1 ~ ~ 3 ~ L 5; S
La présente invention, réalisée au Centre d'Immunologie et de Biologie Pierre Fabre, concerne des vaccins acellulaires perfectionnées.
Il est déj3 connu, par les brevets francais 73 43957, 75 10252 et 76 24124, de préparer des vaccins accellulaires composés de ribosomes ou d'acides ribonucléiques (ARN) ribosomaux associés à des polysaccharides membranaires et adjuvés par des glycoprotéines membranaires.
Mais, il est maintenant apparu que, pour certaines bactéries porteuses de capsules, l'action antigénique et donc vaccinale de leurs ribosomes ou ARN était fortement potentialisée par les polysaccharides capsulaires correspondant auxdites ~
bactéries. ; ~;
C'est pourquoi la présente invention concerne un pro- ~ -cédé pour potentialiser l'action des vaccins acellulaires contenant à titre de principe vaccinal des ARN or des r?bosomes-d'au mcoins une souche bactériene à capsules polysaccharidiques, dans lequel on ajoute à ce vaccin les polysaccharides capsulaires extraits d'au moins une desdites souches bactériennes à capsules -i ` polysaccharidiques.
Ce procédé est, en particulier, utilisable pour potentialiser les vaccins a base d'ARN-ou de ribosomes de pneumocoques tels les Diplococcus, en particulier D. pneumoniae ~ `
:. :
ainsi que de Klebsiella pneumQniae et d'Hemophil~us inFluenzae.
Bien entendu, les compositions des vaccins acellulaires ~ -sont connues et décrites dans les brevets fran~cais cités ;
précédemment.
En particulier, ces vaccins peuvent contenir, outre les ARN ou les ribosomes qui constituent la fraction vaccinale : ;- .
proprement dite, des glycoprotéines membra?aires à titre d'adjvant et/ou des polysaccharides membranaires. ;
ba quantité de polysaccharides capsulaires ajoutée peut varier dans de larges limites mais sera, de préf~rence, - 1 ~
~ 3~
comprise dans un rapport en poids de 2/1 à 1/2 par rapport aux ARN ou ribosomes des bactéries capsulaires du vaccin.
Il n'est pas indispensable, pour obtenir un vaccin potentialisé selon l'invention, d'introduire des polysaccharides capsulaires correspondant à toutes les souches de bactéries cap-sulaires utilisées dans le vaccin, il suffit qu'il comprenne au moins les polysaccharides capsulairles extraits d'une des souches capsulées dont les ARN ou les ribosomes sont utilisés dans le vaccin. : :
On donne ci-après des exemples de vaccins perfectionnés selon la présente invention:
I) Vaccin anti-pneumococcique Ribosomes de Diplococcus pneumoniae 1 2 ;ug Ribosomes de Diplococcus pneumoniae ll 2 ~g Ribosomes de Diplococcus pneumoniae lll 2 ~9 Polysaccharides capsulaires de3 ~9 Diplococcus pneumoniae 1l Polysaccharides capsulaires de3 ~9 Diplococcus pneumoniae lll Glycoprotéines membranaires de18 ~9 Klebsie-la pneumoniae ~:.
Il) Vaccin anti-pneumococcique ARN `
ARN de Diplococcus pneumoniae 11,5 ~9 ARN de Diplococcus pneumoniae ll1,5 ~9 ARN de Diplococcus pneumoniae lll 1,5 ~g Polysaccharides capsulaires de3 ~9 Diplococcus pneumoniae ll `
Polysaccharides capsulaires de3 ~9 Diplococcus pneumoniae lll Glycoprotéines membranaires de20 ~9 Klebsiella pneumoniae III)Vaccin anti-bronchique -- i Ribosomes de Diplococcus pneumoniae I 1 ~g Ribosomes de Diplococcus pneumoniae ll 2 ~9 Ribosomes de Diplococcus pneumoniae lll 1 ~9 1 ~ ~ 3 ~ L 5; S
The present invention, carried out at the Center for Immunology and Pierre Fabre Biology, concerns acellular vaccines perfected.
It is already known from French patents 73 43 957, 75 10 252 and 76 24124, to prepare cell-free vaccines composed of ribosomes or acids ribosomal ribonucleic (RNA) associated with membrane polysaccharides and adjuvanted by membrane glycoproteins.
However, it has now become apparent that for some bacteria carrying capsules, the antigenic action and therefore vaccine of their ribosomes or RNA was strongly potentiated by the capsular polysaccharides corresponding to said ~
bacteria. ; ~;
This is why the present invention relates to a pro- ~ -yielded to potentiate the action of acellular vaccines containing as a vaccine principle RNA or r? bosomes-at least one bacterial strain with polysaccharide capsules, in which capsular polysaccharides are added to this vaccine extracts of at least one of said bacterial capsules capsules -i `polysaccharides.
This process is, in particular, usable for potentiate vaccines based on RNA or ribosomes pneumococci such as Diplococcus, in particular D. pneumoniae ~ `
:. :
as well as Klebsiella pneumQniae and Hemophil ~ us inFluenzae.
Of course, the compositions of the acellular vaccines ~ -are known and described in the French patents ~ cais cited;
previously.
In particular, these vaccines may contain, in addition to the RNA or ribosomes that make up the vaccine fraction :; -.
proper, membrane glycoproteins as an adjuvant and / or membrane polysaccharides. ;
ba amount of capsular polysaccharides added may vary within wide limits but will preferably be - 1 ~
~ 3 ~
included in a weight ratio of 2/1 to 1/2 compared to RNA or ribosomes of vaccine capsular bacteria.
