltene Lösung mit Aktivkohle in einer Menge zwischen 0,1 und 8%-g (vorzugsweise 2 g-%) versetzt und anschließend die Kohle eliminiert und dialysiert.

Stadium 5; Herstellung von gereinigtem Polyosid

Zu der nach der Dialyse erhaltenen Lösung (27,76 Liter) wurden 2760g Natriumazetat zugefügt und der pH-Wert auf 5,80 mit Essigsäure eingestellt. Es wurde Äthanol bis zu einer Konzentration von 40 bis 70 % (vorzugsweise 62%) zugefügt. Nach 30 Minuten Rühren wurde der pH-Wert auf 6,80 + 0,1 eingestellt und es wurde 16 bis 18 Stunden bei +4 C stehengelassen . Der Niederschlag wurde durch Dekantieren und Zentrifugieren isoliert und mit 1 Liter auf -20°C vorgekühltem absolutem Äthanol erneut in Suspension gebracht und anschließend zentrifugiert. Diose Operation wurde einmal wiederholt. Es wurden danach aufeinanderfolgende Waschen mit Aceton und Äthyläther vorgenommen und danach getrocknet, wie in Bei-

spiel 1 beschrieben. Es wurden 35g gereinigtes Polyosid vom Typ 25 erhalten.

Beispiel 8
Pneumococcen-Polyosid Typ 2

Stadium 1: Kultur

Die experimentellen Bedingungen und Fermentationsbedingungen waren diejenigen, die in Beispiel 2 beschrieben worden sind. Nach dem Sterilisieren durch Phenol und der Lyse der Keime durch Natriumdesosycholat würden die Zellrückstände durch Zentrifugieren eliminiert.

Stadium 2: Vorreinigung
Konzentration

Die überstehende Flüssigkeit der Kultur (200 Liter) wurde auf 40 Liter konzentriert, mit physiologischer Kochsalzlösung mit 0,5 % Phenol gewaschen und anschließend erneut auf 34,5 Liter konzentriert. Diese Operationen wurden durch Ultrafiltration über Hohlfasern vom Typ Romicon bewerkstelligt, die einen Rückhalte-Grenzwert für Substanzen bis zum Molekulargewicht über 10000 hatten.

Fraktionierte Alkohol fällung '

Zur konzentrierten Lösung wurde unter Rühren Natriumazetat bis zu einer Endkonzentration von 7,5 g-% zugefügt. Es wurde der pH-Wert auf 5,4 durch Essigsäure eingestellt. In analoger Weise, wie gemäß Beispiel 1, Stadium 2, wurde Äthanol bis zu einer Konzentration von .10 bis 30 % (vorzugsweise 18 %) zugefügt und nach dem Ultrazentrifugieren bis zu einer Endkonzentration von 45 bis 65 % (vorzugsweise 55,5 %) Äthanolgehalt.

Der rohe Polyosid -Niederschlag wurde anschließend durch Dekantieren und Zentrifugieren isoliert. .

Der rohe Polyosid -Niederschlag wurde anschließend durch Zentrifugieren isoliert.

Stadium 3: Deproteinisierung

Das rohe Polyosid (469 g Naßgewicht) wurde in 16 Litern Natriumazetatpuffer 0,3m vom pH-Wert 6,9 in Lösung gebracht. Zu dieser Lösung wurde 0,1 bis 0,5 Volumen (vorzugsweise 0,25 Volumen) einer Mischung aus Phenol und Natriumazetatpuffer gegeben und gemäß Beispiel 1, Stadium 3 gearbeitet.

Stadium 4; Eliminierung der Nucleinsäuren

Es wurde analog Beispiel 1, Stadium 4a gearbeitet.

Zu der gemäß Stadium 3 erhaltenen dialysierten Lösung (18,2 Liter) wurden langsam 6 Liter wässeriger Calciumchloridlosung 2m zugegeben. Nach dem Rühren wurde Äthanol (Endkonzentration zwischen 15 und 35%, allgemein 25%) zugegeben und danach die Mischung ultrazentrifugiert und zur überstehenden Flüssigkeit Äthanol bis zu einer Endkonzentration von 40 bis 70 % (vorzugsweise 60%) zugegeben. Der Niederschlag wurde durch Dekantieren und Zentrifugieren isoliert.

Stadium 5: Herstellung von gereinigtem Polyosid

Der Niederschlag wurde in zwei Liter auf -20 C vorgekühltem absolutem Äthanol in Suspension gebracht und anschließend, wie oben angegeben, zentrifugiert.

Der Prozess wurde einmal wiederholt. Es wurden 2 Waschen mit Aceton und mit Äthyläther durchgeführt und der Niederschlag gemäß Beispiel 1, Stadium 5 getrocknet.

Es wurden 119 g gereinigtes Polyoside vom Typ 6A erhalten.

315 26

-ItS-

Beispiel JO

Typ 1 9 F

Stadium 1: Kultur

Die experimentellen Bedingungen und die Ferrnentationsbedingungen waren diejenigen, die in Beispiel 2.verwendet wurden. Nach der Sterilisation durch Phenol und der Lyse der Keime durch Natriumdesoxycholat wurden die Zellreste durch Zentrifugieren eliminiert.

Stadium 2: Vorreinigung
Konzentration

Die überstehende Flüssigkeit der Kultur (400 Liter) wurde auf 50 Liter konzentriert und mit physiologischer Kochsalzlösung mit 0,5% Phenol gewaschen und danach erneut auf 40,3 Liter konzentriert. Diese Operationen wurden durch Ultrafiltration über Hohlfasern vom Typ Romicon bewerkstelligt, die einen Rückhalte-Grenzwert für Substanzen von einem Molekulargewicht über 10000 hatten.

Fraktionierte Alkoholfä'llung

Zu der konzentrierten Lösung wurde unter Rühren Natriumazetat bis zu einer Endkonzentration von 5 g-% zugegeben. Der pH-Wert wurde auf 5,4 mittels Essigsäure eingestellt. In analoger Weise wie gemäß Beispiel 1, Stadium 2 wurde Äthanol bis zu einer Endkonzentration 15 bis 35% (vorzugsweise 27%) zugefügt und nach dem UItrazentrifugieren wurde die Konzentration von Natriumazetat in der überstehenden Flüssigkeit, die gewonnen wurde, auf 7,3 g-% erhöht und Äthanol bis zu einer Endkonzentration von 55 bis 75% (vorzugsweise 63,5%) zugegeben, wonach der rohe Polyosid Niederschlag erneut durch Zentrifugieren isoliert wurde.

