Glucanne, son procédé de préparation et son application en
thérapeutique.
<EMI ID=1.1>
canne hydrolyse, a un procède pour sa préparation ainsi qu'. des compositions pharmaceutiquement acceptables le contenant. Le glucanne suivant l'invention est utilisable notamment comme agent immunomodulateur dans le traitement des cancers et du rhumatisme articulaire.
<EMI ID=2.1>
peuvent produire des polysaccharides qui agissent sur les cancers et autres tumeurs. Toutefois, ces polysaccharides sont peu solubles dans l'eau et, même s'il est possible d1 obtenir une solution aqueuse de n'importe lesquels d'entre eux, cette solution se transforme aisément en gel. Il s'ensuit qu'il est très difficile d'effectuer des essais pharmacologiques avec ces polysaccharides et encore plus difficile d'utiliser les polysaccharides à des fins thérapeutiques.
Le rhumatisme articulaire est une maladie incurable et, bien qu'on ait étudié de nombreux médicaments afin d'essayer de la guérir, les essais effectués n'ont pas été couronnés de succès. Les traitements connus (par exemple: traitement avec des stéroïdes, des agents non-stérol-
<EMI ID=3.1>
base d'or, etc.) sont tous des traitements symptomatiques et n'agissent pas sur la cause du mal.
Le brevet japonais n[deg.] 828.248 décrit un procédé de préparation d'un polysaccharide ayant une activité antitumeur, consistant à cultiver un microorganisme producteur de glucanne du genre Corticium ou du genre Hypochnus, puis à séparer du bouillon de culture un glucanne présentant
<EMI ID=4.1>
liaisons 6) dans ses ramifications. Toutefois, comme décrit ci-dessus, le glucanne résultant, bien qu'ayant une activité anti-tumeur, est difficile à utiliser en pratique car ses solutions aqueuses ont tendance à gélifier. Toutefois, la Demanderesse a maintenant découvert de façon surprenante qu'en traitant des glucannes de ce type par l'acide formique puis en hydrolysant le produit résultant, on peut obtenir un glucanne ayant une hydrosolubilité sensiblement améliorée et en outre, de façon inattendue, une activité anti-tumeur très améliorée.
C'est ainsi que la présente invention a pour objet un
<EMI ID=5.1>
cations, le rapport de motifs glucose dans les ramifications à motifs glucose dans la chaîne principale étant de 2/7 environ, le glucanne étant caractérise par les propriétés suivantes:
la) le produit lyophilise se présente sous la forme d'un
produit solide amorphe blanc;
(b) il est soluble dans l'eau, dans le diméthyl suif oxyde et dans le diméthylformamide, et il est insoluble dans l'éthanol, l'acétone, l'acétate d'éthyle, le benzène et l'éther diéthylique;
(c) son analyse élémentaire correspond essentiellement aux valeurs calculées pour un polysaccharide hydraté
<EMI ID=6.1> dant essentiellement à celui représenté au dessin annexé; et
(e) on n'observe qu'un pic unique à l'analyse spectroscopique par ultracentrifugation, et il a une masse molé- <EMI ID=7.1>
constante de sédimentation;
le glucanne pouvant être préparé en traitant par l'acide formique un polysaccharide produit par un fongus de la famille des Corticiacées , puis en hydrolysant le produit traité.
L'invention vise également un procédé de préparation du glucanne hydrolyse suivant l'invention, consistant à
<EMI ID=8.1>
par un fongus de la famille des Corticiacées, puis en hydrolysant le produit traité.
L'invention a encore pour objet une composition pharmaceutique contenant, à titre de principe actif, le glucanne hydrolyse suivant la présente invention, en mélange avec un véhicule ou diluant pharmaceutiquement acceptable.
Le polysaccharide utilisé comme substance de départ pour le procédé suivant l'invention est un produit métabolique d'un fongus de la famille des Corticiacées (Basidiomycëtes), par exemple un fongus du genre Corticium ou Hypochnus. On peut obtenir ce polysaccharide de départ en cultivant le fongus choisi, comme décrit de façon plus détaillée dans le brevet japonais n[deg.] 828.248.
