Procédé de préparation d'un antigène staphylococcique
La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'un nouveau produit antigénique staphylococcique, caractérise en ce que l'on fait réagir une matière protoplasmique provenant d'une souche de staphylocoque doré identifiable par la propriété de former des colonies semi-opaques, diffuses et peu cohérentes par culture dans un milieu de culture de gélose mou ou semi-solide contenant du plasma, du sérum ou des composants protéiques de ceux-ci, avec un acide aqueux à un pH d'au plus 4.
On obtient ainsi une solution aqueuse contenant un polysaccharide immunogène, désigné ci-après polysaccharide II p. Cette solution, après ajustage à un pH acceptable pour l'injection, est capable de stimuler la formation d'un anticorps protecteur contre le staphylocoque doré.
Les propriétés morphologiques des souches particulières de staphylocoque doré qui sont utilisées conformément à l'invention sont éminemment caracté- ristiques, car la grande majorité des souches de staphylocoque doré forment des colonies cohérentes, opaques, compactes et denses dans les mmes conditions de culture et ne conviennent pas comme source de matière de départ pour le procédé selon l'inven- tion. Comme exemples de souches de staphylocoque doré utilisables, on peut citer les souches UC76,
Smith, S193N4, H & D, Castellani, MCD138,
SK4473, K6, K93 et K93M. Parmi celles-ci, les souches K93M, MCD138, S193N4 et UC76 sont préfé- rées.
Toutes ces souches de staphylocoque doré ont été déposées dans la collection de cultures de Parke,
Davis & Company, Detroit, Michigan, USA, et dans la collection de cultures du Fermentation Laboratory, Northern Utilization Research and Development Division, Département de l'Agriculture des USA, Peoria, Illinois, sous les numéros donnés dans le tableau suivant :
N de la collection N de la collection
Parke, Davis & Co. du Norbhern Utilization
Researoh Laboratory
UC76 05068 NRRL B-2467
Smith 05067 NRRL B-2468
S193N4 05089 NRRL B-2469
H & D 05087 NRRL B-2471
Castellani 05088 NRRL B-2472
MCD138 05085 NRRL B-2473
SK4473 05086 NRRL B-2474
K6 05090 NRRL B-2475
K93 05091 NRRL B-2476
K93M 05092 NRRL B-2477
La matière protoplasmique immunogène employée comme matière de départ dans le procédé selon l'in- vention peut tre les cellules intactes de l'organisme particulier ou un fragment, constituant ou produit d'altération cellulaire possédant des propriétés im munogènes. Lorsque la matière protoplasmique immunogene consiste en cellules intactes, celles-ci peuvent tre vivantes (capables de se reproduire),
tuées (incapables de se reproduire) ou tre un mélange des deux. La méthode précise employée pour obtenir des staphylocoques tués ou par- tiellement tués n'a pas une importance détermi- nante. Parmi les méthodes utilisables, on peut mentionner un chauffage à environ 600 C pendant 1 h à 1 1/2 h, un traitement par 3-propiolactone (0,1 à 0,2 /o à 370 C pendant 2 h) ou par le phénol (I O/o à 250 C pendant environ 18 h).
Comme autres exemples de matière protoplasmi- que immunogène convenant comme matière de dé- part dans le procédé selon l'invention, on peut citer les matières immunogènes obtenues par un traitement physique ou chimique qui désagrège les cellules des souches particulières de staphylocoque doré sans dé- truire leurs propriétés immunogènes.
Ainsi, ces matières protoplasmiques immunogènes qui conviennent t comme matière de départ dans le procédé selon l'in- vention peuvent tre les débris cellulaires provenant d'une désagrégation mécanique des cellules intactes ; la matière insoluble dans le phénol et insoluble dans l'eau restant après extraction des cellules intactes avec du phénol et un solvant aqueux ; la fraction soluble dans l'eau obtenue par extraction des cellules intactes avec du phénol et un solvant aqueux ; et d'autres fragments et extraits cellulaires des souches particulières de staphylocoque doré.
La fraction hydrosoluble susmentionnée provenant de l'extraction des cellules intactes avec du phénol et un solvant aqueux contient un autre polysaccharide immunogène, désigné polysaccharide I et décrit en détail plus loin.
Dans la mise en oeuvre du procédé selon l'inven- tion, le traitement de la matière protoplasmique immunogène par un acide aqueux à un pH d'environ 4 ou inférieur peut tre conduit au moyen d'acides organiques ou inorganiques très divers. Parmi les nombreux acides utilisables, on peut citer les acides acétique, formique, propionique, monochloracétique, tri chloracétique et chlorhydrique aqueux. La durée et la température du traitement par l'acide aqueux sont t choisies en fonction de la force de l'acide utilisé, afin que la matière de départ soit convertie en polysaccharide désiré sans hydrolyse excessive en unités saccharidiques séparées.
En général, lorsqu'on opère à un pH de 2-4, on chauffe la suspension ou solution de la matière de départ, alors que le traitement est de préférence effectué à la température ordinaire lorsqu'on opère à un pH inférieur à 2 et spécialement en présence d'acides minéraux et d'autres acides forts tels que l'acide trichloracétique. Bien qu'un bref traitement à un pH inférieur à 0 puisse convenir, ces conditions ne sont pas recommandées, car elles provoquent une hydrolyse plus prononcée du produit désiré.
L'acide acétique dilué est un acide préféré et, avec cet acide, il convient de chauffer la suspension ou solution de la matière de départ, dans de 1'acide acétique 0,1-normal pendant 5-60 mn à environ 121"C, sous pression, bien que l'on puisse s'écarter fortement de ces conditions de réaction et obtenir des résultats satisfaisants.
Après le traitement par l'acide aqueux à un pH d'environ 4 ou inférieur, le produit désiré est présent dans la solution aqueuse. Cette dernière est refroidie si nécessaire et séparée du résidu insoluble éventuel par centrifugation, filtration, décantation ou par des moyens analogues.
La solution aqueuse ainsi obtenue contient du polysaccharideII et peut tre utilisée comme vaccin ou pour l'isolement de polysaccharide II purifie. Pour l'emploi comme vaccin, le pH est ajusté à une valeur rendant la solution acceptable pour l'injection.
Le polysaccharide peut tre obtenu sous forme e d'une substance solide brute par élimination de 1'eau de la solution aqueuse ou du vaccin. De préférence, les solutions aqueuses ou les vaccins sont congelés, après dialyse, et sèches à l'état congelé, ce qui fournit un produit solide brut présentant un maximum d'absorption dans l'ultraviolet à environ 256-261 milmicrons en raison de la présence d'acides nucléiques comme impuretés.
Le polysaccharide peut etre purifié par chromatographie, par formation d'un complexe d'ammonium quaternaire insoluble, par préci- pitation des impuretés au moyen d'un alcool, spécia- lement d'un alcanol inférieur tel que l'éthanol en présence de sels tels que l'acétate de sodium ou le sulfate de sodium, ou par une combinaison de ces méthodes.
Après la purification par chromatographie, par formation d'un complexe d'ammonium quaternaire ou par précipitation des impuretés au moyen d'un alcool, le polysaccharide est normalement présent à l'état de sel en solution aqueuse et il est isolé sous forme d'un solide blanc purifié par dialyse de la solution et évaporation ou lyophilisation. Les produits obtenus par lyophilisation sont partiellement hydratés et sont normalement utilisés dans cet état pour les mesures et applications physiques, chimiques et biologiques. Un produit plus sec est obtenu par séchage à 500 C, et on utilise normalement ce dernier pour les microanalyses élémentaires et parfois pour d'autres déterminations.
Sauf indication contraire, les chiffres donnés dans cet exposé se rapportent à des échantillons lyophilisés mais non autrement sèches.
Le polysaccharide II est une substance à haut poids moléculaire comprenant un grand nombre d'unités saccharidiques individuelles. Le polysaccharide II contient des groupes carboxyles et peut donc exister sous forme d'acide libre ou sous forme de divers sels, tels que sels de sodium, de potassium, de calcium, de magnésium, d'ammonium et d'aminés, et de leurs mélanges. La forme d'acide libre et les formes de sel simple ont des propriétés chimiques, physiques et biologiques semblables et peuvent tre facilement transformées l'une dans l'autre à un pH convenable, et sont donc considérées comme équivalentes pour les buts visés par l'invention. Sauf indication contraire, on ne fait pas de distinction dans le présent exposé entre le polysaccharide II sous forme d'acide libre et ses formes de sel simple.
Identification ggngrale
Le polysaccharide II est blanc, soluble dans 1'eau, stable à chaud et non dialysable. Il contient des groupes carboxyles et, sous forme d'acide libre, il ne contient que les éléments carbone, hydrogène, oxygène et azote. Sous les formes d'acide libre et de sel simple, il est fortement lévogyre. Le pouvoir rotatoire spécifique de l'acide libre après séchage à 500C à poids constant est (a) D =-79, 4O en solution aqueuse.