It is not essential to get a vaccine potentiated according to the invention, to introduce polysaccharides capsular corresponding to all strains of bacteria cap-used in the vaccine, it is sufficient that it minus the capsular polysaccharides extracted from one of the strains encapsulated whose RNA or ribosomes are used in the vaccine. ::
Examples of advanced vaccines are given below according to the present invention:
I) Pneumococcal vaccine Ribosomes of Diplococcus pneumoniae 1 2; ug Ribosomes of Diplococcus pneumoniae ll 2 ~ g Ribosomes of Diplococcus pneumoniae lll 2 ~ 9 Capsular polysaccharides from 3 ~ 9 Diplococcus pneumoniae 1l Capsular polysaccharides from 3 ~ 9 Diplococcus pneumoniae lll 18 ~ 9 membrane glycoproteins Klebsie-la pneumoniae ~ :.
II) RNA pneumococcal vaccine Diplococcus pneumoniae 11.5 ~ 9 RNA
Diplococcus pneumoniae ll1.5 ~ 9 RNA
Diplococcus pneumoniae lll RNA 1.5 ~ g Capsular polysaccharides from 3 ~ 9 Diplococcus pneumoniae ll `
Capsular polysaccharides from 3 ~ 9 Diplococcus pneumoniae lll 20 ~ 9 membrane glycoproteins Klebsiella pneumoniae III) Bronchial vaccine - i Ribosomes of Diplococcus pneumoniae I 1 ~ g Ribosomes of Diplococcus pneumoniae ll 2 ~ 9 Ribosomes of Diplococcus pneumoniae lll 1 ~ 9
- 2 -5i5 Ribosomes de Klebsiella pneumoniae 2 ~9 Ribosomes d'Hemophilus influenzae 1 ~9 Ribosomes de Streptococcus pyogenes A12 1 -,ug ;
Polysaccharides capsulaires de2,5~9 Diplococcus pneumoniae 11 Polysaccharides capsulaires de2,5~9 Diplococcus pneumoniae 111 Polysaccharides capsulaires de3 119 Klebsiella pneumoniae Glycoprotéines de Klebsiella pneumoniae 24 ~g IV) Vaccin anti-bronc-hique . ribosomes de Diplococcus pneumoniae 11 2 ~9 . ribosomes de Klebsiella pneumoniae 2 ~ug . ribosomes d'Hemophilus influenzae 1 ~Ig . Polysaccharides capsulaires de Diplococcus pneumoniae 11 2,5,ug . Polysaccharides capsulaires de Klebsiella pneumoniae 2,5ug . Polysaccharides capsulaires -:
d'Hemophilus influenzae 1,5~9 . Glycoprotéines membranaires de Klebsiella pneumoniae 17 ~9 V) Vaccin anti-bronchique . ARN de Diplococcus pneumoniae 11 1,5 ;ug . ARN de Klebsiella pneumoniae1,5 ~9 . ARN d'Hemophilus influenzae1 ,ug . Polysaccharides capsulaires de ~ ~ :
Diplococcus pneumoniae 11 2 ~9 ;~
. Polysaccharides capsulaires de ... :
Klebsiella pneumoniae 2 ,ug . Polysaccharides capsulaires d'Hemophilus influenzae 1,5 ;ug : .
. Glycoprotéines membranaires de :-:
Klebsiella pneumoniae 15 ~9 : ,.
Les différents éléments de ces compositions peuvent être ~0 dosés notamment par des procédés décrits dan les brevets franc,ais cités précédemment.
Les polysaccharides capsulaires peuvent etre préparés, ~;~ ~ 3 ~
, ~ . . . ... . . . .
~ 3~
notamment, à partir d'une so1ution aqueuse de capsules par pré-cipitation 3 l'aide de chlorure de cétyl-pyridinium. Le complexe polysaccharide-chlorure de cétyl-pyridinium est dissocié par un sel inorganique tel que le chlorure de sodium 2M, dans ces conditions le polysaccharide passe en solution et le chlorure de cétylpyridin- ;
ium précipite. ~-On peut alors récupérer les polysaccharides, par exemple en ajoutant de l'éthanol à la solution de polysacc'narides qui ~ ' precipite. ~ ' Les polysaccharides peuvent ensuite ètre à nouveau lavés et purifiés. On peut laver les polysaccharides par un mélange eau/éthanol en présence d'acétate de sodium. ' ' Si on désire purifier les polysaccharides pour éliminer les protéines qui sont encore présentes, on peut extraire ces -protéines 3 partier d'une solution aqueuse de polysaccharides par du phénol, par exemple du phénol à 90~ à chaud.
Les polysaccharides contenus dans la phase aqueuse sont récupérés par précipitation 3 'l'éthanol.
L'invention concerne également les vaccins obtenus par ~
le procéde décrit précédemment. - ' On donne, ci-aprés, des exemples de préparation des différents composants des vaccins selon l'invention que ne la ~
limitent aucunement. ~ ' Procédé général de-fermentati'on ~ -Les souches bactériennes sont entretenues sur tubes de gélose inclinée et la production des biomasses est réalisée en trois étapes successives, tout d'abord en flacon de 500 ml statique à l'étuve puis dans un fermenteur de 20 1 qui est ensemencé au moyen des 500 ml du flacon et enfin dans un fermenteur industriel de 600 1 inoculé avec les 20 1 du fermenteur précedent.
