Glucanne, son procédé de préparation et son application en
thérapeutique.
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canne hydrolyse, a un procède pour sa préparation ainsi qu'. des compositions pharmaceutiquement acceptables le contenant. Le glucanne suivant l'invention est utilisable notamment comme agent immunomodulateur dans le traitement des cancers et du rhumatisme articulaire.
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peuvent produire des polysaccharides qui agissent sur les cancers et autres tumeurs. Toutefois, ces polysaccharides sont peu solubles dans l'eau et, même s'il est possible d1 obtenir une solution aqueuse de n'importe lesquels d'entre eux, cette solution se transforme aisément en gel. Il s'ensuit qu'il est très difficile d'effectuer des essais pharmacologiques avec ces polysaccharides et encore plus difficile d'utiliser les polysaccharides à des fins thérapeutiques.
Le rhumatisme articulaire est une maladie incurable et, bien qu'on ait étudié de nombreux médicaments afin d'essayer de la guérir, les essais effectués n'ont pas été couronnés de succès. Les traitements connus (par exemple: traitement avec des stéroïdes, des agents non-stérol-
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base d'or, etc.) sont tous des traitements symptomatiques et n'agissent pas sur la cause du mal.
Le brevet japonais n[deg.] 828.248 décrit un procédé de préparation d'un polysaccharide ayant une activité antitumeur, consistant à cultiver un microorganisme producteur de glucanne du genre Corticium ou du genre Hypochnus, puis à séparer du bouillon de culture un glucanne présentant
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liaisons 6) dans ses ramifications. Toutefois, comme décrit ci-dessus, le glucanne résultant, bien qu'ayant une activité anti-tumeur, est difficile à utiliser en pratique car ses solutions aqueuses ont tendance à gélifier. Toutefois, la Demanderesse a maintenant découvert de façon surprenante qu'en traitant des glucannes de ce type par l'acide formique puis en hydrolysant le produit résultant, on peut obtenir un glucanne ayant une hydrosolubilité sensiblement améliorée et en outre, de façon inattendue, une activité anti-tumeur très améliorée.
C'est ainsi que la présente invention a pour objet un
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cations, le rapport de motifs glucose dans les ramifications à motifs glucose dans la chaîne principale étant de 2/7 environ, le glucanne étant caractérise par les propriétés suivantes:
la) le produit lyophilise se présente sous la forme d'un
produit solide amorphe blanc;
(b) il est soluble dans l'eau, dans le diméthyl suif oxyde et dans le diméthylformamide, et il est insoluble dans l'éthanol, l'acétone, l'acétate d'éthyle, le benzène et l'éther diéthylique;
(c) son analyse élémentaire correspond essentiellement aux valeurs calculées pour un polysaccharide hydraté
<EMI ID=6.1> dant essentiellement à celui représenté au dessin annexé; et
(e) on n'observe qu'un pic unique à l'analyse spectroscopique par ultracentrifugation, et il a une masse molé- <EMI ID=7.1>
constante de sédimentation;
le glucanne pouvant être préparé en traitant par l'acide formique un polysaccharide produit par un fongus de la famille des Corticiacées , puis en hydrolysant le produit traité.
L'invention vise également un procédé de préparation du glucanne hydrolyse suivant l'invention, consistant à
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par un fongus de la famille des Corticiacées, puis en hydrolysant le produit traité.
L'invention a encore pour objet une composition pharmaceutique contenant, à titre de principe actif, le glucanne hydrolyse suivant la présente invention, en mélange avec un véhicule ou diluant pharmaceutiquement acceptable.
Le polysaccharide utilisé comme substance de départ pour le procédé suivant l'invention est un produit métabolique d'un fongus de la famille des Corticiacées (Basidiomycëtes), par exemple un fongus du genre Corticium ou Hypochnus. On peut obtenir ce polysaccharide de départ en cultivant le fongus choisi, comme décrit de façon plus détaillée dans le brevet japonais n[deg.] 828.248.