Par des microanalyses d'échantillons sèches et des mesures du poids équivalent, la formule brute de l'acide libre a été déterminée comme étant CjgHggNgO. Le polysaccharide II est de nature po lymère et de très haut poids moléculaire.
Analyse spectroscopique
Dans le dessin, la fig. 1 représente le spectre d'absorption dans l'infrarouge du polysaccharide I sous forme d'acide libre dans un disque de bromure de potassium (micro-détermination). Des maximums d'absorption dans l'infrarouge apparaissent à 2,97 ; 3,22 ; 3, 40 ; 5, 78 ; 6,08 ; 6,41 ; 6,47 ; 7,02 ; 7,28 ; 7,64 ; 8, 09 ; 8, 85 ; 9,49 ; 10,83 ; 11,13 et 11,52 microns. Le polysaccharide I est seniblable au polysaccharide II par certaines propriétés physiques, chimiques et biologiques, mais les mesures physiques indiquent que le degré de polymérisation de ces substances est différent. La fig. 2 donne le spectre d'absorption dans l'infrarouge du polysaccharide II, forme d'acide libre, dans un disque de bromure de potassium.
Des maximums d'absorption apparaissent à 2,95 ; 3, 22 ; 3, 33 ; 3, 37 ; 5,73 ; 6,00 ; 6,43 ; 6,96 ; 7,24 ; 7, 61 ; 8, 04 ; 8, 77 ; 9,49 ; 10,83 ; 11,13 et 11,52 microns. Les formes salifiées présentent éga- lement des spectres d'absorption caractéristiques, comme décrit dans la partie expérimentale.
Le polysaccharide II ne présente pas d'absorption sélective dans l'ultraviolet. Cependant, les mesures d'absorption dans l'ultraviolet sont utiles pour déterminer ! a présence d'impuretés exerçant une absorption caractéristique dans l'ultraviolet, notamment des acides nucléiques.
Dosage biologique
Une unité immunologique d'activité a été établie et cette unité est utile pour les analyses quantitatives en laboratoire des préparations de polysaccharide brutes et purifiées ainsi que des solutions aqueuses dont elles proviennent. L'unité d'activité, appelée unité protectrice souris o, est la quantité de matière capable de protéger 50 ouzo d'un groupe de souris contre une agression par 10 000 fois la quantité de staphylocoques capables de tuer 50 ouzo d'un groupe témoin de souris normales.
La substance immunogène est administrée par voie sous-cutanée 7 jours avant l'agression, et cette dernière se fait par administration intrapéritonéale de staphylocoques dans de la mucine. Pour le dosage standard, la souche UC76 de staphylocoque doré est utilisée pour l'agression.
L'activité d'une préparation peut tre exprimée par le nombre d'unités protectrices souris par milligramme ou par millilitre de solution, ou par le nombre de DP50 (doses p. rotectrices a 50 /o) par milligramme ou par millilitre de solution contre une agression de 10000 DL50 (dose léthale à 50 /o). On constate que les préparations purifiées de polysaccharide II contiennent environ 300 000 unités protectrices souris (ou DP50) par milligramme, ou 300 par microgramme. Pour l'estimation de la pureté par dosage immunologique, il faut tenir compte comme d'habitude des erreurs expérimentales affectant les mesures biologiques.
Le polysaccharide II et ses sels, ainsi que les vaccins les contenant, sont capables de stimuler la formation d'un anticorps protecteur et, par administration parentérale, de développer un degré élevé d'immunité, non seulement contre l'infection par la souche de staphylocoque doré employée pour leur préparation, mais également contre l'infeotion par d'autres souches de staphylocoque doré. Comme le polysaccharide II et ses sels peuvent tre purifiés, caractérisés et normalisés avec précision, la repro ductibilité de leur composition chimique et de leur effet clinique est excellente.
Exemple 1
On maintient une culture-mère de la souche
UC76 de staphylocoque doré sur un milieu de culture de composition suivante :
Ingrédients Quantité
Peptone obtenue par digestion pancréati
que de la caséine (Trypticase) 17,0 g
Produit de digestion papaïque de la fa
rine de soja (Phytone) 3,0 g
Chlorure de sodium 5,0 g
Phosphate dipotassique 2,5 g
Glucose 2,5 g
Eau distillée 1000,0 ml
Pour l'emploi, on stérilise ce milieu à l'autoclave à 118-121o C pendant 15 mn. On cultive l'organisme pendant 18-24h à 35-370C et on le maintient sur le mme milieu par transfert une fois par semaine.
On prépare des cultures d'ensemencement en inoculant de grands tubes à essai contenant 30ml du milieu de culture ci-dessus avec environ 0, 3 ml de culture-mère et en incubant à 35-370 C pendant 624 h. Un tube de culture d'ensemencement est prévu pour chaque fiole de production. On prépare une série de fioles de production, contenant chacune 1000 ml du milieu stérilisé décrit ci-dessus. On ensemence chaque fiole avec 30ml de la culture de 6-24 h et on incube à 35-370C pendant 24h. On ajoute une quantité de phénol (de qualité purifiée) pour une concentration de 1"/o (poids/vol) et, après mélange, on laisse reposer la culture à la température ordinaire jusqu'au lendemain pour l'inactivation.
Ensuite, on centrifuge la suspension de cellules dans une centrifugeuse à turbine à air Sharples de laboratoire, à la température ordinaire et à un débit d'environ 250 ml par mn. On recueille les cellules agglomérées, on les remet en suspension dans le 1/lo du volume de la culture originale d'une solution saline à 0,85 O/o dans un mélangeur de Waring, et on les recueille à nouveau par centrifugation. Le nombre de cellules obtenu est calculé d'après un facteur de conversion d'environ 1 X 1012 cellules pour 2,4 g de cellules agglomérées humides, telles que provenant de la centrifugation. Le poids des cellules sèches est d'environ 28 oxo du poids des cellules humides.
On ajoute à la masse cellulaire du phénol contenant une quantité d'eau faible et mesurée de manière à le rendre liquide, à raison de 9 ml de phénol pour 1 X 1012 cellules. On met le solide en suspension et, par une nouvelle addition de phénol ou d'eau, on porte la suspension à un volume calculé de 10,58 ml pour chaque 1 X I012 cellules et a une concentration de phénol calculée de 85 1 O/o (en volume).
On porte la suspension phénolique de cellules à une température de 24 20 C et on la mélange dans un mélangeur Waring pendant 8-10 mn, en maintenant la température en dessous d'environ 50 C. L'émul- sion obtenue par cette opération est centrifugée par portions à 2500 t/mn, à la température ordinaire et pendant 30-60 mn. On abandonne le liquide limpide et on remet les culots solides en suspension dans du phénol à 85 ouzo en volume, à raison de 10 ml de phénol à 85 O/o pour 1 X 1012 cellules originales et on mélange pendant 1-2 mn dans un mélangeur Waring. On recueille à nouveau la masse cellulaire par centrifugation et on abandonne le liquide.
On remet la masse cellulaire en suspension dans de 1'eau distillée en quantité donnant un volume de 5,0-5,5 ml par 1 X 10t2 cellules originales et on dialyse la suspension pendant 24-48 h contre de l'eau de conduite courante froide, puis jusqu'au lendemain contre un volume fixe d'eau distillée à environ 40 C. Si né- cessaire, on répète la dialyse jusqu'à ce que la réac- tion du phénol avec le chlorure ferrique soit négative.
On amène la suspension au pH 7,4 0,2 avec du NaOH 0, 1 N et on la centrifuge à la température ordinaire. On sépare les phases aqueuses et solide et on les conserve toutes deux. On remet le culot solide en suspension dans de 1'eau distillée en quantité donnant un volume de 0,25 à 0,30 ml pour chaque 1 X 1012 cellules originales et, après avoir mélangé à fond, on centrifuge la suspension. On réunit les solutions aqueuses qui surnagent et celles-ci peuvent tre utilisées pour l'isolement du polysaccharide
I. On utilise le culot solide pour la préparation du polysaccharide II par réaction avec l'acide acétique.
Le polysaccharide II est préparé de la manière suivante. Le produit solide lavé provenant de l'ex- traction du phénol et à 1'eau de la souche UC76 de staphylocoque doré, comme décrit ci-dessus, est mis en suspension dans une quantité d'eau distillée donnant un volume de 5,0 ml par 1 X 1012 cellules originales. On ajoute de l'acide acétique 10 N en quantité suffisante pour que la concentration finale de l'acide acétique soit 0,1 N, le pH pour cette concentration étant d'environ 3,4 0,3. On mélange la suspension à fond et on la maintien pendant 5 mn dans un autoclave à 1210 C. On refroidit la suspension à la température ordinaire et on la centrifuge.