Stadium 3: Deproteinisierung

Das rohe Polyosid (427 g Naßgewicht) wurde mittels 16 Litern

Beispiel J_0
Pneumococcen-Polyosid Typ 19F

Stadium 1: Kultur

Die experimentellen Bedingungen und die Fermentationsbedingungen waren diejenigen, die in Beispiel 2 verwendet wurden. Nach der Sterilisation durch Phenol und der Lyse der Keime durch Natriumdesoxycholat wurden die Zellreste durch Zentrifugieren eliminiert.

Stadium 2: Vorreinigung

Konzentration

Fraktionierte Alkoholf ä'llung

Zu der konzentrierten Lösung wurde unter Rühren Natriumazetat bis zu einer Endkonzentration von 5 g-% zugegeben. Der pH-Wert wurde auf 5,4 mittels Essigsäure eingestellt. In analoger Weise wie gemäß Beispiel 1, Stadium 2 wurde Äthanol bis zu einer Endkonzentration 15 bis 35% (vorzugsweise 27%) zugefügt und nach dem Ultrazentrifugieren wurde die Konzentration von Natriumazetat in der überstehenden Flüssigkeit, die gewonnen wurde, auf 7,3 g-% erhöht und Äthanol bis zu einer Endkonzentration von 55 bis 75% (vorzugsweise 63,5%) zugegeben, wonach der rohe Polyosid Niederschlag erneut durch Zentrifugieren isoliert wurde.

Stadium 3: Deproteinisierung

Das rohe Polyosid (427 g Naßgewicht) wurde mittels 16 Litern

Stadium 3; Deproteinisierung

Stadium 4: Eliminierung der Nucleinsäuren

Es wurde analog Beispiel 1, Stadium 4a gearbeitet.

Stadium 5: Herstellung von gereinigtem Polyosid

Es wurden 119 g gereinigtes Polyoside vom Typ 6A erhalten.

Natriumazetatpuffer 0,3m, vom pH-Wert 6,9 in Lösung gebracht. Zu dieser Lösung wurden 0,1 bis 0,6 Volumen (vorzugsweise 0,25 Volumen) der Mischung von Phenol und Natriumazetatpuffer zugefügt und wie in Beispiel 1, Stadium 3 beschrieben weitergearbeitet

Stadium 4: Eliminierung der Nucleinsäuren

Es wurde analog Beispiel 1, Stadium 4a gearbeitet.

Zu der in Stadium 3 erhaltenen Lösung (18,9 Liter) wurden 2,7 Liter einer Lösung von Calciumchlorid 4m zugefügt. Es wurde Äthanol zugesetzt (Endkonzentration an Alkohol zwischen 15 und 35%, allgemein, 25%) und nach dem Ultrazentrifugieren wurde zur überstehenden Flüssigkeit Äthanol zugefügt bis zu einer Endkonzentration von 55 bis 75% ( vorzugsweise 63,5% ) und der Niederschlag wurde anschließend durch Dekantieren und Zentrifugieren isoliert.

Stadium 5: Herstellung von gereinigtem Polyoside

Der Niederschlag wurde in drei Litern auf -20⁰C vorgekühltem absolutem Äthanol in Suspension gebracht und wie oben angegeben zentrifugiert. Die Operation wurde einmal wiederholt. Es wurden anschließend Waschen mit Aceton und mit Äthyläther durchgeführt und danach getrocknet, wie in Beispiel 1, Stadium 5 beschrieben.

Es wurden 120 g gereinigtes Polyosid vom Typ 19F erhalten.

Beispiel 11 Pneumococcen-Polyosid Typ 7F

Stadium 1; Kultur

Die experimentellen Bedingungen sind diejenigen, wie sie in Beispiel 1 , Stadium 1 beschrieben wurden ausgenommenTdes pH-^vertes (6,2 bis 6,8) und die Zugabe von Glucose (Zugaben über 2 Std. 30 Min.)

Stadium 2: Vorreinigung des Pneurnocoecen-Polyosides

Die überstehende Flüssigkeit der Kultur (200 Liter) wurde konzentriert, mit physiologischer Kochsalzlösung mit 0,5% Phenol gewaschen und erneut konzentriert durch Ultrafiltration über Hohlfasern, die einen Rückhalte-Grenzwert für Substanzen von einem Molekulargewicht über 10000 hatten (Typ Amicon oder Romicon). Der Konzentrationsfaktor schwankte zwischen 4 und 10 je nach dem Volumen und der Viskosität der überstehenden Flüssigkeit nach dem Ultrafiltrieren.

Fraktionierte Alkoholfällung

Zu der konzentrierten Lösung (41 Liter) wurde Natriumazetat bis zu einer Endkonzentration von 7g-% zugefügt. Der pH-Wert wurde auf 5,8 mittels Essigsäure eingestellt. In analoger Weise wie gemäß Beispiel 1, Stadium 2 wurde Äthanol bis zu einer Konzentration von 35 bis 55 % (vorzugsweise 45%) zugefügt und nach dem Ultrazentrifugieren wurde die Konzentration der überstehenden Flüssigkeit an Natriumazetat auf 8,2 g-% erhöht und der pH-Wert auf 6,8 mittels Essigsäure eingestellt und anschließend Äthanol bis zu einer Konzentration in der Größenordnung von 60 bis 80 % (vorzugsweise 75%) zugefügt. Nach einer halben Stunde Rühren wurde der pH-Wert auf 6,8 mittels Eisessig eingestellt. Die Mischung wurde 16 Stunden bei +4°C stehengelassen und der Niederschlag des rohen Polyosides wurde anschließend durch Zentrifugieren isoliert.

Deproteinisierung

Das rohe Polyosid (110g Naßgewicht) wurde mit etwa 30 Liter Natriumazetatpuffer 0,3m, pH-Wert 6,9 in Lösung gebracht. Zu dieser Lösung wurde 0,1 bis 0,4 Volumen (vorzugsweise 0,15 Volumen) einer Mischung von Phenol und Natriumazetatpuffer 0,3m vom pH-Wert 6,9 (1:0,4 Volumen/Volumen) zugegeben.

Nach sanftem Rühren (manuell oder mit Magnetrührer) etwa 10 Minuten lang, um eine Emulsion zu erzeugen, wurde die phenolische Lösung ultrazentrifugiert. Die wässerige Phase, die das Polyosid enthält^wurde, falls notwendig, einer zweiten Phenolbehandlung unterworfen, wobei jedoch allgemein ein Zyklus ausreicht.

Die wässerige Phasie wurde gegen entmineralisiertes Wasser 16 Stunden bei +4⁰C zur Entfernung von restlichem Phenol dialysiert.