Pour chaque germe3 une étude pilote sur fermenteur de 20 1 est réalisée préalablement afin de d~terminer les conditions ;
~''`' .
- 4 - ^
~, ~
optimales de developpement en ce qui concerne la ternpérature, le pH, l'oxyg~ne, la vitesse d'agitation et les temps de croissance.
Chacun de ces paramètres étant définis, son contrôle et sa régula- , "' tion automatique sont aussurés au niveau des fermenteurs de 20 et de 600 1.
Les cellules bactériennes sont recueillies en fin de phase de croissance par centrifugation continue à froid et lavées par dispersion dans du tampon tris-HCl, MgC12, pH7 et concentrées par un nouveau passage en centrifugation continue. Dans le cas de germes fragiles ayant tendance à s'autolyser, la culture est refroidie rapidement vers 8 à 10C avant le centrifugation.
La biomasse ainsi obtenue est conservée congelée en attendant d'être utilisée. Sur un prélèvement un contrôle bactériologique est réalisé afin de vérifier l'identité du germe '`' et l'absence de contaminants. La teneur en extrait sec est également déterminée. ~ r Procédé de préparat~on des polysaccharides capsulaires ''~; ~
Pour obtenir les polysaccharides capsulaires, les ~ ' cellules lavées sont dispersées dans un tampon tris-HCl 0,01 M, '' pH7, contenant NaCl 0,10 M et MgC12 0,01 M. La température de la suspension est portée à 40C et les capsules sont séparées par '~
homogénéisation quelques minutes dans un warring blendor à cette ~ ' température. ' Après refroidissement, les cellules décapsulées sont ; ~
séparées par une centrifugation de 30 minutes à 30.000 9 et 4C. '~' Le culot est conservé pour la préparation des ribosomes et de l'ARN ribosomal. Le surnageant contenant les capsules est ~' i~
recueilli.
Les polysaccharides capsulaires sont tout d'abord précipités à partir du surnageant parune additionl'ente d'une solution aqueuse d~e chlorure de cétylpyridinium 3 2%, jusqu'en fin de floculation. Après une heure de repos à 4C, le précipité
'~
de polysaccharide est recueilli par centrifugation et le surnageant écarté. ;~
Le complexe polysaccharide-chlorure de cétylpyridinium précipité est dissocié dans du chlorure de sodium 2M, dans ces conditions le polysaccharide passe en solution alors que le ~ ;
chlorure de cétylpyridinium est éliminé par centrifugation et le surnageant conservé.
Trois volumes d'alcool éthylique froid sont ajoutés au surnageant pour précipiter le polysaccharide qui est recueilli par centriFugation après une heure de repos à 4C. ~ :~
- Le polysaccharide précipité est lavé par dispersion dans un mélange eau-éthanol (30:70 v/v) contenant CH3C00 Na 0,1 M, pendant 30 minutes à température ambiante. La solution de lavage est éliminée par centrifugation et le culot est repris ;~
dans une solution aqueuse 0,1 M de CH3C00 Na.
Afin d'éliminer les protéines pouvant encore contaminer " :
la préparation à ce stade, il est procédé à une extraction 10 minutes à 65C par un volume de phénol à 90% dans l'acétate de sodium 1 M. Aprè~s agitation vive, 10 minutes à 65C, le mélange est refroidi rapidement dans un bain de glace et les deux phases sont séparées par centrifugation 5 minutes à 10.000 9 et 0C. La phase aqueuse supérieure est prélevée délicatement.
Trois volumes d'alcool éthylique froid sont ajoutés 3 la phase aqueuse et le polysaccharide est laissé en précipitation 1 heure à 4C.
Le précipité est recueilli par centrifugation puis dispersé dans un mélange eau-éthanol (30:70 v/v) contenant CH3C00 Na 0,1 M pendant 30 minutes 3 température ambiante. ;
Le précipité lavé est recueilli par centrifugation et repris dans l'eau distillée puis stérilisé par filtration sur membrane 0j22 et lyophilisé.
Procédé de préparation de la fraction ribosomale ~3 ~
La fraction ribosomale est préparée, soit à partir des cellules décapsulées obtenues précédemment lorsqu'il s'agit des ribosomes de bactéries capsulées, soit à partir des cellules obtenues dans le procédé général de fermentation après un éventuel lavage. Les cellules sont mises en suspension dans un tampon tris-HCl, MgC12, pH 7 et soumises à un broyage en continu dans un homogénéiseur équipé d'un réfrigérant à plaques sous une pression de ~00 kg/cm .
Le suspension de broyat bactérien est alors débarrassée des débris cellulaires par une centrifugation de 45 minutes à
30.000 9 et 4C; le surnageant clair, contenant les ribosomes, ` ~`-est conservé.
Les ribosomes bruts sont précipités une première fois du ~--surnageant précédent par addition de 0,8 volume d'alcool éthyligue -~
à -20C. Après un repos de 30 minutes à 4C, le précipité est ;
recueilli par centrifugation et repris dans une solution 3 0,5%
de sodium dodécyl sulfate dans le tampon tris HCl, MgC12, pH 7,2, à température ambiante avec une agitation rapide pendant une heure.