Le produit désiré apparaît à ce moment dans le liquide aqueux qui surnage. On remet le précipité solide en suspension dans une quantité d'acide acétique 0,1 N donnant un volume de 0,5 ml par 1 X 1012 cellules originales. On centrifuge cette suspension, on réunit le liquide aqueux qui surnage avec celui obtenu par la centrifugation précédente et on abandonne le précipité. On amène la solution aqueuse à un pH de 7,4 0, 2 avec du NaOH. Si le produit doit tre utilisé sous cette forme, on ajoute un agent de conservation comme le thimérosal (1 : 10 000) ou le chlorure de benzéthonium (1 : 20 000), on stérilise et clarifie la solution par filtration.
Pour isoler le polysaccharide II solide, on dialyse la solution aqueuse, dont le pH a été ajusté à 7,4 0, 2, contre de 1'eau de conduite courante pendant 3 jours et contre dix fois son volume d'eau distillée pendant 1 jour. On congèle la solution et on la sèche à l'état congelé, obtenant ainsi un solide floconneux blanc qui est le polysaccharide II brut, contenant 94 500 unités protectrices souris par mg.
La purification du polysaccharide II peut tre ef fectuée par chromatographie sur charbon. On met en suspension 497 mg de ce polysaccharide II brut dans 10 ml d'eau et on élimine la matière insoluble par centrifugation. On lave le précipité deux fois avec des portions de 5 ml d'eau, on réunit toutes les solutions aqueuses et on les amène au pH4, 5 avec de l'acide acétique dilué. On étend la solution aqueuse à 40 ml avec de 1'eau et on la fait passer dans une colonne chromatographique préparée avec 650 mg de charbon actif et 650 mg de terre de diatomées. On peut utiliser la Norite et la Celite 545 s. On lave la colonne avec une faible quantité d'eau et on recueille au total environ 43 ml d'effluent.
Ensuite, l'effluent, qui ne présente pas de maximum d'absorption dans l'ultraviolet, est dialyse jusqu'au lendemain contre de 1'eau désionisée et séché à l'état congelé, ce qui laisse 176 mg d'une poudre blanche qui est le polysaccharide II partiellement purifié titrant 163 000 unités protectrices souris par mg. Pour une purification plus poussée, on prépare une seconde colonne chromatographique avec 1, 0 g de charbon actif et 1,0 g de terre de diatomées. On peut utiliser à cet effet le Darco G-60 et la Celite 545 . On lave la colonne avec 100 ml d'une solution à 0,2 ouzo du sel tétrasodique de l'acide éthylènediaminetétra- acétique, puis avec de 1'eau jusqu'à neutralité.
On dissout dans 15 ml d'eau le polysaccharide II partiellement purifié provenant de la colonne précédente (174 mg) et on amène le pH à 4,1 avec de l'acide acétique. On fait alors passer la solution dans cette colonne de charbon et on lave la colonne avec une faible quantité d'eau. On recueille tout 1'effluent, on l'ajuste au pH 5,8-6,0 avec de l'alcali et on le dialyse jusqu'au lendemain contre de 1'eau désionisée. La solution restante, dont le pH est d'environ 4,5, est filtrée à travers de la terre de diatomées et séchée à l'état congelé, ce qui laisse du polysaccharide II purifié contenant environ 300 000 unités protectrices souris par mg. Tel qu'obtenu, le produit est un sel mixte de calcium et de sodium.
Ce produit ne présente pas d'absorption sélective dans l'ultraviolet et ne contient pas de protéine, comme le montre une réaction du biuret négative et un dosage quantitatif des protéines. Pouvoir rotatoire spécifique (a) 2D= -72,30 (0,526 /o dans 1'eau) ou (a) 2D =-83 calculé pour la forme anhydre après perte de 13,2 ouzo de matière volatile à 500 C. Le produit titre :
C = 39,86 ouzo ; H 6, 29 oxo ; N = 7,47 et 7,30 ouzo ; Ca = 2,0 ; /o ; Na = 0,47 /o, trace de phosphore et 5,55 O/o de cendres.
La purification du polysaccharide II peut aussi se faire par l'intermédiaire d'un complexe d'ammonium quaternaire insoluble. On dissout 100 mg de polysaccharide Il brut, titrant 94 500 unités protectrices souris par mg comme décrit, dans 5 ml d'eau et on clarifie la solution par centrifugation. On étend la solution à 11 ml, on l'amène au pH 4, 4 avec de l'acide acétique et on l'agite avec 52 mg de charbon actif (Norite) pendant 10 mn, puis on filtre. On examine le filtrat par spectroscopie dans l'ultraviolet pour contrôler l'élimination des acides nucléiques, et on répète le traitement par le charbon actif jusqu'à ce que le filtrat ne présente pratiquement plus d'absorption sélective dans l'ultraviolet.
Il faut en général deux traitements additionnels avec des quantités de 50 mg et de 30 mg de charbon actif. Le filtrat final, après lyophilisation, laisse 63 mg de polysaccharide
II partiellement purifié, titrant 126 000 unités protectrices souris par mg. A une solution de 60 mg de cette poudre dans 5 ml d'eau et 0,9 ml d'une solution de chlorure de sodium 1 N, on ajoute 8 ml d'une solution de chlorure de cétylpyridinium à 1 /0. Un produit huileux visqueux se sépare. On laisse reposer le mélange à la température ordinaire jusqu'au lendemain puis on le centrifuge. On recueille le produit, on le lave deux fois par centrifugation avec des portions de 1 ml d'eau et on le dissout dans 1 ml d'une solution de chlorure de calcium 0,5-molaire.
On ajoute 4 à 10 volumes d'éthanol, on recueille le sel de calcium qui a précipité et on le lave trois fois à l'éthanol. On redissout le produit dans 1 ml d'eau contenant 0,05 ml de la solution de chlorure de calcium. On raprécipite à l'éthanol, on recueille le précipité et on le lave trois fois à l'étha- nol. Le produit obtenu de cette manière est un sel de calcium de polysaccharide II titrant 239 000 unités protectrices souris par mg. Cet échantillon contient encore un peu de polysaccharides acides phos phorylés.
La purification du polysaccharide II peut encore se faire par précipitation des impuretés avec un alcool. On dissout 590 mg de polysaccharides II brut, titrant 52 ouzo par dosage colorimétrique, dans 55 ml d'une solution de sulfate de sodium 0,15-molaire.
On ajoute goutte à goutte, en agitant, 165 ml d'étha- nol absolu, on sépare par centrifugation le précipité insoluble qui s'est formé, on le lave avec 5-10 ml d'éthanol à 95 O/o et on l'abandonne. On dilue le liquide, y compris l'éthanol de lavage, avec encore 110 ml d'éthanol et on centrifuge.
On élimine une faible quantité d'une impureté insoluble, on concentre le liquide sous vide jusqu'à un volume d'environ 15-20ml, on l'étend à 50ml avec de 1'eau et on le dialyse jusqu'au lendemain contre de 1'eau désionisée
On filtre la solution restante à travers de la terre de diatomées et on la lyophilise, ce qui laisse 307 mg de polysaccharide II (sel mixte de calcium et de sodium) sous forme d'une poudre blanche, dont la pureté, mesurée colorimétriquement, est de 100 /o.
Dans cet exemple, la souche UC76 de staphylocoque doré peut tre remplacé par n'importe laquelle des souches suivantes : Smith, S193N4, H & D, Castel lani, MCD138, SK4473, K6, K93 et K93M.
Exemple 2
On agite 300mg de la matière solide insoluble dans le phénol et insoluble dans l'eau, restant après l'extraction de la souche UC76 de staphylocoque doré avec du phénol et de 1'eau, avec 10 ml d'acide trichloracétique à 5 O/o pendant 24 h à la température ordinaire. On clarifie la suspension par centrifu- gation et filtration à travers de la terre de diatomées, on neutralise le filtrat avec de l'alcali, on le dialyse, on le filtre et on le lyophilise, obtenant ainsi du polysaccharide II brut sous forme d'une poudre blanche dont le titre, mesuré colorimétriquement et biologi quement, est de 20 /o. On purifie le produit comme décrit dans 1'exemple 1.
On peut également employer comme matière de départ le résidu insoluble dans le phénol restant après l'extraction au phénol de la souche UC76 de staphylocoque doré.
Exemple 3
On met en suspension 316 mg de la matière solide insoluble dans le phénol et insoluble dans 1'eau, restant après l'extraction de la souche UC76 de staphylocoque doré avec du phénol et de 1'eau, dans 20 ml d'acide acétique 1 N et on chauffe le mélange à reflux sous agitation pendant 30 mn. On clarifie la suspension par centrifugation et filtration à travers de la terre de diatomées, on neutralise le filtrat avec de l'alcali, on le dialyse, on le filtre et on le lyophilise, obtenant ainsi du polysaccharide immunogène brut dont le titre déterminé colorimétriquement est de 26 /o. On purifie le produit comme décrit dans l'exemple 1.
Dans cet exemple, il convient également de chauffer la suspension dans l'acide acétique 1 N pendant 45 mn à 90-95o C.