Stadium 4; Eliminjierung der Nucleinsäuren

Es wurde schnell, unter Rühren zu der dialysierten Polyosidlösung (36 Liter) das Volumen Aktivkohle Norit, das erforderlich war, eine Suspension mit 20g-% (Gewicht/Volumen) zu bilden, in Natriumchloridlösung 0,14m vom pH-Wert 6,9 oder in destilliertem, von pyrogenen Substanzen befreitem Wasser zugegeben_fvum eine Endkonzentration von Aktivkohle zwischen 0,1 und 8 g-% (vorzugsweise 1,5 g-%) zu erhalten.

Das Gemisch wurde 2 Minuten gerührt und 30 Minuten bei +4 C stehengelassen.

Anschließend wurde die Aktivkohle durch Filtrieren entfernt.

Stadium 5: Herstellung von gereinigtem Polyosid

Zu der dialysierten Polyosidlösung wurde Natriumazetat zugegeben, bis eine Konzentration von 15 g-% erreicht war, und der pH-Wert auf 6,00 mittels Essigsäure eingestellt. Es wurde langsam unter heftigem Rühren ein Volumen auf -20 C vorgekühlter entwässerter absoluter Äthanol, der ausreichte, um eine Endkonzentration an Alkohol von 60 bis 80 % (vorzugsweise 75%) zu erhalten, zugegeben. Nach 30 Minuten Rühren wurde der pH-Wert auf 6,9 eingestellt und die Lösung 16 Stunden bei +4 C stehengelassen. Das Polyosid wurde durch Zentrifugieren isoliert. Der Niederschlag wurde mit einem

- VS-

Liter βια^,^-20^ο0 vorgekühltem absolutem Äthanol in Suspension gebracht/T wie oben erwähnt, zentrifugiert.

Das Verfahren wurde einmal wiederholt. Es wurde anschließend mit Aceton und mit Äthyläther gewaschen und danach wie in Beispiel 1, Stadium 5 angegeben, getrocknet.

Es wurden 20g gereinigtes Polyosid vom Typ 7F erhalten.

Beispiel 12

Pneumococcen-Polyosid Typ 9N

1 ; Kultur

Die experimentellen Bedingungen waren diejenigen, die in Beispiel 1, Stadium 2 beschrieben wurden. Nach der Sterilisation mittels Phenol und Lyse der Keime durch Natriumdesoiy cholat wurden die Zellreste durch Zentrifugieren eliminiert.

Stadium 2: Vorreinigung
Konzentration

Die überstehende Flüssigkeit der Kultur (400 Liter) wurde auf 50 Liter konzentriert, mit physiologischer Kochsalzlösung mit 0,5% Phenol gewaschen und anschließend erneut auf 42 Liter konzentriert. Diese Operationen wurden durch Ultrafiltration über Hohlfasern vom Typ Romicon durchgeführt, welche einen Rückhalte-Grenzwert für Substanzen mit einem Molekulargewicht oberhalb 10000 hatten.

Fraktionierte Alkoholfällung

Zur konzentrierten Lösung wurde unter Rühren Natriumazetat bis zu einer Endkonzentration von 6 g-% zugegeben. Der pH-Wert wurde auf 5,4 mittels Essigsäure eingestellt. Es wurde gemäß Beispiel 1, Stadium 2 gearbeitet und Äthanol bis zu einer Konzentration von 20 bis 40 % (vorzugsweise 33%) zugegeben und anschließend

nach dem Ultrazentrifugieren wurde die Konzentration an Natriumazetat der überstehenden Flüssigkeit auf 6 g-% angehoben und Äthanol bis zu einer Endkonzentration von 50 bis 65% (vorzugsweise 55,5%) zugefügt.

Der rohe Polyosid-Niederschlag wurde anschließend durch Dekantieren und Zentrifugieren isoliert.

Stadium 3; Deproteinisierung

Das rohe Polyosid (660g Naßgewicht) wurde mit 24 Litern Natriumazetatpufferlösung, 0,3m vom pH-Wert 6,9 in Lösung gebracht. Zu dieser Lösung wurde 0,1 bis 0,6 Volumen (vorzugsweise 0,3 Volumen) eines Gemisches aus Phenol und Natriumazetatpuffer zugefügt und weiter gemäß Beispiel 1, Stadium 3 gearbeitet.

Stadium 4; Eliminierung der Nucleinsäuren

Es wurde eine Aktivkohlebehandlung durchgeführt und anschließend dialysiert, wobei in analoger Weise wie gemäß Beispiel 1, Stadium 4b gearbeitet wurde.

Zu der dialysierten Polyosid-Lösung (30 Liter), die gemäß Stadium 3 erhalten wurde, wurde eine Suspension von Aktivkohle Norit bis zu einer Endkonzentration an Aktivkohle zwischen 0,2 und 8 g-% (vorzugsweise 3,33%) zugefügt.

Stadium 5: Herstellung von gereinigtem Polyosid

Zu der gemäß Stadium 4 erhaltenen Lösung (38 Liter) wurden 3420g Natriumazetat zugegeben und der pH-Wert auf 5,4 mittels Essigsäure eingestellt. Es wurde langsam unter heftigem Rühren Äthanol bis zu einer Endkonzentration von 50 bis 65 % (vorzugsweise 55,5 %) zugegeben.

Der Niederschlag wurde anschließend durch Dekantieren und Zentri-

fugieren isoliert und mit 2 Litern absolutem auf -20 C
vorgekühltem Äthanol erneut in Suspension gebracht und anschließend zentrifugiert. Diese Operation wurde einmal wiederholt. Anschließend wurde mit Aceton und Äthylather gewaschen und danach der Niederschlag getrocknet gemäß Eieispiel 1, Stadium 5.

Es wurden 68g gereinigtes Polyosid vom Typ 9N erhalten.

Beispiel 13
Pneumococcen-Poiyosid Typ 12A

Stadium 1: Kultur

Die experimentellen Bedingungen waren diejenigen von Beispiel

Stadium 2: Vorreinigung des Pneumococcen-Polyosides

Konzentration

Die überstehende Flüssigkeit der Kultur (4.0 Liter) wurde auf 10 Liter konzentriert, danach mit physiologischer Kochsalzlösung
mit 0,5% Phenolgehalt gewaschen und erneut auf 9 Liter durch Ultrafiltration mittels des Systems Amicon, das 5 Kolonnen H10 PIO enthielt, erneut konzentriert.

Fraktionierte Alkoholfällung

Zu der konzentrierten Lösung wurden 468g Natriumazetat gegeben
und der pH-Wert auf 5,8 mit Essigsäure eingestellt. Es wurde gemäß Beispiel 1 gearbeitet und Äthanol bis zu einer Konzentration von 15 bis 35 % (vorzugsweise 25%) zugefügt und danach nach dem Ultrazentrifugieren wurde die Konzentration der überstehenden
Flüssigkeit an Natriumazetat auf 7,1g-% angehoben und der pH-Wert auf 5,8 mittels Essigsäure eingestellt, und Äthanol bis zu einer Endkonzentration von 45 bis 75 % (vorzugsweise 58,5 %) zugegeben.