On prépare de préférence le glucanne hydrolysé suivant la présente invention en ajoutant une solution aqueuse d'acide formique à 70-90% pds/pds au polysaccharide de départ et en chauffant le.mélange résultant, de préférence en agitant. La température à laquelle on porte le mélange réactionnel n'est pas particulièrement critique, bien qu'une température de 80 à 100[deg.]C soit préférable. Le temps nécessaire à cette réaction dépend des conditions réactionnelles, en particulier de la température, mais la
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sous pression réduite, après quoi on ajoute de l'eau afin d'hydrolyser le résidu. Il est préférable d'effectuer
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que la déformylation soit terminée. Le matériau gélatineux produit peut être séparé par centrifugation, et on ajoute un solvant organique à la liqueur-mère afin d'obtenir un précipité qu'on recueille. La nature du solvant utilisé
à ce stade n'est pas particulièrement limitée, tant qu'il
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rable d'utiliser un alcool cornue le méthanol ou l'éthanol. 'On dissout ou disperse le précipité dans de l'eau, et on lyophilise la solution ou dispersion, obtenant ainsi le polysaccharide hydrolysé cherché sous la forme d'un produit solide blanc amorphe.
Ce produit solide amorphe est soluble dans l'eau, le diméthyl sulfoxyde et le diméthylformamide et est insoluble dans l'éthanol, l'acétone, l'acétate d'êthyle, le benzène et l'éther diéthylique. Il est thermo-résistant. Les résultats de l'analyse élémentaire correspondent à ceux calculés pour un polysaccharide hydraté de type hexoside et
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rouge du produit (dans la poudre de bromure de potassium) est illustré à la Fig.l. Il a un pouvoir rotatoire
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serve qu'un pic unique à l'analyse spectroscopique par ultracentrifugation du produit.et, d'âpres la constante de sédimentation, sa masse moléculaire s'avère comprise entre
150.000 et 160.000, d'après quoi il est possible de calculer que la valeur de n dans la formule ci-dessus est de
833 à 889.
Les saccharides constitutifs de ce glucanne hydrolysé peuvent être identifiés comme suit. On dissout le glucanne hydrolysé dans une solution aqueuse d'acide sulfurique IN puis on hydrolyse à 100[deg.]C pendant 120 minutes dans un tube scellé. Puis on neutralise le produit à l'aide d'hydroxyde de baryum et on le soumet à une chromatographie sur papier. Lorsqu'on développe le papier de chromatographie à l'aide d'une solution aqueuse ammoniacale de nitrate d'argent, on n'observe qu'une tache unique. Le produit représenté par cette tache unique peut être identifié comme étant du
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vention peut être déterminé en méthylant complètement le glucanne par des moyens classiques, en hydrolysant le glucanne méthylé afin d'obtenir du glucose méthylé, en réduisant le glucose méthylé et en acétylant le produit réduit. La chromatographie gazeuse identifie le mélange résultant comme étant constitué par des acétates de 2,3,4,
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et de 2,4-di-O-méthylglycitol en un rapport molaire d'en-viron 1/2,5/1. Ce résultat confirme que le glucanne suivant la présente invention contient environ deux ramifications (constituées chacune par un seul motif glucose)
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du glucanne. En outre, il se confirme que toutes les liaisons glucose sont en la configuration /3 , par observation
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Le glucanne hydrolysé suivant la présente invention est plus hydrosoluble et moins gélifiable en solution aqueuse que le polysaccharide à partir duquel on l'a pré-
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exemple son activité anti-cancer et son activité suppressive de l'arthrite) sont très fortes et ne s'accompagnent que d'une faible toxicité. En particulier, la forte activité suppressive de l'arthrite et la faible toxicité n'auraient pas pu être prévues diaprés les activités de polysaccharides produits directement à partir de fongi de- la classe des Basidiomycètes. Il s'ensuit que le glucanne hydrolysé suivant la présente invention est notamment utilisable pour traiter des maladies résultant de troubles du système immune, comme par exemple le rhumatisme articulaire.
Les activités biologiques et la toxicité du glucanne hydrolysé suivant l'invention sont mises en évidence par les essais suivants.
(1) Activité anti-néoplasique
On effectue les essais sur des souris mâles de 7 semaines, de souche ICR. On greffe 2 x 106 cellules cancéreuses de Sarcome 180 sur la peau de la région axillaire de chaque souris. Au bout de 6 et 7 jours après greffage, on administre un échantillon du glucanne hydrolysé suivant l'invention (produit comme décrit dans l'exemple 1 ciaprès) dans du sérum physiologique, par injection dans l'abdomen; la concentration de la solution physiologique de glucanne hydrolysé est de 0,1% pds/vol. 25 jours après <EMI ID=19.1>
tue un essai identique sur un lot de souris témoin auxquelles on n'a pas administré de glucanne hydrolyse, et on calcule le taux de suppression de la tumeur Ci) d'après la formule suivante:
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(en mm) du lot témoin et d représente le diamètre moyen de la tumeur du lot traité. Les résultats obtenus sont rapportés au tableau 1, qui montre l'effet, sur le taux de suppression de la tumeur, des variations des quantités de glucanne hydrolyse administrées par jour.