Exemple 4
Une pâte humide de cellules tuées , préparée par traitement d'une culture de la souche UC76 de staphylocoque doré par du phénol à 1"/o (poids/vol) pendant 18 h à la température ordinaire, est mise en suspension dans une quantité d'eau distillée donnant une suspension contenant 200 X 109 cellules par ml. On divise la suspension en trois portions de 170ml chaque.
On traite la première portion par une quantité d'acide acétique donnant une concentration finale d'acide acétique 0,1 N (pH environ 4,0-4,2) et on chauffe sous pression pendant 30mn à 1210C. On refroidit la suspension et on la centrifuge à 8000t/ mn. Le liquide limpide qui surnage contient du polysaccharide II et titre 1,53 mg par ml par dosage colorimétrique.
On traite la deuxième portion par une quantité d'acide acétique donnant une concentration finale d'acide acétique 1 N (pH environ 3,3) et on chauffe sous pression pendant 30mn à 121 C :. On refroidit la suspension et on la centrifuge à 8000t/mn. Le liquide limpide qui surnage contient 1,66 mg par ml de polysaccharide immunogène, par dosage colorimétrique.
On traite la troisième portion par une quantité d'acide trichloracétique donnant une concentration finale d'acide trichloracétique 1 N (pH environ 0,6) et on agite pendant 16h à 230C. Ensuite, on centrifuge la suspension à 8000 t/mn. Le liquide limpide qui surnage contient 1,28 mg par ml de polysaccharide II, par dosage colorimétrique.
Le polysaccharide obtenu en solution aqueuse par l'une ou l'autre des méthodes ci-dessus est purifié comme décrit dans l'exemple 1.
Exemple 5
Un extrait aqueux (1280ml) obtenu par extrac- tion au phénol et à 1'eau des souches UC76 et
K93M de staphylocoque doré, et contenant du polysaccharide I, est acidifié à un pH d'environ 3,3 avec 12,8 ml d'acide acétique ION. On traite la solution à l'autoclave pendant 5 mn à 1210 C et on la refroidit à la température ordinaire. On amène le pH à environ 7,0 par addition de 7,3 ml d'une solution, d'hydroxyde de sodium à 50 /0. Cette solution qui contient désormais du polysaccharide II, titre 10 500 unités protectrices souris par ml. On la concentre sous vide à un volume de 250 ml et on la dialyse jusqu'au lendemain.
On filtre la solution restante et on la lyophilise, obtenant ainsi du polysaccharide II d'un titre de 12"/o par dosage colorimétrique. On dissout 374 mg de ce produit dans 16 ml d'une solution de sulfate de sodium 0, 45-molaire, on ajoute dans 16ml d'eau, puis une solution de 278 mg de chlorure de cétylpyridinium dans 16 ml d'eau. On élimine le précipité par filtration et on lyophilise le filtrat. On dissout le produit solide restant après la lyophilisation dans 6,2 ml d'eau et on ajoute goutte à goutte 31 ml d'éthanol absolu, en agitant. On sépare le précipité par centrifugation et on le lave avec 25 ml d'éthanol à 95 /o, en trois portions.
On réunit les solutions éthanoliques et on les évapore sous vide jusqu'à obtention d'un sirop brun clair. On ajoute de l'éthanol absolu pour précipiter du polysaccharide II solide, que l'on recueille par centrifugation, lave à l'éthanol absolu et sèche sous vide ; 82 mg titrant 48 ouzo par dosage colorimé- trique.
On dissout 80 mg de ce produit dans 1 ml de tampon d'acétate de sodium 1-molaire au pH 5, 6 et on ajoute lentement 9 ml d'éthanol absolu en agitant. On recueille le produit insoluble par centrifu- gation et on le lave trois fois avec de l'éthanol à 95 /o. On dissout le produit dans de 1'eau, on dialyse jusqu'au lendemain et on lyophilise. On le dissout à nouveau dans 8 ml d'eau et on ajuste le pH à 4,0.
Après centrifugation, on recueille le liquide qui surnage et on le fait passer dans une colonne préparée avec 0, 5 g de charbon actif et 0,5 g de terre de diato mées. On lave la colonne avec une faible quantité d'eau et on traite les solutions aqueuses réunies, d'un volume total d'environ 7 ml, avec 0,6 ml d'une solution de chlorure de sodium 1 N, suivie d'une solution de 45 mg de chlorure de cétylpyridinium dans 1 ml d'eau. On sépare par centrifugation le précipité gommeux qui s'est formé, on le lave une fois à 1'eau et on le dissout dans 0,8 ml d'une solution de chlorure de calcium 1-molaire.
On ajoute 10 volumes d'éthanol absolu et on recueille par centrifugation le produit insoluble qui s'est séparé, on le lave trois fois à l'éthanol, on le redissout dans 1 ml d'eau et on le précipite à nouveau par addition d'éthanol. On dissout le produit dans de 1'eau, on dialyse la solution contre de 1'eau distillée et on la lyophilise, obtenant ainsi 22 mg de polysaccharide II (sel de calcium) titrant 92 /o par dosage colorimétrique. On convertit le produit en l'acide libre par dissolution dans une faible quantité d'eau distillée et passage
dans une colonne contenant 2,5 ml d'une Tésine échangeuse de cations sous forme d'acide libre.
On lyophilise la solution aqueuse, obtenant ainsi du polysaccharide II (acide libre) titrant 100 oxo par dosage colorimétrique et d'une viscosité de 0,0159 (0,316 O/o dans l'eau).
Exemple 6
Le polysaccharide II, isolé et purifié par chroma tographie sur charbon comme décrit dans 1'exemple 1, est obtenu sous forme de sel mixte de calcium et de sodium. On le transforme en sel de calcium en procédant de la manière suivante. On dissout 177 mg du polysaccharide dans 8 ml d'eau et on ajuste le pH à 7,0 avec une base. A cette solution, on ajoute 1,8 ml d'une solution de chlorure de sodium 1-molaire, puis 260 mg de chlorure de céthylpyridinium dans 8 ml d'eau. On étend le mélange à 30 ml avec de 1'eau et on le laisse reposer 1 h à la température ordinaire, après quoi on recueille par centrifugation le précipité gommeux qui s'est formé et on le lave une fois avec 4 ml d'eau.
On laisse le précipité s'égoutter et on le dissout en agitant dans 5 ml d'une solution de chlorure de calcium 0,5-molaire. On ajoute 40 ml d'éthanol, on recueille par centrifuga tion le sel de calcium du polysaccharide qui a pré cipité et on le lave trois fois à l'éthanol. Pour obtenir un sel de calcium, plus pur, on dissout le produit dans 5 ml d'eau contenant 0,1 ml d'une solution de chlorure de calcium 0,5-molaire et on le reprécipite par addition de 40 ml d'éthanol. On recueille le produit par centrifugation, on le lave deux fois à l'étha- nol, on le redissout dans de 1'eau et on dialyse contre de 1'eau désionisée la solution pendant 16 h. On filtre la solution,
contenant le sel de calcium du polysaccharide, à travers un tampon de terre de diatomées et on lyophilise le filtrat, obtenant ainsi le sel de calcium purifié du polysaccharide sous forme d'hydrate ; (a) D =-80, 80 (0,6 /o dans 1'eau) ou (a) D3
=-90, 60 calculé pour la forme anhydre après une perte de matière volatile de 10,92 /o à 50 C.
L'analyse du produit séché donne : C = 40, 8"/o ; H = 6,0 ouzo ; N = 7,77 /o ; Ca = 4,83 /o (à la flamme) et cendres = 6,2 /o. Par titration potentiométrique dans 1'eau, le pu'2 est de 3,35, ce qui correspond à un poids équivalent d'environ 600.
Après correction pour le calcium et la perte de matière volatile, le poids équivalent du polysaccharide sous forme d'acide libre est d'environ 510. Dans un disque de bromure de potassium, le sel de calcium présente des maximums d'adsorption dans l'infrarouge à environ 2,93 ; 3,23 ; 3,41 ; 5,78 ; 6, 06 ; 6,42 ; 6, 70 ; 7,06 ; 7,27 ; 7,65 ; 8,02 ; 8,78 ; 9, 50 ; 10,70 ; 11, 20 et 11,55 microns.
Exemple 7
Le polysaccharide II. isolé et purifié par chroma tographie sur charbon comme décrit dans 1'exemple 1, est obtenu sous forme de sel mixte de calcium et de sodium, et est converti en sel de sodium de la manière suivante. On dissout 100 mg du polysaccharide dans 10ml d'eau et 1,8 ml de solution de chlorure de sodium 1-molaire, puis on ajoute, sous agitation, 150mg de chlorure de cétylpyridinium dans 10 ml d'eau. Après avoir laissé reposer à la tempé- rature ordinaire pendant 2 h, on recueille le préci- pité par centrifugation et on le lave avec 3 ml d'eau.