On prépare de préférence le glucanne hydrolysé suivant la présente invention en ajoutant une solution aqueuse d'acide formique à 70-90% pds/pds au polysaccharide de départ et en chauffant le.mélange résultant, de préférence en agitant. La température à laquelle on porte le mélange réactionnel n'est pas particulièrement critique, bien qu'une température de 80 à 100[deg.]C soit préférable. Le temps nécessaire à cette réaction dépend des conditions réactionnelles, en particulier de la température, mais la
<EMI ID=9.1>
sous pression réduite, après quoi on ajoute de l'eau afin d'hydrolyser le résidu. Il est préférable d'effectuer
<EMI ID=10.1>
que la déformylation soit terminée. Le matériau gélatineux produit peut être séparé par centrifugation, et on ajoute un solvant organique à la liqueur-mère afin d'obtenir un précipité qu'on recueille. La nature du solvant utilisé
à ce stade n'est pas particulièrement limitée, tant qu'il
<EMI ID=11.1>
rable d'utiliser un alcool cornue le méthanol ou l'éthanol. 'On dissout ou disperse le précipité dans de l'eau, et on lyophilise la solution ou dispersion, obtenant ainsi le polysaccharide hydrolysé cherché sous la forme d'un produit solide blanc amorphe.
Ce produit solide amorphe est soluble dans l'eau, le diméthyl sulfoxyde et le diméthylformamide et est insoluble dans l'éthanol, l'acétone, l'acétate d'êthyle, le benzène et l'éther diéthylique. Il est thermo-résistant. Les résultats de l'analyse élémentaire correspondent à ceux calculés pour un polysaccharide hydraté de type hexoside et
<EMI ID=12.1>
rouge du produit (dans la poudre de bromure de potassium) est illustré à la Fig.l. Il a un pouvoir rotatoire
<EMI ID=13.1>
serve qu'un pic unique à l'analyse spectroscopique par ultracentrifugation du produit.et, d'âpres la constante de sédimentation, sa masse moléculaire s'avère comprise entre
150.000 et 160.000, d'après quoi il est possible de calculer que la valeur de n dans la formule ci-dessus est de
833 à 889.
Les saccharides constitutifs de ce glucanne hydrolysé peuvent être identifiés comme suit. On dissout le glucanne hydrolysé dans une solution aqueuse d'acide sulfurique IN puis on hydrolyse à 100[deg.]C pendant 120 minutes dans un tube scellé. Puis on neutralise le produit à l'aide d'hydroxyde de baryum et on le soumet à une chromatographie sur papier. Lorsqu'on développe le papier de chromatographie à l'aide d'une solution aqueuse ammoniacale de nitrate d'argent, on n'observe qu'une tache unique. Le produit représenté par cette tache unique peut être identifié comme étant du
<EMI ID=14.1>
vention peut être déterminé en méthylant complètement le glucanne par des moyens classiques, en hydrolysant le glucanne méthylé afin d'obtenir du glucose méthylé, en réduisant le glucose méthylé et en acétylant le produit réduit. La chromatographie gazeuse identifie le mélange résultant comme étant constitué par des acétates de 2,3,4,
<EMI ID=15.1>
et de 2,4-di-O-méthylglycitol en un rapport molaire d'en-viron 1/2,5/1. Ce résultat confirme que le glucanne suivant la présente invention contient environ deux ramifications (constituées chacune par un seul motif glucose)
<EMI ID=16.1>
du glucanne. En outre, il se confirme que toutes les liaisons glucose sont en la configuration /3 , par observation
<EMI ID=17.1>
Le glucanne hydrolysé suivant la présente invention est plus hydrosoluble et moins gélifiable en solution aqueuse que le polysaccharide à partir duquel on l'a pré-
<EMI ID=18.1>
exemple son activité anti-cancer et son activité suppressive de l'arthrite) sont très fortes et ne s'accompagnent que d'une faible toxicité. En particulier, la forte activité suppressive de l'arthrite et la faible toxicité n'auraient pas pu être prévues diaprés les activités de polysaccharides produits directement à partir de fongi de- la classe des Basidiomycètes. Il s'ensuit que le glucanne hydrolysé suivant la présente invention est notamment utilisable pour traiter des maladies résultant de troubles du système immune, comme par exemple le rhumatisme articulaire.
Les activités biologiques et la toxicité du glucanne hydrolysé suivant l'invention sont mises en évidence par les essais suivants.