45 jours après le greffage , on examine soigneusement toutes les souris, afin de déterminer le nombre de souris présentant une régression complète de la tumeur. Les
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bleau 1, dans lequel le nombre de souris présentant une régression complète est rapporté en proportion du nombre total de souris testées, dans le groupe concerné.
Tableau 1
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(2) Activité anti-arthritique
On effectue les essais suivant les modes opératoires
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Arth. Rheum., 12, 472 (19697 permettant de mesurer le pouvoir qu'ont des composés de supprimer l'arthrite à l'adju-
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pour l'évaluation des agents anti-néoplasiques.
A des rats Lewis on injecte l'adjuvant par voie souscutanée dans la face plantaire de la patte arrière droite, afin de provoquer la maladie. Puis on injecte une solu-
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dans l'abdomen, pendant 15 jours après l'inoculation de l'adjuvant..On effectue des essais identiques sur un lot témoin d'animaux auxquels on n'administre pas le glucanne hydrolysé. 18, 20, 24, 28 et 32 jours après l'inoculation de l'adjuvant, on compare le gonflement des pattes des rats traités avec celui des pattes des rats non traités et, en utilisant une formule similaire à celle utilisée pour calculer le taux de suppression de la tumeur, on calcule le taux de suppression pour chaque dose du glucanne hydrolysé. Les résultats (moyennes) sont rapportés au tableau 2 suivant.
Tableau 2
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(3) Toxicité algue
On effectue un test de toxicité aigue (une semaine d'observation) en injectant des échantillons du glucame
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on n'observe pas de mortalité et le poids augmente de façon normale.
Il découle des résultats ci-dessus que le glucanne hydrolyse suivant la présente invention est très précieux
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trer l'agent par voie parentérale (par exemple par injection sous-cutanée, intraveineuse ou intramusculaire). La posologie journalière varie suivant la maladie à traiter,
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mais, d'une façon générale, la posologie journalière chez l'adulte est de préférence de 0,5 à 50 mg, par exemple de 5 mg environ. On peut l'administrer en une seule dose ou en doses fragmentées.
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présenté sous une forme convenant à la voie d'administration choisie, en utilisant tout type de composition couramment utilisé pour d'autres agents immunosuppresseurs. Par exemple, on peut présenter une composition dans une ampoule, sous forme de dose unitaire, ou la présenter dans un récipient pour plusieurs doses, de préférence en
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tion peut être sous la forme d'une suspension, d'une solution ou d'une émulsion dans un véhicule huileux ou aqueux, et peut comprendre des adjuvants classiques, par exemple des agents de mise en suspension et/ou stabilisants et/ou dispersants. L'ingrédient actif peut également être présenté sous la forme d'une poudre à dissoudre avant l'administration dans un véhicule approprié, par exemple de l'eau stérile apyrogène.
Lorsque la composition suivant l'invention est présentée sous la forme de doses unitaires, elle contient de préférence de 0,5 à 10 mg d'ingrédient actif par dose unitaire.
Les exemples non limitatifs suivants sont donnés à titre d'illustration de la présente invention. L'exemple
1 illustre la préparation du glucanne hydrolysé suivant l'invention et l'exemple 2 illustre la préparation d'une composition pharmaceutique le contenant.
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Après avoir évaporé l'acide formique sous pression réduite, on ajoute 600 ml d'eau au résidu et on chauffe le mélange aqueux résultant au reflux. Puis on centrifuge le mélange réactionnel pendant 15 minutes à 10.000 tours/min. Au liquide surnageant ainsi séparé on ajoute 2,4 litres d'éthanol, et on recueille le précipité résultant par centrifugation. On ajoute 500 ml d'eau au précipité, puis on lyophilise le mélange aqueux, obtenant ainsi 2,0 g du glucanne hydrolysé cherché, sous la forme d'un produit solide amorphe blanc. Le produit présente les caractéristiques suivantes:
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Masse moléculaire (analyse par ultracentrifugation, tampon phosphate, pH 6,5): 159.000.
