CA1103155A - Vaccins acellulaires perfectionnes contenant des polysaccharides capsulaires - Google Patents
Vaccins acellulaires perfectionnes contenant des polysaccharides capsulairesInfo
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Abstract
PR?CIS La présente invention concerne un procédé de préparation de vaccins perfectionnés. Il s'agit d'un procédé destiné à potentialiser l'action des vaccins contenant à titre de principe vaccinal des ARN ou des ribosomes d'au moins une souche bactérienne à capsules polysaccharidiques, dans lequel on ajoute à ce vaccin les polysaccharides capsulaires extraits d'au moins une desdites souches bactériennes à capsules polysaccharidiques. Le procédé est utile notamment pour la préparation de vaccins pour la prévention des maladies respiratoires.
Description
1 ~ ~ 3 ~ L 5; S
La présente invention, réalisée au Centre d'Immunologie et de Biologie Pierre Fabre, concerne des vaccins acellulaires perfectionnées.
Il est déj3 connu, par les brevets francais 73 43957, 75 10252 et 76 24124, de préparer des vaccins accellulaires composés de ribosomes ou d'acides ribonucléiques (ARN) ribosomaux associés à des polysaccharides membranaires et adjuvés par des glycoprotéines membranaires.
Mais, il est maintenant apparu que, pour certaines bactéries porteuses de capsules, l'action antigénique et donc vaccinale de leurs ribosomes ou ARN était fortement potentialisée par les polysaccharides capsulaires correspondant auxdites ~
bactéries. ; ~;
C'est pourquoi la présente invention concerne un pro- ~ -cédé pour potentialiser l'action des vaccins acellulaires contenant à titre de principe vaccinal des ARN or des r?bosomes-d'au mcoins une souche bactériene à capsules polysaccharidiques, dans lequel on ajoute à ce vaccin les polysaccharides capsulaires extraits d'au moins une desdites souches bactériennes à capsules -i ` polysaccharidiques.
Ce procédé est, en particulier, utilisable pour potentialiser les vaccins a base d'ARN-ou de ribosomes de pneumocoques tels les Diplococcus, en particulier D. pneumoniae ~ `
:. :
ainsi que de Klebsiella pneumQniae et d'Hemophil~us inFluenzae.
Bien entendu, les compositions des vaccins acellulaires ~ -sont connues et décrites dans les brevets fran~cais cités ;
précédemment.
En particulier, ces vaccins peuvent contenir, outre les ARN ou les ribosomes qui constituent la fraction vaccinale : ;- .
proprement dite, des glycoprotéines membra?aires à titre d'adjvant et/ou des polysaccharides membranaires. ;
ba quantité de polysaccharides capsulaires ajoutée peut varier dans de larges limites mais sera, de préf~rence, - 1 ~
~ 3~
comprise dans un rapport en poids de 2/1 à 1/2 par rapport aux ARN ou ribosomes des bactéries capsulaires du vaccin.
Il n'est pas indispensable, pour obtenir un vaccin potentialisé selon l'invention, d'introduire des polysaccharides capsulaires correspondant à toutes les souches de bactéries cap-sulaires utilisées dans le vaccin, il suffit qu'il comprenne au moins les polysaccharides capsulairles extraits d'une des souches capsulées dont les ARN ou les ribosomes sont utilisés dans le vaccin. : :
On donne ci-après des exemples de vaccins perfectionnés selon la présente invention:
I) Vaccin anti-pneumococcique Ribosomes de Diplococcus pneumoniae 1 2 ;ug Ribosomes de Diplococcus pneumoniae ll 2 ~g Ribosomes de Diplococcus pneumoniae lll 2 ~9 Polysaccharides capsulaires de3 ~9 Diplococcus pneumoniae 1l Polysaccharides capsulaires de3 ~9 Diplococcus pneumoniae lll Glycoprotéines membranaires de18 ~9 Klebsie-la pneumoniae ~:.
Il) Vaccin anti-pneumococcique ARN `
ARN de Diplococcus pneumoniae 11,5 ~9 ARN de Diplococcus pneumoniae ll1,5 ~9 ARN de Diplococcus pneumoniae lll 1,5 ~g Polysaccharides capsulaires de3 ~9 Diplococcus pneumoniae ll `
Polysaccharides capsulaires de3 ~9 Diplococcus pneumoniae lll Glycoprotéines membranaires de20 ~9 Klebsiella pneumoniae III)Vaccin anti-bronchique -- i Ribosomes de Diplococcus pneumoniae I 1 ~g Ribosomes de Diplococcus pneumoniae ll 2 ~9 Ribosomes de Diplococcus pneumoniae lll 1 ~9
La présente invention, réalisée au Centre d'Immunologie et de Biologie Pierre Fabre, concerne des vaccins acellulaires perfectionnées.
Il est déj3 connu, par les brevets francais 73 43957, 75 10252 et 76 24124, de préparer des vaccins accellulaires composés de ribosomes ou d'acides ribonucléiques (ARN) ribosomaux associés à des polysaccharides membranaires et adjuvés par des glycoprotéines membranaires.
Mais, il est maintenant apparu que, pour certaines bactéries porteuses de capsules, l'action antigénique et donc vaccinale de leurs ribosomes ou ARN était fortement potentialisée par les polysaccharides capsulaires correspondant auxdites ~
bactéries. ; ~;
C'est pourquoi la présente invention concerne un pro- ~ -cédé pour potentialiser l'action des vaccins acellulaires contenant à titre de principe vaccinal des ARN or des r?bosomes-d'au mcoins une souche bactériene à capsules polysaccharidiques, dans lequel on ajoute à ce vaccin les polysaccharides capsulaires extraits d'au moins une desdites souches bactériennes à capsules -i ` polysaccharidiques.
Ce procédé est, en particulier, utilisable pour potentialiser les vaccins a base d'ARN-ou de ribosomes de pneumocoques tels les Diplococcus, en particulier D. pneumoniae ~ `
:. :
ainsi que de Klebsiella pneumQniae et d'Hemophil~us inFluenzae.
Bien entendu, les compositions des vaccins acellulaires ~ -sont connues et décrites dans les brevets fran~cais cités ;
précédemment.