-52-

Der rohe Polyösid-Niederschlag wurde anschließend durch Zentrifugieren isoliert.

Stadium 3: Deproteinisierung

Der vorstehend erhaltene Niederschlag (174g Naßgewicht) wurde mit 8 Litern Natriumazetatpufferlösung, 0,3m vom pH-Wert 6,9 in Lösung gebracht.

Zu dieser Lösung wurde 0,1 bis 0,5 Volumen (vorzugsweise 0,5 Volumen) eines kalten Gemisches aus Phenol und Azetat gemäß Beispiel 1, Stadium 3 zugefügt und es wurde weiter wie gemäß Beispiel 1 gearbeitet.

Stadium 4; Eliminierung der Nucleinsäuren

Es wurde analog Beispiel 1, Stadium 4b gearbeitet und eine Aktivkohlebehandlung mit anschließender Dialyse durchgeführt.

Zur in Stadium 3 erhaltenen dialysierten Lösung (7,6 Litern) wurde ein^eSuspension von Aktivkohle Norit zugefügt, um eine Endkonzentration an Aktivkohle zwischen 1 und 7g-% (vorzugsweise 3g-%) zu erhalten.

Stadium 5; Herstellung des gereinigten Polyosides

Die in Stadium 4 erhaltene dialysierte Lösung (9 Liter) wurde mit 450g Natriumazetat versetzt und der pH-Wert auf 5,60 mittels Essigsäure eingestellt. Es wurde Äthanol bis zu einer Konzentration von 45 bis 75 % (vorzugsweise 66,6 %) zugegeben und es wurde der pH-Wert, sofern notwendig, auf 6,6 bis 6,8 eingestellt. Das Polyosid wurde anschließend durch Zentrifugieren gesammelt und mit 1 Liter absolutem auf -20⁰C vorgekühltem Äthanol erneut in Suspension gebracht und zentrifugiert. Anschließend mit Aceton und mit Äthyläther gewaschen und der Niederschlag danach getrocknet, wie in Beispiel !,Stadium 5 beschrieben.

6"

Es wurden 2g gereinigtes Polyosid vom Typ 12A erhalten. Das Polyosid 12A, das in dieser Weise erhalten wurde, unterscheidet sich vom Typ 12F durch die Abwesenheit von Galactose in der chemischen Zusammensetzung.

Die quantitative Bestimmung von Hexosaminen und der Ösen (Glucose, Galactose) wird nach durchgeführter Hydrolyse bzw. durch colorimetrische Analyse gemäß dem Verfahren von G.Ashwell "Methods in Enzymology" _3 (1957) Seiten 95-97, S.P.Colowick & N.O.Kaplan, Eds. Academic Press, N.Y. und durch spectrophotometrische Analyse der reduzierten Coenzyme (NADH und NADPH), die nach enzymatischer Einwirkung von Galactose-Dehydrogenase auf die Menge Galactose und das pluri-enzymatische System Hexokinase-Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase auf die Gesamtmenge Glucose erhalten wurden. Das Polyosid Typ 12A, das erhalten wurde, enthielt 33 bis 38% Hexosarnine und 23 bis 28 % Glucose (auf das Gewicht bezogen) .

Pneumococcen-Polyosid Typ 14
Stadium 1: Kultur

Die exeperimentellen Bedingungen und die Fermentationsbedingungen waren analog denjenigen gemäß Beispiel 2, Stadium 1.

Stadium 2: Vorreinigung des Pneumococcen-Polyosides Konzentration .

Die überstehende Flüssigkeit der Kultur (30 Liter) wurde konzentriert, mit physiologischer Kochsalzlösung mit 0,5% Phenolgehalt gewaschen und erneut auf ein Volumen von 9 Liter konzentriert durch Ultrafiltration über Hohlfasern, die einen Rückhalte-Grenzwert für Substanzen vom Molekulargewicht über 10000 (Typ Amicon H10 P10) hatten.

Fraktionierte Alkohol fällung

Zu der konzentrierten Lösung wurde Natriumazetat bis zu einer

Endkonzentration von 5g-% gegeben. Der pH-Wert wurde auf 5,4 mittels Essigsäure eingestellt. In analoger Weise wie gemäß BeJ^_n spiel 1, Stadium 2 wurde Äthanol bis zu einer Konzentration!15 bis 35% (vorzugsweise 20%) zugegeben und nach dem Ultrazentrifugieren wurde die Konzentration der überstehenden Flüssigkeit an Natriumazetat auf 8 g-% angehoben und der pH-Wert auf 5,8 eingestellt und danach Äthanol bis zu einer Endkonzentration von 50 bis 70 % (vorzugsweise 60 %) zugegeben. Nach einer halben Stunde Rühre wurde der pH-Wert auf 6,6 bis 6,8 eingestellt. Das Gemisch wurde 16 Stunden bei +4 C stehengelassen und der rohe Polyosid-Niederschlag wurde anschließend durch Zentrifugieren isoliert.

Stadium 3: Deproteinisierung

Das rohe Polyosid (110g Naßgewicht) wurde mit etwa 4 Liter Natriur azetatpufferlösung 0,3m vom pH-Wert 6,9 in Lösung gebracht. Zu dieser Lösung wurde 0,1 bis 0,5 Volumen (vorzugsweise 0,3 Volumen) eines Gemisches aus Phenol und Natriumazetatpuffer zugesetzt und weiter gemäß Beispiel 1, Stadium 3 gearbeitet.

Stadium 4: Eliminierung der Nucleinsäuren

Es wurde analog Beispiel 1, Stadium 4b gearbeitet und mit Aktivkohle behandelt und anschließend eine Dialyse durchgeführt. Hierzu wurde die Konzentration an Natriumchlorid der erhaltenen Lösung nach der Analyse gemäß Stadium 3 (4,3 Liter) auf 0,14m gebracht und anschließend wurde eine Suspension von Aktivkohle Norit von 20g-% zugefügt um eine Endkonzentration an Aktivkohle zwischen 0,1 und 8 g-% (vorzugsweise 3,6g-%) zu erhalten.

Stadium 5: Herstellung von gereinigtem Polyosid

Zu der dialysierten Lösung (6 Liter), die gemäß Stadium 4 erhalten wurde, wurde Natriumazetat bis zu einer Konzentration von 10g-% zugefügt und der pH-Wert auf 5> 8 mittels Essigsäure eingestellt. Es wurde Äthanol bis zu einer Konzentration von 50 bis

70% (vorzugsweise 60%) zugefügt. Nach 30 Minuten Rühren wurde der pH-Wert auf 6,8 eingestellt. Der Niederschlag wurde anschließend durch Zentrifugieren isoliert und mit 1 Liter absolutem auf -20⁰C vorgekühltem Äthanol erneut in Suspension gebracht und anschließend zentrifugiert.