La suspension obtenue, contenant les ribosomes, est précipitée par 0,7 volume d'alcool éthylique 3 -20C. Après un repos de 30 minutes à température ambiante, les ribosomes sont `
recueillis par centrifugation à 15C et le culot est repris dans -le tampon tris-HCl, MgC12, pH 7 à 4C par agitation lente, une nuit .
à 4C.
La suspension obtenue est clarifiée par une centrifugation ;
à 30.000 9 à 0C pendant 45 minutes et le surnageant contenant les ribosomes puriFiés est conservé. ;
A ce stade, la solution peut être conservée congelée ~
en vue de la préparation de l'ARN ribosomal ou bien stérilisée ~`par filtration, puis lyophilisée. ~
Procédé d'extraction de l'ARN ribosomal ~ ~;
On extrait l'ARN ribosomal à partir de la fraction ~ 7 ~
ribosomale précédente non lyophilisée.
On mélange un volume de suspension de ribosomes et un volume de phénol 3 80% préalablement équilibré avec du tampon tris-HCl 0,01 M, pH 7, contenant EDTA O,OOl M (sel disodique) ; et O,5% de dodécylsulfate de sodium, puis la température du m~lange ; est port~e rapidement à 65C, et maintenue pendant 10 minutes sous agitation. Le mélange est ensuite refroidi rapidement dans un bain de glace.
Les deux phases sont séparées par centrifugation sous 10 10.000 9 pendant 5 minutes à 4C et la phase aqueuse supérieure , est recueillie avec précaution.
La phase aqueuse obtenue est ensuite réextraite deux fois dans les mêmes conditions par 1/2 volume de phénol à 80%. ~ ;
La phase aqueuse finale est recueillie et débarrassée du phénol résiduel par trois extractions successives avec chaque fois un volume d'éther, dans une ampoule à décanter. Un barbotage d'azote permet ensuite d'éliminer l'éther restant dans la phase aqueuse.
Onajoute alors à la phase aqueuse du chlorure de sodium ~ ;
20 pour obtenir une molarité de 0,1 M, l'ARN est précipité de cette h phase aqueuse par addition de deux volumes d'alcool à -20C. ;
Le précipité est recueilli par centrifugation sous,l o.obo g pendant 10 minutes à 0C. Le culot d'ARN est remis en suspension dans -du tampon tris-~Cl 0,025 M, pH 8,1, contenant NaCl 0,025 M pour avoir environ 2 mg d'ARN par ml de solution.
Procédé de purification de l'ARN ribosomal A la solution d'ARN obtenue précédemment on ajoute un ;
volume d'une solution 2,5 M de phosphate dipotassique et un volume de 2-méthoxyéthanol. Après une agitation énergique de 2 3 3 ;
30 minutes, le précipité est éliminé par centrifugation à 10.000 9 pendant 5 minutes à 4C. Le surnageant clair contenant l'ARN
est recueilli et mélangé avec un volume d'acétate de sodium 0,2 M. - 2 -5i5 Ribosomes of Klebsiella pneumoniae 2 ~ 9 Ribosomes of Hemophilus influenzae 1 ~ 9 Ribosomes of Streptococcus pyogenes A12 1 -, ug;
2.5 ~ 9 capsular polysaccharides Diplococcus pneumoniae 11 2.5 ~ 9 capsular polysaccharides Diplococcus pneumoniae 111 3 119 capsular polysaccharides Klebsiella pneumoniae Klebsiella pneumoniae glycoproteins 24 ~ g IV) Anti-brunch vaccine . ribosomes of Diplococcus pneumoniae 11 2 ~ 9 . ribosomes of Klebsiella pneumoniae 2 ~ ug . 1 ~ Ig Hemophilus influenzae ribosomes . Capsular polysaccharides of Diplococcus pneumoniae 11 2.5, ug . Capsular polysaccharides of Klebsiella pneumoniae 2,5ug . Capsular polysaccharides -:
of Hemophilus influenzae 1.5 ~ 9 . Membrane glycoproteins from Klebsiella pneumoniae 17 ~ 9 V) Bronchial vaccine . Diplococcus pneumoniae 11 RNA 1.5; ug . Klebsiella pneumoniae RNA 1.5 ~ 9 . Hemophilus influenzae1 RNA, ug . ~ ~ Capsular polysaccharides:
Diplococcus pneumoniae 11 2 ~ 9; ~
. Capsular polysaccharides of ...:
Klebsiella pneumoniae 2, ug . Capsular polysaccharides of Hemophilus influenzae 1.5; ug:.
. Membrane glycoproteins of: -:
Klebsiella pneumoniae 15 ~ 9:,.
The different elements of these compositions can be ~ 0 dosed in particular by methods described in the French patents, ais cited above.
Capsular polysaccharides can be prepared, ~; ~ ~ 3 ~
, ~. . . ... . . .
~ 3 ~
in particular, from an aqueous solution of capsules by pre-cipitation 3 using cetyl pyridinium chloride. The complex polysaccharide-cetyl-pyridinium chloride is dissociated by a salt inorganic such as 2M sodium chloride, under these conditions the polysaccharide goes into solution and the cetylpyridin chloride;
It precipitates. ~ -We can then recover the polysaccharides, for example by adding ethanol to the polysacc'narides solution which ~ ' precipitate. ~ ' The polysaccharides can then be washed again and purified. The polysaccharides can be washed by a mixture water / ethanol in the presence of sodium acetate. '' If we want to purify the polysaccharides to eliminate proteins that are still present, we can extract these -3 proteins from an aqueous solution of polysaccharides by phenol, for example phenol at 90 ~ hot.