En particulier, ces vaccins peuvent contenir, outre les ARN ou les ribosomes qui constituent la fraction vaccinale : ;- .
proprement dite, des glycoprotéines membra?aires à titre d'adjvant et/ou des polysaccharides membranaires. ;
ba quantité de polysaccharides capsulaires ajoutée peut varier dans de larges limites mais sera, de préf~rence, - 1 ~
~ 3~
comprise dans un rapport en poids de 2/1 à 1/2 par rapport aux ARN ou ribosomes des bactéries capsulaires du vaccin.
Il n'est pas indispensable, pour obtenir un vaccin potentialisé selon l'invention, d'introduire des polysaccharides capsulaires correspondant à toutes les souches de bactéries cap-sulaires utilisées dans le vaccin, il suffit qu'il comprenne au moins les polysaccharides capsulairles extraits d'une des souches capsulées dont les ARN ou les ribosomes sont utilisés dans le vaccin. : :
On donne ci-après des exemples de vaccins perfectionnés selon la présente invention:
I) Vaccin anti-pneumococcique Ribosomes de Diplococcus pneumoniae 1 2 ;ug Ribosomes de Diplococcus pneumoniae ll 2 ~g Ribosomes de Diplococcus pneumoniae lll 2 ~9 Polysaccharides capsulaires de3 ~9 Diplococcus pneumoniae 1l Polysaccharides capsulaires de3 ~9 Diplococcus pneumoniae lll Glycoprotéines membranaires de18 ~9 Klebsie-la pneumoniae ~:.
Il) Vaccin anti-pneumococcique ARN `
ARN de Diplococcus pneumoniae 11,5 ~9 ARN de Diplococcus pneumoniae ll1,5 ~9 ARN de Diplococcus pneumoniae lll 1,5 ~g Polysaccharides capsulaires de3 ~9 Diplococcus pneumoniae ll `
Polysaccharides capsulaires de3 ~9 Diplococcus pneumoniae lll Glycoprotéines membranaires de20 ~9 Klebsiella pneumoniae III)Vaccin anti-bronchique -- i Ribosomes de Diplococcus pneumoniae I 1 ~g Ribosomes de Diplococcus pneumoniae ll 2 ~9 Ribosomes de Diplococcus pneumoniae lll 1 ~9
- 2 -5i5 Ribosomes de Klebsiella pneumoniae 2 ~9 Ribosomes d'Hemophilus influenzae 1 ~9 Ribosomes de Streptococcus pyogenes A12 1 -,ug ;
Polysaccharides capsulaires de2,5~9 Diplococcus pneumoniae 11 Polysaccharides capsulaires de2,5~9 Diplococcus pneumoniae 111 Polysaccharides capsulaires de3 119 Klebsiella pneumoniae Glycoprotéines de Klebsiella pneumoniae 24 ~g IV) Vaccin anti-bronc-hique . ribosomes de Diplococcus pneumoniae 11 2 ~9 . ribosomes de Klebsiella pneumoniae 2 ~ug . ribosomes d'Hemophilus influenzae 1 ~Ig . Polysaccharides capsulaires de Diplococcus pneumoniae 11 2,5,ug . Polysaccharides capsulaires de Klebsiella pneumoniae 2,5ug . Polysaccharides capsulaires -:
d'Hemophilus influenzae 1,5~9 . Glycoprotéines membranaires de Klebsiella pneumoniae 17 ~9 V) Vaccin anti-bronchique . ARN de Diplococcus pneumoniae 11 1,5 ;ug . ARN de Klebsiella pneumoniae1,5 ~9 . ARN d'Hemophilus influenzae1 ,ug . Polysaccharides capsulaires de ~ ~ :
Diplococcus pneumoniae 11 2 ~9 ;~
. Polysaccharides capsulaires de ... :
Klebsiella pneumoniae 2 ,ug . Polysaccharides capsulaires d'Hemophilus influenzae 1,5 ;ug : .
. Glycoprotéines membranaires de :-:
Klebsiella pneumoniae 15 ~9 : ,.
Les différents éléments de ces compositions peuvent être ~0 dosés notamment par des procédés décrits dan les brevets franc,ais cités précédemment.
Les polysaccharides capsulaires peuvent etre préparés, ~;~ ~ 3 ~
, ~ . . . ... . . . .
~ 3~
notamment, à partir d'une so1ution aqueuse de capsules par pré-cipitation 3 l'aide de chlorure de cétyl-pyridinium. Le complexe polysaccharide-chlorure de cétyl-pyridinium est dissocié par un sel inorganique tel que le chlorure de sodium 2M, dans ces conditions le polysaccharide passe en solution et le chlorure de cétylpyridin- ;
ium précipite. ~-On peut alors récupérer les polysaccharides, par exemple en ajoutant de l'éthanol à la solution de polysacc'narides qui ~ ' precipite. ~ ' Les polysaccharides peuvent ensuite ètre à nouveau lavés et purifiés. On peut laver les polysaccharides par un mélange eau/éthanol en présence d'acétate de sodium. ' ' Si on désire purifier les polysaccharides pour éliminer les protéines qui sont encore présentes, on peut extraire ces -protéines 3 partier d'une solution aqueuse de polysaccharides par du phénol, par exemple du phénol à 90~ à chaud.
Les polysaccharides contenus dans la phase aqueuse sont récupérés par précipitation 3 'l'éthanol.
L'invention concerne également les vaccins obtenus par ~
le procéde décrit précédemment. - ' On donne, ci-aprés, des exemples de préparation des différents composants des vaccins selon l'invention que ne la ~
limitent aucunement. ~ ' Procédé général de-fermentati'on ~ -Les souches bactériennes sont entretenues sur tubes de gélose inclinée et la production des biomasses est réalisée en trois étapes successives, tout d'abord en flacon de 500 ml statique à l'étuve puis dans un fermenteur de 20 1 qui est ensemencé au moyen des 500 ml du flacon et enfin dans un fermenteur industriel de 600 1 inoculé avec les 20 1 du fermenteur précedent.