On redissout le produit dans 2 ml de tampon d'acé- tate de sodium 1-molaire (pH 5,6). On dilue la solution avec 1 ml d'eau, puis on ajoute goutte à goutte 30ml d'éthanol absolu, en agitant et en chauffant, pour précipiter le sel de sodium du polysaccharide.
On refroidit le mélange à la température ordinaire, on recueille le produit par centrifugation et on le lave trois fois à l'éthanol. Pour obtenir un sel de sodium plus pur, on redissout le produit dans 3 ml d'eau contenant 0,5 ml de tampon d'acétate de sodium et on le reprécipite par addition de 30-35 ml d'éthanol comme précédemment. On recueille le sel insoluble dans une centrifugeuse, on le lave à l'étha- nol, on le redissout dans de l'eau et on dialyse la solution contre de 1'eau désionisée pendant 16 h.
On filtre la solution restant après la dialyse à travers un tampon de terre de diatomées et on lyophilise le filtrat pour obtenir le sel de sodium du polysaccharide ; (a) p =-80, 4 (0,69 oxo dans 1'eau) ou (a) 23 =-86, 5 calculé pour la forme anhydre après perte de 7,35 O/o de matière volatile à 500 C.
L'analyse du produit séché donne : C = 42,37 O/o ; H = 5,86 ouzo ; N
= 8,32 /o ; Na = 3,5"/o (à la flamme) ; Ca
= 0,35 /o (trace d'impureté, à la flamme) et cendres
= 7, 93 /o. Dans un disque de bromure de potassium, le sel de sodium présente des maximums d'absorption dans l'infrarouge à environ 2,93 ; 3, 24 ; 3,41 ; 5, 78 ; 6,05 ; 6, 43 ; 6,70 ; 7,10 ; 7,27 ; 7, 65 ; 8,02 ; 8, 85 ; 9,53 ; 10, 70 ; 11,20 et 11,57 microns.
Exemple 8
Le polysaccharide II peut tre obtenu sous forme d'acide libre en soumettant l'un de ses sels à un échange d'ions. On fait passer une solution de 35 mg du sel de calcium du polysaccharide obtenu dans 1'exemple 6 dans 5 ml d'eau distillée à travers une colonne contenant 2,5 ml d'une résine échangeuse de cations (50-100 mesh) sous forme d'acide libre.
La résine Dowex-50WX8 convient. On rince la colonne avec une petite quantité d'eau distillée et on lyophilise l'effluent et les eaux de lavage réunis, obtenant ainsi le polysaccharide (acide libre) sous forme d'une poudre blanche ; (a) 23 =-79, 4 {0, 63 ouzo dans l'eau), échantillon séché. Après séchage à poids constant à 500 C, l'analyse du produit donne : C = 44,89 O/o ; H = 6,48 O/o ; N = 8,34 ouzo et O = 40,3 O/o par différence. La formule brute indiquée est t CH, N., O, .
Un autre échantillon du polysaccharide sous forme d'acide libre, préparé à partir du sel mixte de calcium et de sodium, a présenté un pouvoir rotatoire spécifique (a) 23 =-77, 20 (0,5 O/o dans l'eau).
Après séchage à poids constant à 50 C, l'analyse de ce produit a donné : C = 44,64 oxo ; H = 6,27 ouzo ;
N = 8,15 O/o et O = 40,9 /o par différence. Le dosage biologique a donne 313 000 unités protectrices souris par mg.
Le polysaccharide II sous forme d'acide libre présente les maximums d'absorption dans l'infrarouge suivants, dans un disque de bromure de potassium : 2,95 ; 3,22 ; 3,33 ; 3,37 ; 5,73 ; 6,00 ; 6, 43 ; 6,96 ; 7,24 ; 7,61 ; 8,04 ; 8,77 ; 9,49 ; 10,83 ; 11, 13 et 11, 52 microns.
Le polysaccharide II sous forme d'acide libre peut tre transformé en n'importe quel sel désiré par titration avec la base correspondante, par exemple hydroxyde de sodium, carbonate de potassium ou hydroxyde de calcium.
Process for preparing a staphylococcal antigen
The present invention relates to a process for the preparation of a novel staphylococcal antigenic product, characterized in that a protoplasmic material originating from a strain of Staphylococcus aureus identifiable by the property of forming semi-opaque colonies is reacted, diffuse and inconsistent when cultured in a soft or semi-solid agar culture medium containing plasma, serum or protein components thereof, with aqueous acid at a pH of not more than 4.
An aqueous solution is thus obtained containing an immunogenic polysaccharide, hereinafter referred to as polysaccharide II p. This solution, after adjustment to an acceptable pH for injection, is capable of stimulating the formation of a protective antibody against Staphylococcus aureus.
The morphological properties of the particular strains of Staphylococcus aureus which are used in accordance with the invention are eminently characteristic, since the great majority of strains of Staphylococcus aureus form coherent, opaque, compact and dense colonies under the same culture conditions and do not. not suitable as a source of starting material for the process according to the invention. As examples of strains of Staphylococcus aureus which can be used, mention may be made of the UC76 strains,
Smith, S193N4, H & D, Castellani, MCD138,
SK4473, K6, K93 and K93M. Of these, strains K93M, MCD138, S193N4 and UC76 are preferred.
All these strains of Staphylococcus aureus have been deposited in Parke's culture collection,
Davis & Company, Detroit, Michigan, USA, and in the culture collection of the Fermentation Laboratory, Northern Utilization Research and Development Division, US Department of Agriculture, Peoria, Illinois, under the numbers given in the following table:
N of the collection N of the collection
Parke, Davis & Co. of Norbhern Utilization
Researoh Laboratory
UC76 05068 NRRL B-2467
Smith 05067 NRRL B-2468
S193N4 05089 NRRL B-2469
H & D 05087 NRRL B-2471
Castellani 05088 NRRL B-2472
MCD138 05085 NRRL B-2473
SK4473 05086 NRRL B-2474
K6 05090 NRRL B-2475
K93 05091 NRRL B-2476
K93M 05092 NRRL B-2477
The immunogenic protoplasmic material employed as starting material in the process according to the invention may be intact cells of the particular organism or a fragment, constituent or product of cellular alteration possessing immunogenic properties. When the immunogenic protoplasmic material consists of intact cells, these can be alive (capable of reproducing),
killed (unable to reproduce) or be a mixture of the two. The precise method employed to obtain killed or partially killed staphylococci is not of critical importance. Among the methods which can be used, there may be mentioned heating at about 600 C for 1 h to 1 1/2 h, treatment with 3-propiolactone (0.1 to 0.2 / o at 370 C for 2 h) or by phenol (IO / o at 250 C for about 18 h).
As other examples of immunogenic protoplasmic material suitable as starting material in the process according to the invention, there may be mentioned immunogenic materials obtained by a physical or chemical treatment which disaggregates the cells of particular strains of Staphylococcus aureus without breaking down. destroy their immunogenic properties.
Thus, these immunogenic protoplasmic materials which are suitable as starting material in the process according to the invention can be cellular debris resulting from mechanical disaggregation of intact cells; the material insoluble in phenol and insoluble in water remaining after extraction of the intact cells with phenol and an aqueous solvent; the water soluble fraction obtained by extracting the intact cells with phenol and an aqueous solvent; and other cell fragments and extracts from particular strains of Staphylococcus aureus.
The aforementioned water soluble fraction from the extraction of intact cells with phenol and an aqueous solvent contains another immunogenic polysaccharide, designated polysaccharide I and described in detail later.
In the implementation of the process according to the invention, the treatment of the immunogenic protoplasmic material with an aqueous acid at a pH of about 4 or less can be carried out using a wide variety of organic or inorganic acids. Among the many acids which can be used, mention may be made of acetic, formic, propionic, monochloroacetic, tri-chloroacetic and aqueous hydrochloric acids. The duration and temperature of the aqueous acid treatment are selected depending on the strength of the acid used, so that the starting material is converted to the desired polysaccharide without excessive hydrolysis into separate saccharide units.
In general, when operating at a pH of 2-4, the suspension or solution of the starting material is heated, while the treatment is preferably carried out at room temperature when operating at a pH below 2 and especially in the presence of mineral acids and other strong acids such as trichloroacetic acid. Although a brief treatment at a pH below 0 may be suitable, these conditions are not recommended as they cause more pronounced hydrolysis of the desired product.
Dilute acetic acid is a preferred acid and with this acid the suspension or solution of the starting material should be heated in 0.1-normal acetic acid for 5-60 minutes at about 121 ° C. , under pressure, although it is possible to deviate greatly from these reaction conditions and obtain satisfactory results.
After treatment with aqueous acid at a pH of about 4 or less, the desired product is present in the aqueous solution. The latter is cooled if necessary and separated from any insoluble residue by centrifugation, filtration, decantation or by similar means.
The aqueous solution thus obtained contains polysaccharide II and can be used as a vaccine or for the isolation of purified polysaccharide II. For use as a vaccine, the pH is adjusted to a value making the solution acceptable for injection.