EXEMPLE 2
On dissout 5 mg du glucanne hydrolyse obtenu à l'exemple 1 dans 2 ml de sérum physiologique, puis on stérilise
la solution en chauffant de la manière habituelle afin d'obtenir une solution injectable.
PREPARATION DU CORTICANE
Dans cinq flacons de Sakaguchi de 500 ml on introduit
100 ml d'un milieu glucose-pomme de terre contenant 2 %
en poids de glucose dans une soupe bouillie contenant 200 g par litre de pommes de terre, et on stérilise les contenus. On inocule ces flacons avec une culture de Corticium vagum F-31-9 (FERM N[deg.] 302) et on effectue une culture sous agitation à 26[deg.]C pendant 8 jours. A la fin de la culture on ajoute 800 ml d'eau distillée à 400 ml de bouillon de culture et on ajuste le pH à 7,4. On homogénéise le mélange dans
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centrifugation.
A 1 litre du surnageant on ajoute 3 litres d'éthanol et le précipité résultant est recueilli par centrifugation et dissout dans de l'eau distillée. Puis on ajoute 162 ml d'une solution aqueuse 0,1 M de bromure de cétyltriméthylammonium et 13 ml d'une solution aqueuse 0,5 M d'hydroxyde.de sodium
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la précipitation des polysaccharides. On ajoute 300 ml d'une solution aqueuse à 10 % poids/volume d'acide acétique au précipité résultant afin de le dissoudra et on ajoute 1,2 litre d'éthanol a la solution . On dissout le précipité résultant en 350 ml d'eau distillée et l'on introduit la solution dans un tube en cellulose et on effectue une dialyse avec de
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d'éthanol pour précipiter à nouveau les polysaccharides.
On dissout le précipité résultant dans 100 ml d'eau distillée et on effectue une lyophilisation ce qui donne 2g de glucanne brut.
On dissout 13,5 mg de ce glucanne brut dans 27 ml
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une colonne de Sephadex G-200 . On élue la colonne avec de l'eau distillée et on recueille l'éluat sous forme de fractionsdè 20 ml. Le glucanne présente un pic dans la
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fractions de 2 à 11 et on ajoute 800 ml d'éthanol à la solution résultante.pour provoquer, la précipitation. On dissout le précipité résultant dans de l'eau distillée et
on lyophilise ;on obtient ainsi 9,2 mg d'un glucanne appelé "Corticane *. Le Corticane est une substance neutre blanche.
REVENDICATIONS
1. Glucanne hydrolysé utilisable notamment comme agent immunosuppresseur et présentant des liaisons
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que le rapport de motifs glucose dans les ramifications
a motifs glucose dans la chaîne principale est d'environ 2/7 et le glucanne a les propriétés suivantes: (a) le produit lyophilisé est un matériau solide amorphe blanc;
(b) il est soluble dans l'eau, le diméthyl sulfoxyde et <EMI ID=41.1>
l'acétone, l'acétate d'éthyle, le benzène et l'éther di- éthylique; (c) son analyse élémentaire correspond essentiellement aux valeurs calculées pour un polysaccharide hydraté de type hexoside répondant à la formule
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spectre infrarouge (poudre de KBr) correspondant essentiellement à celui représenté au dessin; et (e) on n'observe qu'un pic unique à l'analyse spectroscopique par ultracentrifugation, et il a une masse moléculaire de
150.000 à 160.000, calculée d'après la constante de sédimentation; le glucanne pouvant être préparé par traitement par l'acide fornique d'un polysaccharide produit par un fongus de la famille des Corticiacées, puis par hydrolyse du produit traité.
2. Procédé de préparation d'un glucanne hydrolyse, caractérisé en ce qu'on traite par l'acide formique un polysaccharide produit par un fongus de la famille des
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Glucanne, its preparation process and its application in
therapeutic.
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hydrolysis cane, has a process for its preparation as well as. pharmaceutically acceptable compositions containing it. The glucan according to the invention can be used in particular as an immunomodulatory agent in the treatment of cancers and rheumatoid arthritis.
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can produce polysaccharides that act on cancers and other tumors. However, these polysaccharides are not very soluble in water and, even if it is possible to obtain an aqueous solution of any of them, this solution easily turns into a gel. It follows that it is very difficult to carry out pharmacological tests with these polysaccharides and even more difficult to use the polysaccharides for therapeutic purposes.