Pour chaque germe3 une étude pilote sur fermenteur de 20 1 est réalisée préalablement afin de d~terminer les conditions ;
~''`' .
- 4 - ^
~, ~
optimales de developpement en ce qui concerne la ternpérature, le pH, l'oxyg~ne, la vitesse d'agitation et les temps de croissance.
Chacun de ces paramètres étant définis, son contrôle et sa régula- , "' tion automatique sont aussurés au niveau des fermenteurs de 20 et de 600 1.
Les cellules bactériennes sont recueillies en fin de phase de croissance par centrifugation continue à froid et lavées par dispersion dans du tampon tris-HCl, MgC12, pH7 et concentrées par un nouveau passage en centrifugation continue. Dans le cas de germes fragiles ayant tendance à s'autolyser, la culture est refroidie rapidement vers 8 à 10C avant le centrifugation.
La biomasse ainsi obtenue est conservée congelée en attendant d'être utilisée. Sur un prélèvement un contrôle bactériologique est réalisé afin de vérifier l'identité du germe '`' et l'absence de contaminants. La teneur en extrait sec est également déterminée. ~ r Procédé de préparat~on des polysaccharides capsulaires ''~; ~
Pour obtenir les polysaccharides capsulaires, les ~ ' cellules lavées sont dispersées dans un tampon tris-HCl 0,01 M, '' pH7, contenant NaCl 0,10 M et MgC12 0,01 M. La température de la suspension est portée à 40C et les capsules sont séparées par '~
homogénéisation quelques minutes dans un warring blendor à cette ~ ' température. ' Après refroidissement, les cellules décapsulées sont ; ~
séparées par une centrifugation de 30 minutes à 30.000 9 et 4C. '~' Le culot est conservé pour la préparation des ribosomes et de l'ARN ribosomal. Le surnageant contenant les capsules est ~' i~
recueilli.
Les polysaccharides capsulaires sont tout d'abord précipités à partir du surnageant parune additionl'ente d'une solution aqueuse d~e chlorure de cétylpyridinium 3 2%, jusqu'en fin de floculation. Après une heure de repos à 4C, le précipité
'~
de polysaccharide est recueilli par centrifugation et le surnageant écarté. ;~
Le complexe polysaccharide-chlorure de cétylpyridinium précipité est dissocié dans du chlorure de sodium 2M, dans ces conditions le polysaccharide passe en solution alors que le ~ ;
chlorure de cétylpyridinium est éliminé par centrifugation et le surnageant conservé.
Trois volumes d'alcool éthylique froid sont ajoutés au surnageant pour précipiter le polysaccharide qui est recueilli par centriFugation après une heure de repos à 4C. ~ :~
- Le polysaccharide précipité est lavé par dispersion dans un mélange eau-éthanol (30:70 v/v) contenant CH3C00 Na 0,1 M, pendant 30 minutes à température ambiante. La solution de lavage est éliminée par centrifugation et le culot est repris ;~
dans une solution aqueuse 0,1 M de CH3C00 Na.
Afin d'éliminer les protéines pouvant encore contaminer " :
la préparation à ce stade, il est procédé à une extraction 10 minutes à 65C par un volume de phénol à 90% dans l'acétate de sodium 1 M. Aprè~s agitation vive, 10 minutes à 65C, le mélange est refroidi rapidement dans un bain de glace et les deux phases sont séparées par centrifugation 5 minutes à 10.000 9 et 0C. La phase aqueuse supérieure est prélevée délicatement.
Trois volumes d'alcool éthylique froid sont ajoutés 3 la phase aqueuse et le polysaccharide est laissé en précipitation 1 heure à 4C.
Le précipité est recueilli par centrifugation puis dispersé dans un mélange eau-éthanol (30:70 v/v) contenant CH3C00 Na 0,1 M pendant 30 minutes 3 température ambiante. ;
Le précipité lavé est recueilli par centrifugation et repris dans l'eau distillée puis stérilisé par filtration sur membrane 0j22 et lyophilisé.
Procédé de préparation de la fraction ribosomale ~3 ~
La fraction ribosomale est préparée, soit à partir des cellules décapsulées obtenues précédemment lorsqu'il s'agit des ribosomes de bactéries capsulées, soit à partir des cellules obtenues dans le procédé général de fermentation après un éventuel lavage. Les cellules sont mises en suspension dans un tampon tris-HCl, MgC12, pH 7 et soumises à un broyage en continu dans un homogénéiseur équipé d'un réfrigérant à plaques sous une pression de ~00 kg/cm .
Le suspension de broyat bactérien est alors débarrassée des débris cellulaires par une centrifugation de 45 minutes à
30.000 9 et 4C; le surnageant clair, contenant les ribosomes, ` ~`-est conservé.
Les ribosomes bruts sont précipités une première fois du ~--surnageant précédent par addition de 0,8 volume d'alcool éthyligue -~
à -20C. Après un repos de 30 minutes à 4C, le précipité est ;
recueilli par centrifugation et repris dans une solution 3 0,5%
de sodium dodécyl sulfate dans le tampon tris HCl, MgC12, pH 7,2, à température ambiante avec une agitation rapide pendant une heure.
La suspension obtenue, contenant les ribosomes, est précipitée par 0,7 volume d'alcool éthylique 3 -20C. Après un repos de 30 minutes à température ambiante, les ribosomes sont `
recueillis par centrifugation à 15C et le culot est repris dans -le tampon tris-HCl, MgC12, pH 7 à 4C par agitation lente, une nuit .
à 4C.
La suspension obtenue est clarifiée par une centrifugation ;
à 30.000 9 à 0C pendant 45 minutes et le surnageant contenant les ribosomes puriFiés est conservé. ;
A ce stade, la solution peut être conservée congelée ~
en vue de la préparation de l'ARN ribosomal ou bien stérilisée ~`par filtration, puis lyophilisée. ~
Procédé d'extraction de l'ARN ribosomal ~ ~;
On extrait l'ARN ribosomal à partir de la fraction ~ 7 ~
ribosomale précédente non lyophilisée.