(1) Activité anti-néoplasique
On effectue les essais sur des souris mâles de 7 semaines, de souche ICR. On greffe 2 x 106 cellules cancéreuses de Sarcome 180 sur la peau de la région axillaire de chaque souris. Au bout de 6 et 7 jours après greffage, on administre un échantillon du glucanne hydrolysé suivant l'invention (produit comme décrit dans l'exemple 1 ciaprès) dans du sérum physiologique, par injection dans l'abdomen; la concentration de la solution physiologique de glucanne hydrolysé est de 0,1% pds/vol. 25 jours après <EMI ID=19.1>
tue un essai identique sur un lot de souris témoin auxquelles on n'a pas administré de glucanne hydrolyse, et on calcule le taux de suppression de la tumeur Ci) d'après la formule suivante:
<EMI ID=20.1>
<EMI ID=21.1>
(en mm) du lot témoin et d représente le diamètre moyen de la tumeur du lot traité. Les résultats obtenus sont rapportés au tableau 1, qui montre l'effet, sur le taux de suppression de la tumeur, des variations des quantités de glucanne hydrolyse administrées par jour.
45 jours après le greffage , on examine soigneusement toutes les souris, afin de déterminer le nombre de souris présentant une régression complète de la tumeur. Les
<EMI ID=22.1>
bleau 1, dans lequel le nombre de souris présentant une régression complète est rapporté en proportion du nombre total de souris testées, dans le groupe concerné.
Tableau 1
<EMI ID=23.1>
(2) Activité anti-arthritique
On effectue les essais suivant les modes opératoires
<EMI ID=24.1>
Arth. Rheum., 12, 472 (19697 permettant de mesurer le pouvoir qu'ont des composés de supprimer l'arthrite à l'adju-
<EMI ID=25.1>
pour l'évaluation des agents anti-néoplasiques.
A des rats Lewis on injecte l'adjuvant par voie souscutanée dans la face plantaire de la patte arrière droite, afin de provoquer la maladie. Puis on injecte une solu-
<EMI ID=26.1>
dans l'abdomen, pendant 15 jours après l'inoculation de l'adjuvant..On effectue des essais identiques sur un lot témoin d'animaux auxquels on n'administre pas le glucanne hydrolysé. 18, 20, 24, 28 et 32 jours après l'inoculation de l'adjuvant, on compare le gonflement des pattes des rats traités avec celui des pattes des rats non traités et, en utilisant une formule similaire à celle utilisée pour calculer le taux de suppression de la tumeur, on calcule le taux de suppression pour chaque dose du glucanne hydrolysé. Les résultats (moyennes) sont rapportés au tableau 2 suivant.
Tableau 2
<EMI ID=27.1>
(3) Toxicité algue
On effectue un test de toxicité aigue (une semaine d'observation) en injectant des échantillons du glucame
<EMI ID=28.1>
on n'observe pas de mortalité et le poids augmente de façon normale.
Il découle des résultats ci-dessus que le glucanne hydrolyse suivant la présente invention est très précieux
<EMI ID=29.1>
trer l'agent par voie parentérale (par exemple par injection sous-cutanée, intraveineuse ou intramusculaire). La posologie journalière varie suivant la maladie à traiter,
<EMI ID=30.1>
mais, d'une façon générale, la posologie journalière chez l'adulte est de préférence de 0,5 à 50 mg, par exemple de 5 mg environ. On peut l'administrer en une seule dose ou en doses fragmentées.
<EMI ID=31.1>
présenté sous une forme convenant à la voie d'administration choisie, en utilisant tout type de composition couramment utilisé pour d'autres agents immunosuppresseurs. Par exemple, on peut présenter une composition dans une ampoule, sous forme de dose unitaire, ou la présenter dans un récipient pour plusieurs doses, de préférence en
<EMI ID=32.1>
tion peut être sous la forme d'une suspension, d'une solution ou d'une émulsion dans un véhicule huileux ou aqueux, et peut comprendre des adjuvants classiques, par exemple des agents de mise en suspension et/ou stabilisants et/ou dispersants. L'ingrédient actif peut également être présenté sous la forme d'une poudre à dissoudre avant l'administration dans un véhicule approprié, par exemple de l'eau stérile apyrogène.
Lorsque la composition suivant l'invention est présentée sous la forme de doses unitaires, elle contient de préférence de 0,5 à 10 mg d'ingrédient actif par dose unitaire.
Les exemples non limitatifs suivants sont donnés à titre d'illustration de la présente invention. L'exemple
1 illustre la préparation du glucanne hydrolysé suivant l'invention et l'exemple 2 illustre la préparation d'une composition pharmaceutique le contenant.