Rheumatoid arthritis is an incurable disease and, although many drugs have been studied in an attempt to cure it, the trials have not been successful. Known treatments (for example: treatment with steroids, non-sterol-
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gold base, etc.) are all symptomatic treatments and do not act on the cause of the disease.
Japanese patent n [deg.] 828.248 describes a process for preparing a polysaccharide having an anti-tumor activity, consisting in cultivating a glucan producing microorganism of the genus Corticium or of the genus Hypochnus, then in separating from the culture broth a glucan having
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links 6) in its ramifications. However, as described above, the resulting glucan, although having anti-tumor activity, is difficult to use in practice because its aqueous solutions tend to gel. However, the Applicant has now surprisingly discovered that by treating glucans of this type with formic acid and then by hydrolyzing the resulting product, it is possible to obtain a glucan having a substantially improved water solubility and, moreover, unexpectedly, a very improved anti-tumor activity.
This is how the present invention relates to a
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cations, the ratio of glucose units in the ramifications to glucose units in the main chain being approximately 2/7, the glucan being characterized by the following properties:
la) the lyophilized product is in the form of a
white amorphous solid product;
(b) it is soluble in water, in dimethyl tallow oxide and in dimethylformamide, and it is insoluble in ethanol, acetone, ethyl acetate, benzene and diethyl ether;
(c) its elementary analysis essentially corresponds to the values calculated for a hydrated polysaccharide
<EMI ID = 6.1> essentially relating to that shown in the accompanying drawing; and
(e) only a single peak is observed on spectroscopic analysis by ultracentrifugation, and it has a molecular mass <EMI ID = 7.1>
sedimentation constant;
the glucan can be prepared by treating with formic acid a polysaccharide produced by a fungus of the family of Corticiaceae, then by hydrolyzing the treated product.
The invention also relates to a process for preparing the hydrolyzed glucan according to the invention, comprising:
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by a fungus of the Corticiaceae family, then by hydrolyzing the treated product.
The subject of the invention is also a pharmaceutical composition containing, as active principle, the hydrolyzed glucan according to the present invention, in mixture with a pharmaceutically acceptable vehicle or diluent.
The polysaccharide used as starting material for the process according to the invention is a metabolic product of a fungus of the family of Corticiaceae (Basidiomycetes), for example a fungus of the genus Corticium or Hypochnus. This starting polysaccharide can be obtained by cultivating the chosen fungus, as described in more detail in Japanese patent n [deg.] 828,248.
The hydrolyzed glucan is preferably prepared according to the present invention by adding an aqueous solution of 70-90% w / w formic acid to the starting polysaccharide and heating the resulting mixture, preferably with stirring. The temperature to which the reaction mixture is brought is not particularly critical, although a temperature of 80 to 100 [deg.] C is preferable. The time required for this reaction depends on the reaction conditions, in particular the temperature, but the
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under reduced pressure, after which water is added to hydrolyze the residue. It is best to perform
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that the deformylation is complete. The gelatinous material produced can be separated by centrifugation, and an organic solvent is added to the mother liquor to obtain a precipitate which is collected. The nature of the solvent used
at this point is not particularly limited, as long as it
<EMI ID = 11.1>
rable to use a horned alcohol methanol or ethanol. The precipitate is dissolved or dispersed in water, and the solution or dispersion is lyophilized, thus obtaining the desired hydrolysed polysaccharide in the form of a white amorphous solid product.
This amorphous solid product is soluble in water, dimethyl sulfoxide and dimethylformamide and is insoluble in ethanol, acetone, ethyl acetate, benzene and diethyl ether. It is heat resistant. The results of the elementary analysis correspond to those calculated for a hydrated polysaccharide of the hexoside type and
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product red (in potassium bromide powder) is shown in Fig. l. It has rotary power
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serve as a single peak for spectroscopic analysis by ultracentrifugation of the product. and, according to the sedimentation constant, its molecular mass turns out to be between
150,000 and 160,000, from which it is possible to calculate that the value of n in the above formula is
833 to 889.