Das Verfahren wurde einmal wiederholt. Es wurde danach mit Aceton und Äthyläther gewaschen und anschließend der Niederschlag gemäß Beispiel 1, Stadium 5 getrocknet.

Es wurden 4,4g gereinigtes Polyosid vom Typ 14 erhalten.

Beispiel 15
Pneumococcen-Polyosid Typ 3

Stadium 1: Kultur

Die experimentellen Bedingungen waren analog denjenigen, die in Beispiel 1, Stadium 1 beschrieben wurden, mit der Ausnahme, daß der pH-Wert auf ungefähr 7,2 eingestellt wurde.

Stadium 2: Vorreinigung

Konzentration

Die überstehende Flüssigkeit der Kultur (200 Liter) wurden auf ein Volumen von etwa 80 Liter reduziert und mehrmals mit physiologischer Kochsalzlösung mit 0,5 % Phenol gewaschen. Diese Operation wurde durch Ultrafiltrieren über Hohlfasern mit einem Rückhalte-Grenzwert von ungefähr 10000 bewerkstelligt. Die überstehende Flüssigkeit wurde von Substanzen mit geringerem Molekulargewicht befreit und danach auf 50 Liter konzentriert.

Direkte Älkoholfällung

Zu der konzentrierten Lösung wurden 2500g Natriumazetat zugefügt und der pH-Wert auf 5,4 mittels Essigsäure eingestellt. Es wurde langsam unter Rühren ein ausreichendes Äthanolvolumen zugefügt,

um eine Endkonzentration von 15 bis 40 % (vorzugsweise 33,3%) zu erhalten.

Nach 30 Minuten Rühren wurde das Gemisch 16 Stunden bei +4 C stehengelassen. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren isoliert. Der isolierte Niederschlag wurde mit 60 Litern Natriumazetatpuffer, 0,37m vom pH-Wert 5,4 in Lösung gebracht und anschließend erneut durch Zugabe von 0,15 bis 0,7 Volumen (vorzugsweise 0,5 Volumen) Äthanol erneut ausgefällt. Nach 30 Minuten Rühren und 16 Stunden 3 tehenlas^serlbei +4 C wurde der rohe PoIyosid-Niederschlag durch Zentrifugieren isoliert.

Stadium 3: Deproteinisierung

Das rohe Polyosid (2180g Naßgewicht) wurde in 85 Liter Natriumazetatpufferlösung 0,3m vom pH-Wert 6,9 gelöst. Zu dieser Lösung ^- wurde
10,1 bis 0,5 Volumen (vorzugsweise 0,2 Volumen) eines Gemisches von Phenol und Natriumazetatpuffer zugefügt und gemäß Beispiel 1, Stadium 3 gearbeitet. . ■

Stadium 4; Eliminierung der Nucleinsäuren

Wie gemäß Beispiel 1, Stadium 4b wurde die Behandlung mit Aktivkohle und anschließender Dialyse durchgeführt. Hierzu wurde die Konzentration an Natriumchlorid der Lösung, die in Stadium 3 erhalten wurde, nach der Dialyse (115 Liter) auf 0,14m angehoben und die Suspension von Aktivkohle Norit zugefügt, um eine Endkonzentration an Aktivkohle von zwischen 0,1 und 8g-% (vorzugsweise 4g-%) zu erhalten.

Stadium .5: Herstellung von gereinigtem Polyosid

Die dialysierte Lösung (139 Liter), die gemäß Stadium 4 erhalten wurde, wurde mit 6950g Natriumazetat versetzt und der pH-Wert auf 5,4 mit Essigsäure eingestellt. Es wurde Äthanol bis zu einer Konzentration von 15 bis 40 % (vorzugsweise 33,3%) zugefügt. Der Niederschlag wurde anschließend durch Dekantieren und Zentrifugieren isoliert und erneut mittels 10 Litern absolutem auf -20 C vorgekühltem Äthanol in Lösung gebracht.

Nach dem Zentrifugieren wurde diese Arbeitsweise einmal wiederholt.

Es wurde weiter mit Aceton und Äthylather gewaschen und danach
gemäß Beispiel 1, Stadium 5 getrocknet.

Es wurden 2 3 5g gereinigtes Polyosid vom Typ 3 erhalten.

Beispiel ]_6

Pneumococcen-Polyosid Typ 8

Stadium 1: Kultur

Die experimentellen Bedingungen waren analog denjenigen, die im Beispiel 1, Stadium 1 beschrieben wurden, mit der Ausnahme, daß der pH-Wert auf etwa 7,2 eingestellt wurde'.

'Siä-dium 2: Vorreinigung
Konzentration

Die überstehende Flüssigkeit der Kultur (400 Liter) wurde auf
ein Volumen von etwa 60 Liter vermindert und es wurde mit physiologischer Kochsalzlösung mit 0,5% Phenol gewaschen. Die Konzentration wurde durch Ultrafiltration über Hohlfasern mit einem
Rückhalte-Grenzwert von etwa 10000 bewirkt. Die überstehende Flüssigkeit wurde von Substanzen mit kleinerem Molekulargewicht befreit, und erneut auf 51,5 Liter konzentriert.

Direkte Alkohol fällung

Zu der konzentrierten Lösung (51,5 Liter) wurden 3090g Natriumazetat gegeben und der pH-Wert auf 5,4 mit Essigsäure eingestellt Es wurde langsam unter Rühren ein Volumen Äthanol zugefügt, das ausreichte, eine Endkonzentration von 18 bis 40 % (vorzugsweise 33,3 %) zu ergeben.

Nach 30 Minuten Rühren wurde das Gemisch 16 Stunden bei +4⁰C

stehengelassen. Der rohe Polyosid-Niederschlag wurde durch Dekantieren und Zentrifugieren isoliert.

Stadium 3; Deproteinisierung

Das rohe Polyosid (2260 g Naßgewicht) wurde in 32 Liter Natriumazetatpufferlösung 0,3m vom pH-Wert 6,9 gelöst. Zu dieser Lösung wurden 0,1 bis 0,5 Volumen (vorzugsweise 0,25volumen) eines Gemisches aus Phenol und Natriumazetatpuffer zugefügt und weiter gemäß Beispiel 1, Stadium 3 gearbeitet.

Es wurde nach der Dialyse das Polyosid aus der wässerigen Phase durch Äthanolfällung in Gegenwart von 1Og-% Natriumazetat (pH-Wert 5,4) extrahiert mit 0,15 bis 0,7 Volumen (vorzugsweise 0,37 Volumen) absolutem entwässertem und auf -20⁰C vorgekühltem Äthanol.