On mélange un volume de suspension de ribosomes et un volume de phénol 3 80% préalablement équilibré avec du tampon tris-HCl 0,01 M, pH 7, contenant EDTA O,OOl M (sel disodique) ; et O,5% de dodécylsulfate de sodium, puis la température du m~lange ; est port~e rapidement à 65C, et maintenue pendant 10 minutes sous agitation. Le mélange est ensuite refroidi rapidement dans un bain de glace.
Les deux phases sont séparées par centrifugation sous 10 10.000 9 pendant 5 minutes à 4C et la phase aqueuse supérieure , est recueillie avec précaution.
La phase aqueuse obtenue est ensuite réextraite deux fois dans les mêmes conditions par 1/2 volume de phénol à 80%. ~ ;
La phase aqueuse finale est recueillie et débarrassée du phénol résiduel par trois extractions successives avec chaque fois un volume d'éther, dans une ampoule à décanter. Un barbotage d'azote permet ensuite d'éliminer l'éther restant dans la phase aqueuse.
Onajoute alors à la phase aqueuse du chlorure de sodium ~ ;
20 pour obtenir une molarité de 0,1 M, l'ARN est précipité de cette h phase aqueuse par addition de deux volumes d'alcool à -20C. ;
Le précipité est recueilli par centrifugation sous,l o.obo g pendant 10 minutes à 0C. Le culot d'ARN est remis en suspension dans -du tampon tris-~Cl 0,025 M, pH 8,1, contenant NaCl 0,025 M pour avoir environ 2 mg d'ARN par ml de solution.
Procédé de purification de l'ARN ribosomal A la solution d'ARN obtenue précédemment on ajoute un ;
volume d'une solution 2,5 M de phosphate dipotassique et un volume de 2-méthoxyéthanol. Après une agitation énergique de 2 3 3 ;
30 minutes, le précipité est éliminé par centrifugation à 10.000 9 pendant 5 minutes à 4C. Le surnageant clair contenant l'ARN
est recueilli et mélangé avec un volume d'acétate de sodium 0,2 M.
Polysaccharides capsulaires de2,5~9 Diplococcus pneumoniae 11 Polysaccharides capsulaires de2,5~9 Diplococcus pneumoniae 111 Polysaccharides capsulaires de3 119 Klebsiella pneumoniae Glycoprotéines de Klebsiella pneumoniae 24 ~g IV) Vaccin anti-bronc-hique . ribosomes de Diplococcus pneumoniae 11 2 ~9 . ribosomes de Klebsiella pneumoniae 2 ~ug . ribosomes d'Hemophilus influenzae 1 ~Ig . Polysaccharides capsulaires de Diplococcus pneumoniae 11 2,5,ug . Polysaccharides capsulaires de Klebsiella pneumoniae 2,5ug . Polysaccharides capsulaires -:
d'Hemophilus influenzae 1,5~9 . Glycoprotéines membranaires de Klebsiella pneumoniae 17 ~9 V) Vaccin anti-bronchique . ARN de Diplococcus pneumoniae 11 1,5 ;ug . ARN de Klebsiella pneumoniae1,5 ~9 . ARN d'Hemophilus influenzae1 ,ug . Polysaccharides capsulaires de ~ ~ :
Diplococcus pneumoniae 11 2 ~9 ;~
. Polysaccharides capsulaires de ... :
Klebsiella pneumoniae 2 ,ug . Polysaccharides capsulaires d'Hemophilus influenzae 1,5 ;ug : .
. Glycoprotéines membranaires de :-:
Klebsiella pneumoniae 15 ~9 : ,.
Les différents éléments de ces compositions peuvent être ~0 dosés notamment par des procédés décrits dan les brevets franc,ais cités précédemment.
Les polysaccharides capsulaires peuvent etre préparés, ~;~ ~ 3 ~
, ~ . . . ... . . . .
~ 3~
notamment, à partir d'une so1ution aqueuse de capsules par pré-cipitation 3 l'aide de chlorure de cétyl-pyridinium. Le complexe polysaccharide-chlorure de cétyl-pyridinium est dissocié par un sel inorganique tel que le chlorure de sodium 2M, dans ces conditions le polysaccharide passe en solution et le chlorure de cétylpyridin- ;
ium précipite. ~-On peut alors récupérer les polysaccharides, par exemple en ajoutant de l'éthanol à la solution de polysacc'narides qui ~ ' precipite. ~ ' Les polysaccharides peuvent ensuite ètre à nouveau lavés et purifiés. On peut laver les polysaccharides par un mélange eau/éthanol en présence d'acétate de sodium. ' ' Si on désire purifier les polysaccharides pour éliminer les protéines qui sont encore présentes, on peut extraire ces -protéines 3 partier d'une solution aqueuse de polysaccharides par du phénol, par exemple du phénol à 90~ à chaud.
Les polysaccharides contenus dans la phase aqueuse sont récupérés par précipitation 3 'l'éthanol.
L'invention concerne également les vaccins obtenus par ~
le procéde décrit précédemment. - ' On donne, ci-aprés, des exemples de préparation des différents composants des vaccins selon l'invention que ne la ~
limitent aucunement. ~ ' Procédé général de-fermentati'on ~ -Les souches bactériennes sont entretenues sur tubes de gélose inclinée et la production des biomasses est réalisée en trois étapes successives, tout d'abord en flacon de 500 ml statique à l'étuve puis dans un fermenteur de 20 1 qui est ensemencé au moyen des 500 ml du flacon et enfin dans un fermenteur industriel de 600 1 inoculé avec les 20 1 du fermenteur précedent.
Pour chaque germe3 une étude pilote sur fermenteur de 20 1 est réalisée préalablement afin de d~terminer les conditions ;
~''`' .
- 4 - ^
~, ~
optimales de developpement en ce qui concerne la ternpérature, le pH, l'oxyg~ne, la vitesse d'agitation et les temps de croissance.
Chacun de ces paramètres étant définis, son contrôle et sa régula- , "' tion automatique sont aussurés au niveau des fermenteurs de 20 et de 600 1.