The constituent saccharides of this hydrolyzed glucan can be identified as follows. The hydrolyzed glucan is dissolved in an aqueous solution of IN sulfuric acid and then hydrolyzed at 100 [deg.] C for 120 minutes in a sealed tube. The product is then neutralized with barium hydroxide and subjected to paper chromatography. When developing the chromatography paper using an aqueous ammoniacal silver nitrate solution, only one spot is observed. The product represented by this unique spot can be identified as
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vention can be determined by completely methylating the glucan by conventional means, hydrolyzing the methylated glucan to obtain methylated glucose, reducing the methylated glucose and acetylating the reduced product. Gas chromatography identifies the resulting mixture as consisting of 2,3,4 acetates,
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and 2,4-di-O-methylglycitol in a molar ratio of about 1 / 2.5 / 1. This result confirms that the glucan according to the present invention contains approximately two branches (each consisting of a single glucose unit)
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glucan. In addition, it is confirmed that all the glucose bonds are in the configuration / 3, by observation
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The hydrolyzed glucan according to the present invention is more water-soluble and less gellable in aqueous solution than the polysaccharide from which it was pre-
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example its anti-cancer activity and its suppressive activity of arthritis) are very strong and are only accompanied by low toxicity. In particular, the high suppressive activity of arthritis and the low toxicity could not have been predicted from the activities of polysaccharides produced directly from fungi of the class of Basidiomycetes. It follows that the hydrolyzed glucan according to the present invention is in particular usable for treating diseases resulting from disorders of the immune system, such as for example rheumatoid arthritis.
The biological activities and the toxicity of the hydrolyzed glucan according to the invention are demonstrated by the following tests.
(1) Anti-neoplastic activity
The tests are carried out on 7 week old male mice, of ICR strain. 2 x 106 Sarcoma 180 cancer cells are grafted onto the skin of the axillary region of each mouse. After 6 and 7 days after grafting, a sample of the hydrolyzed glucan according to the invention (produced as described in Example 1 below) is administered in physiological serum, by injection into the abdomen; the concentration of the physiological solution of hydrolyzed glucan is 0.1% w / v. 25 days after <EMI ID = 19.1>
kills an identical test on a batch of control mice to which no hydrolysed glucan was administered, and the rate of suppression of the tumor Ci) is calculated according to the following formula:
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<EMI ID = 21.1>
(in mm) of the control batch and d represents the average diameter of the tumor in the treated batch. The results obtained are reported in Table 1, which shows the effect on the rate of tumor suppression of variations in the amounts of hydrolyzed glucan administered per day.
45 days after grafting, all mice are carefully examined to determine the number of mice showing complete tumor regression. The
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1, in which the number of mice showing a complete regression is reported as a proportion of the total number of mice tested, in the group concerned.
Table 1
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(2) Anti-arthritis activity
The tests are carried out according to the procedures
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Arth. Rheum., 12, 472 (19697 to measure the power of compounds to suppress adjuvant arthritis
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for the evaluation of anti-neoplastic agents.
In Lewis rats, the adjuvant is injected subcutaneously into the plantar surface of the right hind paw in order to cause the disease. Then we inject a solution
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in the abdomen, for 15 days after inoculation of the adjuvant. Identical tests are carried out on a control batch of animals to which the hydrolyzed glucan is not administered. 18, 20, 24, 28 and 32 days after inoculation of the adjuvant, the swelling of the legs of the treated rats is compared with that of the legs of the untreated rats and, using a formula similar to that used to calculate the rate of tumor suppression, the suppression rate is calculated for each dose of the hydrolyzed glucan. The results (means) are reported in Table 2 below.
Table 2
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(3) Algae toxicity
Acute toxicity test (one week of observation) is carried out by injecting glucam samples
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no mortality was observed and the weight increased normally.
It follows from the above results that the hydrolyzed glucan according to the present invention is very valuable
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the agent parenterally (for example by subcutaneous, intravenous or intramuscular injection). The daily dosage varies depending on the disease to be treated,
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but, in general, the daily dosage in adults is preferably from 0.5 to 50 mg, for example about 5 mg. It can be administered in a single dose or in divided doses.
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presented in a form suitable for the chosen route of administration, using any type of composition commonly used for other immunosuppressive agents. For example, a composition can be presented in an ampoule, in the form of a unit dose, or presented in a container for several doses, preferably in
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tion may be in the form of a suspension, solution or emulsion in an oily or aqueous vehicle, and may comprise conventional adjuvants, for example suspending agents and / or stabilizers and / or dispersants . The active ingredient can also be presented in the form of a powder to be dissolved before administration in a suitable vehicle, for example pyrogen-free sterile water.