The polysaccharide can be obtained in the form of a crude solid substance by removing water from the aqueous solution or from the vaccine. Preferably, the aqueous solutions or vaccines are frozen, after dialysis, and dried in the frozen state, which provides a crude solid product exhibiting an absorption maximum in the ultraviolet at about 256-261 milmicrons due to the presence of nucleic acids as impurities.
The polysaccharide can be purified by chromatography, by formation of an insoluble quaternary ammonium complex, by precipitation of impurities with an alcohol, especially a lower alkanol such as ethanol in the presence of salts. such as sodium acetate or sodium sulfate, or by a combination of these methods.
After purification by chromatography, by formation of a quaternary ammonium complex or by precipitation of the impurities by means of an alcohol, the polysaccharide is normally present as a salt in aqueous solution and it is isolated in the form of a white solid purified by dialysis of the solution and evaporation or lyophilization. The products obtained by freeze drying are partially hydrated and are normally used in this state for physical, chemical and biological measurements and applications. A drier product is obtained by drying at 500 ° C., and the latter is normally used for elemental microanalyses and sometimes for other determinations.
Unless stated otherwise, figures given in this disclosure relate to samples lyophilized but not otherwise dry.
Polysaccharide II is a high molecular weight substance comprising a large number of individual saccharide units. Polysaccharide II contains carboxyl groups and therefore can exist as free acid or as various salts, such as sodium, potassium, calcium, magnesium, ammonium and amine salts, and their mixtures. The free acid form and the simple salt forms have similar chemical, physical and biological properties and can be easily transformed into each other at a suitable pH, and are therefore considered equivalent for the purposes of 'invention. Unless otherwise indicated, no distinction is made herein between polysaccharide II in the free acid form and its simple salt forms.
General identification
Polysaccharide II is white, water soluble, heat stable and non-dialyzable. It contains carboxyl groups, and as a free acid it contains only the elements carbon, hydrogen, oxygen and nitrogen. In the free acid and simple salt forms, it is strongly levorotatory. The specific optical rotation of the free acid after drying at 500C to constant weight is (a) D = -79.4O in aqueous solution.
By microanalysis of dry samples and equivalent weight measurements, the crude formula of the free acid was determined to be CjgHggNgO. Polysaccharide II is polymeric in nature and of very high molecular weight.
Spectroscopic analysis
In the drawing, fig. 1 represents the infrared absorption spectrum of polysaccharide I in the form of free acid in a potassium bromide disc (micro-determination). Infrared absorption maximums appear at 2.97; 3.22; 3, 40; 5.78; 6.08; 6.41; 6.47; 7.02; 7.28; 7.64; 8, 09; 8, 85; 9.49; 10.83; 11.13 and 11.52 microns. Polysaccharide I is sensitive to polysaccharide II by certain physical, chemical and biological properties, but physical measurements indicate that the degree of polymerization of these substances is different. Fig. 2 gives the infrared absorption spectrum of polysaccharide II, the free acid form, in a potassium bromide disc.
Absorption maximums appear at 2.95; 3, 22; 3, 33; 3, 37; 5.73; 6.00; 6.43; 6.96; 7.24; 7, 61; 8, 04; 8, 77; 9.49; 10.83; 11.13 and 11.52 microns. The salified forms also exhibit characteristic absorption spectra, as described in the experimental part.
Polysaccharide II does not exhibit selective absorption in the ultraviolet. However, ultraviolet absorption measurements are helpful in determining! a presence of impurities exerting characteristic absorption in the ultraviolet, in particular nucleic acids.
Biological dosage
An immunological unit of activity has been established and this unit is useful for quantitative laboratory analyzes of crude and purified polysaccharide preparations as well as the aqueous solutions from which they are derived. The unit of activity, called mouse protective unit o, is the amount of material capable of protecting 50 ouzo of a group of mice against aggression per 10,000 times the amount of staphylococci capable of killing 50 ouzo of a control group of normal mice.
The immunogenic substance is administered subcutaneously 7 days before the attack, and the latter is done by intraperitoneal administration of staphylococci in mucin. For the standard assay, Staphylococcus aureus strain UC76 is used for assault.
The activity of a preparation can be expressed by the number of mouse protective units per milligram or per milliliter of solution, or by the number of DP50 (doses for rotectives at 50 / o) per milligram or per milliliter of solution against an attack of 10,000 LD50 (lethal dose at 50 / o). It is found that the purified preparations of polysaccharide II contain approximately 300,000 mouse protective units (or DP50) per milligram, or 300 per microgram. For the estimation of purity by immunoassay, as usual, experimental errors affecting the biological measurements must be taken into account.
Polysaccharide II and its salts, as well as vaccines containing them, are capable of stimulating the formation of a protective antibody and, by parenteral administration, of developing a high degree of immunity, not only against infection with the strain of Staphylococcus aureus used for their preparation, but also against infeotion by other strains of Staphylococcus aureus. As the polysaccharide II and its salts can be purified, characterized and standardized with precision, the reproducibility of their chemical composition and of their clinical effect is excellent.
Example 1
We maintain a mother culture of the strain
UC76 of Staphylococcus aureus on a culture medium of the following composition:
Ingredients Quantity
Peptone obtained by pancreatic digestion
as casein (Trypticase) 17.0 g
Papaic digestion product of the fa
soya rine (Phytone) 3.0 g
Sodium chloride 5.0 g
Dipotassium phosphate 2.5 g
Glucose 2.5 g
Distilled water 1000.0 ml
For use, this medium is sterilized in an autoclave at 118-121o C for 15 min. The organism is cultivated for 18-24 h at 35-370 ° C. and it is maintained on the same medium by transfer once a week.
Seed cultures are prepared by inoculating large test tubes containing 30ml of the above culture medium with about 0.3ml of stock culture and incubating at 35-370 C for 624 h. A seed culture tube is provided for each production flask. A series of production vials are prepared, each containing 1000 ml of the sterilized medium described above. Each flask is inoculated with 30ml of the 6-24 h culture and incubated at 35-370C for 24 h. Add a quantity of phenol (of purified grade) to a concentration of 1% (w / v) and, after mixing, the culture is allowed to stand at room temperature overnight for inactivation.
Next, the cell suspension is centrifuged in a laboratory Sharples air turbine centrifuge at room temperature and at a flow rate of about 250 ml per minute. The agglomerated cells were collected, resuspended in 1 / l the volume of the original culture of 0.85% saline in a Waring mixer, and collected again by centrifugation. The number of cells obtained is calculated based on a conversion factor of about 1 X 1012 cells per 2.4 g of wet agglomerated cells, as from centrifugation. The weight of dry cells is approximately 28 oxo of the weight of wet cells.
Phenol containing a small quantity of water and measured so as to make it liquid is added to the cell mass, at a rate of 9 ml of phenol per 1 × 1012 cells. The solid is suspended and, by further addition of phenol or water, the suspension is brought to a calculated volume of 10.58 ml for each 1 X 10 12 cells and to a calculated phenol concentration of 85 1 O /. o (by volume).
The phenolic cell suspension is brought to a temperature of 24 ° C. and mixed in a Waring mixer for 8-10 minutes, keeping the temperature below about 50 ° C. The emulsion obtained by this operation is centrifuged in portions at 2500 rpm, at room temperature and for 30-60 minutes. The clear liquid is abandoned and the solid pellets are resuspended in phenol at 85 O / O by volume, at a rate of 10 ml of phenol at 85 O / o for 1 X 10 12 original cells and mixed for 1-2 min in a Waring mixer. The cell mass is collected again by centrifugation and the liquid is discarded.
The cell mass is resuspended in distilled water in an amount giving a volume of 5.0-5.5 ml per 1 X 10t2 original cells and the suspension is dialyzed for 24-48 h against tap water. running cold, then overnight against a fixed volume of distilled water at about 40 ° C. If necessary, dialysis is repeated until the reaction of phenol with ferric chloride is negative.
The suspension is brought to pH 7.4 0.2 with 0.1 N NaOH and centrifuged at room temperature. The aqueous and solid phases are separated and both are stored. The solid pellet is resuspended in distilled water in an amount giving a volume of 0.25 to 0.30 ml for each 1 X 1012 original cells and, after mixing thoroughly, the suspension is centrifuged. The aqueous solutions which supernate are combined and these can be used for the isolation of the polysaccharide.
I. The solid pellet is used for the preparation of polysaccharide II by reaction with acetic acid.
Polysaccharide II is prepared as follows. The washed solid product from the phenol and water extraction of Staphylococcus aureus strain UC76, as described above, is suspended in an amount of distilled water to give a volume of 5.0. ml per 1 X 1012 original cells. 10 N acetic acid is added in sufficient quantity so that the final concentration of acetic acid is 0.1 N, the pH for this concentration being about 3.4 0.3. The suspension is mixed thoroughly and kept for 5 min in an autoclave at 1210 ° C. The suspension is cooled to room temperature and centrifuged.