Stadium 4: Eliminierung der Nucleinsäuren

Der Niederschlag von Stdium 3 (1400 g Naßgewicht) wurde mit 27 Litern Natriumazetatpufferlösung 0,14m vom pH-Wert 6,9 in Lösung gebracht. Mit dieser Lösung wurde eine Aktivkohlebehandlung durchgeführt und anschließend eine Dialyse gemäß Beispiel 1, Stadium 4b durchgeführt und hierzu eine Suspension von Aktivkohle Norit verwendet, um eine Endkonzentration an Aktivkohle zwischen 1 und 10 g-% (vorzugsweise 10g-%) zu erzielen.

Stadium 5; Herstellung von gereinigtem Polyosid

Die in Stadium 4 erhaltene Lösung nach der Dialyse (27 Liter) wurde mit 1350g Natriumazetat versetzt und der pH-Wert auf 5,4 bis 5,6 mit Essigsäure eingestellt. Es wurde Äthanol bis zu einer Konzentration von 18 bis 40% (vorzugsweise 33,3 %) zugefügt und nach dem Zentrifugieren wurde der Niederschlag erneut in 2 Litern absolutem auf -20°C vorgekühltem Äthanol in Suspension gebracht und anschließend zentrifugiert. Diese Arbeitsweise wurde einmal wiederholt. Es wurde anschließend mit Aceton und Äthyläther gewaschen und danach wie in Beispiel 1, Stadium 5 beschrieben getrocknet.

Es wurden 52g gereinigtes Polyosid vom Typ 8 erhalten.

Beijsp iel 1 7

Pneumococcen-Polyosid Typ 6B

Stadium 1: Kultur

Die experimentellen Bedingungen und die Bedingungen der Fermentation waren analog denjenigen von Beispiel 9, Stadium 1, mit der Ausnahme, daß die Dauer der Kultur auf 42 Stunden verlängert wurde. Die Kultur wurde danach durch Phenol sterilisert und die

vollständigen

Keime und die Zellreste wurden durch Zentrifugieren entfernt . :..'·.■■■

Stadium 2; Vorreinigung

Konzentration

Die überstehende Flüssigkeit der Kultur (40 Liter) wurde auf 10 Liter konzentriert, mit physiologischer Kochsalzlösung mit 0,5% Phenol gewaschen und erneut auf 8,2 Liter konzentriert. Die Operationen wurden durch Ultrafiltration über Hohlfasern vom Typ Amicon H10-P10 durchgeführt.

Fraktionierte Alkoholfällung

Zur konzentrierten Lösung wurde Calciumazetat bis zu einer Endkonzentration von 5g~% zugegeben und der pH-Wert auf 5,4 mit Essigsäure eingestellt. In analoger Weise, wie gemäß Beispiel 1, Stadium 5 wurde Äthanol bis zu einer Konzentration von 10 bis 35% (vorzugsweise 25 %) zugefügt und nach dem Ultrazentrifugieren wurde zur überstehenden Flüssigkeit das Volumen Äthanol zugefügt, das erforderlich war, um eine vollständige Ausfällung des PoIyosides zu erzielen (Endkonzentration an Äthanol zwischen 45 und 70 %, allgemein 50%). Der rohe Polyosid-Niederschlag wurde anschließend durch Dekantieren und Zentrifugieren isoliert.

Stadium 3; Deproteinisierung

Das rohe Polyosid (40g Naßgewicht) wurde mit 4 Litern Natriumazetatpuf ferlösung, 0,3m vom pH-Wert 6,9 erneut in Lösung gebracht. Zu dieser Lösung wurde 0,1 bis 0,5 Volumen (vorzugsweise Ο,5 Volumen) eines Gemisches aus Phenol und Natriumazetatpuffer, 0,3m vom pH-Wert 6,9 zugegeben (1:0,4 Volumen/Volumen). Nach hef tigem Rühren über 30 Sekunden mit einem Dispergiergerät wurde das Gemisch ultrazentrifugiert.

Die obere wässerige Phase wurde isoliert und danach Behandlung mit kaltem Phenol unterworfen. Das Verfahren^insgesamt dreimal wiederholt.

Die wässerige Phase wurde gegen entmineralisiertes Wasser 18 Stunden bei +4⁰C dialysiert.

Stadium 4: Herstellung von gereinigtem Polyosid

Die gemäß Stadium 3 erhaltene dialysierte Lösung (5,2 Liter) wurde 260g Natriumazetat versetzt und der pH-Wert wurde mit Essigsäure auf 5,4 eingestellt. Es wurde langsam unter Rühren ein Volumen Äthanol zugefügt, das ausreichte, eine vollständige Ausfällung des Polyosides zu erreichen (Endkonzentration an Alkohol zwischen 45 und 70 % (vorzugsweise 55,5 %).

Der Niederschlag wurde anschließend durch Zentrifugieren isoliert und danach mit 1 Liter absolutem auf -20⁰C vorgekühltem Äthanol erneut in Suspension gebracht und zentrifugiert. Diese Arbeitsweise wurde einmal wiederholt. Anschließend wurde mit Aceton und Äthyläther gewaschen und danach gemäß Beispiel 1, Stadium 5 getrocknet.

Es wurden 9g gereinigtes Polyosid vom Typ 6B erhalten.

Bemerkung:

Das Pneumococcen-Polyosid Typ 6B kann in gleicher Weise gereinigt

werden, wie dies nach dem im Beispiel 9 beschrieben ist.

P 2-i

Dieses Beispiel erläutert die endgültige Reinigung von Polyosid 7F durch Ausfällung mit Amoniumsulfat.

Die Ausgangslösung, bei welcher die Ausfällung mit Amoniumsulfat durchgeführt wird, ist die dialysierte Lösung, die nach der Behandlung mit Aktivkohle erhalten wurde, nämlich die gemäß Beispiel 1 1 , Stadium 4 erhaltene Lösung.

Die Konzentration an NaCl wurde auf 0,85g-% erhöht.

Der pH-Wert dieser Lösung wurde auf 6,5 mit verdünnter Essigsäure eingestellt und langsam unter Rühren das Volumen Amoniumsulfatlösung zugefügt, das erforderlich ist, eine gesättigte Lösung zu erzielen oder eine Menge von (NH.)„SO. , die ausreichte, um eine Endkonzentration an (NH₄)^SO.. zwischen 30 und 80 g-% (vorzugsweise 74g~%) zu erzielen.

Das Gemisch wurde 30 Minuten bis 4 Stunden stehengelassen und anschließend mit 15000 U/Min. 30 Minuten ultrazentrifugiert.