Les cellules bactériennes sont recueillies en fin de phase de croissance par centrifugation continue à froid et lavées par dispersion dans du tampon tris-HCl, MgC12, pH7 et concentrées par un nouveau passage en centrifugation continue. Dans le cas de germes fragiles ayant tendance à s'autolyser, la culture est refroidie rapidement vers 8 à 10C avant le centrifugation.
La biomasse ainsi obtenue est conservée congelée en attendant d'être utilisée. Sur un prélèvement un contrôle bactériologique est réalisé afin de vérifier l'identité du germe '`' et l'absence de contaminants. La teneur en extrait sec est également déterminée. ~ r Procédé de préparat~on des polysaccharides capsulaires ''~; ~
Pour obtenir les polysaccharides capsulaires, les ~ ' cellules lavées sont dispersées dans un tampon tris-HCl 0,01 M, '' pH7, contenant NaCl 0,10 M et MgC12 0,01 M. La température de la suspension est portée à 40C et les capsules sont séparées par '~
homogénéisation quelques minutes dans un warring blendor à cette ~ ' température. ' Après refroidissement, les cellules décapsulées sont ; ~
séparées par une centrifugation de 30 minutes à 30.000 9 et 4C. '~' Le culot est conservé pour la préparation des ribosomes et de l'ARN ribosomal. Le surnageant contenant les capsules est ~' i~
recueilli.
Les polysaccharides capsulaires sont tout d'abord précipités à partir du surnageant parune additionl'ente d'une solution aqueuse d~e chlorure de cétylpyridinium 3 2%, jusqu'en fin de floculation. Après une heure de repos à 4C, le précipité
'~
de polysaccharide est recueilli par centrifugation et le surnageant écarté. ;~
Le complexe polysaccharide-chlorure de cétylpyridinium précipité est dissocié dans du chlorure de sodium 2M, dans ces conditions le polysaccharide passe en solution alors que le ~ ;
chlorure de cétylpyridinium est éliminé par centrifugation et le surnageant conservé.
Trois volumes d'alcool éthylique froid sont ajoutés au surnageant pour précipiter le polysaccharide qui est recueilli par centriFugation après une heure de repos à 4C. ~ :~
- Le polysaccharide précipité est lavé par dispersion dans un mélange eau-éthanol (30:70 v/v) contenant CH3C00 Na 0,1 M, pendant 30 minutes à température ambiante. La solution de lavage est éliminée par centrifugation et le culot est repris ;~
dans une solution aqueuse 0,1 M de CH3C00 Na.
Afin d'éliminer les protéines pouvant encore contaminer " :
la préparation à ce stade, il est procédé à une extraction 10 minutes à 65C par un volume de phénol à 90% dans l'acétate de sodium 1 M. Aprè~s agitation vive, 10 minutes à 65C, le mélange est refroidi rapidement dans un bain de glace et les deux phases sont séparées par centrifugation 5 minutes à 10.000 9 et 0C. La phase aqueuse supérieure est prélevée délicatement.
Trois volumes d'alcool éthylique froid sont ajoutés 3 la phase aqueuse et le polysaccharide est laissé en précipitation 1 heure à 4C.
Le précipité est recueilli par centrifugation puis dispersé dans un mélange eau-éthanol (30:70 v/v) contenant CH3C00 Na 0,1 M pendant 30 minutes 3 température ambiante. ;
Le précipité lavé est recueilli par centrifugation et repris dans l'eau distillée puis stérilisé par filtration sur membrane 0j22 et lyophilisé.
Procédé de préparation de la fraction ribosomale ~3 ~
La fraction ribosomale est préparée, soit à partir des cellules décapsulées obtenues précédemment lorsqu'il s'agit des ribosomes de bactéries capsulées, soit à partir des cellules obtenues dans le procédé général de fermentation après un éventuel lavage. Les cellules sont mises en suspension dans un tampon tris-HCl, MgC12, pH 7 et soumises à un broyage en continu dans un homogénéiseur équipé d'un réfrigérant à plaques sous une pression de ~00 kg/cm .
Le suspension de broyat bactérien est alors débarrassée des débris cellulaires par une centrifugation de 45 minutes à
30.000 9 et 4C; le surnageant clair, contenant les ribosomes, ` ~`-est conservé.
Les ribosomes bruts sont précipités une première fois du ~--surnageant précédent par addition de 0,8 volume d'alcool éthyligue -~
à -20C. Après un repos de 30 minutes à 4C, le précipité est ;
recueilli par centrifugation et repris dans une solution 3 0,5%
de sodium dodécyl sulfate dans le tampon tris HCl, MgC12, pH 7,2, à température ambiante avec une agitation rapide pendant une heure.
La suspension obtenue, contenant les ribosomes, est précipitée par 0,7 volume d'alcool éthylique 3 -20C. Après un repos de 30 minutes à température ambiante, les ribosomes sont `
recueillis par centrifugation à 15C et le culot est repris dans -le tampon tris-HCl, MgC12, pH 7 à 4C par agitation lente, une nuit .
à 4C.
La suspension obtenue est clarifiée par une centrifugation ;
à 30.000 9 à 0C pendant 45 minutes et le surnageant contenant les ribosomes puriFiés est conservé. ;
A ce stade, la solution peut être conservée congelée ~
en vue de la préparation de l'ARN ribosomal ou bien stérilisée ~`par filtration, puis lyophilisée. ~
Procédé d'extraction de l'ARN ribosomal ~ ~;
On extrait l'ARN ribosomal à partir de la fraction ~ 7 ~
ribosomale précédente non lyophilisée.
On mélange un volume de suspension de ribosomes et un volume de phénol 3 80% préalablement équilibré avec du tampon tris-HCl 0,01 M, pH 7, contenant EDTA O,OOl M (sel disodique) ; et O,5% de dodécylsulfate de sodium, puis la température du m~lange ; est port~e rapidement à 65C, et maintenue pendant 10 minutes sous agitation. Le mélange est ensuite refroidi rapidement dans un bain de glace.
Les deux phases sont séparées par centrifugation sous 10 10.000 9 pendant 5 minutes à 4C et la phase aqueuse supérieure , est recueillie avec précaution.