The polysaccharides contained in the aqueous phase are recovered by precipitation 3 'ethanol.
The invention also relates to the vaccines obtained by ~
the procedure described above. - ' Examples of the preparation of the following are given below.
different components of the vaccines according to the invention than the ~
in no way limit. ~ ' General de-fermentati'on process ~ -The bacterial strains are maintained on tubes of inclined agar and the production of biomass is carried out in three successive stages, first in a 500 ml static bottle in the oven and then in a 20 1 fermenter which is inoculated with 500 ml bottle and finally in an industrial fermenter of 600 1 inoculated with the 20 1 of the previous fermenter.
For each germ3 a pilot study on fermenter of 20 1 is performed beforehand in order to determine the conditions;
~ '' ``.
- 4 - ^
~, ~
optimal development with regard to temperature, pH, oxygen, agitation speed and growth times.
Each of these parameters being defined, its control and regulation, "' are also ensured at the level of 20 fermenters and 600 1.
Bacterial cells are collected at the end of growth phase by continuous cold centrifugation and washed by dispersion in tris-HCl, MgC12, pH7 and concentrated buffer by a new passage in continuous centrifugation. In the case of fragile germs tending to self-lyse, the culture is cooled rapidly to 8-10C before centrifugation.
The biomass thus obtained is stored frozen in waiting to be used. On a direct debit bacteriological is carried out to verify the identity of the germ `` '' and the absence of contaminants. The dry extract content is also determined. ~ r Process for the preparation of capsular polysaccharides ''; ~
To obtain the capsular polysaccharides, the ~ ' washed cells are dispersed in 0.01 M tris-HCl buffer, '' pH7, containing 0.10 M NaCl and 0.01 MgCl2. The temperature of the suspension is brought to 40C and the capsules are separated by '~
homogenization a few minutes in a warring blendor to this ~ ' temperature. '' After cooling, the decapsulated cells are; ~
separated by centrifugation for 30 minutes at 30,000 9 and 4C. '~' The pellet is kept for the preparation of ribosomes and ribosomal RNA. The supernatant containing the capsules is ~ ' i ~
collected.
The capsular polysaccharides are first of all precipitated from the supernatant by addition of one aqueous solution of cetylpyridinium chloride 3 2%, up to end of flocculation. After an hour of rest at 4C, the precipitate '~
of polysaccharide is collected by centrifugation and the supernatant dismissed. ; ~
The polysaccharide-cetylpyridinium chloride complex precipitate is dissociated in 2M sodium chloride, in these conditions the polysaccharide goes into solution while the ~;
cetylpyridinium chloride is removed by centrifugation and the preserved supernatant.
Three volumes of cold ethyl alcohol are added to the supernatant to precipitate the polysaccharide which is collected by centriFugation after an hour of rest at 4C. ~: ~
- The precipitated polysaccharide is washed by dispersion in a water-ethanol mixture (30:70 v / v) containing 0.1 M CH3C00 Na, for 30 minutes at room temperature. The solution of washing is eliminated by centrifugation and the pellet is taken up; ~
in 0.1 M aqueous solution of CH3C00 Na.
To remove proteins that may still contaminate ":
preparation at this stage it is carried out an extraction 10 minutes at 65C with a volume of 90% phenol in acetate of sodium 1 M. After vigorous stirring, 10 minutes at 65C, the mixture is quickly cooled in an ice bath and both phases are separated by centrifugation for 5 minutes at 10,000 9 and 0C. The upper aqueous phase is gently removed.
Three volumes of cold ethyl alcohol are added to the phase aqueous and the polysaccharide is left in precipitation for 1 hour at 4C.
The precipitate is collected by centrifugation and then dispersed in a water-ethanol mixture (30:70 v / v) containing CH3C00 Na 0.1 M for 30 minutes 3 room temperature. ;
The washed precipitate is collected by centrifugation and taken up in distilled water then sterilized by filtration on membrane 0j22 and freeze-dried.
Process for the preparation of the ribosomal fraction ~ 3 ~
The ribosomal fraction is prepared, either from decapsulated cells obtained previously when it comes to ribosomes of bacteria encapsulated, either from cells obtained in the general fermentation process after a possible washing. Cells are suspended in buffer tris-HCl, MgC12, pH 7 and subjected to continuous grinding in a homogenizer equipped with a plate cooler under a pressure of ~ 00 kg / cm.
The suspension of bacterial ground material is then freed cellular debris by centrifugation for 45 minutes at 30,000 9 and 4C; the clear supernatant, containing the ribosomes, `~` -is kept.
The crude ribosomes are first precipitated from ~ -previous supernatant by adding 0.8 volume of ethyl alcohol - ~
at -20C. After standing for 30 minutes at 4C, the precipitate is;
collected by centrifugation and taken up in a 0.5% solution 3 sodium dodecyl sulfate in the tris HCl, MgC12 buffer, pH 7.2, at room temperature with rapid stirring for one hour.
The suspension obtained, containing the ribosomes, is precipitated by 0.7 volume of ethyl alcohol 3 -20C. After a 30 minute rest at room temperature, the ribosomes are `
collected by centrifugation at 15C and the pellet is taken up in -the tris-HCl buffer, MgCl2, pH 7 to 4C by slow stirring overnight.
at 4C.