Der Niederschlag wurde isoliert und mit etwa 10 Liter destilliertem von pyrogenen Substanzen befreitem Wasser in Lösung gebracht. Die Restsalze wurden durch Dialyse oder durch Diafiltration eliminiert.

Der Wirkstoff wurde anschließend durch direkte Ausfällung mit Äthanol in Gegenwart von Natriumsalzen, wie in Beispiel 11, Stadium 5 beschrieben, isoliert.

Beispiel 19

Herstellung und Verwendung einer Vaccine eii>Pi.^l_einer Vaccine - Z usa mme η s e t ζ u ng

- gereinigtes Streptococcus pneumoniae-

Polyosid 50 Mikrogramm

von jedem der 14 Typen: 1, 2, 3, 4, 6A, 7F, 8, 9N, .12F, 14, 18C, 19F, 23F, 25

- isotonische^s gepuffertes Lösungsmittel auf 0,5 ml

- Phenol (Konservierungsmittel) maximal 1,25mg

Das isotinische gepufferte Lösungsmittel hatte folgende Zusammensetzung:

- Natriumchlorid i 4,15mg

- Dinatriumhydrogenphosphat (Na₂HPO₄.2H₂O) 0,065mg

- Mononatriumdihydrogenphosphat ;

(NaH₂PO₄.2H₂O) ! \ 0,023mg

- Wasser für Injektionszwecke 0,5ml

Verabreichungsweise und -art

Subcutane oder intramuskuläre Anwendung.

Dosierungsbeispiele

Erwachsene: 25 bis 100ug an jedem Polyosid in einer .Einzelinjektion Kinder: 10 bis 50ug jedes Polyosides in einer oder mehreren Injektionen im Intervall von mehreren Wochen.

Therapeutische Indikationen

Verhütung von Pneumococcen-Infektionen und epidemologischer Funktion. Dies betrifft insbesondere

- Personen über 50 Jahren ganz allgemein,

- chronische Bronchitis, Krankheiten des respiratorischen Systems und durch Tabakmißbrauch

- Patienten, die durch eine chronische Krankheit geschwächt sind (Herzinsuffizienz, Diabetes, Leberinsuffizienz oder Niereninsuffizienz, Visceral-Krebserkrankungen oder chronischer Alkoholismus)

- Patienten mit operativ entfernter Milz

- Kinder mit homozygoter Drepanocytose

- Personen, die einer Pneumococcen-Meningitis aufgrund von Schädeltraumata mit Hirnhaut-Knochenfisteln oder einer chronischen Otitis ausgesetzt waren

- wahrscheinlich Kinder, die recidiVen Otitis-Infektionen ausgesetzt waren oder nephrotische Syndrome aufweisen.

Kontra-Indikationen

Aus Gründen der Vorsicht ist es zweckmässig, die Antipneumococcen· Vaccine nicht bei schwangeren Frauen zu verwenden.

Dies trifft auch für Personen zu, die eine akute sich entwickelnde Infektion haben, insbesondere Pneumococcen-Infektion, bei Kindern von mindestens 2 Jahren, die nicht regelmäßig gegen mehrere Serotypen immunisiert waren, .die eine Pneumococcen-Infektion in diesem Alter hervorrufen können und für Personen, die eine Schwächung des Immunsystems aufweisen (chemotherapeutisch-behandelter Krebs) und insbesondere Agranulocytose oder eine Meduläre Aplasie. haben.

Claims

Patentansprüche

von 1. Verfahren zur Reinigung eines Polyosides/streptococcus pneumoniae, dadurch gekennzeichnet, daß als Ausgangsprodukt eine wässerige Lösung des Polyosides verwendet wird, die mindestens 20% Protein-Verunreinigungen, bezogen auf das trockene Produkt, enthalt .und durch Lyse einer Kultur von Streptococcus pneumoniae, Klärung und Konzentration des Polyosides erhalten worden ist, daß zur Verminderung des Proteingehalts 5 bis 50 Vol.-% Phenol bei einer Temperatur von 5 bis 30⁰C zugegeben werden, dar® gerührt wird anschließend die wässerige Phase abgetrennt und isoliert wird und daß, falls notwendig, die Behandlung mit Phenol wiederholt wird, bis der Proteingehalt der wässerigen Phase unterhalb eines vorbestimmten Grenzwerts liegt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei eine
beitet wird.