La phase aqueuse obtenue est ensuite réextraite deux fois dans les mêmes conditions par 1/2 volume de phénol à 80%. ~ ;
La phase aqueuse finale est recueillie et débarrassée du phénol résiduel par trois extractions successives avec chaque fois un volume d'éther, dans une ampoule à décanter. Un barbotage d'azote permet ensuite d'éliminer l'éther restant dans la phase aqueuse.
Onajoute alors à la phase aqueuse du chlorure de sodium ~ ;
20 pour obtenir une molarité de 0,1 M, l'ARN est précipité de cette h phase aqueuse par addition de deux volumes d'alcool à -20C. ;
Le précipité est recueilli par centrifugation sous,l o.obo g pendant 10 minutes à 0C. Le culot d'ARN est remis en suspension dans -du tampon tris-~Cl 0,025 M, pH 8,1, contenant NaCl 0,025 M pour avoir environ 2 mg d'ARN par ml de solution.
Procédé de purification de l'ARN ribosomal A la solution d'ARN obtenue précédemment on ajoute un ;
volume d'une solution 2,5 M de phosphate dipotassique et un volume de 2-méthoxyéthanol. Après une agitation énergique de 2 3 3 ;
30 minutes, le précipité est éliminé par centrifugation à 10.000 9 pendant 5 minutes à 4C. Le surnageant clair contenant l'ARN
est recueilli et mélangé avec un volume d'acétate de sodium 0,2 M.
3~
L'ARN est alors précipité par addition lente de 0,5 volume d'une solution aqueuse à 1~ de bromure de cétyl-triméthylammonium.
Après un repos de 5 minutes 3 4C le précipité d'AR N
est recueilli par centrifugation sous 10.000 9 pendant 5 minutes 3 4C. Le tube de centrifugation est parfaitement essuyé et le précipité lavé deux fois par un exc~s d'alcool à 70~ contenant CH3C00 Na 0,1 M.
. Le précipité d'ARN est alors remis en solution dans du tampon tris-HCl, pH 7, et dialysé une nuit à 2C contre 20 volumes de ce tampon puis lyophilisé après stérilisation par filtration.
Procédé de préparation des glycoprotéines membranaires Les glycoprotéines membranaires sont préparées à partir des broyats bactériens obtenus, par exemple, par mise en suspen-sion des cellules bactériennes obtenues après fermentation dans `:
un tampon tris-HCl, MgC12, pH 7, et broyage en continu dans un ;: ;
homo~énéiseur équipé d'un réfrigérant à plaques sous une pression ~ ~:
de 600 kg/cm2. Le broyat est centrifugé dans le tampon précédent :;,,,:
. à 7.500 g pendant 15 minutes pour éliminer un culot de sédimenta-tion qui contient. les débris cellulaires, puis le surnageant est centrifugé à 30.000 9 pendant 15 minutes pour sédimenter les ` :-:
membranes. La fraction membranaire obtenue, après éventuelle-ment trois cycles de lavage par centrifugation dans des tampons de `~
force ionique décroissante, est suspendue dans l'eau distillée et lyophilisee. .
Le lyophilisat est ensuite soumis à deux extractions . :
successives de deux heures à température ambiante: la première par un melange chloroforme-méthanol (2:1), le deuxième par un . -~
mélange éthanol-éther (3:1~.
Le résidu dégraissé est séché et utilisé pour préparer les glycoprotéines membranaires.
Après remise en suspension du résidu dans une solution ~ ~ , e3~
aqueuse à 2~ de sodium dodécyl sulfate et clarification par centrifugation 15 minutes 3 10.000 tr/min., les glycoprotéines sont précipitées du surnageant par addition de 3 volumes d'éthanol , et quelques ml d'une solution concentrée d'acétate de sodium.
Après un repos d'une heure 3 température ambiante, le r précipité est recueilli par centrifugation et repris dans l'eau distillée.
La reprise est clarifiée par centrifugation 15 minutes à 10.000 tr/min. et le surnageant contenant les glycoprotéines est lyophilisé.
Ces procédés sont utilisés pour préparer les composants utilisés dans les expériences ci-dessous.
Expérience 1 Dans cette expérience on teste l'activité de l'association ribosomes + Polysaccharides capsulaires de Diplococcus pneumoniae.
On utilise 4 groupes de 10 souris.
Chaque souris du groupe A est traitée par 7 ~9 de ribosomes de D. pneumoniae.
Chaque souris du groupe B est traitée par 10 ~9 de polysaccharides capsulaires de D. pneumoniae. `:
Chaque souris de groupe C est traitée par une association , ~ .
de 7 ~g de ribosomes et 10 ~g de polysaccharides capsulaires de D. pneumoniae.
,:
Le groupe D est non traité.
- Chaque dose indiquée est injectée en 5 fois par voie sous-cutane~e au rythme d'une injection tous les trois jours pendant 15 jours. ~- -10 jours après la dernière injection, les animaux sont ponctionnés par les sinus rétro-orbitaires et le sérum est étudié:
1) en immunodiffusion (technique d'Ouchterlony) 2) en immunoélectrodiffusion (technique de Laurell) - 1 0 - , ,:
~3~5 '~
en gel d'agarose à 1~ en tampon de véronal, pH 8,6 contre de l'antigène de D. pneurnoniae total.
En immunodiffusion Contre un antigène total 3iplococcus pneumoniae le s~rum :
des souris traitées du groupe C fait appara~tre des arcs de précipitation identiques en nombre à un sérum de souris vaccinée avec d.e l'antigène Diplococcus pneumoniae total.
En immunoélectrodiffusion .
Contre un antig~ne total Diplococcus pneumoniae, le sérum des souris du groupe C forme un immunoprécipité spécifique en forme de "rocket" dont la hauteur est très supérieure à celle ~:~
de "rocket" obtenue avec du sérum des souris du groupe A ou du groupe B.
La hauteur des "rocket'' peut varier dans des proportions .~
qui vont du double au quintuple en taux d'anticorps spécifiques, ~ .:
suivant les souris, par rapport aux résultats obtenus dans le ~ :~
groupe A. ;
Expérience 2 :.