<EMI ID=33.1>
Après avoir évaporé l'acide formique sous pression réduite, on ajoute 600 ml d'eau au résidu et on chauffe le mélange aqueux résultant au reflux. Puis on centrifuge le mélange réactionnel pendant 15 minutes à 10.000 tours/min. Au liquide surnageant ainsi séparé on ajoute 2,4 litres d'éthanol, et on recueille le précipité résultant par centrifugation. On ajoute 500 ml d'eau au précipité, puis on lyophilise le mélange aqueux, obtenant ainsi 2,0 g du glucanne hydrolysé cherché, sous la forme d'un produit solide amorphe blanc. Le produit présente les caractéristiques suivantes:
<EMI ID=34.1>
Masse moléculaire (analyse par ultracentrifugation, tampon phosphate, pH 6,5): 159.000.
EXEMPLE 2
On dissout 5 mg du glucanne hydrolyse obtenu à l'exemple 1 dans 2 ml de sérum physiologique, puis on stérilise
la solution en chauffant de la manière habituelle afin d'obtenir une solution injectable.
PREPARATION DU CORTICANE
Dans cinq flacons de Sakaguchi de 500 ml on introduit
100 ml d'un milieu glucose-pomme de terre contenant 2 %
en poids de glucose dans une soupe bouillie contenant 200 g par litre de pommes de terre, et on stérilise les contenus. On inocule ces flacons avec une culture de Corticium vagum F-31-9 (FERM N[deg.] 302) et on effectue une culture sous agitation à 26[deg.]C pendant 8 jours. A la fin de la culture on ajoute 800 ml d'eau distillée à 400 ml de bouillon de culture et on ajuste le pH à 7,4. On homogénéise le mélange dans
<EMI ID=35.1>
centrifugation.
A 1 litre du surnageant on ajoute 3 litres d'éthanol et le précipité résultant est recueilli par centrifugation et dissout dans de l'eau distillée. Puis on ajoute 162 ml d'une solution aqueuse 0,1 M de bromure de cétyltriméthylammonium et 13 ml d'une solution aqueuse 0,5 M d'hydroxyde.de sodium
<EMI ID=36.1>
la précipitation des polysaccharides. On ajoute 300 ml d'une solution aqueuse à 10 % poids/volume d'acide acétique au précipité résultant afin de le dissoudra et on ajoute 1,2 litre d'éthanol a la solution . On dissout le précipité résultant en 350 ml d'eau distillée et l'on introduit la solution dans un tube en cellulose et on effectue une dialyse avec de
<EMI ID=37.1>
d'éthanol pour précipiter à nouveau les polysaccharides.
On dissout le précipité résultant dans 100 ml d'eau distillée et on effectue une lyophilisation ce qui donne 2g de glucanne brut.
On dissout 13,5 mg de ce glucanne brut dans 27 ml
<EMI ID=38.1>
une colonne de Sephadex G-200 . On élue la colonne avec de l'eau distillée et on recueille l'éluat sous forme de fractionsdè 20 ml. Le glucanne présente un pic dans la
<EMI ID=39.1>
fractions de 2 à 11 et on ajoute 800 ml d'éthanol à la solution résultante.pour provoquer, la précipitation. On dissout le précipité résultant dans de l'eau distillée et
on lyophilise ;on obtient ainsi 9,2 mg d'un glucanne appelé "Corticane *. Le Corticane est une substance neutre blanche.
REVENDICATIONS
1. Glucanne hydrolysé utilisable notamment comme agent immunosuppresseur et présentant des liaisons
<EMI ID=40.1>
que le rapport de motifs glucose dans les ramifications
a motifs glucose dans la chaîne principale est d'environ 2/7 et le glucanne a les propriétés suivantes: (a) le produit lyophilisé est un matériau solide amorphe blanc;
(b) il est soluble dans l'eau, le diméthyl sulfoxyde et <EMI ID=41.1>
l'acétone, l'acétate d'éthyle, le benzène et l'éther di- éthylique; (c) son analyse élémentaire correspond essentiellement aux valeurs calculées pour un polysaccharide hydraté de type hexoside répondant à la formule
<EMI ID=42.1>
spectre infrarouge (poudre de KBr) correspondant essentiellement à celui représenté au dessin; et (e) on n'observe qu'un pic unique à l'analyse spectroscopique par ultracentrifugation, et il a une masse moléculaire de
150.000 à 160.000, calculée d'après la constante de sédimentation; le glucanne pouvant être préparé par traitement par l'acide fornique d'un polysaccharide produit par un fongus de la famille des Corticiacées, puis par hydrolyse du produit traité.
2. Procédé de préparation d'un glucanne hydrolyse, caractérisé en ce qu'on traite par l'acide formique un polysaccharide produit par un fongus de la famille des
<EMI ID=43.1>