The suspension obtained is clarified by centrifugation;
at 30,000 9 at 0C for 45 minutes and the supernatant containing the purified ribosomes is preserved. ;
At this stage, the solution can be stored frozen ~
for the preparation of ribosomal RNA or sterilized ~ `by filtration, then lyophilized. ~
Method for extracting ribosomal RNA ~ ~;
Ribosomal RNA is extracted from the fraction ~ 7 ~
previous ribosomal not lyophilized.
A volume of ribosome suspension and a volume of phenol 3 80% previously balanced with buffer 0.01 M tris-HCl, pH 7, containing EDTA O, OOl M (disodium salt) ; and 0.5% sodium dodecyl sulfate, then the temperature of the mixture ; is brought quickly to 65C, and maintained for 10 minutes under agitation. The mixture is then rapidly cooled in an ice bath.
The two phases are separated by centrifugation under 10 10,000 9 for 5 minutes at 4C and the upper aqueous phase , is collected with care.
The aqueous phase obtained is then reextracted two times under the same conditions per 1/2 volume of 80% phenol. ~;
The final aqueous phase is collected and cleared residual phenol by three successive extractions with each times a volume of ether, in a separatory funnel. Bubbling nitrogen then eliminates the ether remaining in the phase aqueous.
Then added to the aqueous phase sodium chloride ~;
20 to obtain a molarity of 0.1 M, the RNA is precipitated from this h aqueous phase by addition of two volumes of alcohol at -20C. ;
The precipitate is collected by centrifugation under, l o.obo g for 10 minutes at 0C. The RNA pellet is resuspended in -Tris buffer ~ 0.025 M Cl, pH 8.1, containing 0.025 M NaCl have about 2 mg of RNA per ml of solution.
Method for purifying ribosomal RNA
To the RNA solution obtained previously, one is added;
volume of 2.5 M dipotassium phosphate solution and one volume of 2-methoxyethanol. After vigorous stirring of 2 3 3;
30 minutes, the precipitate is removed by centrifugation at 10,000 9 for 5 minutes at 4C. The clear supernatant containing the RNA
is collected and mixed with a volume of 0.2 M sodium acetate
3~
L'ARN est alors précipité par addition lente de 0,5 volume d'une solution aqueuse à 1~ de bromure de cétyl-triméthylammonium.
Après un repos de 5 minutes 3 4C le précipité d'AR N
est recueilli par centrifugation sous 10.000 9 pendant 5 minutes 3 4C. Le tube de centrifugation est parfaitement essuyé et le précipité lavé deux fois par un exc~s d'alcool à 70~ contenant CH3C00 Na 0,1 M.
. Le précipité d'ARN est alors remis en solution dans du tampon tris-HCl, pH 7, et dialysé une nuit à 2C contre 20 volumes de ce tampon puis lyophilisé après stérilisation par filtration.
Procédé de préparation des glycoprotéines membranaires Les glycoprotéines membranaires sont préparées à partir des broyats bactériens obtenus, par exemple, par mise en suspen-sion des cellules bactériennes obtenues après fermentation dans `:
un tampon tris-HCl, MgC12, pH 7, et broyage en continu dans un ;: ;
homo~énéiseur équipé d'un réfrigérant à plaques sous une pression ~ ~:
de 600 kg/cm2. Le broyat est centrifugé dans le tampon précédent :;,,,:
. à 7.500 g pendant 15 minutes pour éliminer un culot de sédimenta-tion qui contient. les débris cellulaires, puis le surnageant est centrifugé à 30.000 9 pendant 15 minutes pour sédimenter les ` :-:
membranes. La fraction membranaire obtenue, après éventuelle-ment trois cycles de lavage par centrifugation dans des tampons de `~
force ionique décroissante, est suspendue dans l'eau distillée et lyophilisee. .
Le lyophilisat est ensuite soumis à deux extractions . :
successives de deux heures à température ambiante: la première par un melange chloroforme-méthanol (2:1), le deuxième par un . -~
mélange éthanol-éther (3:1~.
Le résidu dégraissé est séché et utilisé pour préparer les glycoprotéines membranaires.
Après remise en suspension du résidu dans une solution ~ ~ , e3~
aqueuse à 2~ de sodium dodécyl sulfate et clarification par centrifugation 15 minutes 3 10.000 tr/min., les glycoprotéines sont précipitées du surnageant par addition de 3 volumes d'éthanol , et quelques ml d'une solution concentrée d'acétate de sodium.
Après un repos d'une heure 3 température ambiante, le r précipité est recueilli par centrifugation et repris dans l'eau distillée.
La reprise est clarifiée par centrifugation 15 minutes à 10.000 tr/min. et le surnageant contenant les glycoprotéines est lyophilisé.
Ces procédés sont utilisés pour préparer les composants utilisés dans les expériences ci-dessous.
Expérience 1 Dans cette expérience on teste l'activité de l'association ribosomes + Polysaccharides capsulaires de Diplococcus pneumoniae.
On utilise 4 groupes de 10 souris.
Chaque souris du groupe A est traitée par 7 ~9 de ribosomes de D. pneumoniae.
Chaque souris du groupe B est traitée par 10 ~9 de polysaccharides capsulaires de D. pneumoniae. `:
Chaque souris de groupe C est traitée par une association , ~ .
de 7 ~g de ribosomes et 10 ~g de polysaccharides capsulaires de D. pneumoniae.