The desired product appears at this time in the aqueous liquid which supersedes. The solid precipitate is resuspended in an amount of 0.1 N acetic acid giving a volume of 0.5 ml per 1 X 1012 original cells. This suspension is centrifuged, the aqueous liquid which supernates with that obtained by the preceding centrifugation is combined and the precipitate is discarded. The aqueous solution is brought to a pH of 7.4 0.2 with NaOH. If the product is to be used in this form, a preservative such as thimerosal (1: 10,000) or benzethonium chloride (1: 20,000) is added, the solution is sterilized and clarified by filtration.
To isolate the solid polysaccharide II, the aqueous solution, the pH of which has been adjusted to 7.40.2, is dialyzed against tap water for 3 days and against ten times its volume of distilled water for 1. day. The solution is frozen and dried in the frozen state, thus obtaining a white fluffy solid which is crude polysaccharide II, containing 94,500 mouse protective units per mg.
The purification of the polysaccharide II can be carried out by chromatography on carbon. 497 mg of this crude polysaccharide II are suspended in 10 ml of water and the insoluble material is removed by centrifugation. The precipitate is washed twice with 5 ml portions of water, all the aqueous solutions are combined and brought to pH 4.5 with dilute acetic acid. The aqueous solution is made up to 40 ml with water and passed through a chromatographic column prepared with 650 mg of activated carbon and 650 mg of diatomaceous earth. You can use Norite and Celite 545 s. The column is washed with a small amount of water and a total of about 43 ml of effluent is collected.
Then, the effluent, which does not show a maximum absorption in the ultraviolet, is dialyzed overnight against deionized water and dried in the frozen state, leaving 176 mg of a white powder. which is the partially purified polysaccharide II assaying 163,000 mouse protective units per mg. For further purification, a second chromatographic column is prepared with 1.0 g of activated carbon and 1.0 g of diatomaceous earth. Darco G-60 and Celite 545 can be used for this purpose. The column is washed with 100 ml of a 0.2 ouzo solution of the tetrasodium salt of ethylenediaminetetraacetic acid, then with water until neutral.
The partially purified polysaccharide II from the previous column (174 mg) is dissolved in 15 ml of water and the pH is brought to 4.1 with acetic acid. The solution is then passed through this carbon column and the column is washed with a small amount of water. All of the effluent is collected, adjusted to pH 5.8-6.0 with alkali, and dialyzed overnight against deionized water. The remaining solution, which has a pH of about 4.5, is filtered through diatomaceous earth and dried in the frozen state, leaving purified polysaccharide II containing about 300,000 mouse protective units per mg. As obtained, the product is a mixed salt of calcium and sodium.
This product does not exhibit selective UV absorption and does not contain protein, as evidenced by negative biuret reaction and quantitative protein assay. Specific optical rotation (a) 2D = -72.30 (0.526 / o in water) or (a) 2D = -83 calculated for the anhydrous form after loss of 13.2 ouzo of volatile matter at 500 C. The product title:
C = 39.86 ouzo; H 6.29 oxo; N = 7.47 and 7.30 ouzo; Ca = 2.0; / o; Na = 0.47 / o, trace of phosphorus and 5.55 O / o of ash.
The purification of the polysaccharide II can also be done by means of an insoluble quaternary ammonium complex. 100 mg of crude polysaccharide II, assaying 94,500 mouse protective units per mg as described, are dissolved in 5 ml of water and the solution is clarified by centrifugation. The solution is extended to 11 ml, brought to pH 4.4 with acetic acid and stirred with 52 mg of activated charcoal (Norite) for 10 min, then filtered. The filtrate is examined by ultraviolet spectroscopy to monitor the removal of nucleic acids, and the treatment with activated carbon is repeated until the filtrate shows virtually no UV selective absorption.
In general, two additional treatments are required with amounts of 50 mg and 30 mg of activated charcoal. The final filtrate, after lyophilization, leaves 63 mg of polysaccharide
Partially purified II, assaying 126,000 mouse protective units per mg. To a solution of 60 mg of this powder in 5 ml of water and 0.9 ml of a 1N sodium chloride solution, 8 ml of a 1/0 solution of cetylpyridinium chloride are added. A viscous oily product separates. The mixture is left to stand at room temperature overnight and then centrifuged. The product was collected, washed twice by centrifugation with 1 ml portions of water and dissolved in 1 ml of a 0.5-molar calcium chloride solution.
4 to 10 volumes of ethanol are added, the calcium salt which has precipitated is collected and washed three times with ethanol. The product is redissolved in 1 ml of water containing 0.05 ml of the calcium chloride solution. The precipitate is precipitated with ethanol, the precipitate is collected and washed three times with ethanol. The product obtained in this way is a calcium salt of polysaccharide II containing 239,000 mouse protective units per mg. This sample still contains some phos phorylated acid polysaccharides.
The purification of the polysaccharide II can also be done by precipitation of the impurities with an alcohol. 590 mg of crude polysaccharides II, titrating 52 ouzo by colorimetric assay, are dissolved in 55 ml of a 0.15-molar sodium sulfate solution.
165 ml of absolute ethanol are added dropwise with stirring, the insoluble precipitate which has formed is separated by centrifugation, washed with 5-10 ml of 95 O / o ethanol and the mixture is dissolved. 'abandoned. The liquid, including the wash ethanol, is diluted with a further 110 ml of ethanol and centrifuged.
A small amount of an insoluble impurity is removed, the liquid is concentrated in vacuo to a volume of about 15-20ml, extended to 50ml with water and dialyzed overnight against water. Deionized water
The remaining solution is filtered through diatomaceous earth and lyophilized, leaving 307 mg of polysaccharide II (mixed salt of calcium and sodium) as a white powder, the purity of which, measured colorimetrically, is of 100 / o.
In this example, the UC76 strain of Staphylococcus aureus can be replaced by any of the following strains: Smith, S193N4, H & D, Castel lani, MCD138, SK4473, K6, K93 and K93M.
Example 2
300 mg of the solid, insoluble in phenol and insoluble in water, remaining after the extraction of Staphylococcus aureus strain UC76 is stirred with phenol and water, with 10 ml of 5 O / trichloroacetic acid. o for 24 h at room temperature. The suspension is clarified by centrifugation and filtration through diatomaceous earth, the filtrate is neutralized with alkali, dialyzed, filtered and freeze-dried, thereby obtaining crude polysaccharide II in the form of. a white powder whose titre, measured colorimetrically and biologically, is 20 / o. The product is purified as described in Example 1.
The phenol insoluble residue remaining after the phenol extraction of Staphylococcus aureus strain UC76 can also be employed as a starting material.
Example 3
316 mg of the solid, insoluble in phenol and insoluble in water, remaining after the extraction of Staphylococcus aureus strain UC76 with phenol and water, is suspended in 20 ml of acetic acid. N and the mixture is heated to reflux with stirring for 30 min. The suspension is clarified by centrifugation and filtration through diatomaceous earth, the filtrate is neutralized with alkali, dialyzed, filtered and freeze-dried, thus obtaining crude immunogenic polysaccharide, the colorimetrically determined titre of which is from 26 / o. The product is purified as described in Example 1.
In this example, the suspension should also be heated in 1 N acetic acid for 45 min at 90-95o C.
Example 4
A wet paste of killed cells, prepared by treating a culture of Staphylococcus aureus strain UC76 with 1 "/ o (w / v) phenol for 18 h at room temperature, is suspended in an amount of distilled water giving a suspension containing 200 X 109 cells per ml The suspension is divided into three portions of 170 ml each.
The first portion is treated with a quantity of acetic acid giving a final concentration of 0.1 N acetic acid (pH approximately 4.0-4.2) and the mixture is heated under pressure for 30 minutes at 1210C. The suspension is cooled and centrifuged at 8000 rpm. The clear liquid which floats contains polysaccharide II and has a titre of 1.53 mg per ml by colorimetric assay.
The second portion is treated with a quantity of acetic acid giving a final concentration of 1N acetic acid (pH approximately 3.3) and the mixture is heated under pressure for 30 minutes at 121 C :. The suspension is cooled and centrifuged at 8000 rpm. The clear supernatant liquid contains 1.66 mg per ml of immunogenic polysaccharide, by colorimetric assay.
The third portion is treated with a quantity of trichloroacetic acid giving a final concentration of 1N trichloroacetic acid (pH approximately 0.6) and the mixture is stirred for 16h at 230C. Then, the suspension is centrifuged at 8000 rpm. The clear supernatant liquid contains 1.28 mg per ml of polysaccharide II, by colorimetric assay.
The polysaccharide obtained in aqueous solution by one or the other of the above methods is purified as described in Example 1.