.~ :
On effectue les memes expériences que précédemment en ~O remplaçant les 7 ~9 de ribosomes de D. pneumoniae par 5 ~9 d'ARN de _. pneumoniae.
En immunodiffusion Contre un antigène total Diplococcus pneumoniae, le .
sérum des souris traitées avec l'association (groupe C) fait appara~tre desarcs de précipitation identiques en nombre à un sérum de souris vaccinée avec de l'antigène Diplococcus ,:
pneumoniae total. ~ :.
~' En immunoélectrodiffusion Contre un antigène total Diplococcus pneumoniae, le : .
sérum des souris du groupe C forme un immuno précipité spécifique en forme de "rocket" dont la hauteur est très supérieure à la hauteur de "rocket'l formée par du sérum anti-ARN de Diplococcus ~.:
3~
pneumoniae (groupe A) ou par du s~rum anti-polysaccharides capsulaires de Diplococcus pneumoniae (groupe B) contre un antigène Diplococcus pneumoniae également.
Cette hauteur de "rocket" pour le groupe C peut varier dans des porportions qui vont du double au quintuple en taux d'anticorps spécifiques suivant les souris par rapport aux résultats obtenus pour le groupe A.
Expérience 3 Cette expérience a pour but l'étudier un vaccin plus complete que dans l'expérience 1.
On utilise pour ce faire 10 souris formant le groupe E
et on injecte à ces animaux une association de: -3,5 ~9 de ribosomes de D. pneumoniae, 5,- ~9 de polysaccharides capsulaires de D. pneumoniae, 12,- ~19 de glycoprotéines membranaires de Klebsiella pneumoniae, :
au même rythme que dans l'expérience 1. . :
. Le sérum des animaux ponctionnés comme précédemment `:.
donne en immunoélectrodiffusion:
- un immuno précipité spécifique en forme de "rocket"dont la hauteur est deux fois supérieure aux résultats obtenus sur le groupe C de l'expérience 1. ~ ~:
Expérience 4 On opère comme dans l'expérience 2 pour étudier un `
vaccin plus complet que celui de l'expérience 2. .
On utilise pour ce faire 10 souris formant le groupe F
et on injecte 3 ces animaux une association de:
2,5 ~9 d'ARN de D. pneumoniae 5,- ~9 de polysaccharides capsulaires de D. pneumoniae 10,- ~g de glycoprotéines membranaires de Klebsiella pneumoniae, au même rythme que dans l'expérience 2.
~3~5~i .
Le sérum de ces animaux ponctionnés comme précédemment donne en immunoélectrodiffusion:
- un immuno précipité spécifique en forme de "rocket"
dont la hauteur est deux fois supérieure aux résultats obtenus pour le groupe C de l'expérience 2. ;
On constate donc que les vaccins selon la présente `~
invention présente une activité vaccinante très supérieure aux vaccins de la technique antérieure.
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L'ARN est alors précipité par addition lente de 0,5 volume d'une solution aqueuse à 1~ de bromure de cétyl-triméthylammonium.
Après un repos de 5 minutes 3 4C le précipité d'AR N
est recueilli par centrifugation sous 10.000 9 pendant 5 minutes 3 4C. Le tube de centrifugation est parfaitement essuyé et le précipité lavé deux fois par un exc~s d'alcool à 70~ contenant CH3C00 Na 0,1 M.
. Le précipité d'ARN est alors remis en solution dans du tampon tris-HCl, pH 7, et dialysé une nuit à 2C contre 20 volumes de ce tampon puis lyophilisé après stérilisation par filtration.
Procédé de préparation des glycoprotéines membranaires Les glycoprotéines membranaires sont préparées à partir des broyats bactériens obtenus, par exemple, par mise en suspen-sion des cellules bactériennes obtenues après fermentation dans `:
un tampon tris-HCl, MgC12, pH 7, et broyage en continu dans un ;: ;
homo~énéiseur équipé d'un réfrigérant à plaques sous une pression ~ ~:
de 600 kg/cm2. Le broyat est centrifugé dans le tampon précédent :;,,,:
. à 7.500 g pendant 15 minutes pour éliminer un culot de sédimenta-tion qui contient. les débris cellulaires, puis le surnageant est centrifugé à 30.000 9 pendant 15 minutes pour sédimenter les ` :-:
membranes. La fraction membranaire obtenue, après éventuelle-ment trois cycles de lavage par centrifugation dans des tampons de `~
force ionique décroissante, est suspendue dans l'eau distillée et lyophilisee. .
Le lyophilisat est ensuite soumis à deux extractions . :
successives de deux heures à température ambiante: la première par un melange chloroforme-méthanol (2:1), le deuxième par un . -~
mélange éthanol-éther (3:1~.
Le résidu dégraissé est séché et utilisé pour préparer les glycoprotéines membranaires.
Après remise en suspension du résidu dans une solution ~ ~ , e3~
aqueuse à 2~ de sodium dodécyl sulfate et clarification par centrifugation 15 minutes 3 10.000 tr/min., les glycoprotéines sont précipitées du surnageant par addition de 3 volumes d'éthanol , et quelques ml d'une solution concentrée d'acétate de sodium.
Après un repos d'une heure 3 température ambiante, le r précipité est recueilli par centrifugation et repris dans l'eau distillée.
La reprise est clarifiée par centrifugation 15 minutes à 10.000 tr/min. et le surnageant contenant les glycoprotéines est lyophilisé.
Ces procédés sont utilisés pour préparer les composants utilisés dans les expériences ci-dessous.
Expérience 1 Dans cette expérience on teste l'activité de l'association ribosomes + Polysaccharides capsulaires de Diplococcus pneumoniae.
On utilise 4 groupes de 10 souris.
Chaque souris du groupe A est traitée par 7 ~9 de ribosomes de D. pneumoniae.
Chaque souris du groupe B est traitée par 10 ~9 de polysaccharides capsulaires de D. pneumoniae. `:
Chaque souris de groupe C est traitée par une association , ~ .
de 7 ~g de ribosomes et 10 ~g de polysaccharides capsulaires de D. pneumoniae.
,:
Le groupe D est non traité.