,:
Le groupe D est non traité.
- Chaque dose indiquée est injectée en 5 fois par voie sous-cutane~e au rythme d'une injection tous les trois jours pendant 15 jours. ~- -10 jours après la dernière injection, les animaux sont ponctionnés par les sinus rétro-orbitaires et le sérum est étudié:
1) en immunodiffusion (technique d'Ouchterlony) 2) en immunoélectrodiffusion (technique de Laurell) - 1 0 - , ,:
~3~5 '~
en gel d'agarose à 1~ en tampon de véronal, pH 8,6 contre de l'antigène de D. pneurnoniae total.
En immunodiffusion Contre un antigène total 3iplococcus pneumoniae le s~rum :
des souris traitées du groupe C fait appara~tre des arcs de précipitation identiques en nombre à un sérum de souris vaccinée avec d.e l'antigène Diplococcus pneumoniae total.
En immunoélectrodiffusion .
Contre un antig~ne total Diplococcus pneumoniae, le sérum des souris du groupe C forme un immunoprécipité spécifique en forme de "rocket" dont la hauteur est très supérieure à celle ~:~
de "rocket" obtenue avec du sérum des souris du groupe A ou du groupe B.
La hauteur des "rocket'' peut varier dans des proportions .~
qui vont du double au quintuple en taux d'anticorps spécifiques, ~ .:
suivant les souris, par rapport aux résultats obtenus dans le ~ :~
groupe A. ;
Expérience 2 :.
.~ :
On effectue les memes expériences que précédemment en ~O remplaçant les 7 ~9 de ribosomes de D. pneumoniae par 5 ~9 d'ARN de _. pneumoniae.
En immunodiffusion Contre un antigène total Diplococcus pneumoniae, le .
sérum des souris traitées avec l'association (groupe C) fait appara~tre desarcs de précipitation identiques en nombre à un sérum de souris vaccinée avec de l'antigène Diplococcus ,:
pneumoniae total. ~ :.
~' En immunoélectrodiffusion Contre un antigène total Diplococcus pneumoniae, le : .
sérum des souris du groupe C forme un immuno précipité spécifique en forme de "rocket" dont la hauteur est très supérieure à la hauteur de "rocket'l formée par du sérum anti-ARN de Diplococcus ~.:
3~
pneumoniae (groupe A) ou par du s~rum anti-polysaccharides capsulaires de Diplococcus pneumoniae (groupe B) contre un antigène Diplococcus pneumoniae également.
Cette hauteur de "rocket" pour le groupe C peut varier dans des porportions qui vont du double au quintuple en taux d'anticorps spécifiques suivant les souris par rapport aux résultats obtenus pour le groupe A.
Expérience 3 Cette expérience a pour but l'étudier un vaccin plus complete que dans l'expérience 1.
On utilise pour ce faire 10 souris formant le groupe E
et on injecte à ces animaux une association de: -3,5 ~9 de ribosomes de D. pneumoniae, 5,- ~9 de polysaccharides capsulaires de D. pneumoniae, 12,- ~19 de glycoprotéines membranaires de Klebsiella pneumoniae, :
au même rythme que dans l'expérience 1. . :
. Le sérum des animaux ponctionnés comme précédemment `:.
donne en immunoélectrodiffusion:
- un immuno précipité spécifique en forme de "rocket"dont la hauteur est deux fois supérieure aux résultats obtenus sur le groupe C de l'expérience 1. ~ ~:
Expérience 4 On opère comme dans l'expérience 2 pour étudier un `
vaccin plus complet que celui de l'expérience 2. .
On utilise pour ce faire 10 souris formant le groupe F
et on injecte 3 ces animaux une association de:
2,5 ~9 d'ARN de D. pneumoniae 5,- ~9 de polysaccharides capsulaires de D. pneumoniae 10,- ~g de glycoprotéines membranaires de Klebsiella pneumoniae, au même rythme que dans l'expérience 2.
~3~5~i .
Le sérum de ces animaux ponctionnés comme précédemment donne en immunoélectrodiffusion:
- un immuno précipité spécifique en forme de "rocket"
dont la hauteur est deux fois supérieure aux résultats obtenus pour le groupe C de l'expérience 2. ;
On constate donc que les vaccins selon la présente `~
invention présente une activité vaccinante très supérieure aux vaccins de la technique antérieure.
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The RNA is then precipitated by the slow addition of 0.5 volume of a 1 ~ aqueous solution of cetyl-trimethylammonium bromide.
After a rest of 5 minutes 3 4C the precipitate of AR N
is collected by centrifugation under 10,000 9 for 5 minutes 3 4C. The centrifuge tube is perfectly wiped and the precipitate washed twice with an excess of 70% alcohol CH3C00 Na 0.1 M.
. The RNA precipitate is then redissolved in tris-HCl buffer, pH 7, and dialyzed overnight at 2C against 20 volumes of this buffer then lyophilized after sterilization by filtration.