daß bei einer Temperatur von etwa 10 bis 20 C gear·
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Phenol in Form eines Gemisches Phenol-Wasser angesetzt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß eine Mischung eingesetzt wird, die aus Phenol besteht, in welchem Wasser gelöst ist.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Behandlung mit Phenol bei einem pH-Wert von 6,9 + 0,5 durchgeführt wird.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das als Polyosid-Ausgangslösung eine gepufferte Lösung verwendet wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Phenol in Form eines Gemisches von Phenol und Pufferlösung zugefügt wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß 10 bis 60 Vol.-% des Gemisches zugesetzt werden.
9. Verfahren nach jedem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Grenzwert einem Proteingehalt von 5 Gew.-% entspricht.
10. Verfahren nach jedem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die isolierte wässerige Phase einer Dialyse zur Eliminierung von restlichem Phenol unterworfen wird.
■11. Verfahren nach jedem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zu der Polyosidlösung vorzugsweise in Gegenwart von .alciumionen ein Alkohol zugesetzt wird, der mit Wasser in ausreichender Menge mischbar ist, daß die Nucleinsäure-Verunreinigungen ausgefällt werden, daß der Niederschlag anschließend eliminiert und vom Alkohol eine neue ausreichende Menge zur Ausfällung des Polyosides zugesetzt wird.
12, Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die fraktionierte Ausfällung mittels Alkohol in Gegenwart von Kalciumionen nach der Behandlung mit Phenol durchgeführt wird.
13. Verfahren nach jedem der Ansprüche 11 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß als Alkohol Äthanol verwendet wird .
14. Verfahren nach jedem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die fraktionierte Ausfällung mit Alkohol bei einer Temperatur von etwa 0 bis +15⁰C durchgeführt wird.
15. Verfahren nach jedem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Alkohol bis zu einer Konzentration von 10 bis 35 % (Volumen/Volumen) zur Ausfällung der Nucleinsäure-Verunreinigungen zugesetzt wird und anschließend erneut Alkohol zur überstehenden Flüssigkeit bis zur vollständigen Ausfällung des Polyosides zugefügt wird.
16. Verfahren nach jedem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß in Gegenwart von ^alciumionen eine" Molarität von 0,25 bis 2m gearbeitet wird.
17. Verfahren nach jedem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung, die gereinigt werden soll, einer Behandlung mit Aktivkohle in ausreichender Menge, um den größeren Teil der Nuclein säure-Verunreinigungen zu eliminieren, zugefΰ γι_Γ± und daß anschließend die Aktivkohle entfernt wird.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß 0,1 bis 12% (Gewicht/Volumen) der Aktivkohle zugefügt werden.
19. Verfahren nach jedem der Ansprüche 11 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß bei einem Nucleinsäuregehalt des Polyosides oberhalb 1 oder 2 Gew.-% nach der fraktionierten Fällung mittels Alkohol der Polyosid-Niederschlag erneut in Lösung gebracht wird und einer Behandlung mit Aktivkohle gemäß jedem der Ansprüche 17 und 18 unterworfen wird.
20. Verfahren nach jedem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß nach der Lyse, Klärung und Konzentration zu der wässerigen zu reinigenden Polyosidlösung ein Alkohol zugesetzt wird, der mit Wasser mischbar ist, um das Polyösid auszufällen und anschließend der Niederschlag erneut in Lösung gebracht wird, um die wässerige Ausgangslösung des Polyosides zu erhalten.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß der Alkohol in Mengen zugesetzt wird, die ausreichen, die vor der Ausfällung des Polyosides niederzuschlagenden Verunreinigungen auszufällen.
22. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß das Polyösid direkt durch Zugabe einer ausreichenden Alkoholmenge, ausgefällt wird.
23. Verfahren nach jedem der Ansprüche 20 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausfällung des Alkohols in Gegenwart eines gelösten Salzes durchgeführt wird .
24. Verfahren nach jedem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Konzentration durch Ultrafiltration durchgeführt wird, wobei der Konzentrationsfaktor etwa 4 bis 10 beträgt.
25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Ultrafiltration mit Hilfe von Membranen durchgeführt wird, welche Substanzen vom Molekulargewicht über 10000 zurückhalten.
26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Membranen Substanzen vom Molekulargewicht oberhalb 50000 oder oberhalb 100000 zurückhalten.
27. Verfahren nach jedem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultur von Streptococcus pneumoniae in einem halbsynthetischen Milieu durchgeführt wird, das Proteine enthält und das nicht durch Inert gas oder Kohlendioxydgas belüftet wird und der pH-Wert und die Zugabe von Metabolitten automatisch eingestellt werden.
28. Verfahren zur Reinigung eines Polyosides von Streptococcus pneumoniae der Typen 1, 4, 5, 1OA, 1 2F, 15B, 17F, 18C, 20, 22F, 23F oder 25 nach den Ansprüchen 12, 19 und 23, dadurch gekennzeichnet, daß nach der Lyse, Klärung und Konzentration die wässerige Ausgangslösung mit einem Alkohol versetzt wird, der mit Wasser mischbar ist, in einer Menge, die ausreicht, die Verunreinigungen auszufällen, daß nach der Elimihierung der Verunreinigungen das Pölyosid damit ausgefällt wird, daß der Niederschlag des Polyosides erneut gelöst wird und daß mit der erhaltenen Lösung eine Behandlung mit einem Phenol zur Reduktion des Proteingehalts durchgeführt und daß mit der wässerigen isolierten Phase eine Behandlung zur Eliminierung der Nucleinsäure-Verunreinigungen durch fraktionierte Ausfällung mit einem Alkohol in Gegenwart von Calciumionen durchgeführt wird und anschließend eine Behandlung mit Aktivkohle durchgeführt wird.
29. Verfahren zur Reinigung eines Polyosides von Streptococcus, pneumoniae der Typen 2, 6A, 6B oder 19F nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß nach der Lyse, Klärung und Konzentration die genannte _wird wässerige Ausgangslösung mit einem Alkohol versetzt/T der mit Wasser mischbar ist, in ausreichender Menge, um die Verunreinigungen auszufällen und daß nach der Eliminierung der Verunreinigungen das Pölyosid

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ausgefällt wird und daß der Niederschlag des PoIyosides erneut gelöst wird und die erhaltene Lösung einer Behandlung mit Phenol zur Verminderung des Proteingehalts unterworfen wird und anschließend die isolierte wässerige Phase einer Behandlung zur Eliminierung der Nucleinsäure-Verunreinigungen durch fraktionierte Ausfällung mit einem Alkohol in Gegenwart von ^alciumionen unterworfen wird.
30. Verfahren zur Reinigung eines Polyosides von Streptococcus pneumoniae der Typen 7F, 9N, 12A oder nach jedem der Ansprüche 1 bis 10 und nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß nach der Lyse, Klärung und Konzentration die Polyosidlösung mit einem Alkohol versetzt wird, der mit Wasser mischbar

^: ist, in einer Menge, die ausreicht, die Verunreinigungen auszufällen und daß nach der Eliminierung der Verunreinigungen das Polyosid ausgefällt wird und daß der Niederschlag des Polyosides erneut gelöst wird und die erhaltene Lösung einer Behandlung mit einem Phenol zur Verminderung des Proteingehalts unterworfen wird und danach die isolierte wässerige Phase einer Behandlung zur Eliminierung der' Nucleinsäure-Verunreinigungen mittels Aktivkohle unterworfen wird.
31. Verfahren zur Reinigung eines Polyosides von Streptococcus pneumoniae der Typen 3 oder 8 nach jedem der Ansprüche 1 bis 10 und nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß nach der Lyse, Klärung und Konzentration die wässerige Polyosidlösung mit ein .Mu Alkohol versetzt wird, der mit Wasser mischbar ist, in einer Menge, die ausreicht, um direkt das Polyosid auszufällen, daß der Niederschlag des Polyosides erneut gelöst wird und die erhaltene

Lösung einer Behandlung mit einem Phenol zur Verminderung des Proteingehalts unterworfen wird und daß danach die isolierte wässerige Phase einer Behandlung zur Eliminierung der Nucleinsäure-Verun-.,,,....„■·■ reinigungen durch Aktivkohle unterworfen wird.
32. Verfahren zur Reinigung eines Polyosides von Streptococcus pneumoniae des Typs 6B nach jedem der Ansprüche 1 bis 10 und nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß nach der Lyse, Klärung und Konzentration die wässerige Polyosidlosung in Gegenwart von calciumionen mit einem Alkohol, der mit Wasser mischbar ist, in ausreichender Menge zur Ausfällung der Nucleinsäure-Verunreinigungen versetzt wird, der Niederschlag eliminiert wird und erneut der Alkohol in einer Menge zugesetzt wird, die ausreicht, das Polyosid auszufällen, daß der Niederschlag von Polyosid erneut gelöst wird und anschließend die erhaltene Lösung einer Behandlung mit einem Phenol zur Verminderung des Proteingehalts unterworfen wird .
33. Pneumococcen-Vaccine, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens ein Polyosid enthält, das nach dem Verfahren von jedem der vorangehenden Ansprüche gereinigt worden ist.