- Chaque dose indiquée est injectée en 5 fois par voie sous-cutane~e au rythme d'une injection tous les trois jours pendant 15 jours. ~- -10 jours après la dernière injection, les animaux sont ponctionnés par les sinus rétro-orbitaires et le sérum est étudié:
1) en immunodiffusion (technique d'Ouchterlony) 2) en immunoélectrodiffusion (technique de Laurell) - 1 0 - , ,:
~3~5 '~
en gel d'agarose à 1~ en tampon de véronal, pH 8,6 contre de l'antigène de D. pneurnoniae total.
En immunodiffusion Contre un antigène total 3iplococcus pneumoniae le s~rum :
des souris traitées du groupe C fait appara~tre des arcs de précipitation identiques en nombre à un sérum de souris vaccinée avec d.e l'antigène Diplococcus pneumoniae total.
En immunoélectrodiffusion .
Contre un antig~ne total Diplococcus pneumoniae, le sérum des souris du groupe C forme un immunoprécipité spécifique en forme de "rocket" dont la hauteur est très supérieure à celle ~:~
de "rocket" obtenue avec du sérum des souris du groupe A ou du groupe B.
La hauteur des "rocket'' peut varier dans des proportions .~
qui vont du double au quintuple en taux d'anticorps spécifiques, ~ .:
suivant les souris, par rapport aux résultats obtenus dans le ~ :~
groupe A. ;
Expérience 2 :.
.~ :
On effectue les memes expériences que précédemment en ~O remplaçant les 7 ~9 de ribosomes de D. pneumoniae par 5 ~9 d'ARN de _. pneumoniae.
En immunodiffusion Contre un antigène total Diplococcus pneumoniae, le .
sérum des souris traitées avec l'association (groupe C) fait appara~tre desarcs de précipitation identiques en nombre à un sérum de souris vaccinée avec de l'antigène Diplococcus ,:
pneumoniae total. ~ :.
~' En immunoélectrodiffusion Contre un antigène total Diplococcus pneumoniae, le : .
sérum des souris du groupe C forme un immuno précipité spécifique en forme de "rocket" dont la hauteur est très supérieure à la hauteur de "rocket'l formée par du sérum anti-ARN de Diplococcus ~.:
3~
pneumoniae (groupe A) ou par du s~rum anti-polysaccharides capsulaires de Diplococcus pneumoniae (groupe B) contre un antigène Diplococcus pneumoniae également.
Cette hauteur de "rocket" pour le groupe C peut varier dans des porportions qui vont du double au quintuple en taux d'anticorps spécifiques suivant les souris par rapport aux résultats obtenus pour le groupe A.
Expérience 3 Cette expérience a pour but l'étudier un vaccin plus complete que dans l'expérience 1.
On utilise pour ce faire 10 souris formant le groupe E
et on injecte à ces animaux une association de: -3,5 ~9 de ribosomes de D. pneumoniae, 5,- ~9 de polysaccharides capsulaires de D. pneumoniae, 12,- ~19 de glycoprotéines membranaires de Klebsiella pneumoniae, :
au même rythme que dans l'expérience 1. . :
. Le sérum des animaux ponctionnés comme précédemment `:.
donne en immunoélectrodiffusion:
- un immuno précipité spécifique en forme de "rocket"dont la hauteur est deux fois supérieure aux résultats obtenus sur le groupe C de l'expérience 1. ~ ~:
Expérience 4 On opère comme dans l'expérience 2 pour étudier un `
vaccin plus complet que celui de l'expérience 2. .
On utilise pour ce faire 10 souris formant le groupe F
et on injecte 3 ces animaux une association de:
2,5 ~9 d'ARN de D. pneumoniae 5,- ~9 de polysaccharides capsulaires de D. pneumoniae 10,- ~g de glycoprotéines membranaires de Klebsiella pneumoniae, au même rythme que dans l'expérience 2.
~3~5~i .
Le sérum de ces animaux ponctionnés comme précédemment donne en immunoélectrodiffusion:
- un immuno précipité spécifique en forme de "rocket"
dont la hauteur est deux fois supérieure aux résultats obtenus pour le groupe C de l'expérience 2. ;
On constate donc que les vaccins selon la présente `~
invention présente une activité vaccinante très supérieure aux vaccins de la technique antérieure.
, - ,,;
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Claims (6)
1. Procédé destiné à potentialiser l'action des vaccins contenant à titre de principe vaccinal des ARN ou des ribosomes d'au moins une souche bactérienne à capsules polysaccharidiques, dans lequel on ajoute à ce vaccin les polysaccharides capsulaires extraits d'au moins une desdites souches bactériennes à capsules polysaccharidiques.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on ajoute à un vaccin contenant des ARN ou des ribosomes d'au moins une souche de pneumocoque de Klebsiella pneumoniae ou d'Hemophilus influenzae comme principe vaccinal, les polysaccharides capsulaires d'au moins une desdites souches de pneumocoque de Klebsiella pneumoniae ou d'Hemophilus influenzae.
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on ajoute à un vaccin contenant des ARN ou des ribosomes Diplococcus de Klebsiella pneumoniae ou d'Hemophilus influenzae comme principe vaccinal, les polysaccharides capsulaires d'au moins une de ces souches de Diplococcus de Klebsiella pneumoniae ou d'Hemophilus influenzae.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les polysaccharides capsulaires sont préparés à partir des capsules bactériennes par précipitation par le chlorure de cétylpyridinium, prélèvement du précipité et décomposition du complexe cétylpyridinium-polysaccharide dans une solution saline et récupération de la solution contenant les polysaccharides capsulaires.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les polysaccharides capsulaires sont préparés à partir des capsules bactériennes par précipitation par le chlorure de cétylpyridinium, prélèvement du précipite et décomposition du complexe cétylpyridinium-polysaccharide dans une solution saline de NaCl 2M et récupération de la solution contenant les polysaccharides capsulaires.
6, Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le rapport en poids entre les polysaccharides capsulaires et les ARN
ou ribosomes de bactéries à capsules polysaccharidiques est compris entre 1/2 et 2/1.
ou ribosomes de bactéries à capsules polysaccharidiques est compris entre 1/2 et 2/1.
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