Example 5
An aqueous extract (1280ml) obtained by phenol and water extraction of the UC76 strains and
Staphylococcus aureus K93M, and containing polysaccharide I, is acidified to a pH of about 3.3 with 12.8 ml of acetic acid ION. The solution is autoclaved for 5 min at 1210 C and cooled to room temperature. The pH is brought to approximately 7.0 by the addition of 7.3 ml of a 50/0 sodium hydroxide solution. This solution which now contains polysaccharide II, title 10,500 mouse protective units per ml. It is concentrated in vacuo to a volume of 250 ml and dialyzed overnight.
The remaining solution is filtered and lyophilized, thus obtaining polysaccharide II with a titer of 12% by colorimetric determination. 374 mg of this product are dissolved in 16 ml of a 0.45 sodium sulfate solution. molar, is added in 16 ml of water, then a solution of 278 mg of cetylpyridinium chloride in 16 ml of water. The precipitate is removed by filtration and the filtrate is lyophilized. The solid product remaining after lyophilization is dissolved in 6 ml. 2 ml of water and 31 ml of absolute ethanol are added dropwise with stirring The precipitate is separated by centrifugation and washed with 25 ml of 95% ethanol in three portions.
The ethanolic solutions are combined and evaporated in vacuo until a light brown syrup is obtained. Absolute ethanol is added to precipitate solid polysaccharide II, which is collected by centrifugation, washed with absolute ethanol and dried in vacuo; 82 mg assaying 48 ouzo by colorimetric assay.
80 mg of this product are dissolved in 1 ml of 1-molar sodium acetate buffer at pH 5.6 and 9 ml of absolute ethanol are slowly added with stirring. The insoluble product is collected by centrifugation and washed three times with 95% ethanol. The product is dissolved in water, dialyzed overnight and lyophilized. It is dissolved again in 8 ml of water and the pH is adjusted to 4.0.
After centrifugation, the supernatant liquid is collected and passed through a column prepared with 0.5 g of activated carbon and 0.5 g of diatomaceous earth. The column is washed with a small amount of water and the combined aqueous solutions, totaling about 7 ml, are treated with 0.6 ml of 1N sodium chloride solution, followed by solution of 45 mg of cetylpyridinium chloride in 1 ml of water. The gummy precipitate which has formed is separated by centrifugation, washed once with water and dissolved in 0.8 ml of a 1-molar calcium chloride solution.
10 volumes of absolute ethanol are added and the insoluble product which has separated out is collected by centrifugation, washed three times with ethanol, redissolved in 1 ml of water and precipitated again by addition of ethanol. The product is dissolved in water, the solution is dialyzed against distilled water and lyophilized, thus obtaining 22 mg of polysaccharide II (calcium salt) assaying 92% by colorimetric assay. The product is converted to the free acid by dissolving in a small amount of distilled water and passing
in a column containing 2.5 ml of a cation exchange tesin in the form of free acid.
The aqueous solution is lyophilized, thus obtaining polysaccharide II (free acid) assaying 100 oxo by colorimetric determination and with a viscosity of 0.0159 (0.316 O / o in water).
Example 6
Polysaccharide II, isolated and purified by carbon chroma tography as described in Example 1, is obtained in the form of a mixed salt of calcium and sodium. It is converted into a calcium salt by proceeding as follows. 177 mg of the polysaccharide are dissolved in 8 ml of water and the pH is adjusted to 7.0 with a base. To this solution are added 1.8 ml of a 1-molar sodium chloride solution, then 260 mg of cethylpyridinium chloride in 8 ml of water. The mixture is made up to 30 ml with water and allowed to stand for 1 hour at room temperature, after which the gummy precipitate which has formed is collected by centrifugation and washed once with 4 ml of water. .
The precipitate is allowed to drain and is dissolved with stirring in 5 ml of a 0.5-molar calcium chloride solution. 40 ml of ethanol are added, the calcium salt of the polysaccharide which has precipitated is collected by centrifugation and washed three times with ethanol. To obtain a more pure calcium salt, the product is dissolved in 5 ml of water containing 0.1 ml of a 0.5-molar calcium chloride solution and it is reprecipitated by adding 40 ml of ethanol. . The product is collected by centrifugation, washed twice with ethanol, redissolved in water, and the solution dialyzed against deionized water for 16 h. We filter the solution,
containing the calcium salt of the polysaccharide, through a pad of diatomaceous earth and the filtrate is freeze-dried, thereby obtaining the purified calcium salt of the polysaccharide as a hydrate; (a) D = -80, 80 (0.6 / o in water) or (a) D3
= -90.60 calculated for the anhydrous form after a loss of volatile matter of 10.92 / o at 50 C.
Analysis of the dried product gives: C = 40.8 "/ o; H = 6.0 ouzo; N = 7.77 / o; Ca = 4.83 / o (flame) and ash = 6.2 / 0 By potentiometric titration in water, the pu 2 is 3.35, which corresponds to an equivalent weight of about 600.
After correction for calcium and loss of volatile matter, the equivalent weight of the polysaccharide as free acid is about 510. In a potassium bromide disc, the calcium salt shows adsorption maxima in the. infrared at about 2.93; 3.23; 3.41; 5.78; 6, 06; 6.42; 6, 70; 7.06; 7.27; 7.65; 8.02; 8.78; 9, 50; 10.70; 11, 20 and 11.55 microns.
Example 7
Polysaccharide II. isolated and purified by charcoal chromatography as described in Example 1, is obtained as a mixed salt of calcium and sodium, and is converted to the sodium salt as follows. 100 mg of the polysaccharide are dissolved in 10 ml of water and 1.8 ml of 1-molar sodium chloride solution, then 150 mg of cetylpyridinium chloride in 10 ml of water are added with stirring. After allowing to stand at room temperature for 2 hours, the precipitate is collected by centrifugation and washed with 3 ml of water.
The product is redissolved in 2 ml of 1-molar sodium acetate buffer (pH 5.6). The solution is diluted with 1 ml of water, then 30 ml of absolute ethanol is added dropwise, with stirring and heating, to precipitate the sodium salt from the polysaccharide.
The mixture is cooled to room temperature, the product is collected by centrifugation and washed three times with ethanol. To obtain a purer sodium salt, the product is redissolved in 3 ml of water containing 0.5 ml of sodium acetate buffer and it is reprecipitated by adding 30-35 ml of ethanol as before. The insoluble salt is collected in a centrifuge, washed with ethanol, redissolved in water, and the solution dialyzed against deionized water for 16 h.
The solution remaining after dialysis is filtered through a pad of diatomaceous earth and the filtrate is lyophilized to obtain the sodium salt of the polysaccharide; (a) p = -80.4 (0.69 oxo in water) or (a) 23 = -86.5 calculated for the anhydrous form after loss of 7.35 O / o of volatile matter at 500 C.
Analysis of the dried product gives: C = 42.37 O / o; H = 5.86 ouzo; NOT
= 8.32 / o; Na = 3.5 "/ o (flame); Ca
= 0.35 / o (trace of impurity, by flame) and ash
= 7.93 / o. In a potassium bromide disc, the sodium salt exhibits absorption maximums in the infrared at about 2.93; 3, 24; 3.41; 5.78; 6.05; 6, 43; 6.70; 7.10; 7.27; 7, 65; 8.02; 8, 85; 9.53; 10, 70; 11.20 and 11.57 microns.
Example 8
Polysaccharide II can be obtained in the form of free acid by subjecting one of its salts to ion exchange. A solution of 35 mg of the calcium salt of the polysaccharide obtained in Example 6 in 5 ml of distilled water is passed through a column containing 2.5 ml of a cation exchange resin (50-100 mesh) under free acid form.
Dowex-50WX8 resin is suitable. The column is rinsed with a small quantity of distilled water and the effluent and the combined washings are lyophilized, thus obtaining the polysaccharide (free acid) in the form of a white powder; (a) 23 = -79.4 (0.63 ouzo in water), sample dried. After drying to constant weight at 500 ° C., analysis of the product gives: C = 44.89 O / o; H = 6.48 O / o; N = 8.34 ouzo and O = 40.3 O / o by difference. The molecular formula shown is t CH, N., O,.
Another sample of the polysaccharide in the form of free acid, prepared from the mixed salt of calcium and sodium, showed a specific optical rotation (a) 23 = -77, 20 (0.5 O / o in water ).
After drying to constant weight at 50 ° C., analysis of this product gave: C = 44.64 oxo; H = 6.27 ouzo;
N = 8.15 O / o and O = 40.9 / o by difference. The bioassay gave 313,000 mouse protective units per mg.
The polysaccharide II in the form of free acid exhibits the following absorption maximums in the infrared, in a potassium bromide disc: 2.95; 3.22; 3.33; 3.37; 5.73; 6.00; 6, 43; 6.96; 7.24; 7.61; 8.04; 8.77; 9.49; 10.83; 11, 13 and 11, 52 microns.
The polysaccharide II in the form of free acid can be converted into any desired salt by titration with the corresponding base, for example sodium hydroxide, potassium carbonate or calcium hydroxide.