When the composition according to the invention is presented in the form of unit doses, it preferably contains from 0.5 to 10 mg of active ingredient per unit dose.
The following nonlimiting examples are given by way of illustration of the present invention. The example
1 illustrates the preparation of the hydrolyzed glucan according to the invention and Example 2 illustrates the preparation of a pharmaceutical composition containing it.
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After evaporating the formic acid under reduced pressure, 600 ml of water are added to the residue and the resulting aqueous mixture is heated to reflux. Then the reaction mixture is centrifuged for 15 minutes at 10,000 rpm. To the supernatant liquid thus separated was added 2.4 liters of ethanol, and the resulting precipitate was collected by centrifugation. 500 ml of water are added to the precipitate, then the aqueous mixture is lyophilized, thus obtaining 2.0 g of the desired hydrolyzed glucan, in the form of a white amorphous solid product. The product has the following characteristics:
<EMI ID = 34.1>
Molecular mass (analysis by ultracentrifugation, phosphate buffer, pH 6.5): 159,000.
EXAMPLE 2
5 mg of the hydrolyzed glucan obtained in Example 1 are dissolved in 2 ml of physiological saline, then sterilized
the solution by heating in the usual manner in order to obtain a solution for injection.
PREPARATION OF CORTICANE
Five 500 ml Sakaguchi bottles are introduced
100 ml of a glucose-potato medium containing 2%
by weight of glucose in a boiled soup containing 200 g per liter of potatoes, and the contents are sterilized. These vials are inoculated with a culture of Corticium vagum F-31-9 (FERM N [deg.] 302) and a culture is carried out with shaking at 26 [deg.] C for 8 days. At the end of the culture, 800 ml of distilled water are added to 400 ml of culture broth and the pH is adjusted to 7.4. The mixture is homogenized in
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centrifugation.
To 1 liter of the supernatant is added 3 liters of ethanol and the resulting precipitate is collected by centrifugation and dissolved in distilled water. Then 162 ml of a 0.1 M aqueous solution of cetyltrimethylammonium bromide and 13 ml of a 0.5 M aqueous solution of sodium hydroxide are added.
<EMI ID = 36.1>
precipitation of polysaccharides. 300 ml of a 10% w / v aqueous solution of acetic acid are added to the resulting precipitate to dissolve it and 1.2 liters of ethanol are added to the solution. The resulting precipitate is dissolved in 350 ml of distilled water and the solution is introduced into a cellulose tube and dialysis is carried out with
<EMI ID = 37.1>
ethanol to precipitate the polysaccharides again.
The resulting precipitate is dissolved in 100 ml of distilled water and lyophilization is carried out, which gives 2 g of crude glucan.
13.5 mg of this raw glucan are dissolved in 27 ml
<EMI ID = 38.1>
a column of Sephadex G-200. The column is eluted with distilled water and the eluate is collected in the form of fractions of 20 ml. Glucan has a peak in the
<EMI ID = 39.1>
fractions from 2 to 11 and 800 ml of ethanol are added to the resulting solution. To cause precipitation. The resulting precipitate is dissolved in distilled water and
freeze-dried to obtain 9.2 mg of a glucan called "Corticane *. Corticane is a white neutral substance.
CLAIMS
1. Hydrolyzed glucan which can be used in particular as an immunosuppressive agent and which has bonds
<EMI ID = 40.1>
that the ratio of glucose patterns in the ramifications
A glucose unit in the main chain is about 2/7 and the glucan has the following properties: (a) the lyophilized product is a white amorphous solid material;
(b) it is soluble in water, dimethyl sulfoxide and <EMI ID = 41.1>
acetone, ethyl acetate, benzene and diethyl ether; (c) its elementary analysis essentially corresponds to the values calculated for a hydrated polysaccharide of the hexoside type corresponding to the formula
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infrared spectrum (KBr powder) essentially corresponding to that shown in the drawing; and (e) only a single peak is observed in the spectroscopic analysis by ultracentrifugation, and it has a molecular mass of
150,000 to 160,000, calculated according to the sedimentation constant; the glucan can be prepared by treatment with fornic acid of a polysaccharide produced by a fungus of the family of Corticiaceae, then by hydrolysis of the treated product.
2. Process for the preparation of a hydrolyzed glucan, characterized in that a polysaccharide produced by a fungus of the family of
<EMI ID = 43.1>