Process for the preparation of membrane glycoproteins Membrane glycoproteins are prepared from ground bacteria obtained, for example, by suspending sion of the bacterial cells obtained after fermentation in `:
a tris-HCl buffer, MgC12, pH 7, and continuous grinding in a;:;
homo ~ eneiser equipped with a plate cooler under pressure ~ ~:
600 kg / cm2. The ground material is centrifuged in the preceding buffer :; ,,,:
. at 7,500 g for 15 minutes to remove a sediment pellet tion that contains. cell debris and then the supernatant is centrifuged at 30,000 9 for 15 minutes to sediment `: -:
membranes. The membrane fraction obtained, after possible-ment three washing cycles by centrifugation in buffers of `~
decreasing ionic strength, is suspended in distilled water and lyophilized. .
The lyophilisate is then subjected to two extractions. :
two hours at room temperature: the first with a chloroform-methanol mixture (2: 1), the second with one. - ~
ethanol-ether mixture (3: 1 ~.
The degreased residue is dried and used to prepare membrane glycoproteins.
After resuspending the residue in a solution ~ ~, e3 ~
aqueous to 2 ~ sodium dodecyl sulfate and clarification by centrifugation 15 minutes 3 10,000 rpm, glycoproteins are precipitated from the supernatant by the addition of 3 volumes of ethanol, and a few ml of a concentrated solution of sodium acetate.
After standing for 1 hour at room temperature, the r precipitate is collected by centrifugation and taken up in water distilled.
Recovery is clarified by centrifugation for 15 minutes at 10,000 rpm. and the supernatant containing the glycoproteins is freeze-dried.
These processes are used to prepare the components used in the experiments below.
Experiment 1 In this experiment we test the activity of the association ribosomes + Capsular polysaccharides of Diplococcus pneumoniae.
4 groups of 10 mice are used.
Each group A mouse is treated with 7 ~ 9 of ribosomes of D. pneumoniae.
Each group B mouse is treated with 10 ~ 9 of capsular polysaccharides of D. pneumoniae. `:
Each group C mouse is treated by a combination , ~.
7 ~ g of ribosomes and 10 ~ g of capsular polysaccharides D. pneumoniae.
,::
Group D is untreated.
- Each indicated dose is injected 5 times per route subcutaneous at the rate of one injection every three days for 15 days. ~ - -10 days after the last injection, the animals are punctured by the retroorbital sinuses and the serum is studied:
1) in immunodiffusion (Ouchterlony technique) 2) in immunoelectrodiffusion (Laurell technique) - 1 0 -,,:
~ 3 ~ 5 '~
in agarose gel at 1 ~ in veronal buffer, pH 8.6 against the total D. pneurnoniae antigen.
In immunodiffusion Against a total antigen 3iplococcus pneumoniae s ~ rum:
treated mice of group C shows arcs of identical precipitation in number to a serum of vaccinated mice with total Diplococcus pneumoniae antigen.
In immunoelectrodiffusion.
Against a total diplococcus pneumoniae antigen, the serum from group C mice forms a specific immunoprecipitate in the shape of a "rocket" whose height is much greater than that ~: ~
"rocket" obtained with serum from group A mice or group B.
The height of the "rockets" can vary in proportions. ~
which go from double to five times the rate of specific antibodies, ~.:
according to the mice, compared to the results obtained in the ~: ~
group A.;
Experiment 2:.
. ~:
We carry out the same experiments as previously in ~ O replacing the 7 ~ 9 of D. pneumoniae ribosomes by 5 ~ 9 _ RNA. pneumoniae.
In immunodiffusion Against a total diplococcus pneumoniae antigen,.
serum from mice treated with the combination (group C) made appear precipitation arcs identical in number to one mouse serum vaccinated with Diplococcus antigen ,::
total pneumoniae. ~:.
~ ' In immunoelectric broadcasting Against a total diplococcus pneumoniae antigen, the:.
serum from group C mice forms a specific immunoprecipitate in the shape of a "rocket" whose height is much greater than the height of "rocket'l formed by anti-RNA serum from Diplococcus ~ .:
3 ~
pneumoniae (group A) or with anti-polysaccharide s ~ rum Diplococcus pneumoniae capsular (group B) against a Diplococcus pneumoniae antigen also.
This height of "rocket" for group C can vary in portions that range from double to five times the rate specific antibodies according to mice compared to results obtained for group A.
Experiment 3 This experiment aims to study a more complete than in experiment 1.
To do this, 10 mice forming the group E are used.
and these animals are injected with a combination of: -3.5 ~ 9 of D. pneumoniae ribosomes, 5, - ~ 9 of capsular polysaccharides of D. pneumoniae, 12, - ~ 19 of Klebsiella membrane glycoproteins pneumoniae,:
at the same rate as in experiment 1.. :
. The serum of the animals punctuated as previously `:.
gives in immunoelectrodiffusion:
- a specific immuno-precipitate in the form of a "rocket" including the height is twice the results obtained on the group C of experience 1. ~ ~:
Experiment 4 We operate as in experiment 2 to study a `
more complete vaccine than that of experiment 2..
To do this, we use 10 mice forming the group F
and these 3 animals are injected with a combination of:
2.5 ~ 9 of D. pneumoniae RNA
5, - ~ 9 of capsular polysaccharides of D. pneumoniae 10, - ~ g of Klebsiella membrane glycoproteins pneumoniae, at the same rate as in experiment 2.
~ 3 ~ 5 ~ i .
The serum of these animals punctuated as before gives in immunoelectrodiffusion:
- a specific immuno-precipitate in the form of a "rocket"
whose height is twice the results for group C of experiment 2.;
It is therefore found that the vaccines according to the present `~
invention has a vaccinating activity far superior to Prior art vaccines.
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